（生物医学工程专业论文）醋大豆肽与低聚糖的制备与分析.pdf

华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t s o y b e a np e p t i d e sa n ds o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e sh a v ei m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ， t h ec o m p o n e n t so fs o y b e a nc h a n g e dd u r i n gb e i n gs t e e p e di nv i n e g a r ，i nt h e m ，t h ec h a n g e o ft h ep e p t i d e sa n do l i g o s a c c h a r i d e so fs o y b e a ni ss i g n i f i c a t i v ef o rt h e i ra p p l i c a t i o n t h e p e p t i d e sa n do l i g o s a c c h a r j d e sw e r ep r e p a r e df r o ms o y b e a nb ys t e e p i n gs o y b e a ni nv i n e g a r f o r e i g h tm o n t h s ，4 a c e t i c a c i df o r1 ，5 ，1 0 ，a n d1 5 d a y s ，r e s p e c t i v e l y ， f l u o r o p h o r e a s s i s t e dc a r b o h y d r a t ee l e c t r o p h o r e s i s ( f a c e ) w e r ea p p l i e dt od e t e r m i n et h e m o l e c u l a rm a s sd i s t r i b u t i o no fo l i g o s a c c h a r i d e si ns o y b e a no l i g o s a c c h a r i d em i x t u r e s m o l e c u l a rm a s sd i s t r i b u t i o no fp e p t i d e si ns o y b c a l lp e p t i d em i x t u r e sw a sd e t e r m i n e db y s d s t r i s 一1 2 p o l y a c r y a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sf p a g e ) a n ds d s t r i c i n e 一1 7 p a g e ， t h ea m o u n to ft o t a ls u g a ra n dr e d u c i n gs u g a ri ne a c hs o y b e a no i g o s a c c h a r i d em i x t u r e sa n d p r o t e i nc o n t e n ti ns o y b c a np e p t i d em i x t u r e sw e r ed e t e r m i n e d ，t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) d e g r a d a t i o na n dl e a c h i n go fs o y b e a np o l y s a c c h a r i d e sd u r i n gb e i n gs t e e p e di n v i n e g a r o ra c e t i ca c i dw e r ec o n t i n u o u s l ys l o w p r o c e s s e s i nr o o mt e m p e r a t u r e ， d e g r a d a t i o nr a t ei n c r e a s e d a st h et i m e ，b u tl e a c h i n gr a t ed e c r e a s e db e c a u s eo ft h e i n c r e a s i n go fs u g a rc o n c e n t r a t i o nd u r i n gb e i n gs t e e p e d d e g r a d a t i o na n dl e a c h i n g p r o c e s sb o t hr e a c h e de q u i l i b r i u ma f t e r 】5d a y sw i t h o u ta d d i n gf r e s