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摘要 量子点的水溶性修饰及标记朊蛋白 分析化学专业硕士研究生郝建玉 指导教师郑鹄志副教授 中文摘要 近年来，量子点作为一种新型的无机纳米荧光材料被广泛应用于生物和医学领域，在细胞 标记、生物分子检测、免疫分析等方面都取得了许多重要成果。与传统有机荧光染料相比， 量子点具有激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称、抗光漂白性强、荧光强度高等显著优点。 量子点的研究已经成为一门新兴的交叉学科，成为纳米材料学和纳米生物医学领域新的研究 热点。本文的主要研究工作归纳如下： ( 1 ) 以二巯基辛酸( d h l a ) 为修饰原料，在前人报道方法上加以改进，基于双巯基与量 子点表面金属原子的螯合作用实现油溶性量子点的水溶性修饰，得到的水溶性量子点各种荧 光性能优良。同时进一步考察了无机金属离子对这种二巯基辛酸修饰量子点的荧光猝灭行为， 并对有关作用机理进行了探讨。 ( 2 ) 利用1 乙基一3 一( 3 一二甲基氨丙基) 一碳化二亚胺( e d c ) 和n 。羟基琥珀酰距胺( n h s ) 将水溶性q d s 与牛血清白蛋白( b s a ) 共价偶联到一起。q d s 与b s a 结合后荧光强度增强， 这主要是因为蛋白将q d s 表面包覆后有效去除了表面缺陷，使荧光强度明显提高。产物 ( b s a q d s ) 对c u 2 + 有较强响应，这为其用于检测环境中的c u 2 + 提供了可能。利用镍柱得到 高纯度正常型朊蛋白( p r p c ) ，并根据5 5 巯基辛酸修饰的水溶性c d s e z n s 量子点表面z n 与 组氨酸的特异性结合，对p r p c 进行标记。利用荧光分光光度计和琼脂糖凝胶电泳两种方法进 行验证。 ( 3 ) 发现朊蛋白自身在6 7 0 n m 处有较强荧光，且荧光强度与其浓度在一定范围内呈线 性。用这种方法测定朊蛋白浓度简单、快速、灵敏。同时对荧光来源进行推理并一一验证， 最后推测导致朊蛋白有荧光的原因是，朊蛋白中的色氨酸与细菌中荧光小分子血卟啉发生荧 光共振能量转移。 关键词：量子点修饰荧光标记朊蛋白荧光小分子 a b s t r a c t w a t e r - s o l u b l em o d i f i c a t i o no fq u a n t u md o t a n di t sa p p l i c a t i o nf o r a b e l i n gprpitsl o tl a d e l i n gr p o s t g r a d u a t em a j o r i n gi na n a l y t i c a lc h e m i s t r y ：h a oj i a n y u s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f z h e n gh u - z h i a b s t r a c t r e c e n t l y ，s e m i c o n d u c t o rq u a n t u md o t s ( q d s ) h a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nb i o l o g i c a la n d m e d i c i n a lr e a l ma san e wk i n do fn o v e lf l u o r e s c e n tn a n o m a t e r i a l s ，a n dh a v eb e e na c h i e v e dm o r e a n dm o r ei m p o r t a n tr e s u l t si nc e l ll a b e l i n g ，b i o m o l e c u l a rd e t e c t i o na n di m m u n o a s s a y c o m p a r i n g w i t ht r a d i t i o n a lo r g a n i cd y e s ，q d sp o s s e s sb r o a de x c i t a t i o n ，n a r r o wa n ds y m m e t r i ce m i s s i o n ， s t r o n gr e s i s t a n c et op h o t o b l e a c h i n ga n dr e l a t i v e l yh i g hq u a n t u my i e l d s n o w a d a y s ，a san e w l y a r i s e ni n t e r d i s c i p l i n a r y , t h er e s e a r c ha b o u tq d sh a sb e c o m eah o tr e s e a r c hf i e l d i nn a n o m a t e r i a