（材料学专业论文）高速离心剪切粉碎对灵芝孢子粉破壁及特性的影响.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 摘要 灵芝是真菌类植物，在植物分类上属于非褶菌目灵芝菌科灵芝属。灵芝孢 子是灵芝成熟时所释放的孢子，是灵芝有性生殖细胞，又称担孢子。它不但具 有灵芝的全部遗传活性物质，其药效更强更全面，据统计，约为灵芝子实体的 7 5 倍。灵芝孢子具有坚硬的双层壁结构，其成分几丁质含量为5 2 0 8 5 7 “， 无机元素构成以s i ( 1 9 0 1 ) 、c “2 4 - 3 1 ) 为主，硅和钙掺入几丁质使得孢壁更加 结实坚硬，且耐酸碱，极难氧化分解，因此限制了人们对孢内有效物质的消化 吸收。为了充分利用灵芝孢子内的有效物质，必须对孢子粉进行破壁。 本文通过高速剪切超细粉碎( h i g hs p e e dc e n t r i f u g a ls h e a r i n g ) 设备，系统研 究了灵芝孢子粉粉碎破壁的工艺过程、特点及影响破壁率的诸多因素。并应用 扫描电镜、红外光谱等物理测试技术对破壁前后的灵芝孢子粉进行了表征。实 验结果表明，影响破壁率的主要因素有粉碎时间和主轴转速，随着粉碎时间的 延长和主轴转速的增大，破壁率增大。当粉碎时间为6 0 m i n , 主轴转速为 1 6 0 0 r r a i n 时，破壁率达到1 0 0 。扫描电镜结果表明，灵芝孢子经过高速剪切 粉碎破壁后，灵芝孢壁被打碎，孢子内含物质呈团状溶出。 为了探讨灵芝孢子粉碎破壁对其有效成分提取率的影响，本实验采用紫外 分光光度法对破壁前后的孢子粉的有效成分水溶性多糖的提取率进行了测定比 较。实验结果表明，经过高速剪切粉碎破壁后，水溶性多糖的提取率提高了4 0 0 8 。 灵芝孢子粉破壁后，有效成分与外界接触，容易氧化变质，为提高其稳定 性，以破壁后灵芝孢子粉为芯材，明胶为囊材，采用喷雾干燥法制备了灵芝孢 子粉明胶胶囊。研究了进口温度、囊材含量对成囊效果的影响。实验结果表明， 当进口温度为9 0 ( 2 ，孢子粉和明胶含量为l ：2 时，孢予粉较好的包覆在明胶中。 灵芝孢子粉具有免疫增强的作用。根据保健食品功能学检验方法，本实验 选取迟发性变态反应和碳廓清实验，比较研究了灵芝孢子粉破壁前后对小鼠免 疫功能的影响。实验结果表明，高剂量的破壁灵芝孢子粉具有明显的免疫增强 功能。 关键词：灵芝孢子粉，高速剪切超细粉碎，提取率，明胶胶囊，免疫功能 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t g a n o d e r m al u c i d u mi sas p e c i e so fb a s i d i o m y c e t e st h a tb e l o n g st o g a n o d e r m a t a c e a eo fa p h y l l o p h o r a l e s g a n o d e r m al u c i d u ms p o r e sa r er e l e a s e db y g a n o d e n n al u c i d u mw h e ni ti sm a t u r e s t u d i e s0 1 1t h et h es p o r e so fg a n o d e r m a l u c i d u mh a v ed e m o n s t r a t e dt h a tt h es p o r e sn o to n l yi n h e r i ta l lt h o s ea c t i v ei n g r e d i e n t s o fg a n o d e r m al u c i d u m ，b u ta l s oh a v eas t r o n g e re f f e c tt h a ng a n o d e r m al u c i d u m a c c o r d i n g t os t a t i s t i c s , i ti sa b o u t7 5t i m e sm o r et h a ng a n o d e r m al u c i d u m h o w e v e r t h e s ee f f e c t sa r ec l o s e l yr e l a t e dt ot h es t a t u so ft h es p o r o d c r m i th a st w oh a r d s p o r o d e r m s ，a n dt h es p o m d e r mb e c o m e sv e r yh a r db e c a u s eo ft h ei n g r e d i e n t so f s i ( 1 9 0 1 ) a n dc a ( 1 9 0 1 ) m i x e di n t oc h i t i n ( t h ec o n t e n to fc h i t i n i s5 2 0 8 5 7 6 4 ) 1 1 1 es p o r o d e r mc a l lr e s i s ta c i da n da