（老年医学专业论文）apoe小鼠动脉粥样硬化中炎症因子的变化及药物干预.pdf

嬲嬲炒a p o e 以小鼠动脉粥样硬化中炎症因子的变化及药物干预研究生：杨国良专业：老年医学导师：李晓燕教授中文摘要中又捅要目的动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 是临床中最常见、危害人类健康最严重的心血管疾病之一。近年来大量的研究表明，炎症和免疫学机制参与了动脉粥样硬化的发生和发展。在炎症和免疫学机制中，各种具有生物活性的炎症因子起着重要的作用。本研究通过建立动脉粥样硬化动物模型，探讨动脉粥样硬化发展过程中t h l t h 2 相关细胞因子及抵抗素的变化，评价瑞舒伐他汀钙及依折麦布对炎症因子的干预作用，为防治动脉粥样硬化提供一种新的思路。方法采用高脂饲料喂养4 周龄雄性a p o e 。小鼠，建立动脉粥样硬化( a s ) 模型，4 周龄雄性a p o e 壬小鼠4 8 只，随机被分为四组：( 1 ) 模型组；( 2 ) 瑞舒伐他汀钙( 1 0 m g k g d ) 组：模型组+ 瑞舒伐他汀1 0 m g k g d 蒸馏水稀释后灌胃；( 3 ) 瑞舒伐他汀钙( 5 m g k g d ) 组：模型组+ 瑞舒伐他汀钙5 m g k g d 蒸馏水稀释后灌胃；( 4 ) 依折麦布组：模型组+ 依折麦布5 m g k g d 蒸馏水稀释后灌胃。4 周龄雄性c 5 7 b l 6 j 野生型小鼠12 只，做为正常对照组。喂养1 2周以后，处死小鼠，收集血清，使用酶比色法测定血清t c 、t g ，使用直接测定法测定血清h d l c 、l d l c ，采用酶联免疫吸附( e l i s a ) 法检测血清内i f n 吖、i l 10 及抵抗素的含量。取出小鼠主动脉，以石蜡包埋，行主动脉根部的连续切片，应用苏木素依红染色( h e 染色) 后，观察和检测小鼠动脉粥样硬化( a s ) 斑块的组织学特点和病变面积，测量斑块的面积( p a ) 、血管管腔的面积( l a ) ，计算校正的斑块面积( 斑块面积血管管腔面积，p a l a ) ，并使用百分比( ) 表示。取小鼠的胸腹主动脉( 自主动脉弓头臂干动脉至髂总动脉的分叉处) 段，使用酶联免疫吸附( e l i s a ) 法检测胸腹主动脉内的i f n 吖、i l 一1 0 含量。结果1 高脂饲料喂养a p o e 小鼠8 周后，主动脉根部形成明显的动脉粥样硬化，斑块体积增大。2 瑞舒伐他汀钙两组和依折麦布组均较模型血中t c 、l d l c 浓度有不同程度的下降，差异有显著性( p 0 0 5 ) 。3 h e 染色观察显示：瑞舒伐他汀钙两组及依折麦布组小鼠动脉粥样硬化( a s ) 病变明显改善，其中瑞舒伐他汀钙( 10 m g k g d ) 组疗效更为显著。4 瑞舒伐他汀钙( 1 0 m g k g d ) 组a s 病变的相对面积显著低于模型组( p 0 0 1 ) 。瑞舒伐他汀钙( 5 m g k g d ) 组、依折麦布组a s 病变的相对面积低于动脉粥样硬化模型组( p 0 0 5 ) 。瑞舒伐他汀钙组间有显著性差异( p 0 0 5 ) 。5 模型组与正常对照组比较，血中i f n 丫浓度均明显升高( p o 0 1 ) ，血i l 1o 浓度明显降低( p 0 0 5 ) 。瑞舒伐他汀钙两组较模型组血中i f n 丫浓度均降低，血i l 1o 浓度明显升高，差异有显著性，p 0 0 1 。瑞舒伐他汀钙不同剂量组间i f n y 浓度、i l 1o 浓度相比，差异有显著性，p 0 0 5 。6 瑞舒伐他汀钙两组较模型组主动脉中i f n 吖浓度均降低，血i l 1 0 浓度明显升高，差异有显著性，p 0 0 1 。瑞舒伐他汀钙不同剂量组间i f n 吖浓度、i l 1 0 浓度相比，差异有显著性，p 0 0 5 ) 。7 模型组与正常对照组比较，血清抵抗素浓度明显升高，差异有显著性，p 0 0 1 。瑞舒伐他汀钙两组较模型组血清抵抗素浓度均降低，差异有显著性，p 0 0 1 。瑞舒伐他汀钙不同剂量组间抵抗素浓度相比，差异有显著性，p 0 0 5 ) 。结论，1 高脂喂养a p o e 小小鼠是理想的动脉粥样硬化动物模型。a s 病变部位以主动脉根部最为明显。动脉粥样硬化模型形成时间短，斑块明显。2 动脉粥样硬化的发展过程中，血清和主动脉中t h l 相关细胞因子( i f n y ) 急剧增加，t h 2 相关细胞因子( i l 10 ) 的数量随之下降，表明t h l t h 2细胞因子的失衡在动脉粥样硬化( a s ) 病变的形成中起了重要作用。3 瑞舒伐他汀钙除了较强的调脂作用外，明显降低t h l 相关细胞因子的含量，且升高t h 2 相关细胞因子。他汀类药物治疗具有较强的抗炎疗效，能2降低t h l 细胞的激活程度，改善t h l t h 2 细胞比例的不平衡，从而减轻动脉粥样硬化，此可能为他汀类药物防治动脉粥样硬化( a s ) 的机制之一。4 瑞舒伐他汀钙可有效地降低动脉粥样硬化小鼠的血和主动脉中i f n 吖含量以及血清抵抗素含量，显著抑制炎症反应，抑制粥样斑块进展。剂量为10 m g k g d 的瑞舒伐他汀钙作用强于5 m g k g d 的瑞舒伐他汀钙。