（纺织工程专业论文）mtg催化羊毛固定化溶菌酶及其抗菌整理研究.pdf

摘要 摘要 溶菌酶是种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，其广泛分布于动植物、微生物中，是 一种抗菌性好、安全无毒的绿色抗菌剂，目前已广泛应用于食品、医药、生物工程等行业， 在纺织行业中也被引起重视，比如通过将其固定在纺织品表面以获得抗菌效果。 目前，国内外关于溶菌酶的固定化技术主要是通过吸附法和化学交联法( 戊二醛) 进行。 本文利用一种新型的生物酶催化剂微生物谷氨酰胺转氨酶( m i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s e ，简称 m t g ) 催化溶菌酶在羊毛织物上的固定化。这既是一种全新的生态法抗菌整理技术，同时也为 羊毛织物的生物法功能化改性提供新的研究思路。 本文首先研究了溶菌酶作为m t g 催化底物的可行性，在此基础上探讨了影响溶菌酶在 羊毛织物上的固定化因素，并进一步对固定化溶菌酶的酶学性质进行了详细的研究，最后对 固载溶菌酶的羊毛织物进行了抗菌性能测试。 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明溶菌酶可以作为m t g 的催化底物；羊毛织物经过预处理 后利用m t g 可以实现溶菌酶的固定化。其中，羊毛织物经过高锰酸钾预处理可获得较好的 固定化效果。优化的固定化条件为：溶菌酶用量2 9 l ，固定化p h 值7 0 ，固定化时间8 h ， m t g 用量2 0 u g 。 游离酶和固定化溶菌酶酶学性质研究结果表明：固定化溶菌酶比游离酶具有更宽范围的 p h 稳定性o h 8 0 1 1 o ) 和温度稳定性( 4 0 7 0 c ) ；与物理吸附法相比，m t g 催化法可赋予固载 溶菌酶的羊毛织物更好的耐水洗性和操作稳定性；在存储稳定性方面，固定化溶菌酶的低温 ( 4 ) 干储藏稳定性良好，3 0 天的酶活维持率在8 0 以上。 固定化溶菌酶的羊毛织物抗菌测试结果表明：m t g 催化法固定化溶菌酶的羊毛织物对革 兰氏阳性菌( 金黄色葡萄球菌) 的抑菌率为7 3 2 3 ，抗菌效果良好，但对革兰氏阴性菌( 大肠杆 菌) 并无抗菌效果；吸附法固定化溶菌酶的羊毛织物在3 次水洗后失去抗菌效果，在5 次水洗 后对金黄色葡萄球菌的抑菌率仅为5 9 5 ，而m t g 催化法固定化溶菌酶的羊毛织物在5 次水 洗后抑菌率为2 3 7 9 ，抗菌效果耐洗涤性优于吸附法。 关键词：溶菌酶；微生物谷氨酰胺转氨酶；固定化；羊毛：酶学性质：抗菌 a b s t r a e t a b s t r a c t l y s o z y m ei sas p e c i a l i z e de l l z y l i l ef o rd i s r u p t i o no fm i c r o b i a lc e l l sw h i c hw i d e l ye x i s t si nt h e a n i m a l s ，p l a n t sa n dm i c r o o r g a n i s m sw i mm a n ya d v a n t a g e s ， s u c ha s p e r f e c t a n t i b a c t e r i a l p e r f o r m a n c e , s a f ea n dn o n - t o x i c a sa l le c o l o g i c a la n t i m i c r o b i a la g e n t ，l y s o z y m eh a sb e e nw i d e l y a p p l i e di nt h ef o o d ，p h a r m a c e u t i c a l ，b i o t e c h n o l o g ya n do t h e ri n d u s t r i e sa n da l r e a d yb e e nb r o u g h tt o t h ef o r e f r o n ti nt h et e x t i l ei n d u s t r y f o ri n s t a n c e ，t e x t i l e sc a nb ep r o v i d e dw i t ha n t i b a c t e r i a l p e r f o r m a n c ew h e nl y s o z y m ei si m m o b i l i z e do nt h e m a tp r e s e n t , a d s o r p t i o nt e c h n i q u eo rc r o s s l i n k e r ( g l u t a r i cd i a l d e h y d e ) i sr e s e a r c h e di nl y s o z y m e i m m o b i l i z a t i o nm a i n l yb o t ha th o m ea n da b r o a d i nt h i sp a p e r , m i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s e 