（环境科学专业论文）22′44′四溴随着苯醚紫外光解及dna损伤毒性研究.pdf

a b s t r a c t b r o m i n a t e df l a m er e t a r d a n t sa r ew i d e l yu s e di np l a s t i c s ，e l e c t r o n i c s ， c o n s t r u c t i o n ，t e x t i l e sa n do t h e rm a t e r i a l sa n dp r o d u c t sd u et ot h e i rg o o d f l a m e r e t a r d a n tp r o p e r t y p b d ei sc u r r e n t l yo n eo ft h em o s tp o p u l a r f l a m er e t a r d e n t s s t u d i e sh a v es h o w nt h a t ，p b d e si sh a r m f u lt ot h e e c o l o g i c a le n v i r o n m e n ta n dh u m a nb o d y , s u c ha st o x i ce f f e c t so rp o t e n t i a l h e a l t hh a z a r dt oa n i m a ll i v e r , t h y r o i d ，r e p r o d u c t i v i t ya n dd e v e l o p m e n t ， n e u r o l o g ya n di m m u n es y s t e m sa n d s oo n i nr e c e n ty e a r s ，p b d e sh a v e b e e nd e t e c t e di nv a r i o u se n v i r o n m e n t a lm e d i aa n dl i v i n go r g a n i s m s ，a l s o i nh u m a nf a ta n db r e a s tm i l kf o rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nl e v e l s s of a r , b d e 一4 7 ( 2 , 2 ，4 ，4 - t e t r a p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r ) i sc u r r e n t l yt h e m o s tw i d e l yd i s t r i b u t e d ，t h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o n so f b i o l o g i c a ls a m p l e s ， o n eo ft h em o s tt o x i cp o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e rc o n g e n e r si nl i v i n g o r g a n i s m sa n dh u m a nb e i n g s ，t h u sp h o t o c h e m i c a lr e a c t i o ni st h em a i n d e g r a d a t i o np a t h w a yo fb d e 4 7i nt h ee n v i r o n m e n t t h e r e f o r e ，i ti so f g r e a ts i g n i f i c a n c et os t u d yt h ep h o t o c h e m i c a lr e a c t i o no fb d e 4 7a n di t s d n a d a m a g et o x i c i t y t h ew o r ko ft h i sp a p e rc o n s i s t so ft w op a r t s ： t h ef i r s tp a r ti st h ep h o t o c h e m i c a lr e a c t i o ns t u d i e so fb d e 4 7 b d e 4 7s a m p l ei sp r e p a r e di