（材料学专业论文）葡萄糖芯片的合成研究.pdf

摘要本文首先以葡萄糖单糖为原料，依次通过全乙酰化、溴代、硝基化、氨基化和脱乙酰化得到1 对氨基苯氧基葡萄糖，即葡萄糖探针。然后，以马来酸酐为单体，过氧化苯甲酰( b p o ) 为引发剂，通过马来酸酐改性聚苯乙烯制备出了葡萄糖芯片基板。最后，再以1 乙基3 ( 3 二甲基氨丙基) 碳二亚胺( e d c ) 为偶联剂将制备好的糖探针和基板进行偶联得到葡萄糖芯片。1 合成出葡萄糖糖探针( 1 对氨基苯氧基葡萄糖) ，通过核磁共振( n m r ) 、红外谱图( f i t r ) 和光电子能谱( x p s ) 进行了表征。同时进行了不同的对比实验，考察了催化剂用量、反应时间、溶剂用量和反应温度等反应条件对其产率的影响，结果表明当催化剂碘与葡萄糖质量之比为0 0 5 ，溶剂二氯甲烷的用量为2 5m l g ( 葡萄糖) ，反应时间为5 5 h 时乙酰化溴代葡萄糖的产率最高，达到6 6 5 3 。当相转移催化剂四丁基溴化铵( t b a b ) 和对硝基苯酚用量摩尔比为l ：3 ，n a o h 量稍高于对硝基苯酚，反应温度为4 0 时1 对硝基苯氧基2 ，3 ，4 ，6 四o 乙酰基葡萄糖的产率最高，达到2 2 4 7 ；当反应温度为室温，反应时间为2 4 h ，n ( 脱乙酰化试剂) ：n ( 反应底物) 为1 5 ：1 时，脱乙酰化的效果最好；当以1 0m i 0 5g 含硝基原料的无水乙醇为反应溶剂，以1 1 ( 底物) ：n ( 浓盐酸) 为1 ：5 的浓盐酸为还原介质，并将反应底物溶于酒精形成溶液后进行滴加时，所得到的产率较高，达到3 6 0 3 ；当吸附时间为4 h ，温度为6 0 7 0 ，脱色液为中性，活性炭用量7 时，活性炭脱色的效果最理想。2 合成出了葡萄糖芯片的基板( 马来酸酐接枝聚苯乙烯) 。通过核磁共振( m r ) 、红外谱图( f i t r ) 和光电子能谱( x p s ) 进行了表征。同时进行了不同的对比实验，考察了反应条件的变化对接枝率的影响。通过实验发现：当单体( 马来酸酐) 的质量分数为1 ，引发剂( 过氧化苯甲酰) 的质量分数为1 ，接枝温度在9 0 时马来酸酐接枝聚苯乙烯的接枝率最高，达到0 7 4 。3 成功以e d c 为偶联剂将合成好的糖探针和基板连接上，通过核磁共振( r ) 、红外谱图( f i t r ) 和光电子能谱( x p s ) 对偶联后的产物进行了表征。考察了不同的偶联条件对偶联结果的影响，最后发现在整个偶联过程中n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 所起的作用很大，反应温度和反应时间等外界条件也就有较大的影响。关键词：葡萄糖芯片；全乙酰化；一锅法；相转移催化；铁粉还原；溶液接枝：e d c 偶联；a b s t r a c tb a s eo ng o o dp r o p e r t i e so fg l u c o s ea n da d v a n t a g e so fc a r b o h y d r a t em i c r o a r r a y st e c h n o l o g y , t h eg l u c o s em i c r o a r r a y sh a dab r i g h tp r o s p e c t i nt h i sp a p e r ，f i r s to fa l l ，t h eg l u c o s ep r o b e sw e r es y n t h e s i z e db yas e r i o u so fp r o c e s sw h i c hc o n s i s t so fa c e t y l a t i o n ，b r o m i n a t i o n ，n i t r o s u b s t i t u t i o n ，a m i n o s u b s t i t u t i o na n dd e a c e t y i a t i o n s e c o n d l y , m a h g p o l y s t y r e n ew a s m a d ea st h eb a s ep l a t eo fc a r b o h y d r a t em i c r o a r r a yd u et ot h em e t h o dw h i c hw a ss i m p l ea n dm a t u r ei nt e c h n o l o g y a tl a s tt h eg l u c o s ep r o b e sa n db a s ep l a t ew e r ec o u p l e dw i t he d cc o u p l i n ga g e n t s 1 t h eg l u c o s ep r o b e sw e r es u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e d t h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r ew a sd e t e r m i n e db yt h en