邮) ， an e wb i o e a t a l y s t s ，i se m p l o y e dt oi m m o b i l i z el y s o z y m eo nt h ew o o lf a b r i c i ti sn o to n l ya b r a n d - n e wa n t i b a c t e r i a lt e c h n i q u e ，b u ta l s oan e wr e s e a r c hi d e ai nt h ew o o lm o d i f i c a t i o n b a s e do nt h ef e a s i b i l i t yt h a tm t gi sa b l et oc a t a l y z ec r o s s l i n k i n go fl y s o z y m e ，t h i sp a p e r o p t i m i z e st h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n sa n dr e s e a r c h e st h ec h a r a c t e r i z a t i o no fi m m o b i l i z e d l y s o z y m e f i n a l l y , t h ea n t i b a c t e r i a le f f e c to ft h ew o o lf a b r i ci m m o b i l i z i n gl y s o z y m ew a ss t u d i e d t h er e s u l ts t u d i e db ys d s p a g ed e m o n s t r a t e dt h a tm t gi sa b l et oc a t a l y z ec r o s s l i n k i n go f l y s o z y m ef o rs t i le l y s o z y m ec a nb ei m m o b i l i z e do nt h ew o o lp r e t r e a t e db yc h e m i c a la g e n t s , p a r t i c u l a r l yp o t a s s i u mp e r m a n g a n a t e r n l ei m m o b i l i z i n gc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：2 9 ll y s o z y r n e , p hv a l u e7 0 ，i m m o b i l i z i n gf o r8 hw i mt h em t g2 0 u g t h er e s u l to ft h ec h a r a c t e r i z a t i o no fl y s o z y m ei n d i c a t e st h a tt h ei m m o b i l i z e dl y s o z y m eh a s b e r e rp ha n dt e m p e r a t u r es t a b i l i t y m t g - c a t a l y z e dl y s o z y m ei m m o b i l i z e do nt h ew o o lh a sb e r e r w a s h i n ga n do p e r a t i o n a ls t a b i l i t yt h a nt h a ti m m o b i l i z e db ya d s o r p t i o n t h ei m m o b i l i z e di y s o z y r n e c a t a l y z e db ym t g r e t a i n sm o r et h a n8 0 o fi t so r i g i n a la c t i v i t yw h e ni ti ss t o r e di nt h ea r y c o n d i t i o na f t e r3 0d a y s ，n l ea n t i b a c t e r i a lf i n i s h i n ge f f e c to ft h ew o o lf a b r i ci m m o b i l i z i n gl y s o z y m es h o w st h a tt h e i n h i b i t i o np e r c e n t a g et os t a p h y l o c o c c u sa u r e u si s 7 3 2 3 ，h o w e v e r , t h e r ei sn oi n h i b i t i o nt o e s c h e r i c h i ac o b t h ea n t i b a c t e r i a le f f e c ta f t e rs e v e r a lw a s h i n g so ft h ei m m o b i l i z e dl y s o z y r n e c a t