no u rl a b ，a n dt h ep h o t o c h e m i c a lr e a c t i o n so f i tw e r ec o n d u c t e di n4d i f f e r e n ts o l v e n t sa n da c e t o n i t r i l ew i t ht w ok i n d s 哪58洲50m 2 帅8jii-脚y o fa d d i t i v e s ，r e s p e c t i o fb d e 4 7i nf o u r r e a c t i o na n dp h o t o l y a c e t o n i t r i l e d m s o m e t h a n 0 1 t h e r ei sa ni n v e r s ec o r r e l a t i o nb e t w e e n p h o t o l y s i sr a t ea n ds o l v e n tp o l a r i t y , t h el e s sp o l a rs o l v e n t sf a v o rb d e 4 7 p h o t o l y s i sr e a c t i o n p h o t o d e g r a d a t i o nr a t eo fb d e 4 7d e c r e a s e di nt h e a c e t o n i t r i l ea d d i n gc u oa n dc u 2 0 ，i n d i c a t i n gt h a to x i d a n ta n dr e d u c t a n t a r en e g a t i v et ot h eo c c u r r e n c eo fp h o t o l y s i s t h ep h o t o l y s i sr e a c t i o no f b d e 4 7i s m a i n l yc o n s e c u t i v ed e b r o m i n a t i o nr e a c t i o n ，p r o d u c i n ga n u m b e ro fl o w e r - b r o m i n a t e d d i p h e n y le t h e r s ，t h e a b u n d a n c eo f p h o t o p r o d u c t s i nv a r i o u ss o l v e n t sr e f l e c tt h es o l v e n te f f e c tt ot h e p h o t o d i s s o c i a t i o np a t h w a y t h es e c o n dp a r ti sb d e 4 7 sd n a d a m a g et o x i c i t ys t u d i e s i nt h i s s t u d y , c y t o t o x i c i t yo fm i c el y m p h o c y t e si n d u c e db yb d e 4 7a n di t s p h o t o p r o d u c t si st e s tb ys i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ( c o m e ta n a l y s i s ) m e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：( d b d e 4 7i so fc y t o t o x i c i t ya n di n d u c e d d n a d a m a g eo fm i c el y m p h o c y t e s ；t h ec y t o t o x i c i t yi n c r e a s ew i t ht h e c o n c e n t r a t i o no fb d e 4 7 t h ep h o t o p r o d u c t so fb d e 4 7i n d u c ed n a d a m a g eo fm i c el y m p h o c y t e sm o r et h a nb d e 4 7 ，a n db d e 1i st h em o s t t o c x i co n eo ft h e m k e yw o r d s ：b d