（动物学专业论文）猪fcγriii介导prrsv抗体依赖增强作用研究.pdf

一 己 原创性声明 i i i flljii ffllfl l t f f i if j i i p i i p iii ll l f j y 18 3 3 8 81 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者：冀l 彳矽乏日期：劢萨一了护 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：吏平磋 日期：仍f d 年 岁月3 0 n 1 一 q 中文摘要 中文摘要 i g gf c 受体( f qr e c e p t o r s ，f c 丫r s ) 可特异亲和免疫球蛋白i g g ( i g g ， i m m u n o g l o b u l i ng ) f c 片段，是非常重要的免疫细胞表面分子，在机体免疫防御 中有很重要的作用，是细胞免疫和体液免疫的桥梁。研究发现f c 丫r s 具有修复 炎性损伤、吞噬作用、抗体依赖细胞毒作用、释放炎性介质和调节b 细胞活性 等功能，是哺乳动物免疫应答的重要组成部分。f c y r s 是治疗自身免疫性疾病、 过敏、癌症等免疫疾病理想的药物靶标。 家畜f e a r s 的研究比人与小鼠滞后，但近年来也有很大进展，一些家畜f c ) , r s 基因先后被克隆，生物学特性方面研究也取得进步。猪l g gf c 受体由三类分子 组成：f c t r i ( c d 6 4 ) 、f c t r i i ( c d 3 2 ) 、f c t r i i i ( c d l 6 ) 。其中f c 丫r i i i ( c d l 6 ) 为 5 0 8 0k d a 的膜糖蛋白，在巨噬细胞、肥大细胞和p m n 细胞中都有表达，是唯 一在n k 细胞上表达的f c 受体。f c t r i i i 有两个i g 样胞外区结构域，是中低亲 和力受体。猪f c t r i i i a 是首个克隆的家畜f c t r i i i 基因，在多形核细胞( a m y ， p o l y m o r p h o n u c l e a r ) 中为4 5k d a 糖蛋白，其胞内区与f c r 丫链或其它亚基相连， 只有通过共转染f c r 丫链，才能在细胞表面表达f c y r i i i a 。 猪繁殖与呼吸综合征( p r r s ) 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒( p r r s v ) 引起 的以母猪流产和仔猪呼吸障碍为主要特征的传染病，是困扰中国和世界养猪业 的主要传染病。p r r s v 具有抗体依赖性增强作用( a d e ) 、病毒容易变异、存在 持续感染性及免疫抑制等免疫特性，其中a d e 是困扰p r r s 防控的最主要问题。 目前有关p r r sa d e 的分子机制研究较少。 a d e 主要由f c 受体介导，为研究猪f c t r i i i 在介导p r r sa d e 中的作用，本研 究构建了猪f c t r i i i 和f c ry 链基因真核表达质粒，共转染m a r e 1 4 5 细胞，通过潮 霉素b 和g 4 1 8 连续双抗性筛选和克隆获得一株稳定表达猪f c y r i i i 的m a r e 1 4 5 细 胞系。用p r r s vb j 4 株与1 6 0 0 倍稀释的抗p r r s vi g g 等体积混合后感染克隆化 的m a r c 1 4 5 细胞系，与空白对照相比，有抗体存在时p r r s v 感染获得的p r r s v 病毒量更高，证明了猪f c ) , r i i i 能够介导p r r s v 抗体依赖增强作用。本试验通过 研究p r r s v 和f c 受体之间的相互作用，初步揭示p r r s v 抗体依赖增强作用的分 子机制，为研制开发新型疫苗、新型免疫佐剂和抗病毒药物提供理论依据，为 进一步研究打下基础。 