l s a n dn a n o b i o m e d i c i n e t h em a i nw o r k si nt h i st h e s i sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) a d o p t i n gd i h y d r o l i p o i ca c i d ( d h l a ) a sm o d i f y i n gr e a g e n t s ，o nt h eb a s i so fs t r o n g b i d e n t a t ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ed h l al i g a n d sa n dt h ez n ss u r f a c ev i at h e i rd i t h i o lp o l a rh e a d s ， h j g hq u a l i t yw a t e r - s o l u b l eq d sw a sa c h i e v e db yas l i g h tm o d i f i c a t i o no ft h ep r o c e d u r eo fo t h e r r e p o r t s t h ei n f l u e n c eo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fd h l am o d i f i e dq d sb yv a r i o u si n o r g a n i cm e t a l i o n sw a sf u r t h e rr e s e a r c h e da n dt h em e c h a n i s mo ft h er e a c t i o nw a sa l s od i s c u s s e d ( 2 ) w a t e r - s o l u b l eq d sw e r ec o n j u g a t e dc o v a l e n t l yt ob o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a lv i a 1 一e t h y l - 3 - f 3 - d i m e t h y la m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e h y d r o c h l o r i d e ( e d c ) a n d n - h y d r o c y l s u l f o s u c c i n i m i d e ( s u l f o - n h s ) t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a si n c r e a s e da f t e rq d s w i t hb s ac o v a l e n t l yb o u n d b e c a u s eq d so v e r c o m et h e i rs u r f a c ed e f e c t sw h e nt h e yw e r ec o v e r e d w i t hb s a ，w h i c hm a k e st h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y t h ep r o d u c t ( b s a q d s ) h a dg r e a tr e s p o n s et oc u 2 + w h i c hm a d et h e s eb i o c o n j u g a t e sh a v i n gp o t e n t i a lt ob ec u 2 + s e l e c t i v e p r o b e h i g hp u r i t yo fp r i o np r o t e i n ( p r p 。) w a so b t a i n e db yn i c k e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y p r p 。 h a db e e nl a b e l e dv i aan o n c o v a l e n ts e l f - a s s e m b l yp r o c e s so n t os u r f a c ef u n c t i o n a l i z e dq d sa n dt h e c o n j u g a t i o nw a sv e r i f i e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r aa n da g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( 3 ) p r pw e r ef o u n dt oh a v