（细胞生物学专业论文）pak1重组蛋白的表达及其在细胞内的定位.pdf

中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：2 訇熟日期： 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文 论文作者签名： 指导教师签名： ，、 中文论著摘要 p a k l 重组蛋白的表达及其在 细胞内的定位 目的 p a k i ( p 2 1 一a c t i v a t e dk i n a s e l ) 是一保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，为 r h o 家族小鸟苷三磷酸酶( r h o g t p a s e ) c d e 4 2 和r a e 下游重要的靶蛋白， 参与许多重要的细胞活动。p a k l 主要分布在脑、肌肉、脾中。p a k i 包含n 一末端调节区和c 一末端激酶区，它的n 一末端调节区含g t p 酶结合域 ( g t p a s eb i n d i n gd o m a i n ，g b d ) ，它可介导p a k l 与r a e 和c d e 4 2 的结合。研 究表明，p a k i 具有广泛的生物学功能，包括细胞骨架的动力学调节，细胞 移动，生存和凋亡，细胞周期，基因转录调节，细胞生长信号转导和转化等， 而这些功能的完成是由于p a k l 磷酸化其下游靶蛋白引起的= 到目前为 止，已经发现了多种p a k i 的底物及其相互作用蛋白。并且许多证据足以 表明在肿瘤发生发展过程中存在p a k l 信号转导途径。本研究通过观察 p a k l 重组蛋白在原核细胞中的表达情况及p a k i 在真核细胞中的定位，为 进一步研究p a k l 的生物学性能提供理论和实验基础。 方法 1 总r n a 提取及e d n a 合成： 总r n a 提取按照r n a 提取p r o t o c o l 操作完成；在m m u l vr e v e r s e t r a n s c r i p t a s e 作用下逆转录为e d n a 。 2 以e d n a 为模板扩增p a k l 依据p a k l 序列，设计2 对引物，建立p c r 反应体系，进行p c r 循环设 计，扩增p a k i 。 3 重组质粒的构建 将p a k l 基因克隆到g s t 融合蛋白原核表达载体p g e x 一5 x i 中，构 建重组质粒p g e x 一5 x 一1 p a k l ；同时，利用基因重组技术将p a k l 基因 1 克隆到g f p 融合蛋白真核表达载体p e g f p 中，构建重组质粒p e g f p p a k l 。 4 g s t p a k l 融合蛋白表达 用p g e x 一5 x 一1 p a k l 重组质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ，i p t g 诱导其表 达，变性后上样，进行s d s p a g e 电泳。 5 、w e s t e r nb l o t t i n g s d s p a g e 电泳结束后将两块凝胶分别转移至2 张p v d f 膜上，用 5 脱脂奶粉封闭3 h ，t b s t 洗膜3 次，每次1 5m i n ，其中一张膜加入用 t b s t 稀释的抗辣根过氧化物酶g s t 抗体，室温轻摇2h t b s t 洗膜3 次， 每次1 5m i n ，压片显影。另一张膜加入用t b s t 稀释的p a k l 抗体，室温轻 摇2h ，t b s t 洗膜3 次，每次1 5m i n ，二抗孵育i h ，t b s t 洗膜3 次每次1 5 r a i n ，压片显影。 6 g f p p a k l 融合蛋白在哺乳动物细胞内的表达 将重组质粒p e g f p p a k i 通过脂质体转染法导入癌细胞系中，用荧 光显微镜方法观察p a k l 在细胞内的定位。 结果 、各种细胞系总r n a 的获得 r n a 提取结束后，测o d 值，a 2 6 0 及；k 2 8 0 ，计算r n a 浓度并估计样品 纯度。所有样品的浓度及纯度均达到使用要求。 二、重组质粒的构建 重组质粒经双酶切后释放出两个片段，长度与载体和p a k l 分别对 应。此外，重组质粒经序列测定证明，p a k l 编码区序列完全正确，提示质 粒构建成功。 三、p a k l 在原核细胞中的表达 可见于诱导开始的1 、2 、4 h 均有融合有g s t 的p a k l 蛋白的表达，且于 2 h 达到高峰，2 h 与4 h 的诱导结果无显著差别。说明p a k l 可以在原核细 胞中表达。 四、w e s t e r n 印迹分析 结果表明，在原核细胞中p g e x 一5 x 一1 p a k l 重组质粒表达了分子量 约9 4k d 的融合蛋白( g s t ：2 6 k d ；p a k l ：6 8 k d ) ，而p g e x 一5 x i 空载体 2 只表达g s t 蛋白( 2 6 k d ) ，与预期结果相同。 