l k a l i ，a n di ti sd i m c u l tt ob eo x i d a t e d d e c o m p o s e d t h u s ，i tr e s t r i c t sa b s o r p t i v i t yo ft h ee f f e c t i v ei n g r e d i e n t so fs p o r e s i n o r d e rt om a k ef u l lu s eo ft h ee f f e c t i v ei n g r e d i e n t si nt h es p o r e s i ti sn e c e s s a r yt o b r e a kt h es p o r o d e r m u s i n gt h eh i g hs p e e dc e n t r i f u g a ls h e a r i n g ( i - i s c s ) p u l v e r i z e r , t h eg a n o d e r m a l u c i d u ms p o r e sw e r eu l t r a f i n eg r o u n d s e v e r a lf a c t o r ss u c ha sp r o c e s s i n g ，p r o p e r t i e s ， w h i c ha f f e c t i n gt h es p o r o d e r m - b r o k e nr a t i ow f f f es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d 1 1 1 e c h a r a c t e r i s t i c so fg a n o d e r m al u c i d u ms p o r e sw e r ea n a l y z e db ys c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ( s e m ) f o u r i e rt r a n s f o r m i n f r a r e ds p e c t r o p h o t o m e t r y ( f r m ) t h em a i n f a c t o r st h a ti n f l u e n c e dt h es p o r o d e r m - b r o k e nr a t i ow e r er o t a t i n gs p e e da n dg r i n d i n g t i m e t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es p o m d e r m - b r o k e nr a t i oi m p r o v e d 埘t l l t h ei n c r e a s i n go fr o t a t i n g s p e e da n dp r o l o n g i n g o ft h e 厚i n d i n gt i m e t h e s p o r o d e r m - b r o k e nr a t i or e a c h e d1 0 0 w h e nr o t a t i n gs p e e dw a s1 6 0 0r r a i na n d g r i n d i n gt i m ew a s6 0 m i n t h es e mr e s u l t sd e m o n s w a t e dt h a tt h es p o r o d e r mw a s g r o u n da n dt h ei n c l u s i o no f t h es p o r e se l u t e di ng r o u p s i no r d e rt os t u d yt h ee f f e c t so fs p o r o d e r m - b r o k e nr a t i o ，t h eu l t r a v i o l e t - v i s i b l e p e c t r o p h o t o m e t e rw a se m p l o y e dt oi n e a s u l a ea n dc o m p a r et h ee x t r a c t i o nr a t i oo f a q u e o u ss o l u b i l i t yp o l y s a e c h a r i d eb e t w e e nt h er a wa n db r o k e ns p o r e s t h er e s u l t s i i 武汉理工大学硕士学位论文 s h o w e dt h a tt h ee x t r a c t i o nr a t i oo fa q u e o u ss o l u b i l i t yp o l y s a c c h a r i d ew a sg r e a t l y i n c r