关键词：i g of e 受体；共转染；猪繁殖与呼吸综合征病毒；抗体依赖增强作用 a b s t r a c t a b s t r a c t i g gf cr e c e p t o r s ( f c t r s ) ，w h i c ha r ew i d e l yd i s t r i b u t e do nt h es u r f a c eo f w e l l - k n o w ni m m u n ec e l l s ，a r ea l li m p o r t a n tf a m i l yo fr e c e p t o rm o l e c u l e s t h e yc a l l b i n d 、析t ht h e i m m u n o g l o b u l i ng ( i g g ) f r a g m e n t ss p e c i f i c a l l y , p r o v i d i n gal i n k b e t w e e nc e l l m e d i a t e di m m u n ea n dh u m o r a li m m u n e r e s p o n s e ，a n dp l a yak e yr o l ei n t h eb o d y si m m u n ed e f e n s es y s t e m t h el a t e s ts t u d yr e v e a l e dt h a tf c y r sa r ea l s oi d e a l d r u gt a r g e t s i nt r e a t i n ga l l e r g i ca n da u t o i m m u n ed i s e a s e s ，i nt h a tt h e i ri m p o r t a n t i m m u n ef u n c t i o ni nr e g u l a t i n gp o s i t i v ea n dn e g a t i v ec e l lr e s p o n s e i nr e c e n tf e wy e a r s ，r e s e a r c ho nl i v e s t o c kf c ? r sh a sm a d eg r e a tp r o g r e s s t h e f c 丫r sg e n e si nm a i nl i v e s t o c ks p e c i e sh a v eb e e nc l o n e da n dt h eb i o l o g i c a l l y f u n c t i o n sw e r ec h a r a c t e r i z e d p o r c i n ef c 丫飚a r ec o n s i s t e do ft h r e et y p e so fm o l e c u l e s ， s u c ha sf c t r i ( c d 6 4 ) 。f c y r i i ( c d 3 2 ) a n df c ? r i i i ( c di6 ) f 吖r i i ii sak i l l do f 5 0 8 0k dg l y c o p r o t e i ne x p r e s s e do nt h em e m b r a n eo fa l v e o l a rm a c r o p h g e sc e l l s ， m a s tc e l l sa n dp o l y m o r p h n u c l e a r ( p m n ) c e l l s t h ep o r c i n ef c t r i i i ac o m p l e xa r e4 5 k d ag l y c o p r o t e i no nt h ep m nc e l l s ，a n dt h e i ri n t r a c e l l u l a rd o m a i n sa l w a y sc o n n e c t w i t hf c ryc h a i no ro t h e rs u b u n i t s s ot h ei nv i t r oe x p r e s s i o no ff c t r i i i ac o m p l e x o nm e m b r a n em u s td e p e n do nt h ec o - t r a n s f e c t i o no ff c t r i i i aa n df o r 丫c h a i ng e n e s p o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m e ( p r r s ) i sa ni n f e c t i o n sv i r a l d i s e a s