五、p a k l ( g f p ) 在细胞中的分布 荧光显微镜下可观察到绿色荧光布满细胞胞浆，核内绿色荧光不明显。 提示转入的质粒已在细胞中表达出p a k l 一g f p 融合蛋白，p a k l 定位于胞 浆。 结论 p a k l 原核表达质粒构建成功，p a k l 重组蛋白可成功的在原核细胞中 表达，p a k l 定位于胞浆。为进一步研究p a k l 生物学特性奠定基础 p a k l ；g f p ；转染；w e s t e r nb l o t 关键词 3 、 英文论著摘要 一 ， t h e e x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i n o fp a k la n di t sl o c a t i o ni nc e l l s a b s t r a c t o b j e c t i v e p a k l ( p 2 1 一a c t i v a t e dk i n a s e l ) i sa ne v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e ds e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e s ，a r eb e c o m i n g i n c r e a s i n g l yi m p o r t a n tf o rav a r i e t yo fc e l l u l a rf u n e t i o n si 1 1m a m m 3 1 i a nc e l l s p a k l a c t sa sd o w n s t r e a me f f e c t o r sf o rt h es m a l lg t p a s e s ，c d c 4 2a n dr a c l p a k l i s h i g h l ye x p r e s s e d i nt h e b r a i n ，m u s c l e ，a n d s p l e e n ，p a k l c o n t a i n sa nn t e r m i n a lr e g u l a t o r yd o m a i na n dac t e r m i n a lk i n a s ed o m a i n i t s 一t e r m i n a lr e g u l a t o r yd o m a i nc o n t a i n sg t p a s eb i n d i n gd o m a i nt om e d i a t et h eb i n d i n go fp a k lt or a c c d c 4 2 a c c u m u l a t i n ge v i d e n c ei n d i c a t e st h a tp a k li s i m p o r t a n tf o r av a r i e t yo fc e l l u l a rf u n c t i o n s i n c l u d i n gc e l l m o r p h o g e n e s i s ，m o t i l i t y ，s u r v i v a l ，m i t o s i s ，c e l tc y c l ea n da n g i o g e n e s i s p a k l a r ei n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no fc e l l u l a rf u n c t i o nv i ap h o s p h o r y l a t i n gan u m b e r o fd o w n s t r e a m t a r g e tp r o t e i n m a n ye v i d e n c e ss h o w e dt h a tp a k la c t i v a t i o no c c u r s d u r i n gt h ep r o c e s so ft u m o r i g e n e s i s ，a n dp a k li sl i k e l yt op r o v i d ei n s i g h ti n t ot h e r o l eo fp a k si nh u m a nc a n c e r s i nt h i s s t u d y ，i d e t e c tp a k le x p r e s s i o ni n p r o k a r y o c y t ea n di t s l o c a t i o ni nt r a n s f e c t e de u k a r y o c y t es o a st o p r o v i d eb a s i sf o r f