hs o l v e n t s i n c e o l i g o s a c c h a r i d e sa n dr e d u c i n gs u g a rc o n t e n ti nv i n e g a r t r e a t e ds o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e p r e p a r a t i o nw e r e 1 4a n d13t i m e sh i 曲e rt h a nt h a to fs o y b e a no l i g o s a c c h a f i d e p r e p a r a t i o ni nt h es a m em e t h o d ，a n d0 1 i g o s a c c h a r d e so fv i n e g a r t r e a t e ds o y b e a na r e c o m p l e t e l yc o m p o s e do fn o n r e d u c i n gs u g a r s ，w h i c hi n d i c a t e st h a t t h eq u a l i t yo f v i n e g a r t r e a t e ds o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e si sb e t t e rt h a nt h a to fs o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e s t r e a t i n gw i t hv i n e g a ri m p r o v e dt h eq u a l i t yo fs o y b e a no l 培o s a c c h a r i d e sa n de n h a n c e d t h ep h y s i o l o g i c a le f f e c t s ， ( 2 ) d e g r a d a t i o na n dl e a c h i n go fs o y b e a np e p t i d e sf r o ms o y b e a ns t e e p e di nv i n e g a r w a sa l s oac o n t i n u o u s l ys l o wp r o c e s s ，w h i c hw a ss i m i l a rt ot h a to fo l i g o s a c c h a r i d e s t h e r em a yb eal i m i tf o rp e p t i d ed e g r a d a t i o ni nb o t hv i n e g a ra n da c e t i ca c i d ，b e c a u s en o p e p t i d e sw i t hm o l e c u l a rw e i g h tl o w e rt h a n 1 0 0 0 0w a sd e t e c t e d m o l e c u l a rw e i g h to f l l 华中科技大学硕士学位论文 n u m e r o u sd e p t i d e sf r o me x t r a c t so fs o y u e a ns t e e p e di n4 a c e t i ca c i df o r4m o n t h sa n d i nv i n e g a rf o r8m o n t h sw a sa b o u tt 0 0 0 0 ，w h i c hm a k e sv i n e g a r t r e a t e ds o y b e a d p e p t i d e se a s i e rt o b ed i g e s t e da n da b s o r b e dc o m p a r i n gt ou n p r o c e s s e da n dp h y s i c a l l y p r o c e s s e ds o y b e a np r o d u c t s k e yw o r d s ：s o y b e a n v i n e g a r o l i g o s a c c h a r i d e s p e p t i d e s i l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：泓潘 臼期：o f g6 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密阢 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：锻跨 日期：西年多月 日 指导教师签名驯覆勿 日期：。一r 年易月7 曰 华中科技大学硕士学位论文 1 绪论 大豆种子中蛋白质含量高达4 0 左右，超过水稻、小麦、玉米等粮食作物的3 6 倍，与动物蛋白近似，是能代替动物性蛋白质的植物产品，素有”植物肉”之称。 