ec a u s e db yp r r s va n dc h a r a c t e r i z e db yt h ea b o r t i o no fp r e g n a n ts o wa n d b r e a t h i n go b s t a c l eo fp i g r e c e n ty e a r s ，t h ei n f e c t i o na n ds p r e a do fv i r u l e n ts t r a i no f p r r s vh a sc a u s e dg r e a td a m a g et ot h ef a r m i n go fs w i n ea l lo v e rt h ew o r l d a n t i b o d y d e p e n d e n te n h a n c e m e n t ( a d e ) i sak e yi m p e d i m e n tf o rd e v e l o p i n ge f f i c i e n tv a c c i n e t oi n v e s t i g a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fa d e ，t w oe u k a r y o f i ce x p r e s s i o n p l a s m i dc o n t a i n i n gf c t r i i ia n df c r tc h a i ng e n e sw e r ei n d i v i d u a l l yc o n s t r u c t e da n d c o t r a n s f e c t e di n t om a r c - 4 5c e l l s t h em a r - 4 5c e l l sw h i c hc a n s t a b l ye x p r e s s e d f c t r i i ic o m p l e xw e r es e l e c t e da n dc l o n e db yt h eb i - a n t i g e n i ca g a i n s th y g r o m y c i nb a n dg 4 18 w h e nt h ec l o n e dm a r c 一1 4 5c e l l sw a si n f e t e d 、i mb j - 4 ，t h ew e l l - k n o w n s t a n d a r ds t r a i no fp r s s va n dt h e1 ：16 0 0 - d i l u t e da n t i - p r r s vi g gm i x t u r e ，m o r e v i r u sw a sh a r v e s t e dt h a nt h ec o n t r o lg r o u pw i t h o u ti g gt h i si n d i c a t e dt h a tf c t r i i i i i a b s t r a c t c o m p l e xc o u l dm e d i a t ea d e i nt h ei n f e c t i o no fp r s s v i nt h es t u d y , t h ep r e l i m i n a r y m o l e c u l a rm e c h a n i s mo fa d ew a si n v e s t i g a t e db ys t u d y i n gt h ei n t e r a c t i o no fp r r s v a n df c 7 r s t h er e s u l tn o to n l yp r o v i d e dt h e o r e t i c a lb a s i sf o rn e wv a c c i n e ，i m m u n e a d j u v a n t a n da n t i - v i r u s d r u g s ，b u ta l s oh e l p t os e a r c hf o ro t h e rp a t h o g e n i c m e c h a n i s m so fi m p o r t a n td i s e a s e s k e yw