u r t h e rs t u d yo fp a k l m e t h o d s t o t a lr n aw a si s o l a t e du s i n gt r i p t t r ea g e n t t h ee d n ao fa l lk i n d so ft i s - s u e sw e r ep r e p a r e du s i n gm m u l vr e v e r s et r a n s c r i p t a s ea n do l i g od tp r i m - e r t e c h n i q u e so fg o n er e c o m b i n a t i o na n dg o n et r a n s f e c t i o n w e r ee m p l o y e d d t h ec o d i n gs e q u e n c e so fp a k lw e r ec l o n e di n t ot h ep r o c a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp g e x 5 x 1 g e n e r a t i n gt h er e c o m b i n a n t p l a s m i d sp g e x 一5 x 一1 p a k l e x p r e s s e di nb i _ 2 1a f t e rt r a n s f o r m a t i o na n di 睨gi n d u c t i o n i n 山ef i r s t s t a g eo faw e s t e r nb l o t ，s d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i sw a su s e dt os e p a r a t ep r o t e i n s ，a n dt h ep r o t e i n sw a ss e p e r a t e do nt h eg e lb a s e do ns i z e i nt h es e c o n d s t a g eo ft h ew e s t e r nb l o t p r o t e i n sf r o mt h eg e l w e r et r a n s f e r r e do n t oam e n b r a n eu s i n ge l e c t r o p h o r e s i s t h ep r o t e i n sw a st r a n s f e r r e dt ot h em e m b r a n ei nt h e s a m ep o s i t i o na s t h e y a r eo nt h e g e l f i n a l l y ，i u s e da n t i g s ts r pa n d p a k la n t i b o d i e st od e t e c tt h eg s t p a k lf u s i o np r o t e i n a tt h es a m et i m e ，p a k le d n aw a sl i g a t e dt oe g f p g e n eo fp e g f p c 1 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f e c t e di n t oc a n c e rc e l ll i n ew i t h l i p o s o m e ， a n dt h e e x p r e s s i o no fg f p p a k lf u s i o np r o t e i nw a so b s e r v e db yf l u o r e s c e n t m i c r o s c o p y r e s l l l t s a f t e ri s o l a t i o no ft o t a lr n a ，t h es a m p l e sw e r eq u a n t i t a t e do nt h eb a s i so f a b s o r b a n e ea t2 6 0 2 8 0 n m t h e i rc o n c e n t r a t i o na n d2 6 0 2 8 0v a l u ec o u l dm e e t t h en e e do fi t sa p p l i c a t i o n w h e nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sd e t e c t e dw i t hd o u b l ee n d o n u l e a s ea n a l y s i s ，t w of r a g m e n t sc o u l db