（纺织化学与染整工程专业论文）聚丙稀腈纤维的生物酶表面改性.pdf

摘要 本文首先简单介绍了腈降解酶的种类及其作剧机理、催化方式，以及日前为止 国外纺织科技工作者对腈水合酶在腈纶纤维改性方面的研究情况，并比较了腈纶纤 维传统的化学及物理抗静电改性方法与新兴的生物酶改性方法各自的优缺点，对腈 纶纤维生物酶改性的应用前景进行了展望。 本文的研究内容主要包括三个方面： ( 一) 优化节杆菌a r t h r o b a c t e r 垆e c u l1 0 1 的发酵条件，实验发现该菌产腈水合酶 的最遁碳源为1 葡萄糖，最佳氮源为o 2 5 ( 1 9 酵母肯利0 2 5 的蛋向胨，最适发 酵箍度为3 5 、培养基最适p h 值为7 0 、摇瓶转速1 6 0 r p m 、发酵培养1 2 小时后 腈水合酶活力达到最大。吐温8 0 等表面活性剂对产酶活力没何促进作用。w 为 4 ，t h # o b a c t e r ，p e c u l1 0 1 所产腈水合酶为胞内酶，同时义是诱导酶。本文还对j 琚 导剂的种类、添加时间及用量进行r 筛选，结泶发现在发孵椤j j j j 加入o 4 的乙l i 可显著提高彳r t h # o b a c t e t s p e c u1 1 0 1 产：睛水合酶的j 舌j ，l 腑作为诱导剂也有类 似作 扫，而向发酵液中添加苯耳f 腈则会i j j j 链抑：# 0a i t h r o b a c t e r 咿e c u l l 0 1 的，= 及腈水合酶的合成。即脂肪腈作为沥导剂加入发酵也l j j 仃效促进j j i 8 5 ) ，所以腈纶大分子 以聚丙烯腈表示( 见下式) ：为改善纤维手感加入的第：单体如内烯酸甲酯、甲基丙 烯酸甲酯、醋酸乙烯酯约为1 0 ：为提高其染色性能加入的第三单体如衣康酸、甲基 丙烯磺酸钠等含量约为1 。 13 书h h 壬 c n 从以上结构式看出： ( 1 ) 腈纶大分了为碳链结构，化学稳定性较好。 ( 2 ) 腈纶大分子的规整性好，分子结构紧密。 ( 3 ) 腈纶分子上存在着大量强极性基氰基。 本来氰基也可以通过氢键与水分子发生缔合，但事实上腈纶的吸湿性很差，这是 因为腈纶纤维的大分子呈不规则的螺旋状空间立体构象，同一大分子上相邻氰基之间 因极性方向相同而相互排斥，而相邻大分子的氰基之间因极性方向相反而以偶极配对 键互相吸引。同时，由于氰基的极性具有很强的负诱导效应，使氰基所联结的叔碳原 子的碳氢键被极化，腈纶分子之问又可以形成很强的偶极性氧键。氰基的偶极效应和 负诱导效应使它们中间的绝大部分已经无能力再与水分子建立氢键的缔合了，所以， 在腈纶中真正能吸引水分子，通过氢键而与水分子缔合的只有少数分布在纤维表面的 没有形成氰偶极配对键和偶极性氢键的自由氰基。 腈纶的吸湿比较低，在合成纤维中属中等。在标准条件下，腈纶纤维的刨潮率为 1 2 2 0 。即使相对湿度提高到9 5 ( 2 0 时) ，回潮率也仅约1 5 3 ( ) 。纤维的 回潮率主要决定于纤维的分子结构和超分子结构， 纤维的带电现象，本质上是由于电荷的产生速度大于其逸散速度所造成。增加纤 维的导电性能即减小纤维的电阻，足防止静电发生的有效措施。| ：。 性能是结构的宏观体现，比较腈纶纤维与棉纤维的结构不难发现，正是由于腈纶 缺乏亲水性基团，回潮率低，所以导电性能比天然纤维羞裂剃。腈纶等疏水性 合纤的体积比电阻为1 0 8 q m ，比棉纤维高达1 0 0 万倍。一般认为，纺织材料的体积比 电阻降低到1 0 7 1 0 ql l l 或表面电阻率降到1 0 1 1 、1 0 lqi l l 时，生产上就不致引起麻烦 【l o 】 传统的腈纶抗静电改性工艺根据其作用机理可分为两种：化学改性和物理改性。1 1 2 6 2 化学改性 2 6 2 1 腈纶大分子结构亲水化 通过与丙烯酸、乙烯基吡啶和二羰基吡咯化合物等亲水性单体聚合或共聚，在大 分子的基本结构中引进大量亲水性基团。 1 4 也可采用增加丙烯腈共聚物中第二单体丙烯酸甲酯含量的办法。因为这种聚合物 的纤维经过碱处理，酯就被水解成酸，最终达到在丙烯腈大分子中引进羧基的上的目 的。日本的爱克斯纶公司生产的水膨润型超吸水腈纶短纤朗喜尔f 就属于该类产品。 该方法虽能显著改善腈纶的抗静电性，但由于大分子主链结构发生变化，势必影 响到腈纶的物理机械性能，顾此失彼，不宜采用。 2 6 2 2 与亲水性物质接枝共聚 聚丙烯腈可与甲基丙烯酸等亲水性单体接枝共聚，改善其吸湿性。1 9 6 9 年日本东 洋纺公司成功地将丙烯腈与天然蛋白通过接枝共聚制得亲水性改性腈纶一西诺。该工 艺的缺点是亲水性物质接枝的量不易控。量少则效果不明显，量多则会使腈纶丧失原 有的一些优良性质，如手感变差，染色牢度下降。 2 6 2 3 强酸、强碱及氧化剂处理 人们尝试采用不同的化学处理方法对聚丙烯腈纤维进行改性，使其更加亲水，在 强酸性或碱性条件下腈纶纤维表面的部分腈基发生水解( s c h e m e1 ) ，得到亲水性基 团酰胺基，如进一步在酸性高温或过氧化氢存在的碱性条件下水解，可得到更强的亲 水性基团羧基。 