e a s e db y4 0 8 a f t e rg r o u n d i n g t h eg a n o d e r m al u c i d u ms p o r e sw e r eg r o u n d ，a n dt h ei n c l u s i o nw s sc o n t a c t e d w i t ht h es u r r o u n d i n g sa n de a s yo x i d a t i v ed e t e r i o r a t e d t oe n h r l l c et h es t a b i l i t yo f g a n o d e r m al u c i d u ms p o r e s ，t h eg l u t i nm a c r o c a p s u l e sw e r ep r e p a r e dw i t hs p r a y d r y i n gm e t h o d t h ei n l e tt e m p e r a t u r ea n dt h ec o n t e n to fc a p s u l ew a l lw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h es p o r e sp o w d e rw a sf i n e l yc o a t e du n d e rc o n d i t i o n so fi n l e t t e m p e r a t u r e9 0 6 c ，g l u t i nc o n t e n t t os p o r e sp o w d e r1 ：2 t h eg a n o d e r m al u c i d u ms p o r e sc a ne n h a n c ei m m u n i t y a c c o r d i n gt of u n c t i o n a l t e s t i n gm e t h o do fh e a l t hf o o d s ，t h ed e l a y e dt y p eh y p e r s e n s i t i v i t y ( d t h ) t e s ta n d c a r b o nc l e a r a n c et e s tw e r ec h o s e nt oc o m p a r et h ei m m u n i t yo fm i c eb e f o r ea n da f t e r s p o r o d e r m - b r o k e n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e1 0 0 0m g k gs p o r o d e r m - b r o k e n s p o r e sc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s ei m m u n i t yo f m i c e k e y w o r d s ：g a n o d e r m al u c i d u ms p o r e s ，h s c sp u l v e r i z e r , e x t r a c t i o nr a t i o ，g l u f i n m a c r o c a p s u l e , i m m u n i t y i i i 武汉理t 大学硕士学位论文 第一章绪论 现代科学技术的发展日新月异，而传统中医药学在今天却举步维艰，如何 将现代科技嫁接于中医药，实现中医药现代化，是中医药学界面临的重大课题。 随着我国加入w t o ，中药产业被认为是最具国际竞争潜力的产业之一，中医现 代化最有可能从中药现代化开始。而中药现代化取决于对现代科学技术的应用 程度，即创新药物的研制与开发水平。现阶段将超微粉碎应用于中药的研发可 能是中药现代化发展的重要方向之一。 1 1 超微粉碎在中药研究中的应用 粉碎是中药材加工和中药制剂生产工艺中的重要环节。我国传统粉碎加工 中药的工艺设备，多为锤击式、球磨式、流动式、截切式、滚筒式及万能粉碎 机等多种粉碎设备，均存在机械能转变为热能，造成物料受热，以致药材的一 些有效活性成分分解，或有的变黏、变软，影响粉碎的正常进行【l 】。为确保粉碎 过程中药性不被破坏，药物不受污染，便予对设备清洁、洗涤、消毒，并符合 我国g m p 要求，必须采用超微粉碎等高新技术。 超微粉碎技术是近2 0 年来国际上发展起来的一项新技术。所谓超微粉碎是 指利用机械或流体动力的途径将物料颗粒粉碎至粒径小于1 0l lm 以下的过程【2 l 。 超微细粉末是超微粉碎的最终产品，具有一般颗粒所不具有的一些特殊的理化 性质，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化学反应活性等。因此超微细粉末 己广泛应用于化工、医药、食品、农药、化妆品、染料、涂料、电子、航空航 天等许多领域。最近超微粉碎技术逐渐被应用到中药制药中来，且呈现出良好 的发展态势p j 。 1 1 1 中药超微粉碎的特点 中药防病治病的物质基础来自于生物活性部位或活性化学组份。