o r d s ：f c ? r e c e p t o r s ；c o - t r a n s f e c t i o n ；p r r s v ；a d e i i i i 目录 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i 目录 第一章前言1 1 1f c 受体的分类1 1 2f c 丫r s 亚类的生物学特性及家畜f e ) , r s 研究进展1 1 2 1f m l r i ( c d 6 4 ) 1 1 2 2f e 丫r i i ( c d 3 2 ) 2 1 2 3f c t r i i i ( c d l 6 ) 3 1 2 4m o f c 丫r i v 3 1 2 5b o f c 7 2 r 3 1 3f c t r 的免疫学功能研究进展3 1 3 1 调节抗体介导的免疫细胞活化。4 1 3 2 介导抗体亚类的不同免疫功能。4 1 3 3 介导细胞吞噬作用。4 1 3 4 介导a d c c 作用5 1 3 5 介导树突状细胞抗原提呈5 1 4p r r s v 的研究进展5 1 4 1p r r s v 5 1 4 2p r r s v 基因组结构6 1 4 3p r r s v 免疫学研究进展6 1 5a d e 作用的研究进展7 i v 目录 第二章转染m a r c 1 4 5 细胞条件优化9 2 1 材料9 2 1 1 质粒、菌种。9 2 1 2 细j 咆9 2 1 3 酶、主要试剂9 2 1 4 试剂配制1o 2 1 5 主要仪器12 2 2 方法13 2 2 1g f p 基因片段的扩增13 2 2 2g f p 重组真核表达质粒的构建。1 3 2 2 3g f p 转染m a r c 1 4 5 细胞1 7 2 2 4 转染条件优化1 9 2 3 结果21 2 1 3 1g f p 片段的扩增2 1 2 3 2g f p 真核表达质粒的构建2 l 2 3 3 稳定转染m a r c 1 4 5 细胞。2 3 2 3 4 质粒转染m a r e 1 4 5 细胞条件优化2 3 2 4 讨论2 6 第三章稳定表达猪f c ) , r i i i 共转染细胞株的建立2 7 3 1 材料2 7 3 1 1 细j 咆2 7 3 1 2 酶、主要试剂2 7 3 1 3 试剂配制2 7 3 2 方法。2 7 3 2 1 猪肺泡巨噬细胞( p a m ) 的采集2 7 3 2 2p a m 细胞c d n a 的获取2 8 3 2 3 猪f c y r i i i 基因片段的克隆。2 9 v 目录 3 2 4 真核表达质粒p c d n a 3 1 - f c 3 , r i i i 的构建3 0 3 2 5 猪y 链基因片段的克隆3l 3 2 6 真核表达质粒p i r e s h y 9 3 - 丫的构建。3 2 3 2 7 稳定转染细胞系的建立。3 3 3 2 8 共转染细胞系的r t - p c r 鉴定3 6 3 2 9 共转染细胞系的玫瑰花环试验3 6 3 2 1 0 共转染细胞系的流式鉴定3 6 3 3 结果与分析3 7 3 3 1p a m 总r n a 的提取3 7 3 3 2 猪f c ) , r i i i 基因片段的扩增3 8 3 3 3 猪丫基因片段的扩增3 8 3 3 4 真核表达质粒p e d n a 3 1 - f c y r i i i 的构建3 9 3 3 5 真核表达质粒p i r e s h y 9 3 吖的构建4 0 3 3 6 共转染稳定表达细胞系的鉴定4 0 3 4 讨论4 5 第四章p o f c t r i i i 介导p r r s v 抗体依赖增强作用( a d e ) 4 7 4 1 材料4 7 4 1 1 病毒和细胞4 7 4 1 2 主要试剂。4 7 4 2 方法4 7 4 2 1 病毒的增殖4 7 4 2 2 病毒t c i d 5 0 的测定4 7 4 2 3 猪f c ? r i i i 介导p r r s v 抗体依赖增强作用4 8 4 2 4 兔抗猪f c 丫r i i i 多抗效价的测定4 8 4 2 5r s f c 丫r i i i 抗体对转染细胞系介导p r r s va d e 的阻断。