er e l e a s e df r o mi t a n dt h e i rs i z ei sc o r r e s p o n d e n tt o v e c t o ra n dt a r g e tg e n er e s p e c t i v e l y m o r e o v e r ，s e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a t p a kc o d i n g s e q u e n c e w a sc o m p l e t e l yc o r r e c t t h e s ee v i d e n c e ss h o w e dt h a t p a k lr e c o m b i n a n tp l a s m i dw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d g s t p a k lf u s i o np r o t e i nc o u l db ee x p r e s s e di nl 、2 、4h r sa f t e ri p t gi n - d u c t i o na n dr e a c h e di t sp e a ka t2 h r w e s t e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nc o u l ds p e c i f i c a l l yb i n dt oa n t i g s ta n dp a k la n t i b o d y s ow e m a yd e t e r m i n et h a t p a k lr e c o m b i n a n tp r o t e i nc o u l db ee x p r e s s e di np r o k a r y o c y t e u n d e rf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p y ，c e h sw h i c hh i g h l y e x p r e s s e dg f pp r o t e i n s h o w e dg r e e nf l u o r e s c e n c e t h ee x p r e s s i o no fp a k lw a so b s e r v e di nc y t o p l a s m t r a n s f e c t e dw i t hp e g f p p a k l 5 c o n c l u s i o n t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp g e x 5 x 1 p a k lw a ss u c c e s s f u l l yc o b s t r u e - t e d ，a n dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i no fp a k lc o u l db ee x p r e s s e di np r o k a r y o c y t e ， a n dp a k li sl o c a t e di nc y t o p l a s m k e yw o r d s p a k l ；g f p ；t r a n s f e e t i o n ；w e s t e r nb l o t 6 7 厂一一妄一j 、一一j r p a k l 重组蛋白的表达及其在细胞内的定位 刖吾 p a k l ( p 2 1 一a c t i v a t e dk i n a s e l ) 是一保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，为 r h o 家族小鸟苷三磷酸酶( r h o g t p a s e ) c d c 4 2 和r a c 下游重要的靶蛋白， 参与许多重要的细胞活动。目前，越来越多的证据显示p a k i 在调节生物 学活性方面具有重要作用，包括细胞骨架的动力学调节，细胞移甜。“、生 存和凋亡。5 j 、细胞周期1 、基因转录凋节。l 8 、细胞生长信号转导和转 化”。等。p a k l 所具有的广泛的生物学功能是由于其磷酸化下游靶蛋白 引起的。到目前为止，已经发现了多种p a k l 的底物及其相互作用蛋白。 并且许多证据足以表明在肿瘤发生发展过程中存在p a k l 信号转导途径。 既然p a k l 信号转导途径在肿瘤的增殖、浸润及转移过程中发挥作用，因此 干扰p a k l 信号转导途径有望成为肿瘤的分子水平的干预靶点。因而，对 于p a k l 的进一步研究具有一定的临床诊疗价值。在本实验中，通过p a k l 原核表达载体的构建实现p a k l 在原核细胞中的表达。同时，将携带活细 胞探针一绿色荧光蛋白( g f p ) 的外源性p a k l 基因导入真核细胞中。