eas t r o n gp h o t o l u m i n e s c e n c ea t6 7 0 n ma n dt h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo fp r pi sl i n e a r l yp r o p o r t i o n a lt o i t sc o n c e n t r a t i o n s oas i m p l e ，r a p i da n ds e n s i t i v e i i i 西南人学硕士学位论文 d e t e c t i o nm e t h o df o rp r pw a sp r o p o s e d t h es o u r c eo fp h o t o l u m i n e s c e n c ew a sd i s c u s s e da n dw e s p e c u l a t et h a t i tw a sc a u s e db yf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) b e t w e e nt h e t r y p t o p h a no f p r pa n dh e m a t o p o r p h y r i ni nt h eb a c t e r i a k e y w o r d s ：q u a n t u md o t s ；m o d i f i c a t i o n ；f l u o r e s c e n c el a b e l i n g ；p r p ； f l u o r e s c e n c es m a l lm o l e c u l a r i v 符号说明 符号说明 b s a b s a q d s d h l a d h l a - c d s e z n sq d s f r e t p r p p r p c p r p r e s p r p s c q d s q y s d s p a g e t o p o t s e s 牛血清白蛋白 二巯基辛酸修饰的c d s e z n s 量子点标记b s a 二巯基辛酸 二巯基辛酸修饰的c d s e z n s 量子点 荧光共振能量转移 朊蛋白 p r p 在细胞内的正常形式 p r p 的突变体 p r p 的致病形式 量子点 量子产率 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三正辛基氧膦 传染性海绵状脑病 n 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。不存在抄袭、伪造等学术不良行为所获的相关内容。对本 研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确 说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：赤i l 建玉 签字日期：v 1 年( 月 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：i i ! i i ) 迪互导师签名：关p 落仅 签字日期：1 年月f 日 签字日期：卅年莎月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第l 苹文献综述及前言 第1 章文献综述及前言 1 1 引言 纳米( n a n o m e t e r ) 是一种长度度量单位，用符号表示为“n i n ”，1 纳米等于十 亿分之一米( 1 0 。9 m ) ，相当于3 - 一5 个原子大小，约为头发丝直径的万分之一。打 个比喻来说，将1 纳米的物体放到乒乓球上，就像将一个乒乓球放到地球上一样。 纳米科技( n a n o s t , n a n o s c i e n c ea n dn a n o t e c h n o l o g y ) 就是在纳米尺度( 1 n m 到 1 0 0 n m 之间) 上研究原子、分子等的特性和相互作用，以及实现在这一尺度范围 内对原子、分子进行操纵和加工的新兴科学。最早提出纳米尺度上科学和技术问 题的是著名物理学家、诺贝尔奖获得者理查德费恩曼。1 9 5 9 年他在美国物理学年 会上所做的题为底部有很大的空间的演讲中提出：如果人类能够在原子分 子的尺度上来加工材料、制备装置，我们将有许多激动人心的新发现。他指出， 我们需要新型的微型化仪器来操纵纳米结构并测定其性质。那时，化学将变成根 据人们的意愿逐个地准确放置原子的问题。1 9 7 4 年，t a n i g u c h i 最早使用纳米技术 ( n a n o t e c h n o l o g y ) - - 词描述精细机械加工。1 9 8 1 年i b m 苏黎世研究所成功研制出 了费恩曼所期望的纳米科技研究的重要仪器扫描隧道显微镜( s c a n n i n g t u n n e l i n gm i c r o s c o p e ，s t m ) ，使人类第一次能够实时地观察单个原子在物质表面 的排列状态和与表面电子行为有关的物化性质，真正意义上实现了人类长久以来 的梦想单原子操纵，这堪称是纳米科技领域的里程碑事件，其发明者宾尼格 和罗勒也于1 9 8 6 年获得诺贝尔物理学奖。