4 9 4 3 结果4 9 4 3 1p o f e ? r i i i 介异p r r s va d e 作用4 9 v t 目录 4 3 2r s p o r i i i 多抗效价的测定5 l 4 3 3 抗r s f c t r m 对p r r s va d e 的阻断作用5 l 4 4 讨论5l 第五章全文总结5 3 参考文献5 4 作者简历5 9 硕士在读期间撰写和已发表的论文5 9 附录a ：英文缩略词表6 0 附录b ：质粒图谱6 1 致谢6 3 v i i 第一章前言 第一章前言 f c 受体( f c r ) 可特异亲和免疫球蛋l 兰t ( i g ) f c 片段。f c r 可介导抗原抗体复合 物与免疫细胞及其它细胞问的相互作用，是体液免疫和细胞免疫间的桥梁【l 】，f c 受体当中，i g gf c 受体( f c t r s ) 研究较为清楚。研究发现f c t r s 在自身免疫和 免疫防御中起着重要作用，在研究自身免疫性疾病 2 1 ( 如系统性红斑狼疮) 、肿 瘤、过敏和传染病中较关键【3 ，4 一l 。动物f c , r s 的研究比人与小鼠滞后，但近年 来也有很大进展，一些家畜f c l r s 基因先后被克隆，生物学特性方面研究也取 得进步。 1 1f c 受体的分类 目前发现的f c r 基因从功能方面可分为两类：一类能够结合抗体抗原复合 物并引起宿主免疫应答，按f c r 与免疫球蛋白结合特性不同分为i g g 受体 ( f c t r ) 、i g m 受体( f c l t r ) 、i g a 受体( f e a r ) 、i g e 受体( f c e r ) 、和i g d 受体( f c s r ) ； 另一类是i g 转运受体( f c r n ) 和多聚i g 受体( p i g r ) ，主要负责转运免疫球蛋白穿 过上皮细胞，研究表明，f c i u 在上皮细胞的表达可减少循环i g g 的降解数量【6 7 1 。 目前鉴定的i g g 受体( f c y r ) ，从结构方面分为五个亚类：f c ) , r i ( c d 6 4 ) 、 f c t r i i ( c d 3 2 ) 、f c 丫r i i i ( c d 16 ) 、m o f c y r i v 和b o f c ) , 2 r t 5 j 。 根据f c 丫r s 胞内区功能不同分为抑制型受体和激活型受体【9 1 0 】，二者共表达 免疫细胞表面，一起调节抗体对免疫细胞的活化【1 1 l 。在激活型受体胞内区 ( f c t r i i a ) 或者与受体相连的f c r ) , 链( f c a r i 和f c e r i 、f c t r i 、f c 一r i i i 、b o f c t 2 r 和m o f c y r i v ) 含有基于酪氨酸的受体活化基序( i t a m ) ，能诱导多种免疫学效应【l ， 1 2 】。唯一的抑制型受体是f c y r i i b ，胞内区有基于酪氨酸的受体抑制基序( i t i m ) ， 通过免疫复合物与激活型受体交联发挥作用，可抑制i t a m 基序介导的细胞活 化【1 3 ，1 4 1 。 1 2f e y r s 亚类的生物学特性及家畜f e , r s 研究进展 1 2 1f c y r i ( c d 6 4 ) 第一章前言 f c l , r i 是含胞内区、跨膜区三个i g 样胞外区的跨膜糖蛋白，主要在单核细 胞和巨噬细胞中表达，未见在淋巴细胞中表达f m r 1 7 ，l5 。i f n 吖可使f c t ri 的 表达在效应细胞中提高5 1 0 倍，同样在g c s f 作用下也可提高。人f e y r i 含 4 种转录体：f c y r i a ( 由h u f c y r i a 编码) 是唯一高亲和力结合免疫球蛋白g 单 体的i g g 受体，在低浓度抗体下可诱导免疫细胞对抗原的摄入、加工及提呈等【1 5 1 6 1 ；可溶性受体( 由h u f c y r i b l 和h u f c ) , r i c 编码) ；h u f c l , r i b 2 则编码含2 个i g 样结构域的跨膜受体，它不能结合免疫球蛋白g 单体【l 。7 】只能结合免疫球蛋白g 复合物。 家畜中，最先从牛淋巴细胞基因组文库中获得牛f c l , r i 胞外区基因片段【l 引， 后来又从牛肺泡巨噬细胞e d n a 文库中获得其全长基因【1 9 1 。近年，本研究小组 发现克隆了猪的f c y r i ，在c o s 7 细胞上瞬时表达，研究其配体结合特性，也阐 述了该受体的分布【2 0 1 、表达。随后本研究小组又发现克隆了绵羊f c t r i ，对其 进行配体亲和实验，绵羊f c ，l , r i 仅能结合绵羊i g g l 不能结合i g g 2 。 