观察 p a k l 在细胞内的定位。通过本课题研究，建立了一套良好的p a k l 基因定 位、质粒构建及蛋白表达体系，为后续工作，即p a k l 相互作用蛋白及其功 能研究打下了基础。 实验材料与方法 一、实验材料 1 细胞来源： r n a 提取及转染所需细胞均来自于医大细胞生物教研室细胞培养室， 于3 7 。c ，5 c 0 2 条件下培养。 2 菌种和质粒 8 d h 5 a ，b l 2 1 感受态细胞，p g e x 一5 x l ，购自p h a r m a c i a 生物技术公 司。真核表达载体p e g f p c 1 ( 美国c l o n t e c h 生物技术公司产品) ，该质粒 含绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 序列，在细胞内表达后可发 出绿色荧光，卡那霉素抗性。 3 试剂： t 4 d n a 连接酶、限制性内切酶、电泳凝胶回收试剂盒，均购自t a k a r a 生物技术公司。质粒提取及纯化试剂盒购自q i a g e n 公司。g s t 抗体( 武 汉博士德) ；细胞培养用d m e m 培养基，小牛血清，脂质体转染试剂盒( l i p o f e c t a m i n ek i t ) 均为美国g i b c ob r l 公司产品。r n a 提取t r i z o l 试剂 ( g i b c o 公司) ，逆转录采用的m m u l vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 来自n e b 。 二、实验方法 1 总r n a 提取及e d n a 合成 总r n a 提取按照r n a 提取p r o t o c o l 操作完成，在紫外分光光度计上对 所提总r n a 进行纯度鉴定和定量。各取约2 0 u g 总r n a 在m m u l vr e v e r s et r a n s e r i p t a s e 作用下逆转录为c d n a 逆转录引物为o l i g od t 。具体操 作方法如下： 1 1 细胞总r n a 的提取： ( 1 ) 弃去细胞培养液，向培养瓶中加入t r i z o l 试剂( g i b c o 公司) 1 r n l ，用吸头反复吹打若干次( 观察：液体变粘稠，细胞脱壁) 。 ( 2 ) 将细胞分解物吸到一d e p c 处理过的1 5m le p 管中，室温静置5 分钟，加氯仿0 2m l ，轻摇1 5 秒。 ( 3 ) 室温静置1 0 分钟后，1 2 0 0 0r p m ，1 5m i n ，4 。c ，离心。然后取上清无 色水相( 约0 6m 1 ) 到新的e p 管( d e p c 处理过) ，加0 5r n l 异丙醇，室温下 静置1 0 分钟。 ( 4 ) 1 2 0 0 0r p m ，1 0 m i n ，4 ，离心。观察总r n a 在管底的白色沉淀，弃 去上清，7 5 乙醇1 0 蹦洗涤后，7 5 0 0r p m ，5r a i n ，4 。c 离心。 ( 5 ) 去上清，用t i p 头吸干液体。干燥沉淀5 一1 0 分钟，d e p c 处理水 2 0 一3 0u l 加入，混匀，5 5 6 0 水浴1 0 分钟溶解总r n a ，测o d 值并计算 浓度。 1 2 第一链c d n a 的合成： ( 1 ) 取一灭菌的无r n a 酶的e p p e n d o r f 管，加入以下样品： 9 中。 r n a 模板1 u g ( 1 u 1 ) o l i g o d t 引物( 5 0 u r n ) 2 u l d n t p ( 2 5 u r n ) 4 u i 加d e p c 水至1 6 u l ( 2 ) 7 0 。c 处理5 分钟，短暂离心后置于冰上 ( 3 ) 混合以下样品 步骤1 的混合物 1 6 u l 1 0 r t 反应缓冲液 2 t x l r n a 酶抑制剂 lu l m m l v ( h 一) 反转录酶 1 u l t o t a 】 2 0 u l ( 4 ) 4 2 2 3 温浴l 小时。 ( 5 ) 9 5 5 r n i n 使酶失活 2 以c d n a 为模板扩增p a k l 2 1 依据p a k i 序列，设计2 对引物： 扩增p a k l c d n a 片段，1 、2 分别克隆到p g e x 一5 x l 、p e g f p 载体 1 ：f ：5 一c g g a a g t a g c 鱼垦兰旦! 