1 9 9 0 年7 月，第一届国际纳米科学技 术会议在美国巴尔的摩召开，标志着纳米科学技术的正式诞生。从纳米科技正式 诞生到现在，近2 0 年时间纳米科技以其惊人的发展速度已经发展成为高度交叉的 综合性科学技术，包括物理、化学、生物学、医学、材料学等。随着纳米科技与 现代医学和生物学的交叉渗透，纳米生物医学已成为纳米科技领域最引人注目、 最有生命力的发展方向之一，吸引着越来越多科研工作者的目光。量子点 ( q u a n t u md o t s ，q d s ) 【1 j ，或称为半导体纳米晶体( s e m i c o n d u c t o r n a n o c r y s t a l s ) ， 是一种由i i 族或i v 族元素组成的直径在1 l o o n m 之间的纳米颗粒，因其独 特的荧光特性而被广泛应用于生物分析领域。本文的主要工作是量子点的水溶性 修饰及其在生物化学中的应用。 1 2 量子点的基本性质 当某些半导体材料小于某一临界尺寸，即其激子波尔半径时，其性质将发生 很大变化。所谓激子波尔半径是指载流子对中，空穴与电子之间的距离，其绝对 数值为纳米量级，当粒径小于这个临界尺寸时，物质的物理化学性质会较宏观体 h 南人硕i 诗j 忙沦史 发，- 很大改娈8j 。作为纳米粒九鞋了 具有许多独特的纳水t i ：质，奠。 1 ：受有以 j 、_ q 种： 1 尺可效心 j 所【w 艟r 尺寸效应指的是随着量子点t 、的逐渐减小，餐j 点 的吸收光谱出现蓝移现琢，尺0 越小，蓝移蚍馨越。矗著。 2 表效应表叫效应是指龟j 7 - 。i 表山j 的原了数ij 豳味丁数之比随粒径的变 小而急剧增大后所引起的性质上的变化。量n 篡粒径越小比表向积越、，- | j 随着 粒径的减小量r 一_ 裸锘在表面的原丁数迅速增加hj ，甘致教而原j 二酗位不足，产 生大量怂空键和：= i 卜饱和键返利表自1 效应使舒予点其有很大表面能和高活代_ 5 “j ， 极小稳定，韫容易与其它原了结台。 3 量f 隧道效应1 7 微观粒子共计舅穿势牟的能力称为隧道效1 0 。传统的功能 材料和元什，其物理尺、r 远j ：于电子自程，所观测的是群电f j 耋输彳了为，描述 的 质主要是宏观物砰毋。、尺寸碱小时，电 f 在纳水尺度审训中运动电r 能 级处于分立状态，城流r 的运输过手_ i ! r p 订明漫电子的波动代，从个量，阱穿越 量了势垒进入月一个量r 阱就会h 现量子隧道放出i 4 介电限域效应舟它叭域是十* 纳米微粒分散丑：异质介质巾由j 界曲_ = ；| 起的 体系介电增强的现缘，它起源于小的微粒与周削介质巾介1 u 常数上的差别。当介 电限域效应所 【起的能赶变化大j 山j 。量r 尺寸教应所引起的变化叫，量丁点的 能级差将减少，反映到吸收光谱上表现为明显的红移现象。 13 量子点的荧光特性 与传统柏机荧光染半4 榭比鼋九皇作为荧光探针有不| 】比拟的优越性： 131 激发光谱宽而连续 图jij 0 种不同粒径的c d s e z n s 量子点在同一光源激发下的荧光成像( 从左至右，最大发 射波长依、欠为4 4 3 ，4 7 3 ，4 8 i ，5 0 0 ，5 1 8 ，5 4 3 ，5 6 5 ，5 8 7 ，6 1 0 及6 5 5n m ) f i g u r ei 1t e nd i s l i n g u l s h a b l ee m i s s i o nc o l o r so f z n s c a p p e dc d s eq d se x c d e d i t han e a r - u v l a m pf r o m i e r t or i g h t ( b l u e i or e d ) t h ee m i s s i o n m a x i m aa m l o c a t e d m4 4 3 4 7 34 8 15 0 0 5 1 8 5 4 3 5 6 55 8 7 6 1 0a n d6 5 5n l n 第1 章文献综述及前言 传统有机荧光试剂激发光谱较窄，不同的有机荧光染料需要不同波长激发光 激发。而量子点能吸收所有比它第一发射波长更短波长的光，因此不同颜色的量 子点能用同一光同时激发，即实现一元激发多元发射( 如图1 1 ) ，大大简化了实际 检测过程，降低了对激发光源的要求。 1 。o 盘 穗 o 。