一c h2 一c h 一羔一c h 2 - - 彳h 一景 尘l c h2-chi ho h o t h 2 0 2i 一 。 + 一 - c nc o n h ， c o o h s c h e m e1 氰基的化学水解法 该方法可有效改善腈纶纤维的抗静电性，但腈纶纤维经高温、强酸、碱、氧化剂 处理后，纤维的物理机械性质会发生变化，强度和手感部有明显下降，腈纶的氰基水 解生成的氨与纤维上尚未水解的氰基结合可形成黄色的脒，导致纤维泛黄，影响了纤 维的美观。同时，使用苛性酸碱带来的废水污染电不容忽视。 2 6 2 4 用抗静电剂处理 传统的抗静电剂( 多为聚醚类或离子型表面活性剂) 处理多采用浸轧的方法，表 面活性剂分子在纤维表面定向排列，亲水基朝外，在纤维表面形成一层连续的亲水性 薄膜，从而提高纤维的吸湿性能和导电性能。 15 该工艺操作简单，成本低廉，能够在基本保持纤维原有特性的情况下，增加纤维 的抗静电性。但耐久性差，特别是耐洗涤性差，且常常使纤维或织物的力学性能或手 感、色调变差，也不f4 分理想。 2 6 3 物理改性 2 6 3 1 共混纺丝 在纺丝之前，把亲水性物质混入高聚物熔体或高聚物浓溶液中，然后按常规方法 进行纺丝。日本的中岛利诚等人采用聚丙烯酰胺和聚丙烯腈共混制得了高吸湿性的腈 纶纤维。 该种方法工艺实施存在困难：选择的亲水性物质要与丙烯腈具有相同的熔融条 件、能在同一凝固浴中成形、力学性质和热性质相似。否则，复合纤维易发生剥离。 同时，两者的比例应适当，亲水性物质偏少，改性不明显：亲水性物质偏多，腈纶的 原有性质得不到保持。 近年来，人们使用纳米级无机抗静电剂应用原液共混的工艺方法，使抗静电剂均 匀分散于聚丙烯腈原液中，然后进行纺丝生产。抗静电剂必须具备两个条件：一是抗静 电剂与聚合物有一定的相容性，以保证均匀地分散在聚合物中：二是抗静电剂有高效 的抗静电性能，有较好的热稳定性，不影响聚合物的纺丝。日本现已，r 发厂些表面 活性剂产品n 。3 ，该类表面活性剂具有与丙烯腈相同的氰键，并且含有亲水性的聚氧乙 烯基团，当这种表面活性剂与聚丙烯腈原液共混纺丝时，通过抗静电利从纤维分子内 部向外迁移，在纤维表面吸附水分，形成一层可以导电的水膜，从而提高腈纶纤维的 抗静电性能。 2 6 3 2 纤维结构微孔化 由于聚丙烯腈纤维是用原液经湿法或干法纺丝来制造的，在纺丝之前将低分子 物、低聚物或高聚物与聚丙烯腈充分混合，制成纺丝溶液，通过控制纺丝过程中溶剂 脱除的条件，比较容易实现纤维的微细孑l 化。或哲存纺丝原液中添加叫溶性物质，在 后加工中在将之溶解掉，也是一种形成微细孔的有效疗法。 该类方法可利用毛细效应显著提高纤维的吸水性，但对二纤维吸湿性，抗静电性 的改善微乎其微。 2 6 3 3 与导电纤维共混 1 6 人们也曾尝试在腈纶织物中混入少量导电纤维( 如碳纤维) ，使产生的静电荷迅 速逸散，从而赋予织物抗静电效果。但因导电纤维的着色性能差，该种方法不适于服 用面料加工，从而限制了它在纺织服装用领域的应用。 2 7 腈水合酶在腈纶纤维改性方面的研究现状 目前为止，腈水合酶在纺织品改性方面的应用研究还较少。最早从事该领域研究 的是日本京都府立大学的学者佐藤睦子n 引。1 9 8 4 年，佐藤睦子就曾尝试用从牙枝霉 菌c l a d o s p o r i i u mc l a d o s p o r i o i d e s ( c c ) 提取出的腈水合酶、酰胺酶和酯酶的粗溶液 处理聚丙烯腈纤维。结果发现经酶改性处理后的腈纶纤维的机械性能、固有粘度和紫 外吸收均有明显改变。 2 0 0 0 年葡萄牙的学者m m t a u b e r 63 等，用红球菌尼r h o d o 砌，0 1 1 写n c i m t 31 1 2 1 6 的细胞破碎液处理p a n 颗粒( 4 0 和1 9 0 k d a ) 和第二单体为乙烯基乙酸酯的聚丙烯腈纤 维。结果发现，p a n 4 0 和p a n l 9 0 的氰基都部分转变为相应的羧基，而腈纶纤维的氰基 仅水解成酰胺基。这一实验结果显示：尼2 响。如拍2 0 嬲舭硼2 2 71 1 2 1 6 产生的氰基水合 酶水解腈纶纤维表面的氰基成酰胺基，而生成的酰胺基与酰胺酶没有发生作用。 2 0 0 1 年意大利的学者e z i ob a t t i s t e l 等n ”用产腈水合酶与酰胺酶的短杆菌口 i m p e l i m ec b s4 9 8 7 4 和棒状杆菌f 力，f j ，i l o p h i l u sa 1 、c c2 1 4 1 9 的细胞破碎液处理 腈纶纤维，并对处理前后的腈纶纤维进行x p s ( x 射线光电子能谱) 分析，发现纤维 表面部分氰基选择性水解为酰胺基。改性后的腈纶纤维涧湿性、抗静电性及酸性染料 可染性均有显著提高。同时酸性染料在腈纶纤维上的上染率也明显提高。 2 8 纺织酶催化反应的作用历程及动力学影响因素 纺织酶加工的主要对象包括纤维、纤维附生物( 丝胶、果胶等) 、加工辅助物质 ( 浆料、印花糊料等) 及加工废水等。