三鱼t g g t g g t g a c a a t g t c 一3 b a m h l r ：5 一a t c t c a c a g a g c t c g a g a c a a t g a g g c t g g 一3 ； x h o i 2 ：f ：5 g c t g c t g g t g a a t l c c a t g t c a a a t a a c g g c c t 3 ， e c o r i r ：5 g g g g t g a g t g g a t c c t t a g t g a i q g t f c t r r g r f f g 3 b a m h i 2 2p c r 反应体系： l o 1 0x 扩增缓冲液( m 9 2 + ) 5 u l d n t p 混合物8 u l 引物各1 u l 模板d n a l u l t a qd n a 聚合酶0 5 u l 加双蒸水至 5 0 u l 2 3p c r 循环设计1 ： 9 4 。c 一一9 4 0 c 一一6 3 0 c 一一7 2 。c 一一7 2 0 c 一一4 0 c 3 m i n3 0 si r a i nl r a i ni o r a i n 3 0c y c l e s p c r 循环设计2 ： 9 4 0 c 一一9 4 。c 一一6 0 0 c 一一7 2 0 c 一一7 2 。c 一一4 。c 3 m i n3 0 s1 m i n1 m i n1 0 m i n 3 0c y c l e s 2 4p c r 反应产物的纯化： ( 1 ) 将p c r 反应后的液体在0 8 琼脂糖凝胶上电泳； ( 2 ) 在紫外灯下切出含目的d n a 片段的琼脂糖凝胶，用纸巾吸净表面 液体，捣碎。称胶块，计算体积( 1 m g = l u l ) 。按重量比1 ：3 ( d n a 片段：胶 块融化液d r 1 ) 加入胶块融化液d r l ； ( 3 ) 7 5 r 2 6 1 0 分钟直至胶完全溶化。其间振荡，琼脂糖必须完全溶 化； ( 4 ) 向上述液体中加入d r l2 1 体积量的d r ，混合均匀。将溶液 置于离一t d 柱中，3 6 0 0 r p m 离心3 0 6 0 秒； ( 5 ) 倒掉液体，加入5 0 0 山溶液r i n s e a ，于离心柱中3 6 0 0 r p m 3 0 6 0 秒 离心，倒掉流出液体； ( 6 ) 用溶液r i n s e b7 0 0 m 洗一遍，3 6 0 0 r p m 离心3 0 6 0 秒； ( 7 ) 重复一次，1 ，2 0 0 0 r p m 再次离心6 0 秒，弃去剩余液体； ( 8 ) 将离心柱置于新的离心管中，在膜中央加入6 0 预热2 0 以灭菌的 双蒸永，静置1 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心6 0 秒，洗脱d n a 。 3 重组质粒的构建 ( 1 ) 将p a k l p c r 纯化产物和原核表达载体p g e x 一5 x 一1 、真核表达 载体p e g f p 分别用限制性内切酶b a m h i 、x h o i ( p a k l 、p g e x 一5 x 一1 ) 及 e c o r i 、b a m h i ( p a k l 、p e g f p ) 消化。 酶切反应体系如下： l ：1 0 幸kb u f f e r2 u l 0 1 b s a2 u l e v e ( p a k l ) 1 u g e c o r l 0 5 u l b a r n h l 0 5 u l 双蒸水至 2 0 u l 3 7 ，反应2 小时； 2 ：1 0 $ kb u f f e r 2 u l 0 1 b s a 2 u l p g e x 一5 x 一1 ( p a k l ) l u g x h 0 10 5 u l b a m h l0 5 u l 双蒸水至 2 0 u l 3 7 ，6 小时 ( 2 ) 待消化完全后将反应液在0 8 琼脂糖凝胶上电泳分离。将含目 的基因和载体片段的凝胶分别切出。 ( 3 ) 纯化d n a 片段，方法同前所述。 ( 4 ) 以t 4 d n a 连接酶将p a k l 酶切纯化片段及载体酶切纯化片段 ( p g e x 一5 x l 、g f p ) 连接：1 0 女t 4 d n a 连接酶b u f f e r2 u l ，1 斗lt 4 d n a 连 接酶，p a k l 酶切纯化片段6 斗l ，载体酶切纯化片段( p g e x 一5 x l 、g f p ) 2 出，去离子水加至2 0 止，1 6 。c 过夜反应。 ( 5 ) 将连接后的反应液取8 s d 转化感受态大肠杆菌，扩增、制备质粒 d n a 。 将连接产物加入5 0 1 山l 融化的感受态中，置于冰上3 0 m i n 。 热休克，4 2 。c4 5 s e e 。 置于冰上2 r a i n 。 加入3 0 0 1 a ls 0 c 培养基( 不含抗生素) ，3 7 。c 摇床上2 2 5 r p m 培养 l h 。 在含有抗性k a n + ( g f p ) 、a m p + ( p g e x 一5 x 1 ) l b 固体培养基上， 将转化产物5 0 u l 涂板。 1 2 3 7 0 c 温箱中培养1 2 1 6 h 。 挑选白色的单菌落，分别置于k a n + ，a m p + 抗性的l b 液体培养基 中，摇菌过夜。 ( 6 ) 次日提质粒：离心菌液1 5 m l ，倒干培养基，加入2 5 0 u l b u f f e rp 1 重悬菌液；加入p 22 5 0 u l ，颠倒混匀，操作时间少于1 0 m i n ；加入3 5 0 u l b u f f e r n 3 ，颠倒混匀，可见絮状沉淀1 3 ，0 0 0 r p m1 0 m i n ，吸上清，移入离心柱中， 1 3 ，0 0 0 r p m1 m i r a ，弃滤液。加5 0 0 u l b u f f e rp b ，1 3 ，0 0 0 r p ml r a i n ，弃滤液。 加入7 5 0 u l p e ，1 3 ，0 0 0 r p m1m i n ，弃滤液。将离。t 2 , 柱放到新的1 5 m le p p e n d o r f 管上，加2 0 u l 灭菌的双蒸水至膜的中央，室温静置i m i n ，1 3 0 0 0 r p m 1 m i n 。即获得所需质粒。 ( 7 ) 最后将质粒进行酶切鉴定。 ( 8 ) 测序。 4 g s t p a k l 融合蛋白表达 i p t g 诱导蛋白在原核细胞中表达：将5 0 u l 过夜培养物( p g e x 一5 x 一1 一p a k l 菌液、p g e x 一5 x 一1 菌液) 分别接入4 n d 含a m p ( 5 0 u 昏m 1 ) ，振荡 培养2 5 小时，至对数中期，测a 5 5 0 分别为0 8 ，0 6 5 。从两管中均取出 l f n l 未经诱导的培养物放人微量离心管中，两管中的余液加i p t c ( 0 1 m o l l 1 ) 1 5 u l 至终浓度为0 5 r e t o o l 1 。在诱导的不同时间( 1 、2 、4 h ) 取l i t l l 样品于 微量离心管中，室温高速离心2 r a i n ，沉淀悬于1 0 0 u l l s d sl o a d i n gb u f f e r 中，1 0 0 ，加热5 m i n ，室温高速离心l r a i n ，冰上放置，待全部样品处理完后， 上样，进行s d s p a g e 电泳。 蛋自电泳胶下层分离胶浓度为1 0 ，上层浓缩胶浓度为3 浓度水 3 0 a c e r i r i s ( p h 8 8 ) 1 0 s d s a p t e m e d l o 1 9 r r d1 6 5 m l 1 3 i i l l ( t 5 m ) 5 0 t l l5 0 【工l l o d 3 ( 5 r n l ) 3 m l o 6 7 5 r a l1 2 5m l ( 0 5 m ) 5 0 l l l 5 0 l o i i l 电泳液为i x i r i s g l y ，起始电压为9 0 v ，进入分离胶后增加电压至1 1 0 v ，蛋白m a r k e r 为b i o r a d 生产的预染蛋白m a r k e r 。 5 w e s t e r nb l o t t i n g ( 1 ) 电泳结束后，将胶和滤纸，硝酸纤维素膜一起浸入转移b u f f e r 。 ( 2 ) 电转仪电转蛋白从胶至硝酸纤维素膜上，4 5 v 恒压，于4 转膜过 夜。 1 3 ( 3 ) 转膜后切除膜多余部分，切角标记方向。 ( 4 ) 将膜正面向上，加入t b s t ，振荡洗涤1 0 m i n ，共三次。 ( 5 ) 膜置于5 脱脂奶粉一t b s t 溶液中封闭，3 7 。c3 h 。 ( 6 ) 将膜正面向上，加入t b s t ，振荡洗涤1 5 m i n ，共三次。 ( 7 ) 用，i b s t 稀释抗g s t 辣根过氧化物酶单克隆抗体，抗体稀释倍数为 1 ：5 0 0 0 ，3 7 。c2 h 。 ( 8 ) 将膜正面向上，加入t b s t ，振荡洗涤1 5 m i n ，共三次。 ( 9 ) e c l 反应，压片显影。 ( 1 0 ) 对照预染蛋白m a l k e r ，确定获得的融合蛋白的分子量大小，检验 是否为p a k l 一g s t 融合蛋白。 ( 1 1 ) 另一张转印后的p v d f 膜使用t b s t 稀释的p a k l 抗体( 1 ： i 0 0 0 ) ，洗膜后压片显影，进一步检测p a k l 一g s t 融合蛋白。 6 g f p p a k l 融合蛋白在哺乳动物细胞内的表达 细胞常规培养于禽1 0 小牛血清的d m e m 培养液中，孵箱环境为 3 7 ，5 c 0 2 。 ( 1 ) 转染前一天，将处于对数生长期的细胞用胰酶消化、计数并铺板， 继续培养使转染日细胞融合度为7 0 9 0 。在铺板和转染期间避免使用 抗生索，这会促进细胞生长，且在转染时不必润洗细胞。 ( 2 ) 在不含血清的d m e m 中稀释d n a ( g f p p a k l 质粒) 。使用前 混匀p l u s 试剂，加入到稀释的d n a 中。混匀，室温静置1 5 分钟。 ( 3 ) 在另一管中使用元血清的d m e m 稀释l i p o f e c t a m i n e 试剂，混 匀。 ( 4 ) 将已复合的d n a ( 步骤2 ) 和稀释的l i p o f e c t a m i n e 试剂( 步骤 3 ) 混合。