m ra n df t i rs p e c t r o s c o p y m e a n w h i l e t h ea f f e c t i o no fr e a c t i o nc o n d i t i o n st op r o d u c t i v i t yo fa l lt h ep r o c e s sw a sa l s os t u d i e d ，a n dt h eh i g hp r o d u c t i v i t yw o u l db eo b t a i n e dw h e nc h o s et h eb e l o wc o n d i t i o n s ：r e a c t i o nt i m e ，5 5 h ；5 0 m g gm a s sr a t i oo f1 2 ( c a t a l y s t ) t og l u c o s e ，a m o u n to fd i c h l o r o m e t h a n e ：2 5m l g( g l u ) a n dt h ef i n a ly i e l dw a s6 6 5 3 t h eb e s tr e a c t i o nc o n d i t i o no ft h es e c o n ds t e pw a so b t a i n e da sf o l l o w s ：m o l a rr a t i oo fc a t a l y s t s ( t a b a ) a n da c e t o b r o m o g l u c o s e ：1 1 ，m o l a rr a t i oo fp - n i t r o p h e n o la n dn a o h ：1 1 5 ，t e m p e r a t u r e ：9 0 。c ，t i m e ：4 h ，a n dt h ef i n a ly i e l dw a s2 2 4 7 a l s o ，t h eh i g h e s tp r o d u c t i v i t yo f1 - p - a m i d o p h e n o x yg l u c o s ew o u l db eg e tw h e nr e a c t i o nc o n d i t i o n sa sf o l l o w s ：r e a c t i o nt i m e ：4 h ，n ( r e a c t i o ns u b s t r a t e ) n ( h c l ) ：1 5 ，e t h a n o ld o s a g e ：5 m i 0 5 9 ( r e a c t i o ns u b s t r a t e ) w h e nr e a c t i o nt i m ew a s2 4 h r e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s2 5 a n dt h er a t i ob e t w e e nd e a c e t y l a t i o na g e n t sa n dr e a c t a n t sw a s1 5 ：1 ，t h ee f f e c t i o no fd e a c e t y l a t i o nw a sb e s t 2 t h eb a s ep l a t e s ( m a h - g - v s ) w e r es u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e d t h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r ew a sd e t e r m i n e db yt h en m ra n df t i rs p e c t r o s c o p y a l s o ，t h ea f f e c t i o no fr e a c t i o nc o n d i t i o n st ot h eg r a f t i n gr a t i oo fp r o c e s s i o nw a ss t u d i e d ，a n dh i g hg r a f t i n gr a t i ow o u l db eo b t a i n e dw h e nc h o s eb e l o wc o n d i t i o n s ：m a s sr a t i oo ft h eb p o ：l m a s sr a t i oo fm a h ：1 r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ：9 0 a n dr e a c t i o nt i m ew a s3 h 3 t h eg l u c o s ep r o b e sa n db a s ep l a t e sw e r es u c c e s s f u l l yc o u p l e dw i t he d c t h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r