嚣 鬈0 6 鬈 毳铡 德 幺 基o 2 意 0 g 铽粥5 0 0 0後 壤磊雠黝 自 静孽l 谚讳够鼢加 w 稳锕埝冉炒，骆黪 图1 2 一种典型有机荧光染料( a ) 和一种水溶性量子点( b ) 荧光光谱对比【9 1 f i g u r e1 2t h ec o m p a r i s i o no fe x c i t a t i o na n df l u o r e s c e n c ee m i s s i o n 【刈 ( a ) e x c i t a t i o n ( d a s h e d ) a n df l u o r e s c e n c e ( s o l i d ) s p e c t r ao ft y p i c a ld y em o l e c u l e t h ed y e w a se x c i t e da t4 7 6 n ma n de m i s s i o nw a sc o l l e c t e da t5 5 0 n m 饵) s e m i c o n d u c t o rn a n o p a r t i c l ew a se x c i t e da t3 5 5 n ma n de m i s s i o nw a sc o l l e c t e da t5 5 3 n m t h en a n o p a r t i c l eh a sam u c hn a r r o w e re m i s s i o na n dab r o a dc o n t i n u o u se x c i t a t i o ns p e c t r u m 图1 2 比较了量子点与典型有机荧光染料的吸收光谱，由图可知，量子点的 激发峰宽而连续，只要波长短于它的第一量子限域峰就能有效激发，而有机荧光 染料只能在较小的范围内激发。 1 3 2 发射峰窄而对称 相对有机染料，量子点的荧光发射光谱峰形狭窄而对称，半高峰宽( f w h m ) 通常只有4 0 n m 甚至更小，且在长波方向没有明显的拖尾现象，其发射峰与有机 荧光试剂的比较见图1 2 。这样可以同时使用不同发射峰的量子点，而发射峰不出 现重叠。这种性质使得量子点有可能用作多彩编码应用于生物荧光标记中【1 0 - 1 4 。 1 3 3 光稳定性强 在持续光激发下，有机荧光染料的荧光衰减迅速，容易被漂白，这在很大程 度上限制了它们在生物荧光标记上的应用。而量子点由于属于无机纳米颗粒，因 此是一种非常稳定的荧光物质，其抗光漂白性要远远好于有机染料。由图1 3 可 国 謦 霉 黛 2 ， 夺 净 8 o 謦谨勿一培程搿；_l懿|鑫zz缡嚣鬈葛 。自人；+ 珂i 伊，2 上 矧。 j 7r 。i 的光 j 儿三一r k t ：- 9 6 0 sj 儿r 赴罗川 咐6 0 t l 二= 1 ( i s ) 的10 0 ，= ”i ， 此置j 玉台- 一目件内长时“l ej 凸f i o2 04 06 0 t i m et m i n 图i3 油j 客- 性量子点、水溶性量予点及罗丹明6 g 的时间分辨光；：白曲线i 、； f i g u r e 3t i m e - m s o l v e dp h l l n b l e a c h i n gc l i 、c f o rt h eo r i g , l a lo n si h e “u b i i z e dq i ) s a n d i l l ier 6 g 34 发射波长可调谐“ 一i i ! i ；一羔l l * j = ：2：! ! 型。塑! l ， e ：；。1 ，y “_ 一一， l 兰三j 一，。专+ 一。 + 弋毫。一。 _ = 一 哼 + = ! 。：3 寮。 耳一 n 毒t - 争 图i4 从2 5 0 n n l 至2 5 0 0 n m 代表性的量子点，量子点发射峰分布从紫外区到红外区贯穿整个谱带二。 f i g u r e1 4r e p r e s e n l a f i v eo d sc o r em a t e r i a i ss c a l e da saf u n c l i o nn f t l l e i re m i s s i o nu 卧c l e n a l h s u p e r i m p o s e dm e ri h es p e c t r u mi n s c lr e p r e s e n l a t i 、cm a t e r i a l su s f o rcr e a t i n gm a g n e t i co d ) 】 第1 章之献综述及f j u 青 有机荧光染料试剂巾，只有极少数的化台物发射波长可达7 0 0 n m 以上( 立u 菁 粪荧光染 ： ) ，而量子点通过改娈其尺_ 和化学组成u 丁以使其发射光谱覆盖远紫外 到近红外的波长区域，从而弥补了普通荧光分_ f 在近红外光谱区品种少的不足【1 9 ”i 。如图14 所示：紫外蓝光( z n s 、z n s e ) ；可见光( c d s 、c d s e 、c d f e ) ：近红 外光( c d s h g s c d s 、i n p 、l n a s ) 等。量子点发光性质的口j 控性以及延续性，对 于其在荇个领域的应剧十分重要。 135 荧光强度高 量子点共有非常高的激发重叠区( e x c i t a t i o nc r o s s s e c t i o n s ) ，这就意味着他们 能吸收 量的激发光；量子点还具有很高的量子产牢，冈此他们能发射大量他们 所吸收的光。这两个网素都导致量子点的亮度根高，单个量子点也能很容易地被 榆测到，相对有机染料提高了检测的灵敏度f 9 ，1 0 , 1 5 , 2 22 。i ，这为考察单个牛物分子 的活动情况以及他们之问的相互作用提供了有利的t 具。 