e 4 7 ，p h o t o c h e m i c a lr e a c t i o n ，k i n e t i c s ，s o l v e n te f f e c t s ， d n a d a m a g e i v 中央民方欠人学倾f j 论文 第一章综述 目录 1 第一节b d e 4 7 研究概述1 一、b d e 4 7 光化学研究概述1 二、b d e 4 7 及其代谢产物毒理学研究概述9 第_ 节瞥细胞凝胶电泳概述1 6 一、 单细胞凝胶电泳发展j 力程一1 6 二、单细胞凝胶电泳作用原理1 8 二、 币细胞凝胶电泳实验流程1 8 四、单细胞凝胶电泳技术的心用一2 l 一 第二三节选题目的及意义2 1 第二章b d e 4 7 合成及光化学降解研究2 3 第一节b d e 4 7 的合成2 3 一、实验材料与方法2 3 二、实验结果与讨论2 4 第二节b d e 4 7 光化学降解研究2 5 一、实验材料与方法2 5 一 二、测定方法的确定2 7 三、不同溶剂中b d e 4 7 光化学降解速率研究2 9 一 四、添加剂对b d e 4 7 光化学降解速率的影响3 5 五、b d e 4 7 光降解产物研究- 4 0 一 六、添加剂对b d e 4 7 光解产物的影响4 8 第三章s c g e 方法研究b d e 4 7 及光解产物的d n a 损伤毒性一5 3 第一节s c g e 检测方法的建立5 3 一 第二二节s c g e 方法检测b d e 4 7 及光解产物的d n a 损伤毒性，5 8 一 一、检测方法的确定5 8 一 二、 b d e 4 7 对细胞存活率的影响6 0 三、 b d e 4 7 对小鼠淋巴细胞的d n a 损伤一6 1 四、b d e 4 7 光解产物对小鼠淋巴细胞的d n a 损伤一6 2 五、结果与讨论一6 4 一 结论 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文目 中央民族大学研究生学位论文作者声明 v 6 6 6 7 一7 6 鉴垦丛叁兰堡上笙塞 第一章综述 第一节b d e 4 7 研究概述 一、b d e 4 7 光化学研究概述 ( 一)b d e 4 7 简介 溴系阻燃剂( b r o m i n a t e df l a m er e t a r d a n t s ，b f r s ) 由于具有良好的阻燃性质， 广泛应用于塑料、电子、建筑、纺织等材料与产品中，其生产和使用已经有3 0 多年的历史。b f r s 分为反应型和添加型两种，其中反应型b f r s 以化学键与基 质结合，不容易散逸出来，而添加型b f r s 以分子问作用力与基质结合，容易从 基质扩散到环境中。目前所使用的溴系阻燃剂主要包括：多溴联苯醚 ( p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y l e t h e r s ，p b d e s )、六溴环十二烷 ( h e x a b r o m o c y c l o d o d e c a n e ，h b c d s ) 、四溴双酚a ( t e t r a b r o m o b i s p h e n o la ， t b b p a ) 及多溴联苯( p o l y b r o m i n a t e db i p h e n y l s ，p b b s ) 等【l 】，各结构式如图1 1 所示。它们的阻燃机理是在高温情况下能分解产生溴原子，溴原子是强还原剂可 以捕获氢氧自由基( o h ) 和氧自由基( o ) 等燃烧反应的核心游离基，从而达 到阻燃灭火的目的【2 1 。 b r l z 4 y z l l o 鹣d e $h b c d h。b鼹rbr。hbr恕。 b r , 图1 1p b d e s 、h b c d 、t b b p a 、p b b s 的化学结构式 f i g 1 1 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fp b d e s 、h b c d 、t b b p a 、p b b s 多溴联苯醚( p b d e s ) 是一类重要的溴系阻燃剂，约占溴系阻燃剂总量的l 3 ， 中央民族人学顺l j 论义 被广泛用于纺织、家具、建材、交通工具和电子产品中【3 1 。目前，p b d e s 已在数 千种产品中存在，大约构成产品重量的5 3 0 不等【4 1 。p b d e s 作为添加型阻燃 剂，是以物理方式结合在树脂基材上的，因此在生产、使用、运输及废弃物报废 处理等过程中容易被释放到环境中【5 1 。