ew a sd e t e r m i n e db yt h en m r 、f t i ra n dx p ss p e c t r o s c o p y t h ee f f e c t so fv a r i o u sf a c t o r s ，s u c ha ss p e c i e sa n dt h ea m o u n to ft h ec o u p l i n ga g e n lc o u p l i n gt i m ea n dt h ea m o u n to fr e a c t i o ns u b s t r a t et oc o u p l i n ge f f e c t i v i t yw e r es t u d i e d a l s o ，t h en h sw a sc r i t i c a lt ot h ec o u p l i n gp r o c e s s k e yw o r d s ：g l u c o s em i c r o a r r a y ；a c e t y l a t i o n ；o n e s t e ps y n t h e s i s ；p h a s e - t r a n s f e rc a t a l y s t s ；s o l u t i o ng r a f t i n g ；e d cc o u p l i n g独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：黄洒签字日期：御于年口占月。千日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解苤盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权苤盗盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名：董弓町签字日期：力。7 年口古月。午日导师签名：签字日期：曼箜g 月n卅年6 月j 日第一章绪论1 1 糖生物学的研究现状第一章绪论1 1 1 糖及糖生物学的定义及性质糖又称为碳水化合物，它们的经验式都符合通式c m h 2 。o 。，其中氢和氧的比例与水分子中氢和氧的比例相同，即：c m h 2 n o 。= c m ( h 2 0 ) 。糖类包括单糖、寡糖、多糖聚糖和糖复合物。糖、蛋白质和核酸是涉及生命活动本质的三类重要生物分子】。在生命活动的过程中，糖作为能量物质及结构物质的作用早己被人们所熟悉。随着分子生物学及细胞生物学的发展，糖的其它诸多生物功能不断被认识【2 】。糖不仅可以多糖或游离寡糖的形式直接参与生命过程，而且可以作为糖复合物，如糖蛋白、蛋白多糖及糖脂等参与许多重要的生命活动。此外，糖复合物还与许多疾病，如癌症、细菌和病毒感染等疾病有着密切的关系，有关糖的研究将成为未来生命科学中的重要研究课题之- - 3 1 。由于糖分子自身的结构特点，使得对糖的研究工作非常复杂，因此有关糖类的研究远落后于蛋白质和核酸，目前在糖化学中顺序测定的分析技术、合成方法学和空间结构技术等，从总体上讲还只相当于6 0 7 0 年代蛋白质和核酸的研究水平【4 】。关于糖类的研究工作与蛋白质和核酸相比，不论是在我国，还是在国外都是一个薄弱的环节。但由于糖的许多引人瞩目的生物功能，使得近几年来关于糖的研究逐步活跃起来，尤其是关于糖生物学的研究取得了突飞猛进的进展，英国、美国、日本等国家在糖类研究工作方面进展较快。2 0 世纪末，伴随基因组学和蛋白质组学的研究取得重大进展，兴起了一个新的生物学研究领域即糖生物学。所谓的糖生物学就是指生物体中所有糖分子及糖结合分子的全部集合，研究生物体中所有糖类以及糖结合分子的结构和功能及其表达和调控等的- - i 新兴分支学科pj 。1 1 2 糖生物学研究的特点尽管糖的研究相对落后，但对其研究却具有重要的意义。人类大约有( 4 0 5 0 ) 1 0 8 个细胞，且这些细胞组成了许许多多的细胞集团，这些集团之间又相互第一章绪论识别、相互作用和相互制约，调节和控制着高等生物沿着固有的空间轴和时间轴井然有序地发展，在如此复杂的发展过程中所需的极其巨大的“生物信息只能由含信息量比核酸和蛋白质大几个数量级的糖链分子来承担。这就导致了“糖生物学的诞生【6 】。2 0 世纪6 0 年代发现在细胞表面上密布有糖缀合物，推测这些糖缀合物糖链在生命过程中担负分子识别的功能。7 0 年代由于物理化学测定方法的建立以及特异的内切和外切糖谱酶在结构测定中的应用，使结构测定成为可能，揭示出糖链惊人的复杂性和多样性。8 0 年代末负责糖链合成的糖基转移酶的克隆，揭示糖链多样性是在基因水平和蛋白质水平进行调控的。这些进展为糖链的结构功能研究的突破奠定了坚实的基础，并直接导致了在1 9 9 0 年首次发现糖链的生理功能。糖链与蛋白质和核酸在结构和功能方面有很多不同之处，如糖链的结构远比核酸和蛋白质要复杂，比如由3 个核苷酸碱基或3 个氨基酸组成的直链分子有6 种可能的序列，而由3 个己糖所构成的三聚糖，其可能的序列则可达1 0 5 6 2 7 6 4 8 种；且糖链的合成并不是有模板的复制，而是通过糖基转移酶和糖苷酶在内质网和高尔基体内合成的，除受酶基因表达的调控外，还受酶活性的影响，即便在同种分子的同一糖基化位点上，糖链的结构也有差异，有不均一性，因此，很难得到结构均一的糖链，糖链结构测定和化学合成也远比核酸和蛋白质要困难，这就极大地限制了对其功能研究 7 1 。