关键词动脉粥样硬化：辅助性t 细胞：t h l t h 2 相关细胞因子；干扰素一丫；白细胞介素1 0 ；抵抗素；瑞舒伐他汀钙；依折麦布c h a n g e so fi n f l a m m a t o r yf a c t o r o na t h e r o s c l e r o s i so fa p o e 。7 。m i c ea n dt h ee f f e c to fd r u g sn a m e ：y a n gg u o l i a n gs p e c i a l i t y ：g e r i a t r i c s ( c a r d i o l o g y )s u p e r v i s o r ：p r o l ix i a o - y a na b s t r a c to b je c t i v ea t h e r o s c l e r o s i si so n eo ft h ec o m m o n e s tc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s ，w h i c hb r i n g sg r e a tt h r e a t e nt op a t i e n t s h e a l t h i n + r e c e n ty e a r s ，al o to fs t u d i e sh a v es h o w e dt h a ti n f l a m m a t i o na n di m m u n em e c h a n i s mt a k ep a r ti nt h ep a t h o p h y s i -o l o g i c a lp r o c e s so fa t h e r o s c l e r o s i s i n f l a m m a t o r yf a c t o rp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ec o u r s e t h ea i mo ft h i ss t u d yi st oo b s e r v ee x p r e s s i o no ft hl t h 2c y t o k i n e sa n dr e s i s t i na n de v a l u a t et h ee f f e c to fr o s u v a s t a t i na n de z e t i m i b ei n t e r v e n c eo na t h e r o s e l e r o s i so fa p o l i p o p r o t e i nek n o c k o u tm i c e o u rr e s e a r c hw o u l ds u p p l yan e wi d e ao ni n v e s t i g a t ea n dc u r eo fa t h e r o s e l e r o s i s m e t h o d s4 8f o u rw e e k so l da p o e 。7 。m i c ef e dw i t hh i g hf a tw e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t of o u rg r o u p s ：m o d e lg r o u p ，r o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p ( 10 m g k g d ) ，r o s u v a -s t a t i nc a l c i u mg r o u p ( 5 m g k g d ) ，e z e t i m i b eg r o u p m e a n w h i l e ，t a k e1 2h e a l t h ym i c e ( c 5 7 b l 6m i c e ) w i t ht h es a m ea g ea n ds a m eg e n e t i cb a c k g r o u n dt ot h en o r m a lg r o u p t w e l v ew e e k sl a t e r ，m i c ew e r ea n e s t h e t i z e d s e r u mw a ss a v e d c o n c e n t r a t i o n so fs e r u ml i p i d s ( t c ，t g ，l d la n dh d l ) w e r em e a s u r e db yb i o c h e m i s t r ya n a l y z e r t h ee x c i s e da o r t i cr o o t sw e r ee x a m i n e df o rd e t a i l e dh i s t o l o g i c a la n a l y s i s p a r a f f i ns e c t i o n sf r o mt h ea o r t i cr o o tw e r es t a i n e dw i t hh e m a t o x y l i na n de o s i n t h