除加工废水外，其他几种加工对象均以固定相 的形式存在于加工体系中，因而是一种多相催化反应。即在纺织酶加工过程中，酶存 在于处理液中，是流动相，而处理对象为固定相，和固定化酶的催化反应正好相反。 从多相催化反应的过程来看，纺织酶催化反应大体上由下面几个过程组成：( 1 ) 酶分 子从水溶液中向纤维扩散：( 2 ) 酶分子在纤维表面吸附：( 3 ) 形成酶和底物络合 物； ( 4 ) 由络合物形成产物：( 5 ) 产物从纤维表面向溶液扩散。 纺织酶催化反应动力学的影响因素主要表现在以下几个方面阿1 ： ( 1 ) 纤维及其附着物通常为固体高聚物，有着特定的超分子和交联结构。因而分子 的刚性大，分子的变形困难，不利于底物分子向有利于催化的形式变形。 1 7 ( 2 ) 由于酶纾胎幽维的孙侧对底物忿孑进行攻击，使某些在均相催化反应中 可以进行的反应部位由于空间障碍而不能进行，因而，酶分f 的转化率相对较 低。 ( 3 ) 酶对纤维表面的催化反应会改变纤维表面的荷电性质。 ( 4 ) 纤维处理过程中通常以纤维集合体( 纱线、织物) 的形式存在，在分配效应的 作用下，纤维集合体内部和外部、纤维表面和溶液中各反应组分的浓度是不同 的。 ( 5 )纤维集合体内部和外部，有的甚至是纤维内部和外部各组分扩散速度是不同 的。 为促进酶从溶液中向纤维表面转移，进而向纤维内部扩散，同时为保证酶在纤维 集合体内部的均匀分布和作用，避免因纤维上局部产物浓度过高，导致反应速率降 低，有必要在酶改性过程中对纤维进行搅拌。 2 9 本文的研究重点 本文的研究内容包括以下几个方面：； ( 1 ) 考虑到本史鲍主夏目驹是利用酶的催。 垡垡旦堡堕绝堑丝塞画的部簸氰基水解生成素撒胜更强昀酰胺基或麓摹i ，所以本实验 选用了即可以合成腈水合酶酰胺酶，又可以合成脯z & 解酶的节杆菌, 4 z t h z o b a c t e zs p e c u l1 0 1 作淑实验菌株，从菌体培养做起，筛选合适的诱导荆并确定其用量，优化菌体 的发酵条件包括发酵温度、p h 值、转速、碳氮源种类及比例等以提高酶活力。 ( 2 ) 选 一。 择简便准确的腈水合酶及酰胺酶活力测定方法，考察各种因素对腈水合酶活力的影 响。 ( 3 ) 型照坌红缝的酶处理工艺条住如温度、p h 值、酶浓等进行优化：向酶处理液 中添加适量的表面活性剂帮助酶分子均匀作用于纤维表面；考虑到腈纶纤维大分子中 相邻大分子间因氰基极性相反而互相吸引，同时大分子间还存在范德华力、氢键和偶 极键等很强的分子问作用力，这些相互作用力会从很大程度上影响到酶对腈纶纤维上 氰基的可及度。为此，本论文在酶处理前采用溶解度参数与聚内烯腈相似的有机溶剂 对腈纶纤维进行了预处理，通过溶胀作用消弱纤维大分子问作用力，增强酶改性效 果。 如前面所述，腈纶纤维传统的改性方法存在不同程度的环境污染、纤维强力损失严 。 一 重、耐久性差、成本高等缺陷。而腈水合酶作为生物催化剂，源于自然，又回归包一 然，顺应了“绿色生产”发展的需拳o 同时由于腈纶纤维致密的大分子结构限定了腈 水合酶对腈纶纤维的改性主要停留存表面的部分氰基，不会引起腈纶纤维的强办擐 失。相信随着生物技术的发展和人们对生态保护的日益重视，腈纶等合成纤维的生物 18 酶夔焦王艺将逐步取年甚传统的化甓改性杰法，。所以本论文的研究具有很好的应用前 景。 1 9 参考文献 1 陈石根，周润琦，雳学，上海：复旦大学出版社， 2 8 5 一- - 2 8 9 ，1 9 9 7 2 k o s h l a n dd e 。 ，4 d v e n z y m o l o g b 2 2 ：4 5 ，1 9 6 0 3 颜思旭等，鳓签! 纪动力学瘌? 与方弦，福建：厦门大学出版社，1 9 8 7 4 熊振平等，酵r 盈北京：化学工业出版社，1 9 8 9 5 郑寿亭，缴生物艨及舆勰山东：山东人民出版社，1 9 7 3 6 齐义鹏，身：维煮酵及真勰四川：四川人民出版社，1 9 8 0 7 周文龙，剪旌勿织乒的勰中国纺织出版社，北京，2 0 0 1 8 宋钧才，李汝勤，i f ：纾维和纺身犏的删讨原彦与皮器纱，中国纺大出版社，1 9 9 5 9 高绪珊，童俨，争鬯纤维及藐静宣绷，纺织工业出版社 1 0 m 利温，s b 塞洛，膨蝴功彪捌，纺织工业出版社 11 顾利霞，刘兆峰等，僦烂黝，中国石化出版社，1 9 9 7 【1 2 j p 一8 2 1 0 2 0 3 【13 j p - 8 2 2 3 0 0 7 【1 4 j p - 8 318 4 0 3 【1 5 】佐藤睦子，身：缍会，吉，4 0 ( 8 ) ，3 0 2 - 3 0 9 ，1 9 8 4 【l6 】m m t a u b e r ，a c a v a c o - p a u l o ，k h r o b r aa n dg m g u b i t z ，a p p l i e da n d e n v i r o n m e n t a l m i c r o b i o l o g y ，4 ：16 3 4 16 3 8 2 0 0 0 【17 】e z i ob a t t i s t e l ，m a r c om o r r a ，m a s s i m om a r i n e t t i ，a p p l i e ds u r f a c el7 7 ：3 2 - 4l ，2 0 01 2 0 第三章酶的活力测定方法及 活力影响因素分析 3 1 实验药品及仪器 表3 1 主要化学试剂 2 1 表3 2 主要仪器 仪器 制造厂家 超级恒温槽 7 5 2 型紫外光栅分光光度仪 z d 一2 型自动电位滴定仪 上海市实验仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 3 2 显色法测酶活 本论文中由a z ，t h r o b a c t e z ls p e c u li 0 1 提取得到的粗酶液( 下文中简称e c u l1 0 1 酶) 可有效水解脂肪腈生成羧酸和铵盐。可以通过测定铵离子的浓度来表征混合酶活 力，目前铵离子浓度的测定方法有奈氏试剂显色法3 、气、液相色谱法。1 、质f 磁共振 法b 1 等。其中奈氏显色法只能定性或半定量测量f n h ；+ ，气液干甘色谱法、质子磁共振法 虽可定量测量 n h ；+ ，但两者对于仪器试剂的要求都较高，不如显色法。测试简捷方 便。显色体系苯酚钠次氯酸钠与铵盐反应可生成蓝色络合物一1 ，利用分光光度法可准 确测定腈化合物水解生成的铵盐浓度，从而确定腈水合酶及酰胺酶的活力。本文重点 考察了显色法测铵离子浓度的各种影响因素，实验结果证明苯酚钠次氯酸钠显色法测 定铵离子浓度精确度高、稳定性也很好。 3 2 1 显色剂 苯酚( 分析纯) 与亚硝基铁氰化钾( 化学纯) 的复配液( 以f 简称a 液) 氢氧化钠( 分析纯) 与次氯酸钠( 化学纯) 的复配液( 以下简称b 液) 3 2 2 实验方法 用移液管吸取1 m l 一定浓度的硫酸铵溶液，移入装有3 5 m lb 液的试管中，并随 后迅速向该试管中加入3 5 m la 液，振荡摇匀，放入3 0 。c 恒温水浴中避光显色，显色 1 5 m i n 后取出，用7 5 2 型紫外光栅分光光度仪的1 c m 比色皿在6 2 5 n m 处测显色液的吸光 度。 2 2 3 2 3 显色剂的确定 a 液中的苯酚钠和b 液中的次氯酸钠可与铵离子反应，生成蓝色络合物，用分光 光度计在其最大吸收波长处测其吸光度值，在根据标准曲线( 下文中将涉及) 推算出 最终反应生成的铵离子浓度，从而计算出该酶的活力大小。 该显色体系的干扰离子有s ，、s o ：、h 二s 。b 液中的亚硝基铁氰化钾作为s 0 ：及金属 硫化物的掩蔽剂，可以屏蔽掉以上离子的干扰。 a 液中的氢氧化钠浓度为2 m ，可以确保显色液为强碱性溶液。 3 2 4 最大吸收波长的确定 因为苯酚钠次氯酸钠和铵离子形成的是蓝色络合物，所以选取5 8 0 、6 9 0 h m 波长范 围对显色液( 3 5 ma 液+ 3 5 n 1 1b 液* i m 水解反应液) 的吸光度( ) 进行测定；同时 测定在该波长范围内显色剂( 3 5 m la 液+ 3 5 m lb 液+ i m 去离子水) 的吸光度 ( 一) 。 1 5 1 2 捌 赢0 9 s _ 善0 6 o 3 o 5 6 05 8 06 0 06 2 06 4 06 6 0 6 8 0 7 0 0 吸收波长( n m ) 图3 1 铵盐与苯酚钠次氯酸钠络合形成的蓝色显色液的吸收曲线 由上图可以清楚的看到，显色液在6 2 5 n m 处有最大吸收，而显色剂a 、b 液本 身在5 8 0 、6 9 0 u r n 范围内吸光度很小，符合分光光度分析法“吸收最大，干 扰最小”的原则。 3 2 5 缓冲液p h 值对显色液吸光度的影响 每种酶都有其最适的工作温度与p h 值，在以显色法为酶的活力测定方法考察酶的 最适p h 值时，要确保酶工作液的p h 值对显色体系的吸光度没有干扰。为此，本实验 用4 、1 0 不同p h 值的磷酸氢二钾磷酸二氢钾缓冲液为溶剂配制七份浓度均为0 5 l i m 的 2 3 硫酸铵缓冲液( n h 。+ 浓度为l l l m ) ，各取h n l 然后与3 5 m b 液、3 5 m l a 液住3 0 。c 显色 1 5 r a i n ，各显色液的最终结果如图3 2 所示，各显色液的最终吸光度值基本一致，即酶 反应液的p h 值对最终显色液吸光度没有显著影响。 趔0 8 箩0 7 餐0 6 0 5 0 4 3456789l o1 1 酶反应液l j i 值 图3 2 酶反应液p l 值对龆色液吸光度的影响 从理论上分析我们也可以得到相同的结论，显色剂b 液中氧氧化钠浓度为2 m ，即 整个显色体系中氢氧化钠浓度应为0 8 7 5 m ，而一般酶的工作液的最适p h 值均为弱酸或 弱碱。所以l m l 反应液中5 0 n 】 l i 的磷酸盐缓冲液对最终显色体系的p h 值影响不大。所 以可以用该显色法筛选混合酶的最适p h 值。 