14 量子点的表面化学修饰 作为一种性能优良的荧光探针，量子点已经广泛应川于生物医学等研究领域， 这些应用通常需要把量子点与特定的生物大分子或药物连接在一起。然而，性质 优良的幂子点，如最常用的c d s e z n s 型量予点都是在有机相中制备的，其表面 包覆着大量的有机分子而呈现疏水性，与生物环境不相容，不能直接用了_ 生物体 系，因此要进行适当的表面功能化修饰，使之发生相转移而具有水溶性。就研究 现状而言，目前主要采用以r 几种表而功能化修饰方法： 141 通过巯基化合物进行修饰 图 5 巯基乙酸处理后的c d s e z n s 量子点与蛋白质以共价键结合【】 f i g u r e i5 a z n s - c a p p e d c d s e q d s i sc o v a l e n l l yc o u p l e d t o8p r o t e i nb y m e r c a p t o a c e t i ca c i d 琦甫 学砸卜? ”论史 刮刚q d s 表面的金属麒j 如iz n 、c d 等0 瑞蜒川j ! 1 1 的络台作用力，以蔬基 双功能分f 取代表卿朗有机分r ，使其从琏水性转变为求水性，另端的功能塾 团划段基、氮琏r t j 以川米t i 生物人分，连接，如胃15 。该方法原料易得，操作简 t 耻力便，更班仕蚶，已经成为龟f - - 冰溶眺化研究领域中最土矍的种修饰手段 目前l 经有人鞋关_ 。使刖各种筛基偶联诚剂2j 晕子点偶默的报 r 发丧口”： a i t $ 5 1 1 。、一一秽 图i6 二巯基辛酸修饰c d s e z n s 量子点“o f i g u r e16m o d i f i c a t i o no f c d s e z n sq d sb yd i h y d r o i i p o i ca c i d 、 牛辅基修饰简便快速俏稳定性不好l ”】，凼此自研究人员采川含有多1 、巯璀的 分子时量了点表而进行修饰，例如用6 ，8 一一巯基辛酸对c d s e z n s 苗子点表面进 j 处j t i ”j 。凶为肯两个巯堆，积巯堆同时与齄子点表而的金属麒f 键俞时具有 一定的蟹合作川( 如图16 ) ，这种作用比单巯旗+ j 金属的健台要妊的多，这就使 得包覆更为紧密，形成的水溢肚带子点比单个蔬牲试剂包薇的蜓为稳定扒文献 报道，币巯琏基闭修 _ i | j 的特了点稳定j ；= ；| 期般少于】犁期，而一疏蓝辛酸修饰的 叫存放1 2 年久 ”3 “。同时巯基辛酸的分了较k ，为蕈，点与生物利料的连 接捉t j + , t 较长的连接臂， 。者偶联坐i r | 容易，且时所杯。d 牛物材制的活性 ： ；【咖 卫 较小i ”】。此外，仃人采用爷羟崔的硫苏糌醇( d t ) 作为修饰荆，圳d t i 和 n 、n 。一糍璀二咪唑( c d i ) 两步反应将艟了- i 变成水溶性，并且米端带t ：羧甚，所 得旨子点稳定悱比单瑞堆化台物修饰的量了j l 好刚。际此之外，还有崩硫薛、疏 代心碱等卫功能分f 作为修饰剂的棚关报道【“s 2 。 142 道过硅烷化进行修饰 硅烷化是纳米粒了修饰u 常用的厅浊之，圳为观柯的硅烷化诚剂私噗作常 丰商，选拌小旧试剂就能够万便地改变纳米粒子衷所带的基团。a l i v i s a t o s 等 一目、， 笫1 章文献绢；述强莳 人i ”报道了使h j 二氧化硅，硅乍c 烷的方法制备水溶盹的z n s 包覆的c d s e 带f 点如刚17 所，f ，他们先h 1 端为氨批的毓基硅烷化试剂取代结合在毓f j _ 表 面的亲油肚配体，通过水解反应往量了，j 表旺u 形成筇层刊氧m 络层结构，再选 扦性地采用带自h ：同的日能l 扪硅烷化试镕l 进 j 第玖砖炕化形成似层辟枫刚编结 构，最后用嬉二种辟烷化试剂封i ；1 1 末反应位点并调估量子点表面电荷状况。 鼓一黪一 ” 圈17 硅烷化试剂修饰量子点示意图” f i g u r e i7s c h e m e o f p r e p a r a t i o n m e t h o do fs i l o x a n e dq u a n t u md o t s 在此革础之上，b a k a l o v a 等【4 0 1 直接利用疏水作用使，l t 表而结合r 层硅烷化 试剂，水解成核后经过进一步硅烷化处理，得到包被有单个量f 点的氨基化硅壳 型费光纳米颗粒。r o s e n z w e i g 等”用 种硅烷化的表面活廿靖0 分子将1 0 0 多个脂 溶性c d s e 量子点l 刊刚包进刚壳层内，制符rc 与生物分r 偶戕的直径为5 0 13 0 n m 的纳米粒子，这种方法制得的水溶陛量了点虽然稳定性好，易于衍生，但其 制缶过程极为繁琐，周l i f i 长、产率低、再现性差，因而该法j 打用不多，发展缓慢。 143 通过静电结合作用进行修饰 这种方法以美国海军研究实验室的m a t l o u s s i 研究组为代袁，他们用一疏基辛 酸为修饰试剂制蔷得到倚负电的水溶性量子点，然历通过简单的静电结合作7 t j ， 使带_ | 。