混匀，室温保温1 5 分钟。 ( 5 ) 在复合物形成同时，使用转染培养基替换细胞培养基。 ( 6 ) 将d n a p l u s u p o f e c t a m i n e 试剂复合物加入含有新鲜培养 基的细胞( 步骤5 ) 中。将复合物同培养基轻轻混匀。5 c 0 2 ，3 7 。c 保温3 小时。 ( 7 ) 保温3 小时后，使用新鲜的完全培养基替换含有复合物的培养基， 继续培养，4 8 h 后在荧光显微镜下观察基因的表达情况。 1 4 实验结果 一、各种细胞系总r n a 的获得 r n a 提取结束后，测0 d 值，a 2 6 0 及a 2 8 0 ，计算r n a 浓度并估计样品 纯度。结果如下： 样品名称r n a 浓度 a 2 6 0 a 2 8 0 c c l t 8 7 c o l o na c c l 2 2 9 l s l 7 4 t d v c a r 3 m c f 一7 蚪e l a c 6 1 6 9 u g u l 0 9 3 u g u l 0 8 7 u g u l 1 5 6 u g u l 1 0 3 u g u l 1 3 1 u g u l 1 2 2 u g u l 1 1 8 u g u l 1 7 9 1 8 3 1 9 2 1 6 6 1 7 6 1 8 5 1 9 l 1 8 2 二、重组质粒的构建 1 用自行设计的引物，以e d n a 为模板进行p c r 反应扩增p a k l ，琼脂 糖凝胶电泳结果： 2 1 2 2 6 b p 5 1 艚岫 f i 9 1 依据p a k l 序列设计引物，p c r 得到的电泳图 m ：2 k bn l a r l c e l ，1 ：p a k l ( b a m h l 、x l a 0 1 ) p c r 产物； 2 ：p a k l ( b a m h l 、e e o r i ) p c r 产物。 分析：可见于2 0 k b 和1 5 k bm a r k e r 之间约1 7 k b 处出现单一条带，片段 1 5 大小与预期结果相符合。 2 质粒提取后，将p g e x - 5 x 一1 p a k 质粒用b a m h l 进行单酶切及 b a m h l 联合x h o l 进行双酶切质粒鉴定电泳图谱( f i 9 2 ) 。 m l 2 1 0 o k b 一 6 0 k b f i 簖p g e x 一5 x 1 p a k l 质粒酶切鉴定图 m ：2 k bm a r k e r ；j ：b a m h l 单酶切产物；2 ：b a m h l 和x h o l 双酶切产物。 分析：p g e x 一5 x l 载体片段约4 9 k b ，p a k l 片段长约1 7 k b ， b a m h l 单酶切使质粒线形化后于6 + 7 k b 处出现单一条带，与目的质粒大小 吻合；双酶切后于5 0 k b 和1 5 k h 附近出现两个条带，长度与载体和p a k l 分别对应单、双酶切均提示质粒构建成功。 3 以上述方法构建p g e x 一5 x 一1 p a k l 质粒后，重组质粒经序列测定 证明，p a k l 编码区序列完全正确( f i 宙) 。 6 萨p g e x - 5 x 一1 - p a k i 质粒测序图 4 将p e g f p p a k l 质粒用b a m i - 1 1 联合e c o r j 进行双酶切质粒鉴定电 1 6 泳图谱( f i 9 4 ) 。 2 1 2 2 6 b p 5 1 4 8 h p _ 2 脚 2 彻 1 5 8 4 t y p 1 3 7 5 1 单 f i 9 4p e g f p p a k l 质粒酶切鉴定图 m ：2 k bm a r k e r ；1 、2 ：b a m h l 和e c o r i 双酶切产物 分析：p e g f p 载体片段约4 7 k b ，p a k i 片段长约1 7 k b ，双酶切后释 放出两个片段，长度与载体和p a k l 分别对应提示质粒构建成功。 以上述方法构建p e g f p p a k l 质粒后，重组质粒经序列测定证明， p a k l 编码区序列完全正确( 数据略) 。 三、p a k l 在原核细胞中的表达 经i p t g 诱导后，将样品悬于1 0 聚丙烯酰胺凝胶，进行s d s p a g e 电泳( f i 9 5 ) g 跚l f i a k l g 盯 m 12 35 8， r i 9 5 p a k l 在原核细胞中的表达( s d s p a g e 电泳 m ：m a r k e r ；i 未诱导的p g e x 一5 x 一1 空载体；2 未诱导的p g e x 5 x 1 p a k l 质 粒；3 诱导1 h 的p g e x 一5 x 一1 空载体；4 诱导1 h 的p g e x 一5 x 一1 一p a k i 质粒；5 1 7 诱导2 h 的p g e x - 5 x 一1 空载体；6 诱导2 h 的p g e x 一5 x i p a k l 质粒；7 诱导4 h 的p g e x -