糖链功能和调控的复杂性也制约了研究的速度，糖链功能的复杂性表现为：( 1 ) 很难预知某一特定糖链的功能和对生物体的重要性；( 2 ) 同一糖链在生物体的不同部位和不同的个体发育阶段功能不同；( 3 ) 较为专一的生物作用通常是通过不寻常的糖链序列或常见糖链的不寻常表达或修饰来介导，而这些特殊的糖链也常常是毒素和病原体的识别目标。因此，对糖链的生物学作用只能逐个的研究。糖链调控的复杂性则表现为调控的细胞、组织特异性和发育阶段性；一种糖基转移酶只能合成一种糖苷键，同一糖苷键则可由不同的糖基转移酶合成【8 】。1 1 3 糖生物学的应用1 1 3 1 糖生物学在酶学领域的研究糖生物学与酶学的关系极为密切，研究表明：一方面，糖是酶作用不可缺少的成分【9 1 。另一方面，酶是进行糖生物学研究不可缺少的工具。糖生物学和糖工程中所有重大课题都离不开糖链的生物合成，而糖链的生物合成必须有糖基转移酶的参与。前面己提到糖链的合成受到酶基因表达的调控。因此，有关糖基转移酶的研究倍受人们的重视，成为酶工程领域的又一个热点课题 i o 】。目前发现的第一章绪论糖基转移酶有1 0 0 多种。有关糖基转移酶的分布和定位、分子结构和家族、分子克隆和表达、酶的调控和缺失等方面的研究，已经取得很多引人注目的成果。1 1 3 2 糖生物学在医学领域的研究病原细菌在哺乳动物组织细胞靶位上的黏附是感染的关键步骤。大多数微生物在细胞表面的吸附是由糖链介导的，另外多种糖缀合物及糖链广泛存在于微生物中，这些糖链常在微生物与动植物的相互作用中起至关重要的作用，病原微生物细胞外膜上的糖链也往往是感染的独立因子，如幽门螺杆菌感染通常与胃炎有关，它主要定植于胃薪膜层，但也能直接与表达l e b 糖链的胃上皮细胞相互作用l l 。约7 0 的人有l e b 组织血型抗原，幽门螺杆菌高选择地与l e b 糖链黏附，而不识别末端为g a l n a ca 1 ，3 的l e b 抗原( 即a 型血抗原) ，故o 型血人群发病率高于a 或b 型血者。幽门螺杆菌是通过其细胞表面的黏附素b a b a 与l e b 结合而黏附于上皮细胞，幽门螺杆菌与宿主间的病理关系可能决定于l e b 介导的黏附【l2 1 。由于许多细胞生理功能所必需的蛋白质是糖基化修饰的，糖基化的不同又常导致蛋白功能的改变。许多疾病就与细胞表面糖基化的改变有关，如由糖基化先天缺损( c d g ) 所引起的临床综合症最初于1 9 8 0 年被发现。目前已发现至少8 种不同的c d g ，被归纳为c d g 1 和c d g 2 。c d g 1 是n 糖链合成缺陷，c d g 2 是n 糖链加工缺陷，这些疾病引起多系统异常，中枢神经异常是主要症状 1 3 - 1 4 】。糖化学在中医药领域也具有较大的应用。多糖是中医药发挥独特疗效的重要物质基础，近年来提取出多种中药多糖，它们具有多方面的生物活性，药理作用甚广，从免疫药理的角度看，是一类非特异性的免疫增强剂，已用于临床f b 】。目前，我国多糖研究在中药领域中的应用主要集中在以下几个方面：( 1 ) 多糖的一般化学分离和提取鉴定。现已完成了大量的基础性工作地道药材采集方面的应用。从多糖含量的变化来确定采收的最佳时间和部位，如根据商陆多糖含量变化选最佳采收期，以确保地道药材的质量【l6 1 。( 3 ) 中药多糖免疫药理学研究的开展；( 4 ) 中药多糖的临床应用。中药多糖在肿瘤与慢性肝炎的治疗方面的应用有着喜人的前景。随着对中药多糖结构和功能研究的深入，中药多糖类药物在临床上新的用途将得到充分地挖掘。1 1 4 糖生物学研究的最新趋势糖类研究己经渗透到生命科学的许多领域。在过去的数年中，各国科学家们在糖生物学领域取得了许多重大发现，如发现细胞质中有不少组分是糖复合物，并用一些糖脂的单抗和免疫组分的方法检测了糖复合物在听觉细胞表面的分布，研究了糖复合物和听觉的关系等【1 刀。另外，对糖链的作用有了新的认识，如糖第一章绪论链在新生肽链折叠过程中的作用、糖链在免疫系统中的作用、糖链在细胞信号传导中的作用、糖链与微生物感染的关系、糖链代谢疾病的关系、糖链的化学合成与结构分析等。目前糖生物学研究中要解决的关键技术问题是糖链结构分析和合成方法的建立。在糖链的分析上需要建立高分辨率、快速的序列测定和构象研究方法及模型；在合成上需要建立高效的方法。但糖链的结构分析和合成很难像核酸和蛋白质那样完全靠化学方法解决，因此化学方法和酶反应相结合是发展趋势，在功能研究方面主要还是研究糖链合成与代谢途径和糖链在细胞内、细胞间的功能，其前沿领域为糖基化、蛋白质与糖链的相互作用及糖在微生物感染中的作用三个领域【l 引。为此，各国科学家都在致力于糖链结构分析和合成方法学上的突破，为糖链的功能分析提供技术支持，同时糖链的功能研究又集中在细胞水平上糖链的调控和识别机制的研究。著名生物学家a j i tv a r k i 指出：“在即将到来的后基因组学时代中，当人们越来越多地将注意力集中到完整器官或生物体的发育和生理学的分子机制时，糖链生物学功能将会更加显而易见。”。糖链的生物学功能是通过糖链对蛋白质功能的修饰、糖缀合物糖链与蛋白质的识别来实现的。