es i z eo fa t h e r o s c l e r o t i cl e s i o ni ne a c hs e c t i o nw a se v a l u a t e d c o n c e n t r a t i o n so fi l 10 ，i f n 一丫i ns e r u ma n dt h et h o r a c o a b d o m i n a la o r t aa n dc o n c e n t r a t i o no fr e s i s t i ni ns e r u mw e r em e a s u r e db ye l i s a r e s u l t s1 a se m e r g e do b v i o u s l yi nt h ea o r t i cr o o ti na p o e 。卜m i c ef e dw i t hh i g hf a td i e t ，a n dt h ea r e ao fp l a q u ew a sf a i r l yl a r g e 2 p l a s mt ca n dl d lw e r el o w e ri nr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p sa n d4e z e t i m i b eg r o u pt h a nt h o s ei nm o d e lg r o u p ( p 0 0 5 ) 3 r e s u l to fp a t h o m o r p h 0 1 0 9 ys u g g e s t e dt h a tt h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so fa p o e 。，。m i c e sa o r t a sa n dc o r o n a r ya r t e r i e si nr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p sa n de z e t i m i b eg r o u pw e r eo b v i o u s l yi m p r o v e dt h a nm o d e lg r o u p ，a n dt h e e f f e c to fr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p ( 10 m g k g d ) w a sb e t t e r 4 t h ep l a q u ea r e a so fr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p ( 10 m g k g d )w e r eo b v i o u s l ys m a l l e rt h a nt h a to fm o d e lg r o u p ( p 0 01 ) t h ep l a q u ea r e a so fr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p ( 5 m g k g d ) a n de z e t i m i b eg r o u pw e r es m a l l e rt h a nt h a to fm o d e lg r o u p ( p 0 0 5 ) t h ep l a q u ea r e a sh a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p s ( p 0 0 5 ) 5 t h el e v e lo fi f n 丫i ns e r u mw a se l e v a t e di nm o d e lg r o u pc o m p a r e dt ot h o s ew i t ht h en o r m a lg r o u p ( p 0 01 ) t h el e v e lo fi l 一10i ns e r u mw a sd e c r e a s e di nm o d e lg r o u pc o m p a r e dt ot h o s e w i t ht h en o r m a lg r o u p ( p 0 0 5 ) t h ec o n c e n t r a t i o n so fi f n 丫i ns e r u mw e r ed e c r e a s e di nr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p sc o m p a r e dt ot h o s ew i t hm o d e lg r o u p ( p 0 0 1 ) t h ec o n c e n t r a t i o n so fi l - 1 0i ns e r u mw e r ee l e v a t e di nr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p sc o m p a r e dt ot h o s ew i t hm o d e lg r o u p ( p 0 o1 ) t h ec o n c e n t r a t i o n s o fi l - 10a n di f n 。