1 2 2f c y r i i ( c d 3 2 ) f c y r i i 是含两个i g 样胞外区结构域的跨膜糖蛋白，主要分布于单核细胞、 巨噬细胞和郎罕氏细胞等【1 5 1 7 l 。f c y r i i 是低亲和力受体，亲和实验表明其不能 结合免疫球蛋白g 单体，仅能和免疫球蛋白g 复合物或多聚体结合。人f c t r i i 含六种转录体。 f c y r i i 是单链受体，其仅链有i t i m ( h u f e y r i i b ) 或i t a m ( h u f c y r i i a 和h u f c y r i i c ) 基序，可自行进行信号转导，不用丫链辅助【r 7 1 。小鼠只 有f c 丫r i i b 得到鉴赳1 1 】。f c y r i i b 是唯一的抑制型受体( 胞内区含有i t i m 基序) 。 f c y r i i b 可抑制免疫球蛋白g 介导的免疫效应，维持机体免疫平衡，f c t r i i b 活 性缺失可引起免疫紊乱，会引发自身免疫性疾病( 如系统性红斑狼疮) 【l3 川。 家畜中，先从牛肺泡巨噬细胞c d n a 文库中克隆的牛f e t r i i 基因序列与人和 小鼠的高度同源，在c o s 7 细胞上表达的牛f c y r l l 只能与牛i g g l 致敏红细胞结 合，不能结合牛i g g 2 致敏红细胞。牛f c 3 , r i i 胞内区同样含有i t i m 基序有与小鼠 f c t r i i b 相似的抑制作用1 8 j 。最近我们研究小组还发现了猪f c t r i i 基因及在组织 中的分布、表达，又在c o s 7 细胞中表达验证其配体亲和特性1 2 1 1 。随后还建立了 稳定表达猪f c ：y r i i 的m a r c 1 4 5 细胞系，研究猪f c y r i i 在介导p r r s v 抗体依赖性增 强作用中的作用。克隆了绵羊的f c t r i i ，胞内区也有保守的i t i m 基序，在c o s 7 细胞中转染表达，只能与羊i g g l 结合，不能结合羊i g g 2 2 2 , 2 3 】。 2 第一章前言 1 2 3f c t r i i i ( c d16 ) f e y r i i i ( c d l 6 ) 是含两个i g 样胞外区结构域的跨膜糖蛋白，是唯一在n k 细 胞上发现的f c 受体【1 5 】。人的f e y r i i i 包括h u f c t r i i i a 和h u f c t r i i i b 。h u f c t r i i i a 是跨膜受体，以中等亲和力结合人免疫球蛋白g 1 和免疫球蛋白g 3 的单体或复 合物与i g g 2 或i g g 4 不结合。h u f c t r i i i b 没有胞内区和跨膜区，通过糖基磷脂酰 肌醇( g p i ) 锚定在中性粒细胞( n e u t r o p h i l i cg r a n u l o c y t e ) 表面，以低亲和力结合人免 疫球蛋白g 1 和免疫球蛋白g 3 t ”】。h u f c 丫r i i i b 可能对f e ) , r i i 有协同作用，也可 能增强免疫反应【j 。 家畜中，最先发现猪的f c t r i i i a 胞内区与f o r 丫链及其它亚基相连。从r 6 t 细胞中鉴定的牛f c y r i i i 的编码蛋白与人f c t r i i i a 同源，而从牛肺泡巨噬细胞 c d n a 文库中克隆的牛f e t r i i i 基因其编码蛋白胞外区只有一个i g 样结构域。最 近我们课题小组又克隆了棉羊f e y r i i i ，只能结合绵羊免疫球蛋白g 1 而与免疫 球蛋白g 2 不结合。 1 2 4m o f c t r i v m o f c l , r i v 是在小鼠中新发现的一类f c 丫r ，主要表达于巨噬细胞、单核细 胞1 0 1 。鼠f c t r i v 可与小鼠免疫球蛋白g 2 a 和免疫球蛋白g 2 b 特异结合，但不 结免疫球蛋白g 1 或免疫球蛋白g 3 。这种受体也要在y 链帮助下才能表达。 1 2 5b o f c 7 2 r b o f c 7 2 r 胞外区包含两个i g 样结构域，z h a n g 等【2 4 从牛肺泡巨噬细胞c d n a 文库中发现了牛免疫球蛋白g 2f c 受体e d n a ，转染c o s 7 细胞可结牛免疫球 蛋白g 2 ，与牛免疫球蛋白g 1 不结合【2 5 6 1 。因其特殊命名为b o f c 7 2 r 。