可以预见，随着糖链在生命活动中的功能和调控机制研究的深入，必将极大地促进功能基因组学和蛋白组学的研究【l9 1 。因此，糖生物学是全面揭示生命本质所不可缺少的分支，是世纪生命科学研究的重要组成部分。1 2 糖芯片的研究现状1 2 1 糖芯片的定义糖芯片作为近年来快速发展起来的一种生物技术，是在基因芯片和蛋白质芯片研究基础上相应诞生的，其基本原理也与基因芯片和蛋白质芯片相似，即将多个不同结构的糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基板上，进而对糖蛋白等待测样品或糖分子本身进行测试、分析。与芯片上糖探针存在特异作用的样品物质会被吸附，其他无特异作用的物质则在清洗液的冲洗下被洗掉1 2 0 1 。通过荧光染色等检测方法可以简单、快速地筛选出存在特异作用的分子，从而在分析糖蛋白结构和作用等方面起到重要作用。4第一章绪论1 2 2 糖芯片的合成方法及进展自从2 0 0 2 年f u k u i 等【2 l 】首次报道了展示在硝酸纤维素膜上的糖芯片技术以来，糖芯片的制备技术得到了蓬勃发展。研究者通过不同的制作方法( 非共价吸附、共价连接、在片合成等) 将不同来源( 天然糖和人工合成糖) 和不同类型( 单糖、寡糖、多糖和复合糖) 的糖固定到不同基板( 玻片、硝酸纤维素、聚苯乙烯板、聚偏氟乙烯膜和自组装单层膜等) 上制备出了不同功能和类型的糖芯片。当然尽管糖芯片技术已经取得了较大进步，但由于糖类化合物是一个结构十分复杂的庞大体系，要分离或合成一系列具有确定结构并且性质类似的多糖或寡糖相对于基因和蛋白质来说比较困难，因此相对于基因芯片和蛋白质芯片，糖芯片的研究仍存在较多困难。在糖芯片的制备过程中，糖探针在固相基板表面的固定化是很重要的一步。目前有三种方法可用来固定糖类：( 1 ) 以非位点特异性、非共价的方式固定于基板表面；( 2 ) 以位点特异性、非共价的方式固定于基板表面；( 3 ) 以位点特异性、共价的方式固定于基板表面。由于非位点特异性、共价的固定方式会在较大程度上削弱糖类的生物活性，所以目前尚没有将未经化学修饰的糖类以非位点特异性、共价的方式固定于基板表面的方法1 2 2 1 。1 2 2 1 以非位点特异性、非共价的方式固定于基板表面将未修饰的糖以非位点特异性、非共价的方式固定在未做衍生化处理的基板表面的技术不需要化学反应，是一种相对简单的固定化方法。w a n g 2 3 1 将未经修饰的不同分子量的、不同结构( 直链型、高支化型、杂合型) 的、不同糖苷键连接的葡聚糖和菊粉分别用异硫氰酸荧光素( f i t c ) 进行标记，然后分别溶于0 9mn a c i 溶液中。用高精度点样机g m s4 17a r r a y e r ：f f 孚样品液点加到硝酸纤维素包被的玻璃片上。每个样点直径1 5 0 1 t i n ，间距3 7 5 1 m a 。作者将多糖芯片用大量水冲洗并用荧光扫描仪检测水洗前后的荧光信号强度，以检测多糖的固定化效率。结果显示分子量是控制固定化效率的关键因素：固定化效率随着分子量的增大而显著增大。当分子量低于3 3 k d 时，多糖分子便不能通过疏水缔合作用有效固定于硝酸纤维素包被的玻璃片上。图1 1利用疏水缔合作用固定多糖探针的糖芯片制备策略f i g1 1i m m o b i l i z a t i o no f p o l y s a e c h a r i d e st h r o u g hh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n 等互第一章绪论w i l l a t s1 2 4 】将已知分子量的果胶多糖酸钙、半乳聚糖、阿拉伯树胶酸、聚木半乳糖醛酸、阿拉伯半乳聚糖蛋白聚糖、新糖蛋8 ( i - 4 ) p d 半乳聚糖b s a ( 牛血清白蛋白) 、还有烟草叶肉细胞、野胡萝卜细胞萃取物中的杂多糖等多种多糖和蛋白聚糖、糖蛋白、新糖蛋白和糖缀合物，分别溶于磷酸缓冲液中( p b s ：0 1 4mn a c i 、2 7m mk c ! 、7 8m m n a 2 h p 0 4 、1 5m mk h 2 p 0 4 ，p h = 7 2 ) ，配成0 5m g m l 的溶液，以不同比例稀释后，用p i n a n d f i n g 型a f f y m e t r i x4 1 7 点样机直接喷点于表面氧化处理的黑色聚苯乙烯板上，通过氢键和物理的疏水相互作用将探针分子固定，每个样点大约5 0p l ，间距3 7 5l a m 。对该糖芯片进行单克隆抗体( m a b s ) 免疫实验，结果表明所有多糖样品均成功固定在基板上，且最小检测浓度为1 6l a g m l ，最小检测量为8 0 瞧。c a r i o n 2 5 i 等分别将不同分子量的葡聚糖先后与氯乙酸、苄胺、s 0 3 嘧啶反应，制得同时带有羧甲基、苯基、磺酸基、羟基的葡聚糖( d m c b s u 葡聚糖) 。由于羧基和磺酸基的存在，该多糖探针带负电。当芯片基板带正电荷时，静电作用力将使多糖探针吸附于其上。他们还依据各功能基团取代度的不同和葡聚糖主链分子量的不同，建立了一个包含5 0 种d m c b s u 葡聚糖的多糖库，然后使用非接触式压电点样器( b c a l ，p e r k i n e l m e r ) 将各类d m c b s u 葡聚糖溶液点加到氨基脲或氨基改性的玻璃片上，每个液滴ln l ，共l8 0 0 个液滴阵列。