大豆蛋白质所含氨基酸完全，尤其是含有赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏 氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等8 种人体必需的氨基酸，属于平衡性良好的蛋 自质。特别是粮食作物的赖氨酸含量都很低，却含有较多的蛋氨酸，大豆蛋白质的 赖氨酸含量丰富，但是含蛋氨酸较低，将大豆与粮食作物搭配使用，在营养上则有 互补作用，因而大豆在解决营养问题上具有重要的作用。 为了进一步提高大豆蛋白质的营养功能，并改善其加工特性，充分发挥大豆蛋 白质在维系人体健康方面的重要作用，提高大豆产品的附加值，自2 0 世纪7 0 年代 以来，人们对大豆蛋白质的水解进行了不断的深入研究。 1 1 大豆多肽的营养价值和生物学功能 大豆多肽是指大豆蛋白质经蛋白酶等作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解 产物，它由许多种肽分子混合物所组成。市场上的大豆多肽产品的蛋白质含量为8 5 左右，并含有少量游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。 从表1 - l 数据看出，大豆肽的必需氨基酸组成与大豆蛋白质完全一样，各必需 氨基酸的含量更接近国际卫生组织颁布的婴幼儿蛋白质摄入标准，因此大豆多肽是比 大豆蛋白质更好的婴幼儿营养食品。 表1 1大豆多肽必需氨基酸的组成 臀谢量值 乎糕字唑错辩 蓐 t 3 74 33 42 89 摹丙氟t4 9 7 22 219 譬l 鼍 3 4 幢氯t6 2 6 65 84 41 6 比 t1 34 22 5 2 21 7 蛋 t 1 2 邑氯t1 21 7 i i95 囊囊t 4 4 5 5 孙 嚣 1 3 异毛重t 4 44 62 82 81 3 亮毫t7 29 3铀“lq 姐赢豫2 4撕 1 9 1 9 1 6 华中科技大学硕士学位论文 大豆肽可由肠道直接吸收，是各种多肽中吸收率最高的物质，用试管模拟人体内 条件迸行酶解的实验结果表明，大部分被消化蛋白质停留在多胍状态。动物活体实 验也己证明，由肠道直接吸收肽类途径比氨基酸途径具有更大的输送量，肽类是以 非n a + 依赖性载体输送而被吸收【l 。4 】。因此大豆肽适合特殊身体条件，特别是手术后 恢复期的病人，婴幼儿，高龄老人，运动员等的营养需要，可以作为肠道营养剂和流 态食品直接食用5 。8 1 ，满足维持和改善蛋白质营养状态的要求。 大豆肽用于人体，还具有多种调节人体生理机能的作用，用丁微生物发酵，能 改善某些发酵特性。 1 1 1 促进脂肪代谢 大豆肽有很强的促进脂肪代谢效果，k o m a s t u t 对小儿肥胖患者食用低热量食 品与添加大豆肽的食品的对比研究表明，大豆默能更快引起皮下脂肪的减少，而且 添加大豆肽组比其它蛋白组产热量更高，说明大豆肽更能促进能量代谢【9 l 。 1 1 2 加速肌肉细胞的恢复 大豆多肽对运动员有增加肌肉的效果。体育运动时，一般4 一6 的能量消耗是 由肌肉蛋白质分解代谢所提供的，而体内不储存蛋白质和所需的氨基酸，所以必须 及时地从外部补充氮源以免造成肌肉蛋白的平衡破坏。而小分予肽比氨基酸或蛋白 质更易于吸收，有助于及时恢复和增加体力【l 。日本研究了让中距离运动员竞走 2 0 k m 后食用含2 0 9 大豆多肽的饮料，在运动前后分别测定血液中肌红蛋白值，发现 摄取大豆多肽组，其肌红蛋白减少比对照组快由于肌肉细胞破坏时，血液中的肌 红蛋白就会增加；肌肉细胞复原时肌红蛋白减则少。因此这一结果说明大豆多肽有 消除疲劳的效果。 1 1 3 降低血清胆固醇 大豆多肽对胆固醇肛常人无降低胆固醇作用，却使l d l h d l 朝比例下降的方向 转变；对高胆固醇值者有明显的降胆固醇作用。大豆多肽的降胆固醇作用，己多次 被动物实验与人体临床试验证实。s u g a n o 研究证明了降低胆同醇的功能因子足h m f ( 微生物蛋白酶酶解大豆蛋白得到的大分子片断) ，而不是脂肪和大豆皂甙 1 1 1 。实 验还发现大豆蛋白质的胰蛋白酶分解物，分子量在5 0 0 0 d a l 以上的部分有降低胆固醇 的效果“。 华中科技大学硕士学位论文 1 1 4 降血压和降血糖 血压与血管紧张素转化酶( a c e ) 的作用有关。a c e 可通过作用于血管紧张素i 从其c 末端切除h i s l e u ，生成有收缩血管活性的血管紧张素i i ，同时使舒缓激肽失 活，两者共同作用引起血压升高【l 孙。c h e n j i u n r o n g s e 实大豆多肽对a c e 有抑制作 用，因而能降血压。但对正常血压无降低作用 1 4 , 1 5 1 。日本目前己有多种大豆降血压 肽产品出售1 1 6 1 。 n i i h o y 用大豆多肽( 1 9 k g ) 喂养高血糖的小鼠，发现在3 0 1 2 0 m i n 后，大豆多肽 能明显降低小鼠的血糖水平1 1 7 】。 1 1 5 抗氧化性和提高免疫调节活性 大豆蛋白经酶水解后的某些小肽具有类似于谷胱甘肽的作用，有一定的抗氧化 以及清除自由基的能力。