丫i ns e r u mh a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p s ( p 0 0 5 ) 6 t h ec o n c e n t r a t i o n so fi f n 丫i nt h et h o r a c o a b d o m i n a la o r t aw e r ed e c r e a s e di nr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p sc o m p a r e dt ot h o s ew i t hm o d e lg r o u p ( p 0 01 ) t h ec o n c e n t r a t i o n so fi l 10i nt h et h o r a c o a b d o m i n a la o r t aw e r ee l e v a t e di nr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p sc o m p a r e dt ot h o s ew i t hm o d e lg r o u p ( p 0 01 ) t h ec o n c e n t r a t i o n so fi l 10a n di f n 丫i nt h et h o r a c o a b d o m i n a la o r t ah a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p s ( p 0 0 5 ) 7 t h ec o n c e n t r a t i o n so fr e s i s t i ni ns e r u mw e r ee l e v a t e di nm o d e lg r o u pc o m p a r e dt ot h o s ew i t ht h en o r m a lg r o u p ( p 0 01 ) t h ec o n c e n t r a t i o n so fr e s i s t i ni ns e r u mw e r ed e c r e a s e di nr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p sc o m p a r e dt ot h o s ew i t hm o d e lg r o u p ( p 0 o1 ) t h ec o n c e n t r a t i o n so fr e s i s t i ni ns e r u mh a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gr o s u v a s t a t i nc a l c i u mg r o u p s ( p 0 0 5 ) c o n e l u s i o n s1 a p o ek n o c k o u tm i c ef e dw i t hh i g hf a td i e ta r eg o o da n i m a lm o d e l sf o ra d v a n c e da t h e r o s c l e r o t i cp l a q u e sr e s e a r c h t h ea o r t i cr o o ti sas i t ew h e r ea t a t h e r o s c l e r o t i cp l a q u e sh a v eb e e nr e p o r t e dt oo c c u ri nt h ea p o ek n o c k 。o u tm o u s e l e s i o n sd e v e l o pr a p i d l ya tt h i ss i t e ，e s p e c i a l l yu n d e rc o n d i t i o n so fh i g hf a td i e t 2 t h ec o n t e n to ft h lc e l l sr e l a t e dc y t o k i n e si ns e r u ma n dt h et h o r a c o a b d o m i n a la o r t aw e r ei n c r e a s e d ，b u tt h 2c e l l sr e l a t e dc y t o k i n e sw e r ed e c r e a s e di nt h ep a t h o p h y s i o l o g i c a lp r o c e s so fa t h e r o s c l e r o s i s t h ei m b a l a n c eb e t w e e nt h lc e l l sa n dt h 2c e l l