和牛免 疫球蛋白g 2 结合。b o f c 7 2 r 与人免疫球蛋白af c 受体( c d 8 9 ) 、人杀伤细胞抑 制受体( k i r ) 和白细胞i g 样受体( l i r ) 同属一类家族。 绵羊f c 7 2 r 基因也被发现，亲和特性试验证明该受体只能结合牛和绵羊免 疫球蛋白g 2 ，与绵羊免疫球蛋白g 1 不结合【2 2 1 。 1 3f e t r 的免疫学功能研究进展 f c y r s 可通过与免疫球蛋白g 的f c 片段结合，参与免疫调节并诱导特定细 第一章前言 胞效应事件，如可修复炎性损伤、吞噬作用、抗体依赖细胞毒作用、炎性介质 的释放、和调节b 细胞活性等【2 7 1 。f c 丫黜最重要的免疫学功能是对细胞反应的 正向调节和负向调节【2 8 】。 1 3 1 调节抗体介导的免疫细胞活化 激活型受体与抑制型受体相互作用共同调节免疫细胞的活化。f e y r i 和 f c 丫r i i i 通过f c ry 链的i t a m 基序触发细胞活化，抑制型受体f c t r i i b 通过胞内 区i t i m 基序，抑制细胞活化，进而引起b 细胞凋亡【1 4 2 8 , 2 9 1 。f c t r i i b 对b 细胞 活化的调控在外周免疫耐受中起到关键作用【3 0 1 ，敲除f 吖r i i b 的小鼠可诱发自 身免疫病【3 ，f c l , r i i b 基因启动子附近的多态性可以引起f c l , r i i b 在活化的b 细 胞转录和表达的下降，引发系统性红斑狼疮等自身免疫病【2 ，3 2 1 。自身免疫型b 细 胞出现在b 细胞成熟的不同阶段，f c t r i i b 介导自身免疫耐受发生在b 细胞成 熟的晚期，抑制b 细胞分化成熟为浆细胞而发挥作用【2 ，3 3 j 。 1 3 2 介导抗体亚类的不同免疫功能 不同动物的i g g 可以分为不同的亚类，每个亚类的i g g 在体内都发挥不同的 免疫作用。老鼠的i g g 可分为i g g l 、i g g 2 a 、i g g 2 b 和i g g 3 ，其e p i g g 2 a 、i g g 2 b 在机体免疫中发挥活化作用，是抗感染免疫的最主要抗体。不同i g g 亚类和活化 性与抑制性受体亲和力不同，最近的研究证实：i g g 亚类和活化性与抑制受体不 同的亲和比( m ) 是发挥不同免疫效应的分子基础。多种影响因素可调节免疫 细胞表面的f c 受体的表达。一些t h 2 细胞因子如i l 一4 ，i l 1 0 和t g f d 能上调抑制 性受体和降低活化性受体的表达，因而可导致低水平和中等水平a i l 匕的i g g 亚类 相对于高a i 比的i g g 亚类免疫活性的相对降低，静脉注射高剂量免疫球蛋白 ( i v i g ) 的抗炎症作用j 下是通过这种机制发挥作用的；相反一些炎症介质如 i f n 吖和补体c 5 a 能上调活化性受体和降低抑制性受体表达，在这种情况下自身 抗体能引起机体的严重的免疫损伤。 1 3 3 介导细胞吞噬作用 巨噬细胞和嗜中性粒细胞是专一的吞噬细胞，吞噬作用主要由f c 丫r 介导， 缺失f 吖或其它f 吖r 可致巨噬细胞的吞噬作用丧失p 4 1 ，i g g 尤其是人i g g l 和i g g 3 亚类对于调理吞噬起主要作用。i g g 结合颗粒抗原后与细胞表面f c 一、r s 4 第一章前言 结合，引起f c y r s 发生凝集，触发s r c 酪氨酸激酶，i t a m 基序被磷酸化，形 成s y k 激酶结合位点，募集的s y k 激酶激活下游级联信号。 1 3 4 介导a d c c 作用 当i g g 抗体与带有相应抗原的靶细胞结合后，可与有f c t r 的中性粒细胞、 单核细胞、巨噬细胞、n k 细胞等效应细胞结合，发挥抗体依赖的细胞介导的细 胞毒作用( a n t i b o d yd e p e n d e n tc e l l m e d i a t e de y t o t o x i c i t y ，a d c c ) 。目前已知， n k 细胞发挥a d c c 效应主要是通过膜表面低亲和力f c y r i i i 所介导的，嗜酸性 粒细胞发挥a d c c 作用是通过其f c e ri i 和f e a r 介导的，嗜酸性粒细胞可脱颗 粒释放碱性蛋白等，在杀伤寄生虫如蠕虫中发挥重要作用。巨噬细胞和n k 细胞 的a d c c 作用是特异性肿瘤抗体杀灭肿瘤细胞主要的分子机制，主要依赖于 f q r 【3 5 】，f c 丫r i i b 缺陷小鼠肿瘤特异性抗体在体内的细胞毒性明显增强【3 6 1 。 