免疫实验结果显示采用氨基脲改性玻璃片为基板的多糖芯片有更好的固定化效率。在与血小板衍生生长因子b b ( p d g f b b ) 的结合实验和细胞增殖实验中，实验组利用该多糖芯片迅速从糖库中筛选出与p d g f b b 具有最佳结合能力，且同时具有增强p d g f b b 促增殖效应的一类d m c b s u 葡聚糖。筛选出的d m c b s u 葡聚糖在某种程度上能够作为肝素的替代物，吸附生长因子。这类通过物理作用固定糖探针的方法已被许多制备糖芯片的实验证实有效，但当该策略应用到以寡糖或单糖为糖探针的糖芯片制备实验时，该方法便不再适用。由于寡糖或单糖分子量小、亲水性好，因此在制备这类糖芯片时需要采用其它牢固可靠的固定化策略。位点特异性、非共价固定化制备策略便因此而提出。1 2 2 2 位点特异性、非共价的固定化策略这种固定化策略是在寡糖或单糖分子上某一特定位点引入疏水锚链，再通过疏水作用将糖探针固定在表面疏水改性的固相基板上。f a z i o l 2 6 j 报道了一种简单高效的方法。实验组首先选用氨乙基d d 半乳吡喃糖苷作为糖分子模型，以甲醇异丙醇( v v = 1 ：1 ) 为溶剂，在9 6 孔微量滴定板的微孔中直接与十四烷基异硫氰酸酯反应，制得带十四烷基疏水尾链的糖探针分子并直接通过尾链的疏水缔合作用固定在微孔内。反复水洗后，用电喷雾离子化质谱( e s i m s ) 和凝集素结合实验检测糖芯片，结果显示半乳糖被成功固定在微孔内。f a z i o 采用这种固6第一章绪论定化策略制备了含艾滋病g p l 2 0 寡甘露糖型寡糖、乳腺癌抗原g l o b oh 等多种寡糖探针的糖芯片。h u a n g1 2 7 也采用类似的方法，在表面疏水的基板上直接合成带脂肪尾链的新糖脂( n e o g l y c o l i p i d ) ，通过疏水缔合作用将糖探针固定。他们首先用a 甘露糖( a m a n ) 作为糖分子模型，醋酸( 1 0 ) 为溶剂，在9 6 孔微量滴定板的微孔中与少量的十四烷基胺混合。糖分子在酸性环境中环状结构将被打开，游离的醛基与脂肪链上的氨基发生席夫碱( s c h i f f b a s e ) 反应，将十四烷基尾链引入糖分子，从而直接在微孔内固定糖探针。对甘露糖有特异性结合作用的f i t c 伴刀豆凝集素( c a n a v a l i ae n s i f o r m i sc o na ) 吸附实验显示，甘露糖探针被成功固定在基板上，c o na 的最低特异性吸附量为0 2t t m o l l 。随后实验组利用此固定化策略制备了含三种复杂寡糖：大肠杆菌0 8 6 抗原、0 1 2 7 抗原、0 1 2 8 抗原的糖芯片，并筛选出对人血清免疫球蛋白m ( i g m ) 特异性结合能力最强的寡糖抗原结构。此外，还有研究者用了一些结构较为简单的糖分子如树胶醛糖、鼠李糖、果糖、乳糖、氨基葡萄糖等作为模型，用标准三氯乙酰亚胺活化程序将糖分子上异头碳原子活化；选用l ，4 顺丁烯二醇、3 全氟代辛基丙醇作为探针尾链合成原料，通过一系列有机反应，合成出一端含伯羟基( 可进行糖基化反应) ，一端含c 8 f 1 7 锚链( 可与氟化基板发生非共价强相互作用) 的长间隔链。随后将三氯乙酰亚胺活化的糖基供体和间隔链混合，二氯甲烷为溶剂，三氟甲基磺酸三甲基硅酯( t m s o t f ) 为促进剂，合成出含有全氟代辛烷尾链的糖探针。最后将糖探针溶于甲醇水( v ：v - - 4 ：1 ) 中，用自动点样仪( c a r t e s i a np i x s y s5 5 0 0a r r a y e r ) 喷点于氟硅烷改性的玻璃片上。在麦胚凝集素( t r i t i c u mv u l g a r i sw ga ) 和落花生凝集素( a r a c h i sh y p o g a e ap na ) 结合实验中，该糖芯片上乙酰氨基葡萄糖和半乳糖均能分别对两种凝集素发生特异性结合，表明探针已经成功固定于基板上。由于全氟锚链的引入，使得该芯片的糖探针对基板有很强的附着力，在清洗时必须使用清洁剂擦洗才能将其去除。1 2 2 3 位点特异性、共价的固定化策略v i l a - p e r e l l o1 2 8 1 报道了一种利用寡肽作为连接链共价固定寡糖分子制备糖芯片的方法，如图1 3 。他们首先通过标准固相合成工艺制备寡肽连接链，该寡肽的n 端需带有乙酰氨氧基，它能与寡糖的还原端进行肟化学连接；c 端需带有两个连续的赖氨酸( l y s ) ，其氨基残基能与羧基改性的基板共价连接，然后将丁戊糖与该寡肽链结合，并将所得的糖肽溶液与n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 、水溶性碳二亚胺( e d c ) 混合，点加在羧基改性的基板上，成功制备出拥有较高灵敏度的寡糖芯片。w ga 凝集素结合实验表明，该芯片上寡糖仍保持相当的活性，能与凝集素发生特异性结合。表面等离子体共振( s p r ) 光谱法分析发现，凝集素吸附平衡常数k 比前k n a h a l k o v a 【1 9 】的检测结果高出两个数量级。