sm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l eo nt h ed e v e l o p m e n to fa t h e r o s e -l e r o s i s 3 r o s u v a s t a t i nc o u l di n t e r v e n ew i t he x p e r i m e n t a la t h e r o s c l e r o t i ed e v e l o p m e n ti nm i c e ，w h i c hm e c h a n i s mm i g h tb et h a tr o s u v a s t a t i nc o u l ds u p p e r s s i v el i p i d ，a n di tc o u l ds u p p r e s st h ea c t i v a t i o no ft h lr e l a t e dc y t o k i n e sa n di m p r o v et h ei m b a l a n c eo ft hl t h 2 4 t h er o s u v a s t a t i nc a l c i u mc o u l ds i g n i f i c a n t l yd e c r e a s et h el e v e l so fi f n 一丫i ns e r u ma n dt h et h o r a c o a b d o m i n a la o r t aa n dd e c r e a s et h el e v e l so fr e s i s t i ni ns e r u m ，i n h i b i ti n f l a m m a t o r ya n di n h i b i tt h ep r o g r e s s i o no fa t h e r o s c l e r o s i s w h e r e a sr o s u v a s t a t i ng r o u p ( 10 m g k g d ) h a ss t r o n g e ri n f l u e n c et h a nr o s u v a s t a t i ng r o u p ( 5 m g k g d ) k e yw o r d sa r t h e r o s c l e r o s i s ；th e l p e rc e l l ；t hl t h 2c y t o k i n s ；i f n - y ；i l - 10 ：r e s i s t i n ：r o s u v a s t a t i n ；e z e t i m i b e6英文缩写英文全称a sa p o ea p o e ，t ct gl d lh d le l i s ah et ht h lt h 2i li l 1 0i l 2i l 4i l 6i l 一1 3i f n 吖t n fm h cv c a mh m g c o ap b so de za t h e r o s c l e r o s i sa p o l i p o p r o t e i ne符号说明a p o eg e n ek n o c k o u tt o t a lc h o l e s t e r o lt r i g l y c e r i d el o w d e n s i t yl i p o p r o t e i nh i g h d e n s i t yl i p o p r o t e i ne n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a yh e m a t o x y l i n - e o s i nth e l p e rc e l l st - h e l p e r1t - h e l p e r2i n t e r l e u k i ni n t e r l e u k i n l0i n t e r l e u k i n 2i n t e r l e u k i n 4i n t e r l e u k i n - 6i n t e r l e u k i n l3i n t e r f e r o ng a m m at u m o rn e c r o s i sf a c t o r中文全称动脉粥样硬化载脂蛋白ea p o e 基因敲除总胆固醇甘油三酯低密度脂蛋白高密度脂蛋白酶联免疫吸附试验苏木精一伊红辅助性t 细胞l 型辅助性t 细胞2 型辅助性t 细胞白细胞介素白细胞介素1 0白细胞介素2白细胞介素4白细胞介素6白细胞介素13干扰素吖肿瘤坏死因子m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x主要组织相容性抗原v a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o l e c u l e血管细胞黏附分子3 - h y d r o x y 一3 一m e t h y l g l u t a r i ca c i d3 羟3 甲基戊二酰辅酶ap h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o no p t i c a ld e n s i t ye z e t i m i b e7磷酸盐缓冲液光密度依折麦布 - - 一刖舌随着中国经济发展及人类物质生活结构的改变，心血管疾病的发病率已经排在各种疾病之首。