早在1 9 7 9 年，在美国p b d e s 生产厂周边环 境中采集的土壤和污泥样品中检测到了十溴联苯( b d e 2 0 9 ) 的存在【6 】，两年后 a n d e r s o n 等7 】手艮道了瑞典v i s k e n 河的梭子鱼中也存在p b d e s 。1 9 8 7 年j a n s s o n 等【8 】 证明了波罗的海、北海、北冰洋的鸟( 以鱼为食) 和海洋哺乳动物的组织样品中 有p b d e s 存在，首次提出p b d e s 是全球性的污染物质。 p b d e s 已被证实广泛存在于环境中，近年来在各种环境介质和生物体内都检 测出了p b d e s ，而且在人体脂肪和母乳中也检出不同浓度水平的p b d e s 9 1 。多溴 联苯醚的化学结构( 如图1 2 ) 与多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e d b i p h e n y l s ，p c b s ) 、 多溴联苯( p o l y b r o m i n a t e db i p h e n y l s ，p b b s ) 相似，因此被认为具有与持久性有 机物染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，p o p s ) 类似的特性( 表1 1 所列为几 种常见的p b d e s 的物化性质) ，如强亲脂性、半挥发性和生物蓄积性等，在环境 中可长期存在，并对生态环境及人体造成危害，如对动物肝脏、甲状腺、生殖和 发育、神经系统和免疫系统等都具有毒性作用或潜在的健康危害，因而受到人们 的广泛关注【1 0 】。 图1 - 2p b d e s 化学结构式 f i g 1 - 2 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fp b d e s 表1 1几种主要p b d e s 的物化性质 t a b 1 1c h e m i c a la n dp h y s i c a lp r o p e r t i e so fs o m ep b d e s 中火民族人学坝f j 论文 p b d e s 的商业性生产开始于2 0 世纪7 0 年代，主要有4 种工业品：四溴联苯醚 ( t e t r a b d e ) 、五溴联苯醚( p e n t a b d e ) 、八溴联苯醚( o c t a b d e ) 和十溴联 苯醚( d e c a b d e ) ，它们实际上都是多种p b d e 同类物( c o n g e n e r ) 的混合物。 2 0 0 1 年5 月2 3 日中国政府签署的斯德哥尔摩公约在2 0 0 4 年1 1 月11 同在我国正 式生效。在首批控制的1 2 种持久性有机污染物( p o p s ) 中未列入多溴联苯醚。 2 0 0 2 、2 0 0 3 和2 0 0 4 年，欧盟相继完成了对p e n t a 一，o c t a 署1 d e c a b d e 的评估，2 0 0 4 年8 月1 5 日起欧盟各国开始全面禁用五溴二苯醚和八溴二苯醚。而对十溴二苯醚 进行了长达l o 年之久的风险评估后，最终定论十溴二苯醚对人体健康和环境无风 险和无危害，欧盟于2 0 0 5 年1 0 月1 5 同公布决议，将十溴二苯醚列入r o h s 指令 ( 关于在电子电气设备中禁止使用某些有害物质指令) 豁免清单，又于2 0 0 8 年4 月1 日取消了此项豁免。十溴二苯醚一度持续进入环境，而其它p b d e s 同系物 由于有稳定的结构，所以在较长的一段时问内会继续对环境造成影响。 迄今的研究结果发现，2 ，2 ，4 ，4 四溴联苯醚( b d e 4 7 ) 是目前分布最广、 生物样品中含量最高、对生物和人体毒性最强的多溴联苯醚同系物之一【儿】。 b d e 4 7 ( 结构式如图1 3 ) 是五溴联苯醚商业品的主要成分之一，由于过去3 0 年 的广泛使用，造成了环境中的大量存在：另一方面低溴代b d e s 的生物富集性高 于高溴代b d e s ，同时高溴代b d e s 又容易发生脱溴降解为低溴代b d e s ；另外， 由于b d e 2 0 9 的高疏水性及高分子量等性质，使其难以被生物体或人体吸收【1 1 ， 因此，b d e 4 7 在动物和人体内的浓度水平往往高于其他的p b d e s 同系物，成为 目前为止生物体内富集程度最高的p b d e 物质，也是仅次于b d e 2 0 9 研究得比较 多的p b d e s 同系物之一。 