电荷的工程化融台蛋白或抗_ 物素蛋门等吸附到量九气表面，从而得到了 衷【f | 功能化的量子点，在此基础上可以实现生物大分子之问的特芹性相瓦作用( 如 陶18 ) ，进一步应h 】于荧光免疫分析等牛物研究领域i “拼i 这种方法可以广泛 王 k f h 南人颤十学位论文 应用r 各种不旧蛋一、抗 车等与量子点结合，结台机理简巾、效；# 商月便于操作， f 坦埘工程融合蛋n 的制备技术要求很高，这也是u 前这种方法仅被极少数突骑审 掌握的原因。 一j 耋 、 蕾 a g 4 o 图18 通过静电结台得到表面功能化的基子点 f i g u r e i8s c h e m eo f p r e p a r a t i o n m e t h o do f f u n c t i o n a l i z e d q d sb ye l e c l r o s t a t i c i n t e r a c t i o n 1 44 通过聚合物进行修饰 d u b e n r d 等将c d s e z n s 量子点包覆在山聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺( p e g - p e ) 和 磷脂酰胆碱形成的嵌段共聚物胶囊l 】( 如图19 所示) ，量f 点胶囊可以菇价连接 到氨基修饰的d n a 上，作为特异性的d n a 杂交探针，摄终用f 生物活体成像1 4 。 q 妒盏”h i l l 】i d7 “蛳i n l u m “l 图i9 磷膳腔束包覆的量子点川 j ：i g u r e l 9s i n g l e q d se n c a p s u l a l i o n i n8 p h o s p h o l i p i db l o c kc o p o l y m e r m l e e i l e 羁 秒 ， 舻 童詈 一蟹 。器豢 卜一_ 三一州n 口 一 岬 b室“吣 。 携q 飒灿 第1 章文献综述及前青 p e n g 等采用树型高分子d e n d r o n 修饰量子点，既提高了量子点的水溶性和稳 定性，又能利用d e n d r o n 末端多种多样的功能基团m ”】。n i e 首创将不同颜色和 数目的量子点包埋入表面特功能基团的聚苯乙烯微球r 丌，从而获得大黾荧光编码 的水溶性微球，并使其具备了良好的水溶性，有望进一步麻用于基冈和蛋白质的 高通量分析以及多霞光学编码p “。此后，他们进一步研究，将t o p o 包覆的 c d s e z n s 量子点用三嵌段两亲共聚物通过自组装方法封装并使之分散，由于 t o p o 和聚台物问强烈的疏水作用使这两层相瓦结合在量子点周嗣形成疏水保 护结构( 图i1 0 ) 吲。 a 恂l l i 啪d 娜t i d 叫d o s | t i a j t - m d e c u kd r u 口 l 呐t 0 图l1 0 共聚物包覆的多功能量子点荧光探针9 “ f i g u r ei 1 0c o p o l y m e r _ c a p p e dm u l t i f u n c t i o n a lq d sp r o b eh 这炎方法由丁二量子点不用作特别处理，其表面的结构没被破坏，所以荧光| ：j = 质几乎不受影响，稳定性极好，但聚合物和高分子的合成都需要一定技术，原料 的难得使这种方法在应用上受到定限制。 145 通过疏水吸引力与生物分子相互作用”1 这种方法虽然简单，但成功报道不多，因而研究较少。 1 5 量子点的生物应用 1 9 9 8 年同期s c i e n c e 上，a l i v i s a t o s l 9 1 和n i e f l5 1 同时以量子点标记生物大分了并 应片j 于细胞荧光成像研究，丌始了麓子点在g 物医学领域的应用。从此，量子点 吼其独特的光学特| 生在生物化学、细胞q ：物学、分子牛物学等研究领域显不了极 其广闯的应j 前景，引起越柬越多科研t 作者的关注。 151 用于核酸分子生物学研究 d u b e r t r e t 等将特定的d n a 序列与p e g p e 胶束包覆的量子点偶联，得到 的d n a 探针能特异性世l 别与其互补的d n a 序列。n i e l 5 1 垮将刁：旧数量、不旧荧 两南大学硕士学位论文 光特性的量子点包覆于同一聚合物微球中，并将d n a 探针序列连接到微球上， 特异性检测到d n a 混合物中与其互补的序列。s p a t h a k m j 等人设计的实验可以检 验量子点标记的d n a 的杂交是否具有特异性。c h a n 等【55 j 利用生物素与亲和素的 特异性相互作用，将生物素化的量子点偶联到亲和素化的核酸探针序列上，在共 聚焦荧光显微镜下观察到了该探针能特异性地识别鼠脑部组织m r n a 。此外，量 子点还可以用于单个d n a 分子上特异序列的标记【5 6 | 。 1 5 2 用于蛋白质研究与分析 量子点在蛋白质检测与研究中的应用近年来引起人们很大的兴趣。 m a t t o u s s i f 4 4 j 等以量子点为荧光标记物进行免疫分析，成功地实现了对b 型葡萄球 菌肠酶素的测定。他们还以四种不同发射波长的量子点分别标记四种不同的抗体， 采用夹心免疫分析法，同时检测到混合样品中的四种抗原，实现了多元免疫分析 【4 6 | 。