已有研究表明，用酸性蛋白酶水解得到的多肽抗氧化能力 最强1 8 , 1 9 l 。分子最在6 0 0 。1 7 0 0 范围内时具有抗氧化作用。h u a 。r u i n gc h e n 等提出抗氧 化性肽由5 1 6 个氨基酸残基组成，并通过氨基酸顺序检测确定r 其氨基酸顺序。 研究还发现大豆肽有免疫调节机能，大豆肽能提高中性白细胞的集成能及肿瘤坏死 因子的产生能，从而起到抑制肿瘤的作用。大豆肽的分子量在3 4 0 0 以下时，不会g 【 起过敏反应。 1 1 6 其他功能 大豆多肽能增强双歧杆菌的发酵作用。并能促进乳酸菌、霉菌、酵母增殖，增 加酵母的产气作用1 2 0 - 2 2 1 。 大豆多肽可用于生产酸奶、于酪、醋、酱油和火腿等食品，能提高生产效率， 改善品质，增强风味和增加营养价值。也可用于生产酶制剂。大豆多肽制作的豆制 品品质和风味更佳，且易于消化吸收，营养丰富。此外，在鱼、肉等高蛋白制品， 焙烤食品，糖果糕点和冷饮食品中，大豆多肽的应用能使生产成本降低，风味品质 改善，保质期延长f 2 3 2 4 j 。 大豆多肽自溶性好，吸湿性和保湿性强，易溶于多种化妆品溶剂中，因此，大 豆多肽可作为保湿剂添加剂用于生产各神化妆品，如用大豆多肽和各种护发剂原料 充分混合制成洗发香波和护发素，使用时能使毛发柔润光滑，效果良好并对毛发 有改善发质，有助于毛发损伤的修复等保护作用。大豆多肽加入香波中可以提高香 波的发泡性，改善泡沫的质量。缓解香波的刺激作用。另外，大豆多肽制成的护肤 化妆品还具有理想的保湿护肤效果【2 ”。 华中科技大学硕士学位论文 1 , 2 大豆多肽的制备工艺 1 2 1 大豆多肽的酶法水解 一些西方学者在上世纪4 0 年代进行蛋白质改性的研究，由于当时及其缺乏鸡 蛋便用酶法改性蛋白质来补充，从而揭开了研究蛋白质水解的序幕。山于受当时 技术条件的限制，水解过程不易控制，水解物的苦味，臭味等问题未能解决，大 豆多肽的研究无多大进展。在6 0 年代术，蛋白酶被用于脂肪、骨和虽白质的分离， 肉的嫩化以及食品功能性质的改善等。1 9 7 4 年，c p u s k i 对蛋白酶改性大豆分离蛋 白的功能特性进行研究，结果发现，酶法改性后的大豆分离蛋白的溶液粘度很低， 不能形成凝胶。随后酶法改性大豆蛋白的研究一直是众多学者关注的课题。上世 纪7 0 年代初，美国开发出新型大豆深加工产品一一大豆多肽。之后美国d e h o w n s p e c i a t i e s 公司建成了年产5 0 0 0 9 屯大豆多肽的工厂。日本在大豆肽开发研究方面也 己进入生产阶段，据报道，他们己经克服了水解产物产生苦味和蛋白酶菌种的选 育难关。经改善风味的大豆肽产品必定被更多的消费者认识和接受，成为人们日 常生活中种优质蛋白质营养品。 从国内外对大豆多肽的研究情况来看，目前在大豆酶法水解制备多肽中主要 存在以下几方面的问题： ( 1 ) 对蛋白质酶解机理与过程控制缺乏系统、深入的理论研究，尤其是在多 酶混合水解或分段水解方面。 ( 2 ) 用于大豆蛋白水解的酶种类不多，仅限于少数几种微生物蛋白酶，动物 蛋白酶和植物蛋白酶。在新酶种的选择和应用上没有新突破。 ( 3 ) 蛋白酶用量大，多肽得率低，生产成本高：水解物的风味，尤其是苦味 问题还未根本解决。 ( 4 ) 水解度与酶解物特性的关系尚未确定，特定生理活性肽的制备还存在一 些技术难题。 1 2 2 生理活性肽的制备 随着生物技术的进步和生命科学的发展，一些活性肽的结构和生理功能逐渐 明确，推动了活性肽的研究，人们发现源于食品蛋白的一些特殊序列具有促吸收， 降血压，调节血清中血脂水平等功能，因此，对于大豆肽中那些具调节血压功能 活性肽的研究成为当今研究大豆肽的热点。r 本对降血压肽的研究则已进入工业 4 华中科技大学硕士学位论文 化阶段，并针对同本国的实际主要在海产低值鱼类与鱼类加工副产品方面进行了 有益的尝试。我国于上世纪8 0 年代中后期开始研究大豆肽，有多所高校相继开展 了对大豆蛋白的酶法水解，大豆肽的功能性质和生理活性的研究。吴建平1 1 7 等通 过研究发现用蛋白酶e 水解大豆豆粕可生产较高活性的降血压肽，并分析了生产出 的大豆降压肽的氨基酸组成和分子量分布。沈蓓英【26 】则水解大豆分离蛋白，控制 水解度为1 7 1 9 ，制得了抗氧化性肽。但市场上仍未见到此类产品。 1 3 大豆低聚糖的营养价值和生物学功能 大豆低聚糖( s o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e s ) 是大豆中可溶性寡糖的总称。其主要成 分是蔗糖( s u c r o s e ) 、棉予糖( r a f f i n o s e ) 、水苏糖( s t a c h y o s e ) 及少量的毛蕊花糖 ( v e r b a s c o s e ) 。某些大豆低聚糖的制品中还合有葡萄糖、果糖、半乳糖肌醇甲醚、 右旋肌醇甲醚等【27 1 。由于糖苷键的特殊构造，大豆低聚糖= 1 i 易被人体的酶作用， 水苏糖和棉子糖对胃酸有一定的稳定性，因此大豆低聚糖为难消化性糖。 人们对大豆低聚糖生理功能1 2 8 , 2 9 1 的认识有一个发展过程。