证明该制备工艺具有较高的固定化效率。8 ：姆“一：量靠u “8 东：空；。i | 呵o _ r 一彝o - 18 船高过，一l6 r _图i - 2 通过寡肚链连接寡糖探针与固相载体的固定化策略f i g i - 2s h o r tp e p t i d e m e d i a t e d i m m o b i l i z a t i o no f o i i g o s a c c h a r l d e s t oac a r b o x y ld e r i v a t i z e ds o l i ds u r f a c ep a r k ”等则将马来酰亚胺改性的糖点样到巯基活化的玻璃片上，通过加成反应将糖探针固定的糖芯片制备方法。他们选用葡萄糖、岩藻糖、唾液酸、h 露糖等多种糖类为原料分别用o - 糖苷键、n 一糖苷键、及“b 异构四种键接方式将其固定在基板上。并通过高通量的凝集素结合实验定量测定了不同键接方式对不同糖分子生物活性的影响。随后他们咀唾液酸为模型通过上述方法制作成糖芯片，并在基扳上通过3 次糖基转移酶催化的糖基化反应，合成出唾液酸化路易斯x 抗原( s m a l l l e “) ，直接在基板上台成出古复杂寡糖探针的糖芯片。研究表明，马来酰亚胺基与巯基的加成反应具有高效性与稳定性，可用来共价连接基板和糖分子。另外，作者将糖探针的共价固定化策略与糖自动化固相台成方法相结台，在基板上直接制各带复杂寡糖探针。这为研制更为精密复杂的糖芯片提供了新的思路。他们”还研究出了一种利用环氧基团改性的玻璃片将酰胼衍生化的糖共价周定的糖芯片制各方法，首先是将聚乙二醇( p e g ) 舶两个端羟基改性，其中一个用酰肼基团活化，另一个用羧基括化。然后在偶联剂的作用下，2 0 种氨基单糖糖苷与p e g 衍生物反应，获得末端带有酰胼基的糖探针。由于p e g 具有十分优异的生物惰性选用它来作为糖探针的尾链，既起到间隔链的作用，将糖分子与基板隔开，又可阻止基板对蛋白质的非特异性吸附。最后用p m 型点样仪分别将溶有2 0 种糖探针的溶液点加到表面环氧基改性的玻璃片l ，每个液滴体积为第一章绪论ln l ，浓度为1m m ，通过共价反应连接固定。该实验组用此糖芯片定量研究了p - l ，4 半乳糖转移酶的活性以及多种抑制因素对其活性影响。此外，有不少科学家将有机合成中些反应条件温和且高产率的合成手段引入糖芯片的制备中来。克里克( c l i c k ) 反应便是其中一种，c u ( i ) 催化的叠氮与炔烃的反应是c l i c k 反应中应用较普遍的一种。它具有极高的反应效率，而且参与c l i c k 反应的基团与大多数有机试剂均不发生反应，具有很好的选择性，并且对溶剂和p h 值基本没有要求，催化条件也十分温和p 2 l 。h u a n g 3 3 1 用可编程一锅法合成了胸腺癌细胞和卵巢癌细胞表面的六糖抗原g l o b oh 以及多种去顶端衍生物，并将其还原端用叠氮基活化。然后用炔胺与表面n h s 改性的玻璃片反应，将玻璃片表面覆上一层末端带炔基的单分子层。将上述寡糖衍生物分别配成不同浓度的溶液，点加于改性玻璃片上面。在c u ( i ) 的催化下，炔基和叠氮基发生l ，3 偶极成环加成反应，从而将g l o b oh 六糖的所有结构序列都固定在了玻璃片上。随后实验组用多种抗g i o b oh 单克隆抗体对糖芯片进行免疫检测时，发现顶端去葡萄糖一半乳糖( g i c g a d 的四糖g l o b oh 类似体与完整六糖结构有基本相同的免疫应答，而糖序列中的岩藻糖( f u c ) 对免疫应答有加强的效果；用病患血清进行免疫检测时，发现去f u c 的五糖g i o b oh 类似体与不去f u c 的完整六糖结构有基本相同的免疫应答，否定了其有加强免疫应答的效果，暗示了免疫血清具有多克隆性或g l o b oh 在不同免疫应答阶段具有不同的免疫响应。h 。吨蚝“k 键鼬 l图1 3 通过c l i c k 反应连接糖探针的固定化策略f i g1 3c l i c kc h e m s t r y m e d i a t e di m m o b i l i z a t i o no fc a r b o h y d r a t e - a z i d ec o n j u g a t e st oas o l i ds u r f a c ed i e l s a l d e r 成环加成反应也是种优异的有机反应。近来有科学家将其引入生物分子的固定化策略中。该反应有十分优异的性质：水对反应有极大的加速作用；反应温度十分温和( 常温) 。s u n 蚓开发了连续使f f d i e l s a l d e r 成环加成反99 飞婶挣玲科第一章绪论应和c l i c k 反应的糖芯片制作工艺。首先他们合成出端基为炔基和环戊二烯基的p e g 链。然后用此p e g 衍生物处理马来酰亚胺己酰基改性的玻璃，马来酰亚胺与环戊二烯进行d i e l s a l d e r 成环加成反应，从而在基板上引入生物惰性的p e g 链和炔端基。最后用c l i c k 反应将2 叠氮基乙基o 乳糖苷固定在炔基化的玻璃片上，成功制得含单一乳糖探针的糖芯片。在整个反应过程中，各反应基团互不反应且对生物分子保持良好的惰性。f i t c p na 凝集素实验表明该工艺有优良的可重复性和固定化效率。