3 2 6 显色温度和时问对显色液吸光度的影响 通过实验我们发现，铵离子溶液与显色剂的反应在1 9 需3 0 r a i n 达到平衡，而在 2 4 则需2 0 m i n ，3 0 时1 5 m i n 即可达到显色平衡。而且显色形成的蓝色络合物溶液可 在室温下稳定存放2 4 小时之久基本不变色，说明该显色法具 有较高的稳定性。为提高实验效率，本实验采用3 0 显色1 5 m i l l 。 3 2 7 苯酚钠次氯酸钠显色法硫酸铵标准曲线 本实验用p h 7 0 的去离子水配制一系列浓度的硫酸铵溶液作为标准溶液，各取 l m l 与3 5 m lb 液、3 5 m la 液在3 0 显色1 5 m i i i ，在其最大吸收波长6 2 5 n m 处分别测 其吸光度，并作图3 2 如下。其线性方程为y = 6 0 6 9 7 x + 7 8 1 e 一4 ，r - - - - o 9 9 9 9 4 ， s d = o 0 0 2 8 6 ，p o 0 0 0 1 。由图3 3 可见，该标准曲线的线性相当好，灵敏度很高，可 以用于e c u l1 0 1 酶活力的测定。 2 4 迥0 8 型 一2 1 0 6 菩0 4 o 2 o上一! 二二二_ 二_ _ i 一 图3 3 显色法测铵根离子浓度标准曲线 3 2 8 结论 1 实验证明，可用苯酚钠次氯酸钠显色法测定酶催化腈化合物水解生成的铵离子浓 度，从而确定e c u l i 0 1 酶活力，该方法具有很好的线性和稳定性。 2 确定铵离子与显色剂形成的蓝色络合物溶液测定用波长为6 2 5 n m ，显色条件为3 0 。c 下显色1 5 m i i i 。 3 因为e c u l l 0 1 酶与底物反应体系的缓冲液p h 值对最终显色液的吸光度影响很小， 可以用该显色法评价e c u l1 0 1 酶的最适作用p h 值。 3 3a r t h r o b a c t e rs p e o u i10 1 所产e o u i10 1 酶的诱导特性和 各组分活力 3 3 1 诱导剂的筛选 许多微生物虽然具有目的酶的结构基因，但是如果培养基中不含该酶所催化反应 的底物，结构基因将处于无活性状态，即酶的合成受到阻遏。一旦加入底物，结构基 因将被激活，酶的合成开始，这种酶成为“诱导酶”。诱导剂一般是该酶所催化反应 的底物。目前发现的多数腈水解酶为诱导酶，只有少数腈水解酶为组成酶。为了考察 a 1 ，t h r o b a c t e z s p , e c u l1 0 1 产e c u l l 0 1 酶的诱导特性，本实验选用几种脂肪腈化合物 及芳香腈化合物、酰胺化合物作为诱导剂，诱导剂用量为0 4 ( v v ) ，以考察其对 a 1 ，t h r o b a c t e l 印e c u l l 0 1 产e c u l l 0 1 酶活力的影响，结果如图3 4 所厅：。 实验结果表明，a 1 t h z o b a c t e rs p e c u i1 0 1 所产e c u l1 0 1 酶为诱导酶，当基础培 养基中不添加任何诱导剂时，e c u l l 0 1 酶对丙腈水解几乎没有催化能力。比较发现， 脂肪腈特别是乙腈可以显著提高e c l q l 0 1 酶的活力。不饱和脂肪腈( 丙烯腈) 、酰胺 类化合物做诱导剂对e c i l l1 0 1 酶活力的提高促进作用很小。这一结论与a s a n o 的观点 有相通之处旧一1 。 2 5 p 1 0 0 h 衄 箸8 0 伽( 皿 誊 6 0 也 墼4 0 o =2 0 u 叫 0 l 空白乙腈丙腈 一一囫一囫一囫一 苯甲腈丙烯腈丙烯酰胺己内酰胺 诱导剂种类 图3 4 诱导剂对e c u l l 0 1 酶活力的影响 3 3 2e c u l l 0 1 酶的活力分析 一般认为，脂肪腈做诱导剂得到的酶溶液中含有腈水合酶和酰胺酶两种，他们共 同作用可催化脂肪腈水解；而芳香腈做诱导剂得到的酶液中主要含腈水解酶，主要催 化芳香腈水解。本试验目的是利用酶催化聚丙烯腈纤维上的氰基水解成吸湿性较强的 羧基或酰胺基，因而采用乙腈做诱导剂，从4 z ，t h l ，o b a e t e l ，9 p e ( 、u l1 0 l 细胞内提取得 到的e c u l1 0 1 酶中应该含有酰胺酶和腈水合酶两种酶，正是任这两种酶的共同作用 下，脂肪腈水解生成相应的羧酸和铵盐。 为了进一步了解两种酶各自的活力情况，本文选用了一系列不同的腈化合物做底 物进行活力分析。用乙腈和丙腈作为饱和脂肪腈的代表化合物，丙烯腈作为不饱和脂 肪腈的代表化合物，苯甲腈代表芳香腈类，而丙烯酰胺代表酰胺类化合物。 取0 1 m l 适当稀释的酶液，加入p h 为7 0 的1 0 0 n l i 磷酸钾缓冲液2 6 1 1 1 ，在4 5 水浴中预热2 m i n ，迅速加入0 3 m l 浓度为0 1 m 的底物( 腈化合物或酰胺化合物) 溶 液，振荡摇匀，并开始计时，在4 5 恒温反应1 5 m i n 后立即取出。