a l y z e db ym t g i sb e r e rt h a na d s o r p t i o ni m m o b i l i z a t i o n k e y w o r d s ：l y s o z y m e ；m t g ；i m m o b i l i z a t i o n ；w o o l ；c h a r a c t e r i z a t i o n s ；a n t i b a c t e r i a l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是泰人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：三董蟹、 日 期：迦璺：厶 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：二窆丝) 导师签名： 日 期： 第一章绪论 1 1 羊毛织物抗茵整理概述 第一章绪论 纺织品的抗菌整理是指利用抗菌防臭剂或抑菌剂处理织物( 天然纤维、化学纤维以及混纺 织物) ，使其获得抗菌、防霉、防臭等功能，从而保持纺织品的清洁卫生。抗菌整理的目的一 方面是为了防止织物被微生物污染，另一方面是为了防止疾病传播，保证人体健康，降低交 叉感染率l i 捌。 羊毛是人类最早利用的天然纤维之一，作为纺织工业的重要原料，它具有手感好、保暖 性佳、穿着舒适等诸多优点【3 1 。但是羊毛纤维主要由角蛋白构成，它是微生物的良好营养物 质，在一定的温、湿度条件下，微生物特别是细菌、霉菌等极易繁殖，造成织物降解，既影 响羊毛织物本身的使用寿命和品质，又严重损害消费者的健康 4 1 。因此，对羊毛织物进行适 当的抗菌整理，从而避免微生物的生长和传播就显得极为重要。 如何对羊毛织物进行抗菌整理，并使其具有安全可靠而且持久的抗菌效果是纺织行业十 分关心和亟需解决的问题。长期以来，国内外学者广泛致力于研究羊毛织物的抗菌整理技术， 但直到现在，羊毛织物的抗菌功能多是采用化学方法进行后整理加工得到。目前，用于羊毛 抗菌整理的抗菌剂主要有无机、有机和天然三大类【5 】 1 、无机类 无机类抗菌剂主要是金属离子以及一些光催化型抗菌剂【5 】。 ( 1 ) 金属及金属盐 很多金属物质如银、铜、锌以及它们的化合物都可以作为抗菌剂，它们通过与细菌中的 细胞蛋白结合，使细菌变性或失活，从而达到抗菌目的。目前，市场上已经商品化的大多数 抗菌剂是银系抗菌剂。关于该类抗菌剂的抗菌机理目前主要有接触抗菌和光催化抗菌两种， 其中被广泛认可的是接触抗茵机理f 6 。8 】。接触抗菌理论认为：l 当a g + 与细菌接触后，可以通过 库仑引力牢固地吸附在细菌带负电荷的细胞膜上，并进一步穿透细胞壁进入细菌内部，破坏 细胞合成酶的活性，使细胞丧失分裂增殖能力而死亡，而且a 矿会从死菌体中游离出来继续杀 菌，抗菌效果较为持久f s 一。 但是，银系抗菌剂也存在着问题，由于a g + 是强氧化剂，在空气中久置后颜色会由浅棕色 向棕色、深棕色、褐色变化，容易造成整理后织物色泽变化；另外，a r 对真菌和霉菌的作用 效果欠佳，使其应用受到限制。 ( 2 ) 光催化型 光催化型抗菌剂均为半导体化合物，但真正能起到杀菌、除臭等功能的半导体光催化剂 却不多，目前研究较多的是锐钛型二氧化钛光催化抗菌材料【5 , 1 0 】。虽然光催化抗菌剂具有消毒 效果快、杀菌能力强、耐久性好、无二次污染、稳定性较好等特点，但它必须在光照条件下 江南大学硕士学位论文 起作用，这极大地限制了使用范围。 2 、有机类 有机类多为传统型抗菌剂，主要包括有机酸、酚、醇等【l l 】。 ( 1 ) 季铵盐类 季铵盐抗菌剂系脂肪族类季铵盐或聚烷氧基三烷基氯化铵。通常铵盐类的阳离子化合物 具有杀菌能力，尤其是含有1 2 1 8 个碳原子的季铵盐类，常作为纤维的消毒剂和杀菌剂【l 5 】。季 铵盐化合物是最常用的抗菌剂，但由于其与纤维的结合力差，常与反应性树脂并用，以提高 其耐久性【1 2 1 。 ( 2 ) 有机硅季铵盐类 有机硅季铵盐系列抗菌整理剂是一类新型的阳离子表面活性剂，其分子结构可变性强， 性能优良，合成简单，应用前景广阔【1 1 其中最著名的当属美国道康宁公司的d c 5 7 0 0 ，具有 良好的耐久性、安全性及广谱抗菌性。 ( 3 ) 胍类 在医药领域应用的双胍类消毒剂中，选择在水中溶解度小的而对纤维吸附能力高的品种， 就可用于作为抗菌纤维的抗菌剂，比如盐酸聚六甲撑基双胍( p h m b ) ，对革兰氏阴性菌、革兰 氏阳性菌、真菌酵母菌都有光谱抗菌作用【1 3 】，目前已经进入市场运作，效果良好。 ( 4 ) 卤胺化合物 卤胺化合物抗菌剂是一种新型的抗菌剂，是指含有n x 键( x 可以为c l 或b r ) 的化合物，它 可以由含胺、酰胺或者酰亚胺基团的化合物经氧化剂如次卤酸盐作用后得到 1 4 1 。目前我国开 发研究还比较少，距工业化生产应用更远。 虽然有机盐类抗菌剂具有杀菌力强、效果持久、来源丰富，在使用量较少的情况下就可 以达到很好抗菌效果等优点，但是有机盐类抗菌剂一般毒性较大，在诸如持效性、耐热性、 使用安全性和细菌耐药性方面都存在固有缺陷，而且许多抗菌整理剂如芳香族卤化物等都存 在生态问题，整理加工过程中容易对环境造成危害。 3 、天然类 ( 1 ) 甲壳素及壳聚糖 天然类抗菌剂主要包括甲壳素及其衍生物等【”】。