图1 - 3b d e 4 7 化学结构式 f i g 1 - 3 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fb d e 4 7 通常认为p b d e s 的生物降解作用并不明显，光化学降解被认为是p b d e s 在环 境中的主要降解途径【m 】。近年来，p b d e s 的实验室光化学降解主要研究不同光源、 不同介质或溶剂以及添加不同光敏剂或光催化剂条件下对p b d e s 降解速率和产 物种类的影响，从而了解并推测p b d e s 同系物的环境归趋。 中央民族人学坝l j 论文 ( 二)不同光源下的光解研究 根据光化学第一定律( g r o t t h u s d r a p e rl a w ) ，只有被分子吸收的光子才能 有效地引发光化学反应。因此，了解p b d e s 的紫外光吸收波段是研究其光化学 反应的基础。p b d e s 属于有机溴代化合物，能吸收u v b ( 2 8 0 - - - 3 1 5 r i m ) 和u v a ( 3 1 5 4 0 0 n m ) 段光谱光能，紫外光所提供的能量通常会导致溴原子的丢失，从 而产生重排的可能性 1 0 】。e r i k s s o n 等【1 2 】测定了四氢呋哺d ? 7 种p b d e 单体的紫外 吸收光谱，如图4 所示，图中编号1 7 的曲线依次表示b d e 2 0 9 、d e 2 0 6 、b d e 2 0 3 、 b d e l 8 3 、b d e l 5 5 、b d e 8 5 、b d e 7 7 这7 种p b d e 的紫外吸收光谱。从图中可以 看出，不同的p b d e 单体，其紫外吸收光谱不同，溴取代数目和溴取代位置是两 个主要影响因素，随着溴取代数目的增加，p b d e s 能吸收更高波段的紫外光。 羊 暑 丸i m i 图1 47 种p b d e 单体的紫外吸收光谱【1 2 】 f i g 1 - 4a b s o r p t i o ns p e c t r ao fs e v e np b d ec o n g e n e r s 【1 2 】 如图1 4 所示，p b d e s 在太阳光中含有的紫外光波段( 2 8 0 4 0 0 n m ) 有吸收， 因此环境中存在的p b d e s 能够在太阳光照下发生光解。 p b d e s 的光解速率取决于光源的紫外波段和辐照光强。h e r r m a n n 等【1 3 】考察 了甲苯中1 3 种p b d e s 混合物在日光下的降解作用，光照1 4 天之后，除b d e 2 0 9 几 乎完全降解，五溴以下的低溴代联苯醚几乎不降解，六至七溴的同类物发生一定 程度的降解，剩余浓度为初始的8 0 0 旷9 0 。而据e r i k s s o n 等【1 2 】的研究，在紫外光 照下，四氢呋喃中4 种p b d e 单体和甲醇中9 种p b d e 单体都发生光解，其光解速 率常数范围为0 1 2 x 1 0 - s 8 3 1 0 巧s 。 h a 曲e r g 等【1 4 】甲苯中b d e 2 0 9 在u v a 、u v - a b 和u v - a b c - 三种紫外光照射16 h 中央民族人学坝l ：论文 的产物，均检测到大量的p b d f 类产物。总p b d f 浓度随着紫外波段范围的增加而 增加，分别为3 5 ，4 2 ，1 4 p g ml _ l 。三种紫外光照射后p b d f 占b d e 2 0 9 初始量的 0 3 1 ，0 3 5 和1 2 。当b d e 2 0 9 全部光解完毕之后，u v - a b c 光照反应中p b d f 的增加尤其显著。所有实验中主要产物均为4 6 溴b d f 。从光解产物的种类上看， 三种紫外光照射下p b d f 种类没有差别，说明产物种类与紫外光的波段没有明显 关系。而产物浓度随着紫外波段范围的变化，可能是因为b d e 2 0 9 及其光解产物 更容易吸收短波长的紫外光。 ( 三)不同溶剂中的光解研究 有机溶剂的种类也是影响p b d e s 光解速率的另一个因素。b d e 4 7 、1 8 1 、2 0 7 和2 0 9 在四氢呋哺中的光解速率比甲醇中快【1 2 】。乙腈水( 1 1 ) 混合溶液中，b d e l 5 在3 0 0 n m 紫外光照下降解速率比纯有机溶剂( 乙腈和甲醇) 中明显减慢：光照 3 0 m i n ，乙腈水( 1 1 ) 混合溶液中b d e l 5 剩余7 3 ，而乙腈和甲醇中b d e l 5 分别剩余5 1 和4 1 。这可能与水的供氢能力有关，因为在供氢能力方面这3 种溶剂的强弱顺序依次为：四氢呋喃 甲醇 乙腈。