w a n g 5 7 1 等应用量子点的共振能量转移原理，以最大发射波长为6 1l n m 、5 5 5 n m 的红、绿量子点分别标记牛血清白蛋白( b s a ) 和抗牛血清白蛋白( i g g ) ，当二者形 成免疫复合物时，b s a 上的红色量子点荧光增强，i g g 上的绿色量子点荧光相应 减弱。w i l l a r d 等1 5 酬用量子点标记生物素化的b s a ，四甲基罗丹明( t m r ) 标记 链霉亲和素，形成了以量子点作为能量供体，有机荧光物质t m r 作为能量受体 的共振能量转移体系( 如图1 1 1 ) ，可以对生物素与链霉亲和素的结合进行检测。 f r 孤 图1 11 利用蛋白质特异性结合的f r e t 分析【5 驯 f i g u r e1 1 1f r e ta s s a yo fp r o t e i n p r o t e i nb i n d i n g 5 8 1 c o u r t y 等归9 j 对量子点示踪活细胞中蛋白质单分子动力学的方法学进行了详 细的介绍。c h o i 等【6 0 】设计了基于量子点荧光共振能量转移的蛋白质纳米传感器。 b a k a l o v a 等则将量子点应用于蛋白质印迹以检测痕量蛋白。d a h a n 等【6 2 】报道了 利用量子点观察活细胞中单个蛋白质分子的动力学行为。 l o 第1 章文献综述厦前言 酶的活性和酶的作用也可通过量子点观测。s c h l e i f e n b a u m 等i ” 在p l e c k s t r i n ( p 4 7 ) 蛋白中标记上荧光蛋白对，检测蛋白质激酶c 的活干牛。s t o c k h o l m 等m 3 应用多光子显微技术和f r e t 联用检测钙激活中性蛋向酶( c a l p a i n ) 在活鼠臂肌 细胞中的活性。j i a n g h o n gr a o 等e 6 5 1 利用生物发光共振能量转移( b r e t ) ，将q d s 作为能量受体检测金属蛋白酶基体( m m p s ) 。如图1 1 2 ，加入n i 2 + 后，带6 个 组氨酸的发光蛋白自组装在量子点表而，发生b r e t 而激发q d s ，加八m m p 一2 后，g l y 与v a l 之问的氨键断裂，b r e t 体系被破坏，量子点的荧光随之降低，从 而实现蛋白酶基体的检测。 图 图i1 2 利用量子点b r e t 检测金属蛋白酶基体 “】 f i g u r ei 1 2b r e 丁_ b a s e dd e t e c t i o no f m m p - 2w i t ha s s e m b l e dq d s 6 s l 53 用于生物传感 ( a )( b 1 3 量子点用于生物传感器f a ) 浓度型麦芽糖传感器阿“】：( b ) 基于f r e t 光学传感器 f i g u r el 13u s e d f o r b l o s e n s e r ( a ) c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t m a l t o s es e n s o r 岬6 ” ( b 1f r e b 拈e do p t i c a ls e n s o r 鬻盖一 、一 匝一，己基餮 尝一7 馥一了卫三。圈 岖 嘲 ，叫 6 。够 曲南大学硕士学位论文 曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼皇曼曼曼曼曼皇皇曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼皇曼曼i一一 一i i 曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼! 曼曼曼曼曼! 曼曼 c l a p p 等【6 6 1 将人工改造的并且保持结合能力的麦芽糖结合蛋白( m b p ) 与量子 点通过静电作用结合，再将花青染料共价结合到m b p 的特定位点上，形成 q d m b p c y 3 的f r e t 体系。m e d i n t z 等【6 7 ，6 8 1 应用麦芽糖结合蛋白作为生物识别 物质，设计了浓度型麦芽糖传感器，如图1 1 3 ( a ) 图。在m e d i n t z 等【6 8 】设计的光学 传感器中，以磺化n 一羟基琥珀酰亚胺( s u l f o - - n h s ) 活化光敏物质l ，3 ，3 一三甲 基一螺f 2 ，2 一吲哚啉- - 2 h - - 1 一苯并吡喃 ( 简称b i p s ) ，得到s u l f o - - n h s - - b i p s ， 当照射光在可见光区与紫外光区之间变换时，就会产生可逆的光学转换 6 9 1 ，如图 1 1 3 ( b ) n 。 1 5 4 用于细胞生物学研究 量子点在细胞生物学中的早期应用主要是固定细胞和组织的免疫荧光标记， 如细胞膜蛋白【7 0 】、肌动蛋白 引l 、微管及核抗原 7 2 】等，近年来研究领域逐渐扩展到 活细胞4 5 ，7 3 7 6 1 。 此外，量子点还被广泛应用于活体成像5 2 ，7 7