在相当长的一段时间 内认为大豆低聚糖是胀气因子，强调要在大豆加工过程中除去，理由是大豆低聚糖 不被人体消化吸收而直接进入大肠中经产气菌发酵产生c o z 等气体，引起嗝气、肠 鸣或腹痛等使人难以忍受的肠胃胀气现象。近年来，只本以大豆低聚糖为原料进行 了一系列的研究，分别摄入已经酶解去除水苏糖和棉予糖的大豆及未经处理的大 豆，两者间的胃肠胀气现象并无明显差异。而将水苏糖、棉予糖加入原硝i 产气的食 物中，摄入后并没引起胃肠胀气现象的加剧。这些研究表明，大豆低聚糖并不是引 起胀气的直接因素。 大量研究结果表明，水苏糖和棉子糖对人体具有重要的医学价值【3 。这是因为 食入后，它们在小肠内不被消化和吸收，当它们到达回肠和大肠时，却能促进双歧 杆菌等有益菌的增殖，从而具有抑制有害菌生长繁殖、防癌抗癌、防止便秘、老年 性疾病及延缓衰老等一系列生理功效。人体肠道内由于缺乏分解低聚糖所需的酶， 因此不能直接利用大豆低聚糖，但它可以被肠道内的双歧杆菌充分利用【j “。双歧杆 菌是人体肠道内有益菌种，属于嫌气性的革兰氏阳性菌，双歧杆菌的细胞壁可粘附于 肠粘膜的上皮细胞，阻止致病菌的入侵，同时通过以下几种方式抑制有害菌的生长： 双歧杆菌在代谢过程中产生大量的乙酸和甲酸，使肠内环境的p h 下降，从而抑制致 病菌的生长，且有机酸可促进肠道蠕动，防止便秘；双歧杆菌具有胆酸水解酶，能使结 华中科技大学硕士学位论文 合胆酸游离，有效抑制致病菌生长，缺乏胆酸7 。一脱氧酶，可避免病原体所需的二级 胆汁酸生成；产生b i f i l o n g 和b i f i d i n 两种抗菌物质。因此，双歧杆菌可调节和协同 其他肠道菌群，维持肠道菌群平衡，促进肠道蠕动，较好地治疗习惯性便秘、急性腹 泻、小儿秋季腹泻等肠道疾病阮圳。 由于双歧杆菌的细胞、细胞壁成分以及细胞外分泌物都能显著提高机体免疫 力。同时还能直接分解破坏一些致癌物质，并能加速致癌物质排出体外，因此具有 预防肠癌的作用i ”j 。 董玉枝等 3 5 1 研究了大豆低聚糖对高脂太鼠脂质过氧化的影响，结果显示：大 豆低聚糖具有降低血清总胆固醇( t c ) 和血清甘油三脂( t g ) ，增加血清高密度脂 蛋白胆固醇( h d l c ) ，提高h d l c t c 比值的作用。能降低心肌组织过氧化脂质 ( l p o ) 水平，提高心肌组织超氧化物歧化酶( s o d ) 活性；有抑制脑组织过氧化 损伤的趋势。表明大豆低聚糖能改善脂肪代谢，降低衄清胆固醇减轻脂质过氧化 对心脑组织的损伤，有助于延缓衰老进程，减少人类心血管病发生率，提高生存质 量。有人认为，双歧杆菌通过抑制人体内活化的t 细菌，控制新形成低密脂度蛋白 接受器，起到降低血清胆固醇含量的作用。对小鼠的实验结果表明，双歧杆菌通过 影响0 一羟基一b 一甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶的活性，控制胆固醇的合成而降 低血清月h 圆醇的含量1 3 b4 0 1 。也有人认为双歧杆菌代谢产生烟酸的能力与血清胆固 醇水平的降低有一定的关系【4 卜4 4 i 。 胡刚等1 4 5 1 进行了大豆生物活性物质调节免疫作用的研究，在含有大豆低聚糖 的淋巴细胞培养中，m t t o d 值明显高于对照组；含有大豆低聚糖的淋巴细胞与靶 细胞混合培养中，靶细胞释放乳酸脱氢酶明显高于对照组，说明大再低聚糖可以直 接作用于脾淋巴细胞和n k 细胞，促进脾淋巴细胞转化和提高n k 细胞杀伤活性。 研究也表明，大豆低聚糖有明显抑制淀粉老化的作用，且抑制效果随添加量的增 加而加强。因此，在面包等淀粉类食品中添加大豆低聚糖能延缓淀粉老化，防止产品 变硬，延长货架寿命。到目前为止，大豆低聚糖还是美国f d a 唯一认可应用于食品中 的功能性低聚糖。 1 4 大豆低聚糖的制备工艺 大豆低聚糖一般采取水浸取、碱液提取和膜分离技术等制备。水浸取效率很低； 碱液浸取虽有有效成分含量高的优点，但时间太长；而膜分离技术设备投资大，工艺 6 华中科技大学硕士学位论文 较复杂。刘峥等【4 6 l 采用碱液为提取剂，在微波条件下提取大豆中的低聚糖，既保持了 碱液提取的优点，又有操作简单、效率高、时间短的特点，是一种较佳的低聚糖提取 技术。微波提取因升温速度快且受热均匀已成功用于蔗糖、辣椒素、果胶等的提取， 主要是利用微波的介电加热效应。因植物中有效成分大都存在于植物细胞巾，植物 的细胞壁和原生质膜严重地阻碍有效成分的渗出，采用微波辐射手段能有效地改善 这种阻滞扩散过程，因而大大提高了有效成分的溶出。以碱液为提取剂，微波加热提 取大豆中的低聚糖比仅用碱液加热提取时间大为缩短，且在相同碱液浓度下，提取液 中有效成分含量较高。经实验得出微波提取最佳条件为：微波功率5 0 0 w ，提取时间 6 m i n ，碱液浓度1 2 。金华丽等1 47 】确定了较优的碱液提取 j 艺：1 0 9 脱脂大豆粉， 加入1 5 0 m 1 1 n a 2 c 0 3 ，5 5 恒温水浴加热并搅拌，浸提时间2 h 。赵贵兴等【4 剐认为6 0 、1 5 h 、p h l o 1 2 的提取工艺有助于大豆低聚糖的溶出。 开本对大豆低聚糖的开发和应用位居世界的前列，日本卡尔比食品工业公司首 先开发大豆低聚糖，并于1 9 8 9 年产品j 下式上市，年产量约1 5 0 0 吨，产品有糖浆、颗粒、 粉术等形式。我国对大豆低聚糖的研究尚属起步阶段。