但是这3 种溶剂体系中b d e l 5 的降解产物都是b d e 3 和联苯醚，即其反应机理都是还原脱溴【”】。 e r i k s s o n 等考察了水中( 含 1 3 o ) ，该实验能够检测单、双链 的断裂和碱性不稳定点( 某些损伤因子能够导致脱嘌呤或者脱嘧啶位点的产生， 形成碱性不稳定剧7 5 1 ，其在强碱条件下能够转换成d n a 链的断裂) ，从而使检 测的灵敏度得到极大改善。大部分具有基因毒性的化学试剂所诱导的d n a 单链 断裂和碱性不稳定点要多于d n a 双链的断裂，如x 射线和h 2 0 2 诱导的d s b s 与s s b s 之比分别是l ：2 0 和l ：2 0 0 0 ，因此碱性彗星检测成为十分灵敏的d n a 损伤的检测方法。 1 9 9 0 年，o l i v e 等建立了尾长指标并首次叙述了“尾矩( t a i lm o m e n t ) ”的 概念【_ 7 6 】，且很快就被广泛接受。为了检测某些特异性的d n a 损伤，有的研究者 将损伤因子作用后的细胞再用特异性修复酶处理，修复酶可将特异性d n a 损伤 转换成d n a 链的断裂，从而提高了彗星实验检测的特异性。如核酸内切酶i i i ( e n d o n u c l e a s ei i i ) 可以用来检测嘧啶氧化损伤【7 。7 1 。随后1 9 9 6 年，c o l l i n s 等对 该方法进行了进一步改进，并利用核酸内切酶i i i ( e n d oi i i ) 和甲酰胺嘧啶糖 基酶分别检测了氧化嘧啶和8 。羟基鸟嘌呤的损伤。1 9 9 7 年，s a n t o s 7 8 1 等首次将 s c g e 技术与d n a 荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n c el n s i t u h y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 结合起来，为s c g e 技术的应用丌辟了新的途径。我国朱志良博士率先在国内建 中央民族人学坝i ：论文 立了彗星荧光原位杂交技术体系，并利用该技术体系发现人9 号染色体是苯代 谢产物的靶染色体。2 0 0 1 年，n a d i n 等建立了s c g e 银染法【_ 7 9 】，进一步提高了 损伤d n a 分析的灵敏度。此后，彗星分析作为- i - j 发展势头非常强劲的方法， 广泛的应用到各研究领域之中，然而对于该实验的一些具体操作和评价指标，目 前还没有一个统一的标准，ge i s c n b r a n d a 等人于2 0 0 2 年【8 0 】、h a r t m a n n 等人分 别于2 0 0 3 8 1 1 及2 0 0 4 8 2 1 年发表了最新的彗星分析操作指南，对于彗星分析标准的 全球统一化起到了指导作用。2 0 0 5 年至今，彗星分析方法更广泛的被应用到生 物、医学、环境等相关领域，全球科研项目硕果累累。 二、单细胞凝胶电泳作用原理 传统的d n a 电泳理论认为，d n a 迁移距离是与其片段大小成比例的，与此 相反，s c g e 所形成的“彗星”形态并非由断裂的d n a 小片段迁移而形成。s c g e 有着与传统的电泳不同的形成机理。 哺乳类动物体内细胞的d n a 分子量很高并具有严密的超螺旋结构。在细胞 核中，d n a 双链以组蛋白为核心形成核小体，在核小体中d n a 为负超螺旋结构， 细胞d n a 未受损伤时，外加电场不会使d n a 在凝胶中泳动。而当各种外源性 和内源性d n a 损伤因子诱发d n a 链断裂时，d n a 的负超螺旋结构受到破坏， 在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它膜结构被破坏，细胞内的各种蛋白质、 r n a 及其它成分均扩散到裂解液中，而核d n a 分子量很高不能进入凝胶，仍然 保留在核区。d n a 在碱性环境中解螺旋，使d n a 断链和碱易变性d n a 片段从 严密的超螺旋结构中释放出来，由于这些d n a 碎片分子量较小且多为单链，电 泳时带负电荷的断链就可以离开核区向电泳槽阳极移动。未被破坏的d n a 在电 泳中停留于核中形成较大的荧光亮点，游离出来的d n a 碎片则形成类似彗星尾 部的微小的荧光亮点，从而形成彗星分析实验中所特有的“彗星”状图像 8 3 1 。d n a 受损伤愈严重，产生的d n a 碎片就越多也越小，相同电泳条件下迁移的d n a 量就越多，由于凝胶分子筛具有空i n j 阻挡效应，使得越小的d n a 碎片电泳迁移 率越大，迁移的距离也愈长。 