其中，动脉粥样硬化( a s ) 及其并发症占有很大的比例。动脉粥样硬化( a s ) 可引起严重的临床并发症，并且具有较高的致死率【l 】。但是动脉粥样硬化( a s ) 发病的详细机制尚未完全明确。因此，有关a s 的发病机制及其防治的研究一直是医学研究领域的热门课题。尽管人们曾先后提出脂质浸润学说、血栓形成和血小板聚集学说、单克隆学说等，但对动脉粥样硬化的发生机制不能提供确切的答案。r o s s 在19 9 9年提出了损伤一反应学说【2 】，得到大家的认可。r o s s 提出“a s 是一种炎症性疾病而不是单纯的脂质沉积所导致”的概念，指出其具有慢性炎症反应特征的病理过程，炎症反应伴随于动脉粥样硬化发病全过程。大量的研究表明，在动脉粥样硬化病变处有不同程度的炎性细胞的浸润及一些炎症介质的表达【3 】3 。越来越多证据表明动脉粥样硬化是一种慢性炎性病变【4 1 ，参与a s 发生、发展的各种细胞有血管内皮细胞、单核巨噬细胞、平滑肌细胞和t 淋巴细胞，其中巨噬细胞和t 淋巴细胞的相互作用可促发细胞免疫反应。同时，被激活的t 淋巴细胞，主要是辅助性t 细胞( t h ) 可产生细胞因子，影响a s 的进展过程。有研究表明，应用c d 4 单克隆抗体消除高胆固醇饲料小鼠辅助性t 淋巴细胞，可使主动脉的粥样硬化斑块面积减少7 0 ，以c d 3 单克隆抗体排空t 细胞也有同样的作用。因此，辅助性t 淋巴细胞在动脉粥样硬化的形成中发挥了重要的作用p j 。辅助性t 细胞( t h ) 根据分泌细胞因子的种类可分为t h l 和t h 2 两个亚群，t h l 细胞主要分泌的细胞因子有i f n 吖、i l 2 、i l 17 、t n f - a 等，作为致炎性介质，增强细胞毒性t 细胞和n k 细胞的活性，主要起促进细胞免疫应答的作用；t h 2 细胞主要分泌的细胞因子有i l 一4 、i l 1 0 、i l 1 3 、i l 5 等，作为抗炎性介质，主要使b 淋巴细胞产生抗体，发挥体液免疫的作用【6 】。在人类动脉粥样硬化( a s ) 的发病各阶段中均有不同程度的t 淋巴细胞浸润，其中主要为t h l 亚群细胞，t h 2 亚群细胞较少【7 】。一般认为t h l 样细胞促进而t h 2 样细胞减轻炎症反应。应用药物或基因敲除的方法阻止t h l 信号途径传导，可以延缓动脉粥样硬化的进程【8 ，9 ，1 0 ，】。而t h 2 相关细胞因子可以增强抗动脉粥样硬化的免疫反应l l 引，白细胞介素10 可以阻止t h l 作用途径，8白细胞介素1o 缺失1 3 、鼠脂质条纹的进展明显加快【1 3 , 1 4 】。抵抗素是一种由脂肪细胞分泌的肽类激素，存在于血浆中的富含半胱氨酸的分泌性蛋白，属于抵抗素样分子。越来越多研究表明抵抗素与a s 相关，并参与了a s 的发生发展，抵抗素含量与炎症因子的含量呈现正相关，而且一致都认为炎症的过程中存在着高抵抗素水平。他汀类药物是3 羟3 甲基戊二酰辅酶a ( h m g c o a ) 还原酶抑制剂，使肝细胞内胆固醇合成受抑制，从而降低血胆固醇，降低动脉粥样硬化的发病率和病死率，现己作为治疗动脉粥样硬化的基本药物。近期的研究表明，他汀类药物抑制动脉粥样硬化的作用除了降脂作用以外，还有独立于降脂的作用或称为“多效性”作用。多效性作用包括改善内皮功能、降低血管壁氧化应激和炎症反应、增强a s 斑块的稳定性、抑制血管壁血栓形成、减少血液中凝血酶原、减轻细胞增殖等，可能与其间接抑制胆固醇合成途径中的多种异戊二烯类中间产物有关【”】。大量的临床和基础实验结果表明，他汀类药物有较强的免疫调节效应，能够减少细胞粘附分子的表达、减少斑块内的炎性细胞浸润、抑制t 淋巴细胞的激活并调节辅助性t 细胞亚群的功能，从而改善血管内皮细胞功能，减少因炎症和自身免疫反应对机体的破坏，抑制或逆转动脉粥样硬化的进展。为了探讨t h 相关细胞因子及抵抗素与a s 的关系，观察瑞舒伐他汀钙、依折麦布对相关炎症因子的影响及其抗a s 的机制，本研究( 1 ) 以a p o e 人小鼠为实验对象，建立动脉粥样硬化动物模型，行主动脉根部连续切片，应用苏木素一依红染色( h e 染色) 后，观察和检测小鼠动脉粥样硬化( a s ) 斑块的组织学特点和病变面积，测量斑块的面积( p a ) 、血管管腔的面积( l a ) ，计算校正的斑块面积( 斑块面积血管管腔面积，p a l a ) ，并使用百分比( )表示。证实瑞舒伐他汀钙的抗a s 作用。( 2 ) 采用酶联免疫吸附实验法检测血清内干扰素吖、白细胞介素1o 及抵抗素的含量。( 3 ) 取小鼠的胸腹主动脉( 自主动脉弓头臂干动脉至髂总动脉的分叉处) 段，使用酶联免疫吸附法检测胸腹主动脉内的干扰素吖、白细胞介素10 的含量。相信本研究不但对于明确a s 的免疫机制和瑞舒伐他汀钙的抗a s 机制，而且还为将来可能开展的a s 免疫学治疗提供一定的实验依据。