中药复方 是中医药防治疾病的主要手段。但是，中药复方药效的特点是物质多成分、多 武汉理工大学硕士学位论文 途径、多靶点的整体性调节，因而就使得中药复方有效成分的研究相当困难。 但是，生物机体对药物的吸收、代谢、排泄是一个极其复杂的过程，中药产生 的药理效应不能唯一地归功于该药物特有的化学组成，还应与药物的物理状态 有关 4 ，5 】。改变药物的的物理状态可能是新型药物研制的一种有效方法。在改变 药物物理状态方面，改变药物的单元尺寸( 体积) 是十分有效的方法。 中药粉碎的特点与中药本身的组成及性质有密切关系。中药与一般的无机 矿物既有共同性又有其自身的特点，其种类繁多，组成成分和结构复杂多样 6 1 ， 可以用作药用资源的中药涉及天然植物、动物及矿物原料，以天然植物为多数， 从组成植物体部分的基本成分来看，主要是一些普遍存在的初级代谢产物，如 纤维素、叶绿素、淀粉、蛋白质、树脂、树胶、糖类等，这些成分一般无药用 价值，而生物活性成分通常是以初级代谢产物为基体，分布于初级代谢产物的 细胞内和细胞间质，由其衍生出来的次级代谢产物，如生物碱、萜类、黄酮、 葸醌、氨基酸等【”，它们在植物体内的含量很低，多则百分之几，少则百万分之 几。因此，中药的超细粉碎主要是基体成分的破碎，根据基体成分含量的多少 将中药大致分为以下几类：( 1 ) 淀粉性药物：苡仁、绿豆等：( 2 ) 纤维性药物：当归、 甘草等：( 3 ) 油脂挥发性药物：乳香、五味子、益智等。除了以上植物类中药外， 还有动物类中药和矿物类中药，如鲨鱼软骨、蚕蛹、珍珠、滑石等。 对于一些含挥发油成分的药物，由于超细粉碎可在常温或低温下进行，因 此可以保留药物的活性成分，从而保证了药物的疗效发挥。对于动物类药材可 以在不需要任何前处理的条件下进行粉碎，而且一些生物活性物质也不会被破 坏。采用超细粉碎技术后，一般不再需要长时间地浸提、煎煮等办法来提取有 效成分，从而减少了有效成分的损失，可以最大限度地利用原药材。 大多数中药在通常情况下是固体，一般以块状、粒状、结晶、无定形存在， 表现出的物理性质主要有嘲： ( 1 ) 硬度，即物料的坚硬程度，反映了物料对磨耗的抵抗性，物料的硬度越 高，物料抵抗塑性变形的能力越大，越不容易被密碎。植物类中药的硬度多为 软质，而些骨甲类药材则比较硬而且韧。 ( 2 ) 脆性，脆性反映了物料塑变区域的长短。脆性大，塑变区域短，在破坏 前吸收的能量小，亦即容易被击碎或撞碎。多数矿物类中药均具有相当的脆性， 粉碎时沿晶体的结合面碎裂成微小晶体，故较易于粉碎。菲极性晶体药物因缺 乏相应的脆性，受外力产生变形而阻碍粉碎，同时这类物质有较强的内聚力来 武汉理工大学硕士学位论文 平衡外加机械力。 ( 3 ) 韧性，韧性与脆性相反，受外力时虽然变形但不易折断，含纤维多的或 含角质的中药都具有相当的韧性。另外，韧性与物料的含湿量有关，如深度干 燥后多成坚韧特性，增加了粉碎的难度，故中药在超细粉碎前应适当干燥，控 制物料的含湿量。 以上特性对中药粉碎有重要影响，表明中药粉碎并非简单的等同于常规粉 碎，它决定了粉碎作用力的选择，也决定了粉碎设备的选型。 中药的超微粉碎，当前主要指细胞级微粉碎 9 】。中药细胞破壁技术，是日本 学者最早研究和提出，在国内则是刚兴起的一项高新技术。所谓细胞级微粉碎， 是指以生物细胞破壁为目的的粉碎作业，它不以粉碎细度为目的，而是追求细 胞的破壁率。虽然细胞的破壁率越高其细度越细，但细度作为种宏观的检测 指标，无法表达药材的真实性状。中药材品种绝大多数来自于动植物。动、植 物药材是由多种功能的细胞组成，细胞又是由细胞膜、壁、细胞质和细胞核组 成，一般情况下药用有效成分主要存在于细胞内，在细胞完整无损的状态下， 有效成分只有透过细胞膜( 壁) 后才能被利用。完整的细胞膜对有效成分的释 出形成阻力，这种阻力随细胞团内的细胞数量的增多而增大。为消除这种阻力 应采取超微粉碎技术，将细胞打破，使胞内的有效成分直接接触溶媒而释出。 中药原材料经超微粉碎处理后，电镜下观察其实际粒径的9 0 d , 于6um ，基本 上不存在细胞形式，将其置于水面：大部分的药料粉末迅速下沉至水底，一般 粉碎的粉末则漂浮在水面。通过超微粉碎，能将原生材料从传统工艺得到中心 粒径1 5 0 - - 2 0 0 目的粉末，提高到现在的中心粒径为3 0 0 目以上。对于一般药 材在该细度条件下，细胞破壁率大于9 5 ，这项新技术的应用，不仅适合于各 种不同质地的药材，而且可使其中的有效成分直接暴露出来，而不是以往有效 成分从细胞壁( 膜) 释放，从而使药物起效更加迅速、完全。 1 1 。2 超微粉碎在申药生产中的意义 超微粉碎技术引入中药精细加工之中，将迅速提高我国中药行业的科技水 平，提高中药的质量和疗效，增强我国中药产品在国际市场的竞争力。其作用 在于： 1 1 2 1 增强有效成分在体内的吸收 3 武汉理工大学硕士学位论文 中药材分植物药、动物药和矿物药三大类。除矿物药外，动物药、植物药 的主要药效成分通常存在于细胞内与细胞间质，且以细胞内为主。 植物药材除有效成分外，含大量的其他成分，如蛋白质、脂肪、淀粉、树 脂、黏液质、果胶、鞣质及构材物质( 如纤维素、拴皮、石细胞等) 。