其中壳聚糖因含有游离氨基，能结合酸 分子，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有良好的抗菌性、吸附性和生物相容性，而且容易 被修饰和改性，易加工成纤维、薄膜、颗粒等各种形态，使之能适应各种环境应用的需要， 目前已经作为织物整理剂，在织物抗菌整理方面具有良好的应用前景 1 6 , 1 7 】。 ( 2 ) 植物类提取物 这类提取物通常是液体，主要使用微胶囊技术对纺织品进行整理。该技术首先将提取物 封入微胶囊，再用树脂将其固着在织物上。目前，植物类提取物使用较多的是桧柏油，其抗 菌机理是它的分子结构上两个可供配位络合的氧原子与微生物体内蛋白质作用，从而达到抗 菌目的。 ( 3 ) 昆虫抗菌性蛋白质 2 第一章绪论 昆虫适应环境能力很强，对细菌霉菌和病毒等微生物的侵袭有很强的抵抗力，因此，可 以从它们体内分离出抗菌性蛋白质并设法用于纺织品上，这是目前抗菌研究的新方向【l 犯0 1 。 随着人们环保意识的提高，目前采用天然抗菌剂对织物进行抗菌整理加工的研究越来越 多，在生物技术突飞猛进的2 l 世纪，针对天然抗菌整理的研究将是未来抗菌整理的一个主要 研究方向。 1 2 溶茵酶 1 9 0 7 年，尼科耳( n i c o l l e ) 发表了枯草芽孢杆菌s u b t i l i s ) 溶解因子的报告【2 l 】，1 9 2 2 年，英 国细菌学家弗莱b 刃( f l e m i n g ) 发现人的鼻涕、唾液、眼泪也有强力的溶菌活性，并把其溶菌作 用因子命名为溶菌酶【2 2 1 。从此，国内外学者开始了对于溶菌酶的研究。近几年来，根据溶菌 酶的溶菌特性，人们已经将其广泛应用于医疗、食品防腐、畜牧及生物工程中，该物质具有 较高的应用和研究价值。 1 2 1 溶菌酶及其来源 溶菌酶( l y s o z y m e ，e c 3 2 j j 7 ) ，又称为n 乙酰胞壁质聚糖水解酶( n - a c e t y l m u r a m i d a s e ) ， 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶【2 3 ，2 引。根据其作用的微生物种类不同可以分为两大 类，一类是分解细菌细胞壁的溶菌酶，另外一类则是分解真菌细胞壁的溶菌酶【2 5 1 。 溶菌酶来源广泛，大致可以分为以下三类：一 ( 1 ) 动物溶菌酶 鸡蛋清溶菌酶是动物源溶菌酶的典型代表，也是目前结构了解最清楚的溶菌酶之一【2 6 】。 它由1 2 9 个氨基酸组成，具有4 个s s 键，分子量约为1 4 0 0 0 k d a ，等电点为l l ，最适温度为5 0 ， 最适p h 值为6 7 ，是一种稳定的碱性蛋白质。此外，从其它鸟类蛋白、哺乳动物乳汁及体液中 也能分离得到溶菌酶。 ( 2 ) 植物溶菌酶 植物溶菌酶大多从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离提取【2 6 1 ，其分子量较大，约 为2 4 0 0 0 2 9 0 0 0 k d a 。植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1 3 ，但对 胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的l o 倍。 ( 3 ) 微生物溶菌酶 微生物产生的溶菌酶一般分为7 类 2 1 】：内n - 乙酰已糖胺酶，此酶的作用机理与鸡蛋清 溶菌酶相同，都能破坏细菌细胞壁肽聚糖中的p 1 ，4 糖苷键；酰胺酶，能切断细菌细胞壁 肽聚糖中n a m 与肽“尾 之间的n - 乙酰胞壁酸l - 丙氨酸键；内肽酶和蛋白酶，能分解细 胞壁缩氨酸聚糖的缩氨酸键；p 1 ，3 、p 1 ，6 葡聚糖酶和甘露聚糖酶( 葡甘聚糖酶) ，能分 解酵母细胞的细胞壁：壳多糖酶，与葡聚糖酶共同作用，可分解霉菌和酵母；磷酸甘露 糖酶，与p - 1 ，3 、p 1 ，6 葡聚糖酶和甘露聚糖酶共同作用，可分解原生质；脱乙酰壳多糖 酶，主要分解毛霉菌( m u c o r ) 和根霉菌( r h i z o p u s ) 。 3 江南大学硕士学位论文 1 2 2 溶菌酶的功能 ( 1 ) 抗菌消炎 溶菌酶能催化水解细胞壁中的n 乙酰胞壁酸和n - z , 酰氨基葡萄糖之间的p 1 ，4 糖苷键， 使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细胞壁溶解【2 7 1 。溶菌酶能直接 水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白a 以及补体的协同下，也能水解部分革兰氏阴性菌。 此外，它还可以与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能增强抗生素和其它药物的 疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎，修复组织的目的【2 们。 ( 2 ) 抗病毒 溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与d n a 、r n a 以及脱辅基蛋白形成复盐， 使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为 显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性，其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病 毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染【2 6 】。 ( 3 ) 增强免疫力 溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和 非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用，同时可以改善巨嗜细胞吞噬和消化功能， 激活白细胞吞噬功能，增强机体的抵抗力【2 6 1 。 ( 4 ) 在基因工程等领域的应用 溶菌酶是基因工程及细胞工程必不可少的工具酶，可用于制造和提取菌体的活性物质如 核酸、酶及活性多肽等，在微生物育种制备原生质体时，也是一种重要的破壁酶。 1 3 谷氨酰胺转胺酶 谷氨酰胺转胺酶( 蛋白质谷氨酸吖- 谷氨酰胺转胺酶，t r a n s g l u t a m i n a s e ，简称t g ，e c 2 3 2 j 3 ) ，又称转谷氨酰胺酶或1 ，谷氨酰胺酰基转移酶2 8 2 轴，它能催化蛋白质分子内、分子间 发生交联，蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，从而改善蛋白 质的功能性质，是生产高营养价值的新型蛋白类食品的重要酶制剂之一【3 0 1 ，在食品加工业中 具有巨大的应用前景，被成为“21 世纪超级食品粘合剂 。 1 3 i 谷氨酰胺转胺酶的作用机理 t g 是一种催化酰基转移反应的转移酶，其典型反应如图1 1 f 3 1 1 。利用此催化反应在各种 蛋白质分子之间或者之内引起共价交联，从而对蛋白质进行改性。 4 第一章绪论 一 图l - i 蛋白质分手经t g 作用模型 f i g l - l m o d e lo f p r o t e i n p r c c c m e d b v t g t g 以肤链中谷氨酰胺残基的卜羧酰胺基作为酰基供体，其酰基受体可以是以下几种【”】： ( 1 ) 多肽链中赖氨酸残基的s - 氨基：形成蛋白质分子内或分子间的一忙谷氨酰) 赖氨酸异 肽键( 图1 2 曲，使蛋白质分子发生交联，从而改变食物的质地和结构，改善蛋白质的溶解性、 起泡性、乳化性等许多物理性质。 ( 2 ) 伯胺基：形成蛋白质分子和小分子伯胺之间的连接( 图i - 2 b ) ，利用该反应可以将一些 限制性氨基酸引入蛋白质以提高其营养价值。 ( 3 ) 水：当不存在伯胺时，水会成为酰基受体，其结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成谷 氨酸残基( 圉i - 2 c ) ，该反应可用于改变蛋白质的等电点及溶解度。 o il omconh2+hzn-lysolnc o = n hl ”+ n h i fli b g i n - c o - n h i + r n h 2 一g j n - c o - n h r + n h j l & j g b p c o n h 2 + h o h 一g m c o o h + n h 3 i 目1 - 2 t g 的作用特点 f i g1 - 2c a t a l y z cc h a r a c t e r i s t i co f t g 1 3 2 微生物备氨酰胺转胺酶 微生物谷氨酰胺转胺酶( 6 抽，t r a n s g l u t a m i n a s e , 简称m t g ) 3 3 川，它的 作用机理和t g 完全一致，而性质上更具优势。m t g 是一种分子量在4 0 k d a 左右的胞外酶， 球状构型单聚链，由3 3 1 千氨基酸组成，活性中心包含一个游离的c y s 残基，它的活性不 依赖于c a 2 + ，最适p h 为6 - 8 ，最适温度为3 7 5 0 c 之j 3 3 ”，不同菌种来源的m t g 在酶学性 质上略有不同。 1 j 3 谷氯酰瞬转胺醇的应用进展 ( 1 ) 食品工业：t g 目前已经广泛应用于食品加工业的各个领域，主要包括面制品、肉制 品、乳制品、水产品等f 圳。通过t g 的交联作用，使蛋白质之间达到优势互补，提高蛋白质的 营养价值经t g 改性后，蛋白质的胶凝性、塑性、持水性、水溶性、稳定性等均会得到改善。 江南大学硕士学位论文 在食品添加剂上t g 可部分替代硝酸盐、亚硝酸盐等稳定剂，提高食品的营养价值，改善口感， 延长保质期。目前食品安全倍受关注，t g 作为天然的酶制剂，比化学添加剂更加安全健康。 t g 在食品加工中的主要作用包括：保护食品蛋白质中的赖氨酸避免发生化学反应，赖 氨酸是人体必需的八种氨基酸之一；提高蛋白质的营养性；包埋脂类或脂溶性物质； 形成耐热耐水性的膜；提高食品的弹性和持水能力。 ( 2 ) 羊毛加工工业：鉴于t g 的独特功能以及羊毛本身作为一种蛋白质纤维，目前国内外 已经把t g 引入羊毛的染整加工工业中，也取得了一定的效果。 江南大学的范雪荣、崔莉等人在相关研究中利用m t g 修复高锰酸钾和蛋白酶对羊毛的 损伤0 6 1 ；卢雨正、高卫东等人则利用m t g 处理羊毛精纺织物以提高织物的尺寸稳定性、抗 皱性、压烫性等性能【3 7 1 ；天津工业大学的侯学锋利用t g 修复绵羊绒、驼绒在加工过程中的 化学和机械损伤，经过修复后的羊绒、驼绒纤维断裂强力均有不同程度的提高，机械性能也 得到一定的改善【3 8 l 。 