三、单细胞凝胶电泳实验流程 在o s t l i n g 等【7 3 1 的中性电泳和s i n g h 等7 4 1 的碱性电泳基础上，现己发展了多 中央民族人学帧 j 论文 种实验方法，比较常用的是碱性条件下的电泳，其基本实验路线包括以下步骤： l 苎竺竺! 苎茎1 日l 型兰兰竺堕堡竺1 日乜竺_ 鸯i 竺璺竺竺j 广 厂 广 广 o 圈一困钽囤钽圈 图1 - 8 单细胞凝胶电泳流程 f i g 1 8 s t e p so fs c g em e t h o d ( 一) 准备细胞：采用台盼蓝染色计数，检测细胞活性，存活率需大于9 0 ，然 后用p b s 配制一定浓度细胞悬液。 ( 二) 铺胶：近年来虽然制胶等各方面不断改进，由传统的磨砂载玻片上铺3 层凝胶的“夹心法”改进为两层或单层灌胶，但胶板易损坏和脱胶的问题仍没有 得到很好解决，且操作步骤多、时间长，也使该技术的规范和推广困难重重。目 前t r e v i g e n 公司研制的t r e v i g e nc o m e t s l i d e t m 载玻片，成功的提高了低熔点 琼脂糖和载玻片的附着力，减少了常规制胶方法中既耗时又不可靠的底胶制备方 法，但由于产品价格昂贵需多次使用，而多次浸染e b 必然造成交叉污染。 ( 三) 裂解：裂解的目的是破膜和去蛋白，从而使断裂的d n a 片段能够在外加 电场作用下从细胞核中迁移出来。目前去除细胞内蛋白质的方法有两种，一是用 高盐溶液进行盐析，二是使用蛋白酶消化的方法，彗星实验通常使用前者。裂解 液由高盐与去垢剂构成，能使蛋白质变性，膜脂被抽提，导致维持膜结构稳定性 的作用力丧失，细胞膜溶解，细胞内的大部分物质随即溶解，扩散至裂解液中， 与d n a 相结合的蛋白质在高盐的作用下也与d n a 分离，扩散到裂解液中。 ( 四) 解旋：解旋的目的是将双链d n a 变成单链并且使r n a 降解。目前彗星 实验常用解旋液( 1 m me d t a + 3 0 0 m mn a o h ) 的p h 值在1 3 以上，细胞d n a 在 此环境下，很快变性解旋，由双链变成单链，同时高碱性环境能使r n a 全部水 解。 ( 血) 电泳：凝胶电泳是当自仃核酸研究中最常用的方法，有分子筛和电泳的双重 效果，简单、快速、灵敏、成本低、分离效率高。s c g e 一般选用低电压( o 5 5 v c m ) 和短时f , j ( 5 3 0 m i n ) 。电压过高、电泳时间过长虽然能提高检测灵敏 度，但可能会使少许i f 常的细胞形成拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、 电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果。 ( 六) 中和：中和电泳后载玻片上的高碱性环境，以便下一步的染色。 中央民族人学顺l ：论义 ( 七) 染色：中和后进行染色，所用染料有吖啶橙、溴化乙锭、碘化乙锭等多种。 目前大多数实验室采用的是价格低廉，但毒性很大的溴化乙锭。染色时间为 2 - 2 0 m i n ，为防止荧光衰减，应尽快阅片。 ( 八) 细胞观察与图像分析：通过光学采集系统获得图片，透过带有落射荧光的 显微镜，可以清晰看到细胞发出的激发荧光。受到损伤的细胞呈现出彗星形状， 细胞损伤越严重，彗尾就越长。通过c a s p l 2 2 图像处理软件对彗星的各项指标 进行分析，最终对细胞的损伤程度进行评价。 ( 九) 评价指标：目前根据图像评价d n a 损伤程度所使用的指标大致有如下几 种：形状指标、距离指标、强度指标、“矩”类指标。 形状指标：这是一类比较粗略的指标。根据细胞荧光图像是否像彗星一样头 尾分明将其分为彗星样细胞和非彗星样细胞，计数一定量细胞中彗星样细胞所占 的比例，即彗星样细胞发生率，可估计d n a 的损伤程度【8 4 1 。这种指标可通过镜 下观察直接得到，方便实用。 距离指标：直接在显微镜下或在照片上测出彗星的一些长度数值，如尾长 1 8 5 - 8 7 1 ，即沿电泳方向“彗星”尾部最远端与头部中心问的距离；总彗星长度【8 8 】， 即“彗星”电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等【8 9 】，以评价d n a 损 伤程度。这些指标描述电泳中d n a 泳动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设 备及图像处理软件，而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之 间有较为良好的线性关系【7 3 1 9 0 - 9 2 。 