对于以普 通方法粉碎、以粉末形式入药的中药，其有效成分绝大部分被包裹在未被击破 的细胞内，药物粉粒进入胃肠道后，由于细胞内有效成分一般比无效成分的分 子量小的多，因而可以透过细胞壁，逐渐释放出来，再转移或溶解到胃肠液中， 由小肠吸收。当药物粒子较租时，细胞往往几个或数十个聚集在一起，细胞内 的有效成分要穿过众多细胞壁才能释放出来，因而药物的释放速度很慢；由于 药物在体内的停留时间有限，在极低释药速度的情况下药物有效成分的吸收量 也极低；同时由于粒子较粗，吸附在小肠壁上的量也较少，吸收量亦较少。另 一方面，因为药物粒度大，混合的均匀度偏低，不同性状的药物成分会因为细 度、细胞膨胀速度、从细胞壁的迁出速度、对肠壁吸附性等的差异，造成吸收 速度和程度的不同，从而影响复方药物的疗效。 植物药材经超微粉碎后，绝大多数细胞的细胞壁破裂，细胞内的有效成分 不需通过细胞壁屏障而直接和给药部位接触。一方面，由于微粉药物粒径小， 比表面积极大，极易吸附在小肠壁上被小肠壁吸收，大大提高了有效成分的吸 收速度；另一方面，微粉与给药部位接触面积大，延长了药物在体内的滞留时 间，药物的吸收量也显著增加。 1 1 2 2 匀化作用 多数中药通常含有水分、油性成分及挥发油等成分，在高强度撞击及剪切 力的作用下，当细胞壁被打碎时，这些成分从细胞内迁移出后使微小粒子表面 呈半润饰状态，并在药材中的某些具有表面活性物质的作用下，与亲水性成分 亲和，产生乳化、均匀混合而达到“均质态”，此时粒子与粒子之间形成半稳定 的“粒子团”，而每一个“粒子团”都包含着相同比例的中药成分。油细胞中的 挥发性成分在细胞被打碎的同时也“均质化”。这种经过“均质化”的中药微粉 进入肠胃道后很快均匀分散，其水性、油性及挥发性成分以原有的成分比例同 步吸收，与普通粉碎方式粉碎的粉末在体内的吸收速度及吸收程度相比大有改 善。由于纤维具有一定的吸收膨胀性，经过超微粉碎的药物粉末，其纤维已达 到超细化状态，膨胀质点大大增加，因而具有药物辅料的作用，在肠胃道中可 4 武汉理工大学硕士学位论文 迅速崩解，促进药物有效成分的释放、吸收。 1 1 2 3 有利于保留生物活性成分，提高药划1 0 】 在超微粉碎过程中，经控制可不产生过热现象，甚至可在低温状态下进行， 并且粉碎速度快，有利于保留不耐高温的生物活性成分及各种营养成分，从而 提高药效。如珍珠，用传统方法加工会破坏其部分成分，而在6 7 c 左右的低温 和严格的净化气流条件下进行超微粉碎，能充分完接地保留有效成分，增强其 延缓衰老的作用。灵芝含有丰富的氨基酸和微量元素，具有激活免疫功能、抗 肿瘤、抗血栓等作用，超微粉碎后，疗效发挥更加完全。 1 1 2 4 节省原料，便于应用 中药经超微粉碎后，可用较小剂量，获得原处方疗效。一般药物，经超微 粉碎后可不再经过浸提、煎煮等处理，减少了生产环节中有效成分的损失，最 大限度地利用了原材料，因此该技术尤宜于珍贵稀有中药的粉碎，并且由于细 度的增加，可改善口感，便于服用。另一方面，因超微粉碎是在全封闭无粉尘 的系统中进行的，可有效避免外界污染，使产品的微生物含量及灰尘得以控制。 1 1 2 5 保留中药的性与功能 中药强调配伍，复方应用是其特点。中药复方中所含的多种有效成分能够 针对影响机体的多种因素，通过多环节、多层次、多靶点对机体进行整体调节 作用，以适应机体病变的多样性和复杂性特点。中药有效成分以微粉形式入药， 保留了处方全组分及其药效学物质基础，保持了中药的属性和功能主治，体现 了中药辨正旖制，整体治疗的特点。 1 1 2 6 开发中药新剂型新品种 一些名贵中药材如珍珠、麝香、鹿茸、人参、冬虫夏草等均可经过超微粉 碎后，制成直接口服的散剂、胶囊、微囊等制剂。也可利用中药微粉化后分散 性好、渗透率增加、刺激性小，制成外用药剂及与适当基质混合后制成透皮制 荆，或将一些疗效好、不良反应大的药物与超微细磁粉起制成靶向制剂。此 外，尚能把药一食同用的中药微粉作为食品添加剂，加入饮料及食品中制成各 种保健滋补品。 蓝堡堡三盔堂堡堂焦垫皇 1 1 3 超微粉碎在中药研究中的现状 陈长洲等测定天麻超细粉( 通过4 0 0 目筛) 天麻素溶出参数t 5 0 ( m i n ) 9 2 0 ， 优于2 5 0 日( 2 2 6 0 ) 、l o o 目( 4 4 4 0 ) ，天麻超细粉制成颗粒后t 5 0 ( m i n ) 1 0 6 6 ，仍然 优于l o o 目( 6 3 8 4 ，p o 0 1 ) 、天麻配方颗粒( 3 3 5 5 ，p 1 0 4 时显示出强抑制肿瘤活性。其主链越长， 侧链频率越高，分子量越大，生物活性越高 5 0 】。灵芝多糖的基本结构如图3 1 所 示： 灵芝多糖的药理作用如下 5 l 】： ( 1 ) 抗肿瘤 灵芝多糖抗肿瘤活性可能是通过其对免疫活动或对宿主机能的影响而介导 的，且水溶性多糖可能起着更重要的作用，而且具有抗肿瘤活性的多糖有最适 分子量范围，分子量越大，抗肿瘤活性越强。 武汉理工大学硕七学位论文 卜札 图3 1 灵芝多糖的基本结构 f i g 3 1 f u n d a m e n t a ls t r u c t u r eo f g a n o d e r m al u c i d u m p o l y s a c c h a r i d e ( 2 ) 调节心血管系统 有研究表明，红芝的多糖有明显的强心降压作用，对动脉粥样硬化有预防 和治疗作用：灵芝于子实体提取出两种聚糖，经腹腔注入正常小鼠，均能降低 血糖，其机理可能是由于提高了血浆胰岛素水平，加快了葡萄糖代谢，外组织 和肝的葡萄糖利用加快，而达到降血糖作用；机理尚不清楚。 ( 3 ) 免疫调节 经腹腔注射或经口服食用，从红芝子实体提取的多糖组分能增强对蛋白质 抗原延迟超过敏化。灵芝多糖b n 3 g 能增强伴刀豆自a 诱导的鼠t 细胞扩增。 ( 4 ) 其他药用作用 促进蛋白质与核酸的合成；神经系统的调节作用；对呼吸系统的作用；抗 炎作用；对肌肤营养不良的作用；放射保护作用；保肝、解毒作用等。 3 1 原料与药品 灵芝孢子粉，购于山东菏泽市福生堂灵芝科技开发中心；苯酚( 分析纯) ； 浓硫酸( 分析纯) ；葡萄糖( 分析纯) ；岛津u v - 1 6 0 1 紫外分光光度计。 破壁灵芝孢子粉：高速离心剪切式超细粉碎机中湿式粉碎，粉碎工艺参数 武汉理工大学硕+ 学位论文 为溶液浓度5 8 ，主轴转速1 6 0 0 r m i n ，粉碎时间6 0 m i n 。 3 2 灵芝孢子粉中有效成分水溶性多糖的提取 目前，灵芝多糖提取方法主要有以下几种： 1 水提醇沉法 原理：利用多糖溶于水或酸、碱、盐溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶 剂的特点，从不同材料中进行提取。提取时一般先将原料物质脱脂与脱游离色 素，然后用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液进行提取，提取液经浓缩后即以等重或 数倍的甲醇或乙醇、丙醇等沉淀析出，得粗多糖。 2 膜分离法 原理利用多糖分子量大小，在通过半透膜时，实现机械分离。然后再低 温浓缩、干燥，得粗多糖。膜分离法对实验设备要求较高， 3 其他方法 当前也有利用超声提取，超临界萃取，等方法，但都处于实验阶段，距离 实现产业化还有一定的距离。 根据实验室的条件，本实验采用水提醇沉法。随着热浸提时间的延长，多 糖提取率也逐渐增加，但增加的趋势逐渐趋缓，时间太长，提取率有下降趋势， 可能是由于受热时间长，多糖的糖苷键断裂导致多糖含量降低。因此，实验选 择提取时间为1 4 0 m i n 。 表3 1 水溶性多糖的提取流程 f i g 3 1 e x t r a c tp r o c e s so f a q u e o u ss o l u b i l i t yp o l y s a c c h a r i d e 孢子粉沸水趁热过加9 5用9 5 4 9 + 水浴上 滤。滤乙乙 2 0 0 m l回流 液在旋醇4醇洗 ( 称取 1 4 0 转蒸发 k 倍量 涤， 一 破壁的 m l n 仪上浓沉淀加水 溶液缩至加热 ( 7 2 9 7 1 0 m l溶解 g j 左右 基堡墨王盔堂堡主堂焦造塞 水提醇沉法的提取流程如表3 1 所示。所得即为灵芝粗多糖溶液。 3 3 水溶性多糖的含量测定 灵芝多糖的含量测定方法主要有苯酚一硫酸法，葸酮一硫酸法，地衣酚比 色法。苯酚一硫酸法与葸酮一硫酸法、地衣酚比色法相比具有操作简单、准确 度商的特点。苯酚硫酸法是利用单糖、多糖及它们的衍生物与苯酚一硫酸试剂 反应生成橙黄色溶液，在一定波长处有特征吸收，而进行含量测定的，此法操 作简单，不需要水解，如果条件控制得当，灵敏度高，重现性、选择性和稳定 性均较好。 本实验采用苯酚一硫酸法来测定灵芝多糖的含量。 ( 1 ) 样品溶液的制备 取过滤后的滤液定容至5 0 m l ( 2 ) 标准储备液的制备 取1 0 5 干燥至恒重的葡萄糖对照品，另用蒸馏水溶解，配置呈l i n g r o t 的标准储备液。 ( 3 ) 测定波长的选择 精密吸取标准储备液液2 m l ，以同样蒸馏水为空白，按回归方程项下操作， 在紫外分光光度计上对4 0 0 - - 5 6 0 h m 波长区间进行扫描，得到最大吸收波长 4 9 0 5 n m 。 ( 4 ) 样品的测定 精密吸取样品溶液0 4 m l ，按回归方程项下操作，测得吸光度，根据回归 方程计算含量。 ( 5 ) 线性关系考察 精密称取标准储备液0 5 ，l ，1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 o m l ，于5 0 m l 量瓶中，加水 稀释至刻度，再分别精密吸取上述各溶液2 o m l ，于l o m l 具塞试管中，同时取 2 m l 蒸馏水作为空白溶液，分别加入5 苯酚溶液各l m l ，摇匀，迅速加入浓硫 酸5 o m l ，摇动5 分钟，置沸水溶液中加热1 5 m i n ，然后置于冷水浴中冷却3 0 m i n ， 在分光光度计上最大波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖加入量为 横坐标，进行回归处理，得到线性回归方程。 ( 6 ) 稳定性试验 2 8 武汉理上大学硕士学位论文 取样品测定项下的试样溶液，分别于0 5 小时，1 小时，2 小时，4 小时，4 8 小时 测定吸光度，结果得r s d 为o 1 9 ，说明其在4 8 小时内稳定性良好。 ( 7 ) 精密度的测定 取同一供试样品，测定5 次，结果如表3 3 所示。 