除黑龙江天菊集团首家研制 成功并投入大批量生产外，其他仍停留于实验室范围。 商品大豆低聚糖是以生产浓缩或分离大豆蛋白时的副产物乳清( 干基含糖量 7 2 ) 为原料生产的，大豆乳清加水稀释后加热处理使残留大豆蛋白沉淀析出，上 清液再经过滤处理进一步滤去残存的大豆蛋白微粒，经活性炭脱色后用膜分离技术 ( 如反渗透) 或离子交换技术进行脱盐处理，接着真空浓缩至含水2 4 左右，即得 透明状糖浆产品。加入赋形剂混均后造粒，再进行干燥即得颗粒状产品 4 9 - 5 3 1 。大豆 低聚糖浆则是一种无色透明液体，甜味纯正，近似蔗糖，甜度为蔗糖的7 0 7 5 。其 粘度高于蔗糖和高果糖浆( 含5 5 果糖的果葡糖浆) ，低于麦芽糖浆( 含麦芽糖5 5 ) ； 与其它糖浆一样，温度升高，粘度降低。人豆低聚糖的吸湿性、保湿性比蔗糖小，但优 于果葡糖浆。其渗透压略高于蔗糖，低于5 5 的高果糖浆。大豆低聚糖浆具有良好 的热稳定性、酸稳定性及酸性贮存稳定性。大豆低聚糖在1 4 0 。c 短时间加热1 i 会分 解，即使加热到1 6 0 。c 对水苏糖和棉子糖的破坏也很少。在酸性条件i i ( p h5 6 ) 加 热到1 2 0 。c 仍很稳定；既使在p h 3 的酸性条件下，大豆低聚糖的稳定性也优于蔗糖。 大豆低聚糖还有很好的酸性贮存稳定性，在p h 3 、2 0 下贮存1 2 0 d ，残存率在8 5 以 上，3 7 。c 下贮存1 2 0 d 残存率仍在6 0 以上。因此，大豆低聚糖可应用于高温加热的罐 头食品及酸性食品与饮料中。 华中科技大学硕士学位论文 1 5 醋大豆及其大豆肽与低聚糖的研究现状 醋大豆即醋浸渍的大豆，是以整粒大豆为原料，经食醋浸渍而成。 醋大豆被视作保健食品，这源于些民间经验，即醋大豆可以预防和治疗便秘， 还可预防高血压，糖尿病及肥胖症，对肩周炎也有显著的效果 5 4 1 。我国民问也早 有关于醋大豆软化血管治疗疾病的说法。 醋大豆的某些作用已经通过科学实验得到一定证明。例如经临床试验【55 1 ，连食1 0 周醋大豆( 每f t3 餐，每餐5 粒) 后，患者的高血压、胆固醇、甘油三酯明显下降。用 醋大豆加工成的醋大豆胶囊( 每1 0 0 9 含亚油酸2 5 3 5 9 ，亚麻酸o 4 o 6 9 ，总黄酮 o 2 o 4 9 ) 具有调节血脂的作用。林建等【56 】进行了醋大豆红曲胶囊调节血脂的实验 研究。其醋人豆红曲胶囊丰要成分是醋大豆和红曲。醋大豆是大豆经食用老醋浸泡 一年之后，烘十、粉碎而成。结果表明，醋大豆红曲胶囊可明显降低血清甘油三酯， 对胆固醇亦有一定的降低作用。作者认为这是由于大豆富含多种成分的降脂物质， 经过食醋浸泡，使这些成分更易于吸收，发挥效能。同时，红曲中含羟甲基四戊酰辅 酶( h m g c o a ) 还原酶抑制剂，已知h m g c o a 还原酶是胆固醇体内生物合成的限速 酶，h m g c o a 还原酶抑制剂的存在能抑制体内胆固醇的合成。在醋大豆红曲胶囊 中，醋大豆与红曲协同作用共同达到降脂的效果。 颜土灿口报道了醋大豆降脂胶囊的制备，并检测了降脂胶囊的活性成分对大鼠 的作用，动物实验结果表明，与喂饲高脂饲料的对照组大鼠相比，醋大豆降脂胶囊能 明显降低血清胆固醇。 有关醋大豆的功能性成分的科学研究也正在开展。 经检测醋大豆的主要营养成分有【5 ”：总酸( 以乙酸计) 5 5 9 1 0 0 9 ，氨基酸( 以 氮计) o 1 4 9 1 0 0 9 ，还原糖( 以葡萄糖计) 2 0 9 1 0 0 9 ，蛋白质3 , 0 9 1 0 0 9 ，大豆 低聚糖3 0g ，不饱和脂肪酸8 0 ( 占总脂肪酸的百分数) ，卵磷脂6 0g ，以 及醋酸铬、维生素，异黄酮类物质，微量元素以及多种生理活性酶。 韩涛等 5 8 1 研究了大豆在醋渍过程中包括总酸含量和游离氨基酸含量等物质含 量的变化，并对醋大豆产品的感观评价作了分析，结果表明在一定浓度的醋液中， 大豆含酸量在开始的1 2 h 内快速增加，浸渍醋液的含酸量则快速下降，从2 4 h 以后， 大豆的含酸量和浸渍醋液的含酸量都趋于恒定。当增加醋液浓度时，大豆含酸量随 醋液浓度的增加，在开始的1 2 h l 勾也表现出快速增加，随后增加缓慢，继而含酸量趋 华中科技大学硕士学位论文 于稳定。在相同的浸泡时间下，醋液浓度对醋大豆含酸量有明显的影响，要获得含 酸量高的醚大豆，或缩短浸渍时间，应使用较高浓度的醋液浸渍大豆。在不同浓度醋 液中达到平衡后，大豆平衡酸度与原始醋液浓度呈良好的线性关系。渍醋4 8 h 后， 大豆中游离氨基酸的含量增加，每l o o g 豆- 予分别增加了6 2 1 0m g ，而醋液中游离氨 基酸的含量减少了1l o m g 。由此韩涛等分析认为，豆子中游离氨基酸含量的增加不 仅是醋液中游离氨基酸转移到大豆中，很可能在渍醋期间，大豆蛋白质被醋巾酸所 作用，分解出少量游离氨基酸。这对增加醋大豆产品中有效成分的含量是有益的。 表明用渍豆醋液加工功能饮料，可能会带来附加的社会和经济效益。 刘曼西和陈芬怕圳分析比较了醋浸2 8 d 前后大豆中可溶性总糖及还原糖、脂肪 酸、氨基酸、可溶性蛋白质和总黄酮等成分的差异。结果表明，醋浸后浸泡的醋液 中可溶性总糖和还原性糖的含量均显著增加，各约是水浸泡大豆的1 1 倍和2 2 倍。 