国外相关研究中，英国诺丁汉大学的c o r t e zj 等人利用t g 处理羊毛织物，减轻了在偏碱 性洗涤条件下羊毛制品的褪色和损伤【3 9 1 ；另外，c o r t e zj 等人还利用t g 的催化作用成功将荧 光标记的1 ，5 戊二胺引入羊毛纤维，从而证实了羊毛角蛋自具有能与伯胺基发生交联反应的 作用位点1 4 0 1 ，这些研究结果表明t g 在蛋白质纤维材料改性方面具有一定潜力。 1 4 酶的固定化 上世纪6 0 年代，固定化酶技术开始发展1 4 1 1 。最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起 来，成为不溶于水的酶的衍生物，称为“水不溶酶 或“固相酶”，后来发现，也可以把酶包 埋在凝胶内或置于超滤装置中。当把酶置于超滤装置中时，高分子底物与酶被截留在超滤膜 一侧，而反应物可以透过膜流出，在这种情况下，酶自身仍是可溶的，只不过被固定在一个 很有限的空间内，因此用水不溶酶和固相酶的名称不恰当。1 9 9 7 年第1 届国际酶工程会议正 式建议采用“固定化酶”的名称1 4 。 目前酶的固定化方法已超过2 0 0 种，其固定化方法大致可分以下几类：吸附法、包埋法、 共价键合法和交联法【4 2 l ，固定化原理如图1 3 所示。 铸雾零够 吸驸法包埋法共价结合法交联法 图1 - 3 酶的固定化方法 f i g 1 _ 3m e t h o d so f e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n ( 1 ) 吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而实现酶的固定化。通过将酶 6 第一章绪论 液与具有活性表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶，是最简单的 固定化技术，在经济上也最具有吸引力。吸附法可分为物理吸附和离子交换吸附，常用的载 体则有无机载体、有机载体、有机大分子物质等。 ( 2 ) 包埋法 包埋法是将载体与酶混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定于载体 网格里，从而实现酶的固定化，分为凝胶包埋法和微囊化法【4 l 】。此法的优点是适用范围广， 工艺简单，固定化过程中酶分子仅被包埋而未参与化学反应，故可得到活力较高的固定化酶。 ( 3 ) 共价结合法 共价结合法是酶分子的非必须基团与载体表面的活性官能团通过形成化学共价键实现的 不可逆的酶固定化方法。酶和载体的共价结合有三种方式：与载体直接反应结合；通过 同源双功能试剂与载体结合；通过异源双功能试剂与载体连接后再与载体反应结合。 ( 4 ) 交联法 交联法是用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进 行反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网状结构的固定化酶。能起到交联作用的试 剂很多，最常用的是戊二醛，其它交联剂有异氰酸衍生物、双氮联苯、n ，n - 聚甲烯双碘丙 酮酰胺和n ，n 乙烯双马来酰亚胺等。交联法常与吸附法或者包埋法配合使用，使酶更加紧 密的与载体结合【4 3 1 。 1 5 本论文的目的、意义及研究内容 1 5 1 研究的目的和意义 i ， 目前应用于羊毛织物抗菌整理的抗菌剂各有优缺点。在三大类抗菌剂中，无机类抗菌剂 耐热性好，但用于纺织品整理难以获得耐久的效果，并且大部分品种存在重金属毒性问题， 这使其应用受到很大局限。有机盐类抗菌剂虽然具有优良的抗菌效果，但是有机盐类抗菌剂 一般毒性较大，在诸如持效性、耐热性、使用安全性和细菌耐药性方面也都存在固有缺陷， 而且许多抗菌整理剂如芳香族卤化物等都存在生态问题，整理加工过程中容易对环境造成危 害。此外特别需要提出的一点是：目前研究的许多抗菌整理剂不能与毛纤维反应，它们必须 通过树脂在高温下固着在毛纤维上，但是由于羊毛属于蛋白质材料，不耐高温，因此在加工 中容易造成毛织物泛黄以及强力下降，不仅影响织物手感，而且耐洗涤性也不理想。所有这 些问题都使得传统的抗菌整理受到了限制。 针对上述羊毛制品功能化加工中存在的技术障碍，传统化学法已难以取得突破性进展， 而近年来随着生物技术在纺织中应用的扩展，采用环境友好的生物抗菌剂和生物整理工艺将 有望成为今后抗菌整理的一个主要研究方向。 溶菌酶作为一种天然的生物抗菌剂，已被广泛应用于食品和医疗卫生行业，它具有的抗 菌性强、安全无毒、热稳定性好、作用范围广等特点使其在纺织品的抗菌整理研究中有着很 广阔的应用前景。传统溶菌酶在织物上的固定化主要有物理吸附法和化学交联法等，物理吸 7 江南大学硕士学位论文 附法是利用溶菌酶分子与载体之间的离子键以及分子间作用力结合，这是最简单的固定化方 法，但是因为结合力弱而不耐洗涤 4 4 , 4 5 】；化学交联法则是通过交联剂( 如：戊二醛等) 在羊毛织 物与溶菌酶分子之间形成稳定的共价键，可以提高溶菌酶在羊毛上的结合牢度，但是却造成 了羊毛织物的泛黄现象，而且不利于生态环保4 6 】。