3 4 结果与分析 3 4 1 最大吸收波长的选择 按照分析方法，用l c m 比色皿测定3 0 0 - - 8 0 0 n m 之间的吸光度。从图3 2 可 以看出，当吸收光波长为4 9 0 5 n m 时，标准储备液的吸光度最大，所以本文测 量多糖含量时最大吸收波长选择4 9 0 5 n m 。 魁 米 螫 波长n m 图3 2 标准储备液的吸收曲线 f i g 3 2a b s o r p t i o nc u r v eo f s t a n d a r ds t o c ks o l u t i o n 3 4 2 标准储备液浓度与吸光度的关系 武汉理工大学硕士学位论文 表3 2 吸收度与浓度的关系 t a b l e3 2 r e l a t i o n s h i pb e t w e e na b s o r b a n c ea n dc o n c e n t r a t i o n 曲线的线性回归方程为：y = o 0 1 3 0 + o 0 0 6 1x 相关系数r = 0 9 9 8 7 从上表可以看出，在0 - - 1 2 0 9e n i l 范围内呈良好的线形关系。 3 4 3 精密度的实验结果 武汉理工大学硕士学位论文 表3 3 精密度的测定结果 t a b l e3 3m e a s u r e m e n to f p r e c i s i o n 样品号水溶性多糖提取率平均含量相对标准偏差辑) 10 4 4 8 20 4 5 2 30 4 6 5 0 4 5 4 1 9 4 0 4 6 3 50 4 4 2 由上表可以看出，该法精密度较好。 3 4 4 破壁前后水溶性多糖的提取率 表3 4 灵芝孢子粉中水溶性多糖的提取率 t a b l e3 4e x t r a c t i o nr a t i oo f a q u e o u ss o l u b i l i t yp o l y s a c c h a r i d e 样品组 提取率 灵芝孢子原粉 破壁后灵芝孢子粉 0 3 2 4 0 4 5 4 表3 4 为破壁前后灵芝孢子粉有效成分水溶性多糖的提取率。从表3 4 中可 以看出，经过高速离心剪切式超细粉碎机( h s c s ) 粉碎后，灵芝孢子孢壁被破 碎，孢壁内包裹的有效成分无需通过孢壁充分溶出，水溶性多糖得到了充分的 释放，其有效成分之一水溶性灵芝多糖含量( 以葡萄糖计) 较原粉提高了4 0 0 8 。因此，经过超微粉碎破壁后，可以提高孢予粉的生物利用度或有效成分的 提取率，对生产企业可以简化提取方式，缩短提取时间，达到既缩短生产周期、 武汉理工大学硕士学位论文 节约能源，又提高原料的综合利用率。 3 5 小结 ( 1 ) 苯酚一硫酸法可用于灵芝水溶性多糖的测定，其结果精确，重现性好， 灵敏度高。 ( 2 ) 经过超微粉碎破壁后，灵芝孢子粉的有效成分水溶性多糖的提取率提高 了4 0 0 8 ，说明灵芝孢子粉破壁后，其孢壁被打碎，有效成分充分释放，从而 有利于水溶性多糖的提取。 武汉理工大学硕士学位论文 第四章灵芝孢子粉破壁改性研究 灵芝孢子粉碎破壁后，有效成分直接溶出与外界接触，有效成分易受到氧 化而变质。为了改善这种情况，必须对破壁后的灵芝孢子进行表面改性。微囊 化是表面改性的一种较好的方法。 微胶囊技术是种用成膜材料把固体或液体包覆使形成微小粒子的技术。得 到的微小粒子叫微胶囊。包在微胶囊内部的物质称为囊心，囊心可以是固体， 也可能是液体或气体。微胶囊外部由成膜材料形成的包覆膜称为壁材。壁材通 常是由天然的或合成的高分子材料形成。徼囊的外形取决于囊芯物的性质和囊 材凝聚的方式可以呈球状实体或平滑的球状膜壳型、葡萄串形、表面平滑或 折叠的不规则结构等各种形状c ”。药物微囊化后有以下特点： 能有效地降低芯材的p h 值、氧气、湿度、熟、光和其它物质等步 界环境 因素的反应活性，有效地防止这些外界环境因素对芯材的破坏等不良影响； 减少芯材向环境的扩散或蒸发抑制芯材中有效活性成分的挥发损失，提 茼其稳定性，使品质保持持久； 能人为而有效地控制芯材的释放使芯材原有的效能得到大限度地发挥； 掩盖芯材的异味，改善芯材的口感和味觉； 改变芯材的物理和化学性质，能将液体或半固体的流质体转化为自由流动 的固体粉末，便于贮藏和运输。 胶囊制各方法通常根据其性质、囊壁形成的机制和成囊条件分为物理法、 物理化学法、化学法等3 大类 5 j - 5 6 。化学方法包括界而聚合法、原位浆合法、 聚合物快速不溶解法、气相表面聚合法等。物理化学方法包括水溶液中相分离 法、有机溶剂中相分离法、溶液中干燥法、溶液蒸发法、粉末床法等。物理方 法包括空气悬浮涂层法、喷雾干燥法、真空喷涂法、静电气溶胶法、多孔离心 法等。其中，喷雾干燥法以操作简单，成本低廉而广泛应用于生产中。 根据实验室条件，本文采用小型喷雾干燥器进行破壁灵芝孢子粉的微胶囊 根据实验室条件，本文采用小型喷雾干燥器进行破壁灵芝孢子粉的微胶囊 化的工艺研究。 武汉理工大学硕士学位论文 4 1 实验材料及仪器 灵芝孢子粉，购于山东菏泽市福生堂灵芝科技开发中心 明胶( 分析纯) ，上海化学试剂有限公司； h j 一3 数控恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司； b u c h i1 9 0m i i l is p r a y d r y e r j s m 5 6 1 0 l v 型扫描电子显微镜 d m a x r bx r d 4 2 实验方法 4 2 1 喷雾干燥法制备微囊的原理 药物与水、高分子胶质混匀后形成乳状液，即药物被固态胶薄膜包围的包 裹体悬浮于水中。