留存在醋大豆的总糖和还原糖的含量显著低于水浸泡大豆，各比水浸泡大豆下降了 3 5 u4 0 。大豆中主要的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的相对含量均下降，其中， 软脂酸下降了1 2 l ，硬脂酸下降了o 5 8 ，油酸下降了3 0 1 。而主要的多i i 饱 和脂肪酸的相对含量显著升高。其中，亚油酸增加了1 3 2 ，亚麻酸增加了6 3 2 。 上述5 种脂肪酸中，饱和脂肪酸，单不饱和脂肪酸多不饱和脂肪酸的比例在水浸泡 大豆中为1 ：1 3 ；3 2 ，在醋大豆中为1 ；1 2 ：4 1 。大豆的蛋白质含量显著降低， 留存在醋大豆中的总可溶性蛋白质约为水浸泡大豆的2 0 ，溶出到浸泡醋液中的 蛋白质约为水浸泡大豆的1 6 。根据蛋白质电泳谱带推测醋大豆及浸泡醋液含有 较多低分子量多肽。醋浸后大豆的总氨基酸含量由1 5 7 下降为1 3 4 ，其中必需 氨基酸的含量下降了1 3 8 ，非必需氨基酸的含量下降了0 9 2 ，唯一例外的是组 氨酸含量约增加了l 倍。除了组氨酸外，两种碱性氨基酸与两种酸性氨基酸( 含两 种酰胺) 的比值在醋大豆中为1 0 4 ，水浸泡大豆中为1 2 2 。表明碱性氨基酸溶出较 多。与水浸泡大豆比较，醋大豆中的异黄酮的种类及其相对含量发生了很大的变化。 在醋浸后，大豆中的异黄酮类物质溶出较多，致使浸泡醋液中异黄酮类化合物的含 量增加。 王清祺1 6 0 l 等采用2 乙酸浸泡大豆7 天，对其会雀花素相对含量与常见大豆类制 品中的金雀花素相对含量作了比较，结果表明，醋大豆中的金雀花素含量最少，很 可能和它经过了乙酸的浸泡溶出、分解或与乙酸发生了反应有关。另外，从聚酰胺 层析结果可以看出，其它成分的变化也比较显著。 9 华中科技大学硕士学位论文 另外有报告指出经过长时间的醋渍大豆中原有的一些有害物质如胰蛋白酶抑 制因子，凝血素等在乙酸的作其；j 下失去活性，使得大豆的功效更加突出5 8 1 。 1 6 研究内容、目的与意义 综上所述，大豆肽和大豆低聚糖是有重要生理作用的物质。醋浸过程中，大 豆诸成分均发生变化，但是以大豆肽和低聚糖的积累最有实际意义。本文拟制备和 部分纯化醋大豆低聚糖和多肽，并借助荧光辅助糖电泳和s d s 一聚丙烯酰胺凝胶 电泳研究醋浸过程大豆多糖和蛋白质的降解或改变，分析醋大豆低聚糖的组成和肽 的分子量分布。该研究将为醋大豆产品的开发提供理论依据。 o 华中科技大学硕士学位论文 2 1 前言 2 醋大豆低聚糖的制备与分析 人豆多糖主要是阿拉伯半乳聚糖和纤维素等。大豆低聚糖( s o y b e a n o l i g o s a c c h a r i d e s ) 是大豆中可溶性寡糖的总称，主要成分是蔗糖( s u c r o s e ) 、棉子糖 ( r a f f i n o s e ) 、水苏糖( s t a c h y o s e ) 及少量的毛蕊花糖( v e r b a s c o s e ) 呻“。鉴于水苏糖和棉 子糖是大豆低聚糖中的主要有效成分，他们都是非还原糖，因此大豆低聚糖的品质 应以有较高比例的非还原糖作为评定标准。 水苏糖和棉子糖广泛存在于各种植物中，但以豆科植物的含量最多。研究表明， 末成熟的大豆几乎没有水苏糖和棉子精，到了成熟期其含量才会显著增加，但大豆 一旦发芽，其含量随之减少。采收后的大豆即使在低于1 5 和6 0 相对湿度以卜的 条件下贮藏，其水苏糖和棉子糖的含量仍会减少。这表明大豆能够产生水解水苏糖 或棉子糖等的酶。因此抑制酶的活动应该是制备大豆低聚糖中应予以注意的。 刘曼西和陈芬的研究表明，醋浸后浸泡的醋液中可溶性总糖和还原性糖的含量 均显著增加1 5 。但是未说明这些糖是否低聚糖。已知蔗糖、棉子糖、水苏糖及毛 蕊花糖均为非还原性寡糖。水苏糖和棉了糖的化学结构式是在蔗糖分子的葡萄糖一 侧以a 一1 ，6 糖苷链分别结合两个和一个半乳糖分子构成的糖( 图2 一1 ) 。如果它们 水解，将会产生还原性单糖，而阿拉伯半乳聚糖和纤维素如果水解，则应产生还原 性低聚糖和还原性单糖。 c h ，o hr c h ， 嗨。蝠茹轼 “o h“o hh t 图2 。1大豆低聚糖的结构 裂。赃m 州一 辑 华中科技大学硕士学位论文 因此有必要研究醋浸过程中大豆多糖和低聚糖的水解产物。评判醋浸是否能改 善大豆低聚糖的品质。 本章拟采用荧光辅助糖电泳跟踪醋浸过程中多糖和低聚糖的水解。荧光辅助糖 电泳( f l u o r o p h o r e a s s i s t e dc a r b o h y d r a t ee l e c t r o p h o r e s i s ，f a c e ) ，也称为荧光标记糖的 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s o ff l u o r o p h o r e l a b e l e d s a c c h a r i d e s ，p a g e f s ) ，是本实验室黄刚良博士引进的一种简单、快捷的糖类分析方 法。