对此，本研究拟引入一种新型的生物催 化剂m t g ，利用m t g 将溶菌酶固定化于羊毛织物表面，不仅可以赋予羊毛织物抗菌效果， 而且还可以解决物理吸附法结合力弱以及戊二醛交联造成的羊毛泛黄现象，有助于拓展生物 酶在纺织中的应用。 1 5 2 研究的主要内容 本文主要研究利用m t g 对溶菌酶进行催化交联从而实现其在羊毛织物上的固定化，达 到赋予羊毛织物抗菌效果的目的，主要研究内容有以下四个方面； ( 1 ) 通过十二烷基磺酸钠。聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外光谱等研究方法表征溶菌酶在 m t g 的催化作用下相互交联，从而证明了溶菌酶可以作为m t g 的催化底物的可行性。 ( 2 ) 羊毛纤维表层存在着疏水性和化学稳定性极强的类脂层，这不利于m t g 催化溶菌酶 与羊毛交联；因此必须对毛纤维表层进行适当的预处理，破坏或者去除类脂层。本文拟采用 双氧水、高锰酸钾以及亚硫酸钠等预处理试剂对羊毛织物进行预处理，并通过测定织物表面 酶活来表征预处理效果，探讨影响溶菌酶在羊毛织物上的固定化因素。 ( 3 ) 溶菌酶经固定化后，其酶学特性会发生改变，因此本研究将详细考察游离酶和固定 化溶菌酶的最适温度、最适p h 、温度稳定性、p h 稳定性、操作稳定性、储藏稳定性以及水 洗稳定性等酶学性质。 ( 4 ) 采用振荡烧瓶法对固载溶菌酶的羊毛织物进行抗菌性能测试( 包括革兰氏阳性菌和 革兰氏阳性菌) 以及抗菌效果的耐洗性测试。 8 第二章试验材料、仪器和方法 2 1 试验材料与试剂 第二章试验材料、仪器和方法 试验材料：羊毛织物( 全毛华达呢，2 2 0 9 m 2 ，无锡协新毛纺有限公司) ，微生物谷氨酰胺转氨 酶( 酶活1 0 0 u g ，江苏一鸣生物制药有限公司) ，蛋清溶菌酶( 酶活2 0 0 0 0 u m g ，广西庞博生物 工程有限公司) ，微球菌粉( m l y s o d l e i k t i c u s ，南京建成生物工程研究所) 。 试剂及药品：三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ，四甲基乙二胺( t e m e d ) ，nn - 亚甲基双丙烯酰胺( b i s ) 十二烷基磺酸钠( s d s ) ，考马斯亮蓝r - 2 5 0 ，考马斯亮蓝g 2 5 0 ，甘氨酸，过氧化氢( 3 0 ) ， 高锰酸钾，亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氢氧化钠，乙醇，磷酸，硼 酸，乙酸，盐酸( 以上试剂为分析纯) ；j f c ，皂片，丝毛洗涤剂( 工业级) ；蛋白胨，琼脂粉， 牛肉浸膏( 生化试剂) 。 2 2 试验仪器 试验所用仪器如下表2 1 所示。 表2 - 1 仪器与设备 t a b 2 - 1i n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 仪器名称型号生产厂家 电泳仪 u v p 凝胶成像系统 脱色摇床 台式高速离心机 紫外可见分光光度计 电子天平 数显恒温水浴锅 电热鼓风干燥箱 玻璃匀浆管 扫描电子显微镜 酸度计 水浴恒温振荡器 霉菌培养箱 洁净工作台 手提式压力蒸汽消毒器 e p s 3 0 1 e c 3 t s 1 t g l ，1 6 b i 肛2 8 0 2 s p i 上0 3 h h 2 1 0 1 a 1 1 0 m l q u a n t a - 2 0 0 p h s 一2 c w h y f 2 f m _ j 1 6 0 b i i s w - c j i b u 翰二2 8 0 b 北京市六一仪器厂 美国b i o r a d 公司 北京市六一仪器厂 德国e p p e n d o r f a g 上海尤尼柯仪器有限公司 上海梅特勒托利多仪器有限公司 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司 上海市实验仪器总厂 南京建成生物工程有限公司 荷兰f e i 公司 上海伟业仪器厂 台湾瑞比公司 上海跃进医疗器械厂 苏州安泰空气技术有限公司 江阴滨江医疗设备厂 9 江南大学硕士学位论文 2 3 试验及测定方法 2 ，3 1m t g 催化溶菌酶的交联反应 2 3 1 1m t g 催化溶菌酶分子交联 准确称取蛋清溶菌酶粉末，配制成浓度为1 的溶菌酶溶液，加入酶活为2 0 u g 的m t g ， 在3 7 。c 保温反应一定时间，取出反应混合物，以1 4 0 0 0 r m i n 速度充分离心1 5 r a i n ，取上清液 进行凝胶电泳。 2 3 1 2 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) ( 1 ) 配制电泳试剂 电泳缓冲液：3 9t r i s + 1 4 4 9 甘氨酸+ l gs d s ，加蒸馏水至i l ，p h 为8 3 左右； 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝r 一2 5 0lg ，甲醇4 5 m l ，蒸馏水4 5 0 m l ，冰醋酸10 0 m l ； 脱色液：甲醇l o o m l ，冰醋酸1 0 0 m l ，蒸馏水8 0 0 m l ； ( 2 ) 聚丙烯酰胺凝胶的配制 表2 - 2 聚丙烯酰胺凝胶配制 t a b 2 2c o n f e e to f p o l y a e r y l a m i d eg e l ( 3 ) s d s p a g e 电泳 按照表2 2 所示配制分离胶和浓缩胶，取2 3 1 1 中上清液与s d s 聚丙烯酰胺样品缓冲液 混合，沸煮5 m i n ，取1 0 u l 进行凝胶电泳。