用移液管迅速吸取 h n l 反应液，移入装有3 5 mb 液的试管中，并随后迅速向该试管中加入3 5 1 1 1 1a 液， 振荡摇匀，放入3 0 恒温水浴巾显色并开始计时，显色1 5 1 n i n 后取出，用分光光度计 在6 2 5 n m 处测显色液的吸光度值。 腈水合酶活力定义：在适当的条件下，每分钟催化腈化合物水解生成l i j 4 1 1 0 相应 的酰胺化合物的酶量为一个活力单位。 酰胺酶活力定义：在实验条件下，每分钟催化酰胺化合物水解生成1 n 0 1 铵离子 的酶量为一个活力单位。 2 6 活力测定结果如图3 5 所示。 0 0 3 9 丙腈乙腈丙烯腈丙烯酰胺苯甲腈 底物( 2 0 r a m ) 图3 5 腈水合酶及酰胺酶的底物特异性分析 由图3 5 分析可得到以下三个结论： ( 1 ) 相同摩尔浓度的丙烯腈和丙烯酰胺在相同的酶催化反应体系卜，最终水解生成的 铵离子的浓度相差1 0 倍之多。两种酶的催化途径如式3 1 所示f 1 ： ：n 竺12 a m i d a s e c h c t + - - c n c h = c h - - - c o n hc h 3 - - - c h - - - - c o o h + n h l1“12 _ c31 式3 1腈水合酶酰胺酶催化丙腈水解 由此可以看出，丙烯腈的水解速率取决于腈水合酶的催化能力，因为腈水合酶催 化丙烯腈水解生成丙烯酰胺的速率远远低于酰胺酶催化相同摩尔浓度的丙烯酰胺的速 率，所以在1 5 分钟的水解时间里，2 0 n n 的丙烯酰胺在酰胺酶的催化作用下完全水解生 成2 0m l 小! 的丙烯酸和氨：而2 0 m m 的丙烯腈在腈水合酶的催化作用下并未完全水解生成 2 0 1 1 3 1 的丙烯酰胺，只有大约2 l i 州的丙烯腈在腈水合酶和酰胺酶的催化作j e h 下进一步水 解生成2 n n 的丙烯酸和氨。实验结果说明，相同的催化条件下( 温度、 ) h 、底物浓 度) ，酰胺酶的活力明显高于腈水合酶的活力。 ( 2 ) 腈水合酶对芳香腈的水解没有催化能力，腈水合酶适于催化水解脂肪腈。a l i s o l 3 j 哼3 认为细菌产酶的类型与诱导剂的种类有关，用脂肪腈做诱导剂，菌体一般合成腈 水合酶酰胺酶，而用芳香腈如苯腈做诱导剂时，菌体合成的主要是腈水解酶。 y a s u h i s aa s a n o 等学者n 们认为，腈水合酶酰胺酶主要催化脂肪腈的水解，而腈水解酶 催化芳香腈的水解。本文的实验结果与以上观点相吻合，即本文所用， ，t & v l m c ，盯印 e c u l l 0 1 在乙腈的诱导下合成的腈水合酶主要催化水解脂肪腈，对芳香腈的水解没有催 化活力；酰胺酶可催化脂肪族酰胺化合物水解生成相应的竣酸。这与本论文的目的 “催化聚丙烯腈纤维上的氰基水解生成极性更强的酰胺基或羧罐”相符，所以 a 1 1 t h r o b a c t e z s p e c u l l 0 1 所产e c u l1 0 1 酶适用于腈纶纤维的表向改性。 2 7 一蚕_ | 一： 一 一暑 一 一昌 乙 l n 翠型装擎 ( 3 ) 由于4 r t h r o b a f g e ts p e c u l l 0 1 合成的酰胺酶的活力大于腈水合酶的活力，我 f | j 可以丙腈最终水解生成的铵离子的浓度来确定腈水合酶的活力。活力计算公式如 下： 酶活力：咝堂壁笪l o o o 3 15 3 0 2 0 6 0 6 9 7 腈水合酶和酰胺酶活力的计算公式相同，唯一区别在于两者测活所用底物不同。 本文所用腈水合酶活力为1 6 9 。、2 1 0 u m l ，酰胺酶活力在4 8 0 、5 0 0 u m l 。 3 4 影响混合酶活力的因素分析 由于我们的实验目的是用培养得到的e ( 、 1 11 0 l 酶水解腈纶上的氰基生成亲水性更 强的羧基，所以可以根据最终的水解液中铵离子浓度表征e c t l l1 0 1 酶的水解活力。由 于各种酶在特定的条件下部有其最适的作用温度、p h 值，同时酶活力还受底物浓度、 酶浓度、缓冲液类型、离子强度、金属离子、激活剂或抑制刹等因素的影响。本文就 以上因素对e c u l1 0 1 酶活力的影响分别进行了分析。 3 4 1 温度对e c u l l 0 1 酶活力的影响 3 4 1 1 酶催化反应的“最适温度” 温度对酶的作用具有双重影响，一方面与一般的化学反应一样，在一定范围内升 高温度可以提高酶的催化活性：另一方面，由于酶是一种生物蛋白，温度过高可加速 酶蛋白的变性，导致酶得失活。“1 e3 通常所谓的“最适温度”就是这两种效应的综合 结果。 温度对酶反应速度的影响可根据e y r i n g 等的绝对反应速度理论，也称为过渡态理 论来讨论。该理论认为，在反应系统中，并不是所有的分子都能进行反应，它们需要 获得一定的能量转入瞬时的活化状态，即成为活化分子以后才能反应生成产物，这种 从“基态”到“活化态”所需的能量称为“活化能”。加速化学反应有两种途径： 增加活化分子的数目；降低反应的活化能。