操作时，利用适当的试剂通过还原胺化反应在糖的还原端引入一个荧光基团， 所得糖荧光标记产物用高密度聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，p a g e ) 可达到高分辨率的分离，然后在紫外光下观察分析，灵敏度 可达到亚p m o l l l 水平。目前，已有数种衍生方法和若干种相应衍生试剂被应用，其 中8 一氨基萘基一1 ，3 ，6 一三磺酸( 8 - a m i n o n a p h t h a l e n e 1 ，3 ，6 - w i s u l f o n a t e ，a n t s ) 应 用较多。a n t s 衍生化的糖分予不仅提供了生色( 荧光) 基团，还提供了3 个负电荷， 使原来为中性的糖分子能在各种p h 值的缓冲液中，在电场力作用下产生电迁移。分 离寡糖常使用的凝胶浓度范围为2 0 - - 4 0 ( w l v ) 。该方法具有快速、灵敏且较价廉， 可以对多个样品平行地进行定量分析，技术上易操作等优点。本实验室的研究工作 已经证明荧光辅助糖电泳分离时，寡糖间可以根据聚合度( 相对分子质量) 和糖莆 键等彼此区分( 尚未报告) ，这是因为以聚丙烯酰胺凝胶作载体的荧光辅助糖电泳 具有分子筛效应，因而能够分离聚合度不同的寡糖。 糖的定量分析采用葸酮法和3 ，5 二硝基水杨酸法( d n s 法) 。蒽酮硫酸法是 利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，测定时下扰较大，限于目前国内的实验 条件，多糖的含量仍然主要采用这种方法，其原理为：多糖在浓硫酸水合产生的高温 下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与葸酮反应生成橙色衍生物。在波长4 9 0 n m 左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色 法测定其含量，所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成。一致或为含量较高的单糖， 这样测得的值较准确。需要强调的是，这种方法所测定的是总糖的含量而不是总多糖 的含虽，因此首先应测定样品中游离的单糖含量，然后将总糖的含量减去游离单糖的 含量，即为总多糖的含量。3 ，5 - 二硝基水杨酸比色法( d n s 法) 利用单糖或还原性 寡糖的还原性，使二价铜离子还原为价铜，它是在碱性条件下显色，能较准确测定 还原糖。 虽然荧光辅助糖电泳只能应用于具有还原端的寡糖混合物的分析，但是可以跟 踪水解中还原性寡糖和单糖的产生，如果与糖的定量测定方法结合，则有可能用来 分析多糖和寡糖的水解程度。 华中科技大学硕士学位论文 2 2 材料与方法 2 2 1 醋大豆和对照大豆样品的制备 东北大豆购自华中科技大学集贸市场。 浸泡大豆用的白醋为佛山市海天调味食品有限公司液念发酵产品。其中含水、 食用醋酸、白酒、食盐，总酸度3 5 9 1 0 0 m l 。 称取5 0 0 9 大豆，无菌水冲洗干净，滤干，浸泡在1 5 l 该白醋液中。静置约8 个月，过滤，分别收集醋大豆和滤液( 以下称醋大豆液) 。留取少量未浸泡白醋液 作为对照( 以下称食醋) 。 称取2 5 0 9 干大豆，无菌水冲洗干净，滤干，按1 9 3 m l 分别浸泡在4 乙酸和 水中。常温下静置1 d 、5d 、1 0 d 、1 5d ，2 0 d 过滤，分别收集大豆和浸泡液。 用家用食品加工器将醋大豆和对照大豆分别粉碎成醋大豆粉和对照大豆粉( 以 下分别称为醋大豆和对照大豆) ，用研钵进一一步粉碎，置于一1 0 。c 冰箱保存备用。 2 2 2 主要试剂及药品 乙醇、冰乙酸、浓盐酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、3 ，5 一二硝基水杨酸等均为 分析纯。丙稀酰胺( a c r y l a m i d e ) 、双丙稀酰胺( b i s a c r y l a m i d e ) 、过硫酸铵( a m m o n i u m p e r s u l f a t e ) 、四甲基乙二胺( t e m e d ) 、硼氰氰化钠( n a b h 3 c n ) 等购于s i g m a 。a n t s 购于e u g e n e ，o r ，u s a 。二甲亚磺l ( d i m e t h y s u l f o x i d e ，d m s o ) 购于m e r c k 公司。所用水 均为超纯水。 2 2 3 主要仪器设备 可见分光光度仪( w j f7 2 0 0 型) ，紫外分光光度计( t h e r m os p e c t r o n i c ) 、凝 胶电泳仪( 北京六一仪器厂生产) 、离心机、恒温水浴、电子天平、微量移液器、 家用食品加工器、凝胶成像仪等。 2 2 4 大豆低聚糖的提取 低聚糖的提取参照文献1 4 7 1 ： ( 1 ) 取l o g 大豆样品加入l 碳酸钠15 0 m l 。5 5 。c 水浴2h 。 ( 2 ) 过滤得滤渣和滤液( 乳清) 。滤渣置4 冰箱中保存。 ( 3 ) 滤液( 乳清) 用2 m 盐酸调节p h 至4 5 左右，置于3 2 水浴l o m i n ，使 蛋白沉淀，冷却后，置4 冰箱过夜。 华中科技大学硕士学位论文 ( 4 ) 离心上述滤液，得