电流2 0 m a ，时间：1 5 h 。电泳完毕后，胶片用考 马斯亮蓝染色液进行染色，时间为1 h 。染毕，胶片置于脱色液中充分脱色至蛋白带在胶片上 清晰呈现，并用凝胶成像系统进行成像处理。 2 3 2 羊毛织物的预处理 ( 1 ) 高锰酸钾预处理 织物热水浸渍一高锰酸钾氧化( k m n 0 4 4 o w f ，j f cl g l ，p h = 4 0 ，4 0 * ( 2 ，3 0 m i n ，浴 1 0 第二章试验材料、仪器和方法 比l ：2 0 ) _ 皂洗( 4 5 ，1 5 m i n ) 叶中和清洗( n a 2 c 0 32 o w f ) 一清水冲洗一烘干( 5 0 ) _ 脱色 ( n a h s 0 36 o w f ，n a c1 ( v v ) ，4 0 c ，3 0 m i n ，浴比l ：2 0 ) 叶冲洗_ 烘干待用。 ( 2 ) 亚硫酸钠预处理 织物浸渍还原液( n a 2 s 0 33 o w f ，p h = 8 0 ，4 0 c ，4 5 m i n ，浴比1 ：3 0 ) 一水洗烘干待用。 ( 3 ) 双氧水预处理 织物热水浸渍- 双氧水氧化( h 2 0 23 0 m l l ，n a a s i 0 44 9 l ，n a 2 c 0 3o 2 o w f ，p h = 8 5 ， 5 0 ，6 0 m i n ，浴比1 ：2 5 ) _ 清水冲洗- 烘干待用。 2 3 3 溶菌酶活力的测定 2 3 3 1 游离溶菌酶活力测定 测定原理：溶菌酶溶解细菌细胞壁，从而降低细菌溶液的浑浊度，利用可见分光光度计 即可测定这一反应【4 7 】。本试验测定时选取的细菌为溶壁微球菌。 游离酶活力定义：一个溶菌酶活力单位相当于在规定条件下于4 5 0 n m 处每分钟使吸光度 降低0 0 0 1 时所需的酶量。溶菌酶活力单位通常用u m g 来表示。 ( 1 ) 磷酸盐缓冲溶液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) 的配制 分别配制o i m o f ln a e h p 0 4 和o 1 m o l ln a h 2 p 0 4 溶液，利用p h 计准确配制p h 值为6 2 4 的p b s ，作测试液备用。 ( 2 ) 溶菌酶作用底物的配制： 取一定量的溶壁微球菌粉，以p h = 6 2 4 的p b s 溶解，并在玻璃匀浆管中充分研磨3 - 5 m i n ， 使菌液混合均一，稀释至其吸光度( 树5 0 n m ) 为1 3 左右。 ( 3 ) 溶菌酶溶液的配制 取一定量的溶菌酶溶于p h = 6 2 4 的p b s 中，配制浓度为l m g m l 的酶溶液，每次吸取 0 1 m l 并用p b s 稀释至1 0 m l ，即每0 5 m l 酶液中含酶量为0 0 0 5 m g 。 ( 4 ) 吸光度的测定 按上述( 2 ) 步骤配制底物溶液，并于2 5 c 水浴中保温，取2 5 m l 溶液用直径l c m 的玻璃比色 皿测定4 5 0 n m 处的吸光度值( 0 0 4 5 0 ) ，计为零时刻读数；加入0 5 m l 游离酶液，迅速摇匀并同时 计时，记下反应1 5 s 时的读数o d l 以及反应7 5 s 时的读数0 1 ) 2 ，空白样为浓度为0 1 m o l l ，p h 6 2 4 i 拘p b s 4 7 , 4 8 1 。根据公式( 2 1 ) 计算游离酶活力，计算公式如下。 游离溶菌酶活力( u m g ) 2 面面a 五o 孺d 丽, 5 0 ( 2 - 1 ) 式中：d d 4 5 0 ：溶壁微球菌液在4 5 0 n m 处6 0 s 内吸光度变化值；样品量：o 5 m l 酶液中溶菌酶 的毫克量。 2 ，3 3 2 固定化溶菌酶活力测定 固定化溶菌酶活力定义：每平方厘米羊毛织物上的含酶量使4 5 0 下降0 0 0 1 为一个活 力单位( 2 5 c ，p h = 6 2 4 ) 。 江南大学硕士学位论文 取一定量的微球菌粉用p h = 6 2 4 ，o 1 m o l 的p b s 稀释，使其吸光度在波长4 5 0 n m 下为 0 6 0 8 ，每2 5 m l 微球菌液中加入直径为l c m 羊毛织物小圆片，通过微球菌液的浊度变化来 确定羊毛织物上固定化溶菌酶的活力大小【4 9 j ，计算公式如下。 固定化溶菌酶活力c m ：) ：a o d , 5 _ ox 一1 0 0 0 ( 2 - 2 ) 6 式中：a o d 4 5 0 ：微球菌液在4 5 0 n m 处6 0 s 内吸光度变化值；s ：加入羊毛织物的面积( c m 2 ) 。 2 3 4 溶茵酶的固定化及羊毛纤维表面形态分析 2 3 4 1 固定化溶菌酶 称取溶菌酶粉末，用0 1 m o l l 的p b s 配制成一系列浓度的酶溶液。把经过预处理的羊毛 织物剪成直径为1 c m 的小圆片，每次称取0 5 9 浸渍于上述溶菌酶溶液中，同时加入2 0 u g 羊 毛织物的m t g ，反应体系置于3 7 c 恒温条件下反应不同时间，固定化后试样