催化剂所以能加速反应是因为它们能通 过形成活化能较低的中间络合物，降低反应总的活化能。酶促反应也是这样，如果酶 对热稳定，那么，酶促反应在温度升高时，将同时受到反应物分子的动能随温度升高 而增加和酶催化促进反应活化能降低的双重影响。对于催化剂促进的反应来说，它们 的温度系数一般小于未催化反应，说明催化剂降低活化能可能是加速反应更重要的因 素1 引。 本义以1 0 0 1 1p h ：7 0 的磷酸氢二钾磷酸：氢舒p 为缓冲体系，以2 0 t m 的丙腈为底 2 8 物，分别在3 0 。c 、3 5 。c 、4 0 。c 、4 5 。c 、5 0 。c 、5 5 。c 温度条件下反应1 5 分钟，以显色法 测定e c u l l 0 1 酶的活力。结果如图3 6 所示。 1 0 0 8 0 芟 6 0 善4 0 血 谧2 0 o z b3 u3 b4 04 55 0b b6 u 酶反应温度( ) 图3 6e c u l l o l 酶反应的“最适温度 图3 6 显示酶的反应温度一反应速度曲线为“钟罩型”，在较低的温度范围内， 酶反应速度随温度的升高而增大，但超过4 5 。c 后，反应速度反而下降：所以4 5 。c 为混 合酶的“最适温度”。产生钟罩形的原因就是由于一方面温度加速了酶反应的进行， 另一方面温度加速了酶蛋白变性。 温度的这种综合影响，即“最适温度”与时间有密切关系，不同的反应时间测得 的最适温度往往不同。本文在3 0 - , 5 0 。c 的一系列温度条件下，分别测定了5 、1 0 、 1 5 、2 0 、2 5 、3 0 分钟时e c u l l 0 1 酶的活力变化，以时间为横坐标，显色液吸光度为纵 坐标做图3 7 。 硎0 5 社双0 4 米0 3 警o 2 o 1 o 。- 。，。_ 。_ 。一 ! 十3 0 斗3 5 j 十4 0 ! 十4 5 j + 5 0 1 ，一 051 0152 02 53 03 5 反应时间( m i n ) 图3 7 酶反应最适温度与时间的关系 由图3 7 可以看出，在反应初期，即反应5 分钟时，5 0 条件下丙腈的水解速率 最大；随反应时间的延长到1 5 分钟时，4 5 。c 条件下水解速率最大，这一较高的反应速 率一直延续到反应3 0 分钟时。若继续延长反应时问，相信较低反应温度如3 0 ”c 或3 5 2 9 条件下e c u l l 0 1 酶催化丙腈水解的程度超越4 5 。c 。这是由于温度促使酶蛋白变性是 随时间而累加的。在反应的最初阶段，酶蛋白变性常来不及表现，因此，反应的初速 度随温度升高而增大：但是，随反应时间延长，酶蛋白变性因素逐渐突出，反应速度 随温度升高的效应逐渐为酶蛋白变性效应所“抵消”，故而在不同的反应时间内测得 的“最适温度”也不同，随反应时问延长，酶反应“最适温度”逐渐下降。 3 4 1 2e c u l l 0 1 酶的热稳定性 化学反应( 包括催化反应在内) 的活化能为8 3 6 81 6 7 3 6 0 j 1 1 1 0 1 左右，大多为 5 0 2 0 8 - 1 0 4 6 0 0 j m o l ；而蛋白质变性的活化能则高得多，通常达1 6 7 3 6 0 4 1 8 4 0 0 j m o l ，这主要是由于变性伴随熵值显著升高的缘故，正因为如此，酶存溶液中很容易 随温度升高而急剧失效，失效的温度系数从1 0 到几百引。 为测定e c u l1 0 1 酶的热稳定性，本文将酶液分别在2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 条件下恒温2 4 小时，然后在4 5 测定酶的活性，结果如图3 8 所示。 r 烘 悲 省譬 瓤 星 誊 o o ( ) o 0 o 酶保温温度( ) 图3 8 酶稳定性一温度曲线 图3 8 告诉我们，e c u l l 0 1 酶在2 5 。c 、3 0 。c 条件下恒温2 4 小时可保持活力为原 来的9 0 左右，随保温温度提高，e c u l l 0 1 酶的活力下降迅速，保温2 4 小时后，4 0 的e c u l l 0 1 酶残存活力为最初的6 5 ：5 0 的e c u l l ( ) l 酶残存活力则仅为最初的5 。 即e c u l1 0 1 酶在2 5 、4 0 。c 的热稳定性较好，恒温2 4 小时后活力仍可保持最初的5 0 以 上。 e c u l1 0 1 酶处理腈纶纤维时，因腈纶纤维为疏水性纤维，而酶溶于水，酶催化腈纶 纤维上氰基水解为非均相反应，处理所需时间相对较长，不能盲目选用腈水合酶活力 测定时的“最适温度”来处理纤维。筛选腈纶纤维的酶处理条件时，应综合考虑反应 时间和温度的影响。 3 0 考虑到高温短时间内腈水解剧烈，而低温长时间酶活力保持较高，为厂综合评价 腈化合物在不同温度的酶溶液中长时间水解程度，本文考察j 9 小时内丙腈水解程度 随酶处理温度一时间的变化情况。结果如3 9 所示，纵坐标为显色法测丙腈水解牛成的 铵离子浓度所得吸光度值，横坐标为酶处理时问。 趔l 5 蜂1 2 二纠 ，h 餐o 9 0 6 o 3 o 。- 。1 。