在喷雾干燥过程中，乳状液被雾化成液滴后，经受热使雾滴 蒸发，在雾滴表面形成一层类似于半透膜样的表面膜。该膜具有网状结构，能 起到网筛作用，一些小分子物质( 如水) ，由于体积小，受热后可顺利移出网 外，而分子体积大的芯材则滞留在网内，由于对水有渗透性，使水分能快速蒸 发，而不造成囊心物的过多损失，从而形成被壁材包围的粉末状微囊颗粒佣。 4 2 2 灵芝孢子微囊的制备 称取一定量的灵芝孢子粉，加入一定量的明胶( 预先用热水溶开) 和2 0 0 m l 蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌10 m i n ，混合均匀后，乳状液经蠕动泵进入喷雾干 燥器的旋转式喷嘴( 直径为0 7 m ) ，见图4 1 。在压缩空气的作用下，可制得粉末 状固体微球。 武汉理工大学硕士学位论文 图4 1 喷雾干燥仪平面图 f i g 4 1 f u n c t i o n a lp r i n c i p l eo f s p r a y 蛳 1 入口，2 加热装置，3 喷嘴，4 旋涡分离器，5 抽气泵，6 进风温度传感器，7 出风温度传感器，8 收集器 4 2 3 分析方法 采用j s m - 5 6 1 0 l v 型s e m 观察灵芝孢子粉微囊化后的形貌；采用d m a x r b x r d 分析微囊化前后的成分变化。 武汉理工大学硕士学位论文 4 3 结果与分析 4 3 1 明胶含量对成囊的影响 图4 2 微囊的s e m 图 f i g 4 2s e mo f m i c r o c a p s u l e ( a 孢子粉：明胶= l ：1 ；b 孢子粉：明胶= 1 ：2 ；c 孢子粉：明胶= l ：3 ) 影响孢子粉成囊结果的工艺参数主要有孢子粉和明胶的相对含量及喷雾干 燥仪的进口温度。改变孢子粉和明胶的相对含量，探索制备明胶胶囊的合适壁 材含量。实验采用的工艺参数为：进口温度：1 0 0 ( 2 ；a s p i r a t i o n ：1 0 0 ：抽气泵：8 ； 增塑剂甘油：3 m l ；气流量：3 0 l h 一。图( a ) 为孢子粉：明胶= 1 ：1 时的微囊 s e m 图。从上图可以看出，微囊间存在着严重的粘接现象，颗粒粒径分布不均 匀，为1 1 0 l lm ；图( b ) 为孢子粉：明胶= l ：2 时的微囊的s e m 图，从上图 可以看出，颗粒分散均匀，颗粒的平均粒径为4 1 0 t jm ；图( c ) 为孢子粉：明 胶= l ：3 的微囊的s e m 图，随着明胶含量的增多，颗粒平均粒径逐渐增大。 武汉理工大学硕士学位论文 4 3 2 x 射线衍射测定 5 0 0 4 0 0 3 0 0 銎 2 0 0 u l o o o 7 0 0 6 0 0 5 0 0 2 护( 。) ( a 孢子粉) 2 0 ( 。) ( b 孢子粉：明胶= 1 ：2 ) 3 7 伽 善 撕 m 。 山u 武汉理工大学硕士学位论文 2 e l ( 。) ( c 孢子粉：明胶= 1 ：3 ) 图4 3x 射线衍射测定 f i g 4 3 x r a yd i f f r a c t i o no f m i e r o e a p s u l e 图4 3 为微囊的x 射线衍射图。图a 为孢子粉原粉；图b 为孢子粉：明胶= 1 ：2 ；图c 为孢子粉：明胶= 1 ：3 。采用的工艺参数为进口温度：1 0 0 c ； a s p i r a t i o n ：1 0 0 抽气泵：8 ；增塑剂甘油：3 m l ；气流量：3 0 l h 。从上图可以 看出，孢子粉存在明显的特征峰，而在1 ：2 和1 ：3 的微囊中，已经看不到孢 子粉的特征峰，说明孢子粉较好的包覆在明胶中。 4 3 3 进口温度对成囊的影晌 m 喜| 枷 蓦 瑚 m 。 山u 武汉理工大学硕士学位论文 图4 4 不同温度形成的微囊的s e m f i g 4 4 s e mo f m i c r o c a p s u l ea td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ( a ：1 0 0 ；b ：9 0 ；c ：8 0 ) 改变喷雾干燥仪的进口温度，探索制备明胶胶囊的合适的进口温度。上图 为进口温度分别为1 0 0 ，9 0 ，8 0 c 所制各的微囊的显微形貌图。所采用的工 艺参数为孢子粉：明胶= 1 ：2 ；a s p i r a t i o n ：1 0 0 ；抽气泵：8 ；增塑剂甘油：3 m l ： 气流量：3 0 l h - 1 。从上图可以看出，当进口温度为8 0 c 时，形成的微囊间的粘 接现象较明显：当进口温度为1 0 0 时，微囊表面存在着较多的皱褶；当进口温 度为9 0 c 时，所形成的微囊表面光滑，颗粒均匀。这是因为：随着进口温度的 降低，溶剂的蒸发很慢，所形成的微囊得不到充分的干燥，颗粒间相互粘接在 一起；而进口温度过高，干燥过快，则液滴会浓缩或变干，使膜产生皱褶；当 温度提高到一定温度时，水的蒸发速度适宜