9第一部分弟一鄙万a p o e - - 小鼠动脉粥样硬化动物模型的建立及药物干预材料与方法1 材料1 1 实验动物选用4 周龄雄性c 5 7 b l 6 j 野生型小鼠1 2 只，2 0 - 4 0 9 ：4 周龄雄性a p o e 小鼠( c 5 7 b l 6 j 背景) 4 8 只，2 0 , 、- 4 0 9 ，均由北京大学医学部实验动物中心提供。动物使用许可证编号：n o s c x k ( 京) 2 0 0 6 - 0 0 0 8 ，级别s p f 。自由进食、水，适应性饲养1 周后进入实验。饲养于济南军区总医院动物中心清洁级环境，饲养条件符合国家二级标准，温室2 2 + 2 ，相对湿度5 5 士15 ，每日明暗室各1 2 小时。1 2 动物饲料1 2 1 高脂饲料a p o e 小鼠饲以“西方类型膳食”饲料，其中胆固醇含量为0 1 5 ，脂肪含量为2 1 ，购自中国军事医学科学院实验动物研究所动物资料中心。1 2 2 普通二级清洁饲料用于喂养正常小鼠。1 3 实验药品1 3 1 瑞舒伐他汀钙( 可定)英国阿斯利康制药有限公司批号：e t 0 5 41 3 2 依折麦布( 益适纯)美国先灵葆雅公司批号：z e z p a i3 0 0 51 4 主要试剂、液体及配制1 4 10 0 1 m 磷酸盐缓冲液( p b s )0 0 1 m 磷酸盐缓冲液( p b s ) - 称取分析纯的n a c l8 5 9 ，n a 2 h p 0 4 1 4 9 ，n a h 2 p 0 4 0 2 9 ，加入1 0 0 0 m l 蒸馏水中溶解，调节p h 值至7 2 7 6 。1 4 21 戊巴比妥钠( 分析纯，s i g m a 公司，美国)称取分析纯的戊巴比妥钠1g ，加入蒸馏水lo o 毫升溶解，轻轻摇动使其完全溶解。1 4 - 34 多聚甲醛液( 由病理科赠送)称取4 0 9 多聚甲醛，加入8 0 0 m l0 1m o l l 的磷酸盐缓冲液，加热到6 0 c并滴加少许1 nn a o h 用磁力搅拌使粉末完全溶解至溶液清亮，用0 1m o l l磷酸盐缓冲液定容至1 0 0 0 m l ，充分混匀。l o1 4 4 无水乙醇( 由病理科赠送)1 4 5 多聚甲醛( 由病理科赠送)1 4 6 二甲苯( 由病理科赠送)1 4 71 盐酸酒精lm l 浓盐酸加入8 0 酒精10 0m l 中，混匀。1 4 8 配制9 5 、9 0 、8 5 、7 5 梯度脱水乙醇9 5 乙醇溶液无水乙醇9 5m lh 2 0定容1o om l9 0 乙醇溶液无水乙醇9 0m 1h 2 0定容10 0 m l8 5 乙醇溶液无水乙醇85m lh 2 0定容1o o m l7 5 乙醇溶液无水乙醇7 5m lh 2 0定容lo o m l1 4 9 苏木素染液( 由病理科赠送)1 4 1 0 中性树胶+( 由病理科赠送)1 5 主要仪器显微镜数码相机系统d p l 0日本，o l y m p u sr m 2 13 5 石蜡切片机德国，l e i c a 公司全自动生化分析仪日本，o l y m p u s高速台式离心机上海医用分析仪器厂恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂l e i c aq w i ni m a g ep r o c e s s i n ga n da n a l y s i s 软件德国，l e i c a 公司常规手术器械洁净工作台2 方法2 1 动物粥样硬化模型的建立及分组高脂饲料( o 15 胆固醇、21 脂肪、其余为普通饲料) 喂养的4 周龄雄性a p o e 山小鼠4 8 只，随机分四组：( 1 ) 模型组；( 2 ) 瑞舒伐他汀钙( 10 m g k g d ) 组：模型组+ 10 m g k g d 蒸馏水稀释后灌胃；( 3 ) 瑞舒伐他汀钙( 5 m g k g d ) 组：模型组+ 5 m g k g d 蒸馏水稀释后灌胃；( 4 ) 依折麦布组：模型组- i - - 5 m g k g d 蒸馏水稀释后灌胃。4 周龄雄性c 5 7 b l 6 j 野生型小鼠1 2只，做为正常对照组。西方类型膳食连续喂养8 周后从模型组a p o e 。小鼠中随机抽取2 只，麻醉后处死，在无菌条件下取出主动脉，常规脱水，石蜡包埋并切片，苏木素依红染色( h e 染色) 以观察动脉粥样硬化程度，确定造模是否建立。以镜下见到血管内膜增生和明显的脂质条纹突起作为动物模型制备成功的标志。第8 周开始进行药物干预，每天给予瑞舒伐他汀钙、依折麦布灌胃，正常组和模型组予以等量蒸馏水灌胃。2 2 血液标本的采集及检测于实验1 2 周末小鼠禁食禁水一夜，通过腹腔注射1 戊巴比妥钠( 5 0 m g k g ) ，麻醉后采用眼球摘除取血法，每只小鼠取血不少于o 8 m l 。血样静置2 小时后高速离一l , ( 3 0 0 0 转分钟) ，分离上层血清。用于血清脂质( t c 、t g 、h d l c 、l d l c ) 及i f n 丫、i l 1 0 及抵抗素的含量的测定，其余血清7 0 保存备用。使用酶比色法检测血清t c 、t g ，使用直接测定法检测h d l c 、l d l c ，使用全自动生化分析仪检测。采用酶联免疫吸附实验法检测血清内i f n - y 、i l - 1 0 及抵抗素的含量。