实验组以此为范式制备了糖芯片和蛋白芯片。号瓣乏之姜聋图l - 4 连续使用d i e l s a l d e r 成环加成反应和c l i c k 反应的糖探针固定化策略f i g1 - 4d i e l s - a l d e ra n dc l i c kc h e m s t r y - m e d i a t e di m m o b i l i z a t i o no fc a r b o h y d r a t e - a z i d ec o n j u g a t e st oas o l i ds u r f a c e以上制备策略都需要先将糖基供体进行活化，然而多步的化学改性反应增加了原料的损耗和实验难度，影响了寡糖芯片实用性。于是有科学家尝试了直接用未经处理的糖和改性的玻璃片进行组装的糖芯片制备策略。z h o u1 3 5 将1 0 种未经改性的寡糖通过共价键固定在表面覆盖乙酰氨氧化单分子层的玻璃片上，制备了寡糖芯片。第一步，将玻璃片浸润在硅烷偶联剂环氧硅烷溶液中，使其表面环氧功能化；第二步，用a ，二胺聚乙二醇溶液处理玻片，进一步在玻片上覆盖一层带伯氨基的p e g 单分子层；第三步，对活泼的伯氨基进行化学改性，引入乙酰氨氧基团。第四步，用将p i x s y s 5 5 0 0 自动点样仪将寡糖溶液点加到基板表面。寡糖分子还原端的醛基与活泼的氨氧基进行肟化学反应，从而通过共价键将寡糖分子固定在基板上，制得糖芯片。随后实验组用该芯片进行多种凝集素的特异性结合实验，分别测定了凝集素对各个寡糖的亲和结合常数，1 0第一章绪论并定量测定了部分凝集素对该芯片的最小可探测浓度。瞎肇啕罕竺竺竺竺竺竺! 竺竺t 1 盎1 瓯= = i = = 一l p o ”雠忡榭缸c 蝴，c o o h 怍母_ 一嘲”l 卜= 一c o c h = - o - m 4 早i i i l 卜= 等- o h - 翎广舢_ 缸l b = = 一_ c o c k - o - m ,阜量毫肇图1 5 利用肟化学连接将未改性糖固定在基板上的糖芯片制备策略f i g1 - 5a t t a c h m e n to fu n t r e a t e do l i g o s a c c h a r i d e st oa l la m i n o o x y a e e t y ld e r i v a t i z e ds o l i ds u r f a c et h r o u g ho x i m ec h e m i s t r yl i g a t i o n在未改性糖的固定化策略中，除了使用氨氧基活化的基板外，酰胼活化的基板同样对未改性糖有良好的化学选择性。l e e 【3 6 】分别制备了表面具有氨氧基和酰胼基的玻璃基板，并将葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、岩藻糖四种未保护糖点于其上。凝集素结合实验发现：在同样条件下，用酰胼基固定糖探针的糖芯片比用氨氧基固定糖探针的糖芯片对糖结合蛋白有更强的结合能力。平行液相实验发现，未保护糖在与酰胼或氨氧基反应时均会生成开环和闭环两种结构，但与酰胼反应的主产物为闭环结构，与氨氧基反应的主产物为开环结构。作者推测，这是用酰胼基固定糖探针的芯片有更高灵敏度的主要原因。随后，作者将2 1 种单糖、二糖、寡糖、多糖分别溶于p h - 5 的p b s 溶液中，分别点样于氨氧基改性的玻璃片和酰胼基改性的玻璃片上。用c y 3 陈皮木耳凝集素( a a u r a n t i a a a ) 、c y 3 - 银斑百里香凝集素( t v u l g a r i st v ) 、f i t c c o na 、抗路易斯x 寡糖抗体，对两种芯片进行糖蛋白特异性结合实验。结构表明采用酰胼改性玻璃片制备的糖芯片在同等条件下灵敏度比氨氧基改性的玻璃片制备的糖芯片高出近一倍，证实了之前的结论。糖芯片在使用过程中，特别易受到基板上非特异性吸附的蛋白残留物的干扰，影响精确度【3 7 】。因而要求基板既能与糖基供体进行高效的化学反应，又能对待测样品保持良好的惰性。为了克服上述缺点，s h i r a h a t a 那】开发了一种以硅片为糖芯片基板的制备工艺。与玻璃片相比，硅片具有埃米级的表面平整度、良好第一章绪论的表面各向同性、良好的化学和热稳定性、与生物分子具有良好的相容性，因此可以有效降低基板对蛋白的非特异性吸附，在理论上是一种理想的糖芯片基板材料。s h i r a h a t a 实验组将乳糖与对乙烯基苯甲胺混合并在沸腾的甲醇溶液中冷凝回流2h ，获得带有乙烯基的乳糖苷( v l a ) 。然后用h f ( 1v 0 1 ) 处理硅片表面，除去s i 0 2 氧化膜，得到质子化的硅基板。将v l a 溶于二甲基亚砜( d m s o ) ，并将硅基板浸入该溶液，高温冷凝回流5h ，v l a 与质子化的硅基板s i ：h 发生加成反应，获得含表面覆盖糖探针的硅基板。最后将基板覆上光掩膜并用紫外光照射，以断裂s i c 键，获得表面乳糖探针分布区域可控的糖芯片。蓖麻凝集素( r i c i n u sc o m m u n i sa g g l u t i n i n ，r c a l 2 0 ) 特异性结合实验表明，该基板的信噪比与p