_ _ 。- 。_ 一 i 十2 5 j i + 3 0 十3 5 i + 4 0 ： + 4 5 123456789 酶处理时问( 小时) 图3 9 丙腈水解程度随酶处理温度一时问的变化 在4 5 。c 条件下反应最初的l 、4 小时内丙腈水解最剧烈，5 小时后4 5 。c 丙腈水解程 度低于4 0 。c 丙腈水解程度，9 小时后3 5 条件下丙腈水解程度有超越4 5 。c 水解程度的 趋势。这一规律再次验证了“酶的最适作用温度随时间延长而下降”的结论。考虑到 酶催化反应的初始速率和热稳定性，腈纶纤维或织物的酶处理温度宜选用3 ( ) 、4 0 。 3 4 2p h 值对e c u l l 0 1 酶活力的影响 p h 值对酶活性的影响也极为显著。通常，酶只有在一定的i ) h 值范围内才表现出活 性，在特定条件下都有其“最适1 ) h 值”。p h 值可以通过各种因素影响酶的活性，这是 因为在酶的活性部位具有很多的酸性或碱性氨基酸的侧链基团 1 2 ，1 4 ，它们可随着 p h 的变化而发生解离并处于不同的正负高价离子或等电荷状态，它们将直接影响到酶 的活化和酶与底物的亲和力，而酶要表现活性，它的活性部位和结合部位各有关基团 都必须具有一定的解离形式，才最适合于酶与底物的作用，表现出最高的活性。其中 任何一种基团的解离状态发生了变化就将使酶从活性状态转入无活性状态：反之亦 然。 1 4 同时，p h 还可能影响底物的解离状态和影响反应系统中其他组份的解离状 态，对酶促反应产生影响。另外，因为酶的化学本质是蛋白质，在过酸或过碱的条件 下可以使酶的空间结构破坏，使酶的蛋白质变性，引起酶的活性丧失，因而1 ) h 值对酶 的稳定性的影响不可忽视 1 5 。 31 如果将处于活性解离状态的酶概括为e h ，而由活性状态转入无活性状态时，其酸 性解离形式概括为e h 2 + ，碱性解离形式概括为e 。根据上述分析，酸碱对酶活性的影 响实际上和抑制剂的作用非常类似，这就是说，p 1 1 对酶反应动力学的影响可以简化为 酸、碱的抑制影响，如式3 2 所示： k a k h e h + h 与寻士e 瞅e hi 釜e + h 式3 2p h 对酶反应动力学的影响 3 4 2 1e c u l1 0 1 酶的最适作用p h 值 本文依次选用柠檬酸钠柠檬酸、磷酸氢二钾磷酸二氢钾、硼酸硼酸钠、碳酸钠 调节反应体系p h 值为4 6 、6 、8 、8 、9 、9 5 、1 0 5 。在4 5 。c 的反应温度下、4 o 、9 0 的 p h 范围内、测定e c u l l 0 1 酶的相对活力，并作图3 1 0 。 1 0 0 o8 0 啦 茗6 0 吠 矗4 0 呱 链2 0 o 3 4 5 6 789 1 0 酶作用p h 值 图3 1 0 酶活力- p h 曲线 由图3 1 0 可见e c u l1 0 1 酶在p h6 6 、7 6 范围内活力保持在9 0 以上，当1 ) h 值为 7 o 时活力最高，而p h 小于4 或大于9 时酶活力则不足3 0 ，这是由于强酸强碱导致 酶蛋白变性，活力严重受损。分析结果认为7 0 为e c u l1 0 1 酶的最适p h 值。 3 4 2 2 缓冲体系类型对e c u i1 0 1 酶活力的影响 酶的活力与缓冲液的类型也有关系，本论文选用生物酶活力分析时较为常用的三 种缓冲体系：磷酸氢二钠一柠檬酸、磷酸二氢钾一硼砂、磷酸- 二氢钾一磷酸氢二钾，三种 缓冲液均为0 1 m ，p h 为7 0 。在相同的活力测试条件下，酶在三种缓冲液中的相对活力 如图3 1 l 所示。 3 2 实验数据显示e c u l l 0 1 酶存磷酸二氢钾磷酸氢钾缓冲体系中活力高于其他两种 缓冲液，不过酶在三种缓冲体系中活力相差不是很大。我们最终选择磷酸氢二钾磷酸 二氢钾作为e c u l1 0 1 酶的最适缓冲体系。 1 0 0 r7 5 恤 莨5 0 丘 * 溢2 5 o ! 爱“董 誓，隔 ；园磷酸氛二钠一； l ；二j ： 幺 。 柠檬酸： 王 蠢：； l 园磷酸二氢钾一 乓： 4 4 4 硼砂 骅 # o o ：， 矗“：一 | 圜磷酸二氧钾一i 形o ：j 力： 磷酸氢二钾| c 7 3 4 2 3 缓冲液摩尔浓度对e c u l l 0 1 酶活力的影响 e c u l l 0 1 酶的活力与缓冲液摩尔浓度也有关系，摩尔浓度越高，缓冲液能力越强： 但摩尔浓度的提高导致酶溶液中离子强度增大，对酶的活力可能会产生一定影响。本 文分别以0 0 2 5 m 、0 0 5 m 、0 1 m 的磷酸氢二钾一磷酸二氢钾为缓冲液，测定酶的相对活 力，结果如图3 1 2 所示。 结果显示，随缓冲液摩尔浓度的增大，酶活力提高，0 1 m 的磷酸盐缓冲液最适于 作为e c u l l 0 1 酶的缓冲体系。 1 0 0 0 0 r 虹7 5 0 0 1 7 盎5 0 0 0 * 餐2 5 0 0 谶 0 0 0 囝0 ( j 2 5 m 豳0 0 5 m ! 园0 1 m ! 图3 1 2 缓冲液摩尔浓度对混合酶活力的影