1 3 5 介导树突状细胞抗原提呈 抗原通过细胞表面f c l , r 进入细胞后诱导强烈的抗原特异性t 细胞反应。与 游离的抗原相比，抗原抗体复合物能更有效地内化到d c 细胞内，从而启动d c 细胞特有的抗原提呈途径，抗原进入细胞后被蛋白酶降解成多肽，并转移至内 质网与m h c1 分子结合，呈递于细胞表面【37 。在f c ) , r 介导的抗原提呈途径中， f c t r i i b 是唯一对其起负向调节作用的受体2 8 , 3 s , 3 9 1 。 1 4p r r s v 的研究进展 1 4 1p r r s v 猪繁殖与呼吸综合征( 也称蓝耳病) 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒( p r r s v ) 引起的病毒性传染病。蓝耳病的主要特征是母猪厌食、发热、怀孕后期发生流 产、死胎和木乃伊胎；幼龄仔猪发生呼吸道症状。1 9 8 7 年美国首先报道这种症 状发生，1 9 9 1 年荷兰学者最先在感染的原代猪肺泡巨噬细胞( p a m ) 中分离到 p r r s v ，命名为l e l y s t a dv i r u s ( l v ) 1 4 0 j ，1 9 9 2 年美国学者也分离到一株p r r s v ， 并命名为a t c cv r - 2 3 3 2 4 l4 2 1 。1 9 9 6 年我国学者郭宝清等在暴发流产的胎儿中 分离到p i 汛s v ，命名为c h 1 a 1 4 3 】。根据病毒血清型和遗传特性的差异，国际上将 其划分为两种基因型：欧洲型( 以l v 为代表) 和美洲型( 以a t c cv r2 3 3 2 为代 第一章前言 表) 。两类p r r s v 的基因序列约有6 0 同源性。前者主要流行于欧洲地区，而后 者主要流行于美洲和亚太地区。2 0 0 6 年以来，我国大部分猪场暴发了一场规模 较大的传染病，该病以高热、呼吸困难、皮肤发红等为特征，给养猪业造成了 很大损失。运用分子生物学方法诊断与鉴定，最后证实猪繁殖与呼吸综合征病 毒变异株为主要病原 4 4 , 4 5 。迄今为止，我国分离的p r r s v 毒株有少量欧洲型，多 为美洲型【4 6 。目前，p r r s 在世界范围内都有感染，p r r s v 变异能力强，不断有 新型毒力更强的毒株出现，迄今也没有有效地疫苗研制成功，给养猪业带来很 大损失。 1 4 2p r r s v 基因组结构 猪繁殖与呼吸综合症病毒属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。 p r r s v 为有囊膜的不分节段单股正链r n a 病毒，呈卵圆形或球形，为2 0 面体 对称，直径约为4 5 - - 6 5 n m 。p r r s v 基因全长约1 5 k b ，包括8 个o r f 框，其相 邻的开放阅读框均有部分重叠。占基因组较大部分的( 约8 0 ) 是o r f l 包括 o r f l a 和o r f l b ，编码聚合酶和r n a 复制酶，产生非结构蛋白。其上游有长约 1 8 0 - - - 2 2 0 个核苷酸的5 蝴x e ( n o n c o d i n gr e i g nn c r ) ，高度保守，其作用是 作为5 端前导序列引导各个亚基因组m r n a s 的翻译。3 7 端有6 个编码框，编码 p r r s v 结构蛋白，其中o r f2 - 4 分别编码次要结构蛋白包括囊膜糖蛋白g p 2 、 g p 3 和g p 4 。o r f 5 7 分别编码主要结构蛋白包括囊膜糖蛋白g p 5 ( 2 5 k d ) 、基 质蛋白m ( 1 9 k d ) 和核衣壳蛋白n ( 1 5 k d ) ；其后含有一个p o l y ( a ) 尾，是p r r s v 复制酶识别和结合的区域，以启动合成负链r n a 。研究表明p r r s v 的n s p 2 区 【4 5 1 和o r f 5 区变异较大 4 7 , 4 8 】， 逼圈圜圜豳圆圈圈嚆圈髓_ 西* 乜困拦r l n 1 4 3p r r s v 免疫学研究进展 p r r s v 在体外主要感染猪肺泡巨噬细胞( p a m ) 和培养的外周血单核细胞， 也感染脾脏、扁桃体、淋巴结、肝脏、派亚氏淋巴结、胸腺的巨噬细胞，( 但是 不能感染腹膜巨噬细胞、新分离的血单核细胞、骨髓内的祖细胞) 。还有几种非 巨噬细胞也能感染p r r s