2 3 动物处死及主动脉标本采集于实验1 2 周末取血后处死动物，解剖小鼠，取小鼠的主动脉，生理盐水冲洗，4 甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋，主动脉根部用做石蜡切片，h e 染色后，检测a s 斑块的面积，测量斑块面积( p a ) 、血管管腔面积( l a ) ，计算校正斑块面积( 斑块面积血管管腔面积，p a l a ) ，并用百分比( )表示。取小鼠的胸腹主动脉( 主动脉弓头臂干动脉起始处至髂总动脉分叉处)段经组织匀浆后取上清液，采用酶联免疫吸附实验( e l i s a ) 法检测胸腹主动脉内的i f n y 、i l 1 0 含量。2 4 主动脉根部的组织学观察【m 】及动脉粥样硬化面积的检测1 2h e 染色步骤：1 将各组小鼠的主动脉根部切下，用4 多聚甲醛固定，制备石蜡切片；2 常规进行石蜡包埋、脱水、连续切片( 5 u r n ) 、制片；3 每间隔5 0 t m 取1 张切片( 每只小鼠共取6 张) ，行苏木精伊红( h e )染色；4 石蜡切片按下述方法常规脱蜡至水，行h e 染色：( 1 ) 将切片放于6 0 至7 0 * ( 2 烤箱中过夜，防止脱片；( 2 ) - - 甲苯i 脱蜡1o 分钟，二甲苯i i 脱蜡l0 分钟；( 3 ) 用无水乙醇洗去二甲苯1 分钟x 2 次；( 4 ) 9 5 酒精脱水1 分钟，9 0 酒精脱水1 分钟，8 5 酒精脱水1 分钟；( 5 ) 自来水洗2 分钟；( 6 ) 苏木精染色5 分钟：( 7 ) 自来水冲洗1 分钟；( 8 ) 1 盐酸酒精分化2 0 秒；( 9 ) 自来水冲洗1 分钟；( 1 0 ) l 氨水返蓝3 0 秒；( 1 1 ) 自来水冲洗1 分钟：( 1 2 ) 伊红染色3 分钟；( 1 3 ) 自来水冲洗3 0 秒；( 1 4 ) 8 5 酒精脱水2 0 秒，9 0 酒精脱水3 0 秒，7 5 酒精i 、i i 脱水各1分钟n ；( 15 ) 无水乙醇i 、i i 脱水各2 分钟；( 16 ) - 甲苯i 、i i 透明各2 分钟；( 17 ) 中性树胶封片；( 1 8 ) 光镜下观察照相；( 19 ) 应用显微镜数码相机系统d p i0 观察h e 染色的切片，用l e i e aq w i ni m a g ep r o c e s s i n ga n da n a l y s i s 软件分析切片上显示的动脉粥样硬化斑块面积进行分析。常规石蜡包埋，连续切片3 0 张，每隔5 张取1 张，行h e 染色，算出平均值进行分析，测量斑块面积( p a ) 、血管管腔面积( l a ) ，计算校正斑块面积( 斑块面积血管管腔面积，p a l a ) ，并用百分比( ) 表示。2 5 统计学处理及方法对实验所得的所有数据应用s p s s18 0 统计软件进行统计处理，数值均以均数土标准差( i s ) 表示。两组间的数据比较采用t 检验，两组以上的数据比较采用单因素方差分析。p o 0 5 表示差异有显著性，p o 0 1 表示差异有极显著性。1 4多士里：日不1 血清内血脂分析结果如表1 ，图l 所示：模型组与正常对照组比较，血中t c 、l d l c 浓度均明显升高，血t g 浓度也升高，差异有极显著性，p 0 0 1 ，说明敲除a p o e基因，能明显导致血脂代谢紊乱。各用药组较模型组血中t c 、l d l c 浓度有不同程度的下降，差异有显著性( p 0 0 5 ) 。各用药组对h d l 影响均无统计学意义。表l各组动物血脂检测情况( x + s ，m m o l 1 )注：与模型组相比，宰p o 0 1 ，“p 0 0 5 ；与正常组相比，p o 0 1 ，p 0 0 52 主动脉粥样硬化病变形态学的检测结果a p o e 小小鼠a s 病变部位以主动脉根部最为明显，其次为胸主动脉，因此，本研究应用h e 染色的主动脉根部石蜡切片来观察小鼠的动脉粥样硬化病变。正常组：主动脉壁薄厚均匀，各层结构完整清晰，内膜光滑、中膜平滑肌细胞排列整齐，未见a s 斑块形成。( 见附图2 )模型组：主动脉根部可以看到明显的动脉粥样斑块明显形成，各期病变均可见。主动脉管壁厚薄不均，可见由大量泡沫细胞形成的脂纹脂斑期病变；斑块表面由纤维帽覆盖，胶原纤维玻璃样变，内膜可见平滑肌细胞出现的纤维斑块期病变；由大量泡沫细胞及胆固醇结晶形成的粥样斑块期病变。( 见附图3 )瑞舒伐他汀钙( 1 0 m g k g d ) 组：主动脉壁a s 病变以脂斑脂纹期、粥样斑块期为主。内膜增厚，多数呈钉突状隆起，可见由少量泡沫细胞形成的脂纹脂斑期病变；粥样斑块期病变斑块较小，脂质核心小，斑块内胆固醇结晶明显减少，病变程度比模型组明显减轻；病变程度较瑞舒伐他汀钙( 5 m g k g d ) 组、依折麦布组轻。( 见附图4 )瑞舒伐他汀钙( 5 m g k g d ) 组：主动脉壁a s 病变以脂斑脂纹期、粥样斑块期为主。动脉内膜增厚明显，斑块内有泡沫细胞堆积及明显的胆固醇结晶，脂质核心较模型组变小。病变比模型组轻，但较瑞舒伐他汀钙( 10 m g k g d ) 组病变程度重，与依折麦布组的病变程度相当。( 见附图5 )依折麦布组：主动脉壁a s 病变以脂斑脂纹期、粥样斑块期为主。动脉管壁厚薄不均，内膜增厚明显，斑块内有泡沫细胞堆积及明显的胆固醇结晶，脂质核心较大。病变比模型组有所减轻，但较瑞舒伐他汀钙( 10 m g k g d )组病变程度重；与瑞舒伐他汀钙( 5 m g k g d ) 组病交程度相当。