强度指标：o s t l i n g 等人最初用s c g e 技术检测射线对d n a 损伤时用“彗星” 头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述d n a 的损 伤。p o l l e r t 9 3 】等人用“彗星”尾部总荧光强度同“彗星”头部总荧光强度的比值 来表示d n a 的损伤程度。新近有报道根据“彗星”尾部荧光强度将细胞分为五 类，由弱到强分别计为0 、1 、2 、3 、4 ，将1 0 0 个细胞的分值加在一起表示d n a 的损伤程度，并证明该数值与总彗星长度有较好的相关性。这些指标都不同程度 的反映了电泳中泳动d n a 的量。 “矩”类指标：上述距离类指标和强度类指标均不能全面反映d n a 损伤程度， 有实验证明损伤因素作用剂量增大时，d n a 损伤程度明显增加而尾长基本不变。 1 9 9 0 年o l i v e 等人首次描述了“尾矩”的概念，定义为尾部d n a 占总d n a 的百 分比与头、尾部中心l 日j 距的乘积。实验证实该指标比上述其它指标都优越，且很 中央民族人学顾j ：论义 快就被广泛接受。乔琰叫等人经过实验比较指出，尾矩指标能够更全面的评价 d n a 的损伤程度，而单独以尾长或尾部d n a 百分比作为分析指标则往往不能真 实反映致损伤剂的剂量一效应关系。这类指标可以通过计算机影像分析系统简便 获得。 四、单细胞凝胶电泳技术的应用 s c g e 是一种具有极高实用价值的、应用前景十分广阔的d n a 损伤检测新 技术。它所需样品量少，工作日程短，为现场人员调查和分析研究提供了可能； 方法具有高度灵敏性【9 5 】；无需复杂的仪器设备，与图像分析系统联合应用，结 果更精确，操作更方便，且无放射性示踪剂，既降低成本又减少对人体的危害。 适用范围广，凡能制成单细胞悬液的各种真核生物细胞均适用。 因此，碱性s c g e 技术已广泛应用于d n a 放射损伤、d n a 剪切损伤、d n a 交联的检测和研究，环境诱变剂或诱癌剂引起的d n a 损伤和修复的研究，药物 的遗传毒性评价，细胞凋亡鉴定，作为生物标记进行环境生物监测及人类流行病 学研究，衰老学研究，肿瘤治疗方案、癌症病人放、化疗方案的最佳选择及科学 愈后的研究及药物筛选，真核微生物研究等【9 6 。o 。 第三节选题目的及意义 多溴联苯醚( p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r s ，p b d e s ) 是一类溴代阻燃剂， 广泛应用于电子电器产品、塑料制品和纺织品等。近年来由于其在全球环境和生 物体内的普遍存在而备受关注。环境分析研究表明，目前在各种各样的环境样品 中都检测出了p b d e s 的存在，包括沉积物、土壤、空气、生物样品和人体血液、 脂肪等，分布范围几乎遍及全球，而且p b d e s 具有生物累积作用，对神经、甲状 腺和免疫等系统有毒害作用。光化学降解被认为是p b d e s 的主要降解途径，目前 这方面的研究成果很少。因此，考察多溴联苯醚的光降解机理以及遗传毒性对其 环境迁移归趋和毒性评价具有指导意义。 本研究以环境中存在丰度最高的一种同类物b d e 4 7 ( 2 ，2 ，4 ，4 四溴联 苯醚) 为对象，研究不同性质的有机溶剂和氧化还原添加试剂对其降解速率和降 中央艮族人学坝f j 论义 解产物的影响，推断其降解途径和反应机制，并应用单细胞凝胶电泳技术分析 b d e 4 7 和光解产物的遗传毒性。 中央民族人学顺i ：论义 第二章b d e 4 7 合成及光化学降解研究 第一节b d e 4 7 的合成 一、实验材料与方法 ( 一)实验材料 1 主要化学试剂 二溴联苯醚，液b r 2 ，f e 粉，c c l 4 ，5 n a s 0 3 ，1 m n a o h ，无水乙醇，试剂 纯度均为分析纯。 2 主要仪器装置 三口烧瓶，恒压滴液管，球形冷凝管，干燥管，磨口玻璃塞，分液漏斗，烧 杯，量筒，铁架台，油浴； 恒温加热磁力搅拌器( h j 3 ，常州国华电器有限公司) ； 电子天平( f a l l 0 4 n 型，d = 0 1 m g ，上海精密科学仪器有限公司) ； 旋转蒸发仪( r e 5 2 a a ，上海亚荣生化仪器厂) ； 超声波清洗器( k q 一2 5 0 e 型，昆山市超声仪器有限公司) 。 ( 二)合成方法 秤取3 3 9 ( 0 0 1 m 0 1 ) 4 , 4 一二溴联苯醚白色粉末放入三口烧瓶中，量筒量 取c c l 4 约1 5 m l 加入三口烧瓶中，至白色固体完全溶解。量筒量取c c l 4 约 5 m l 加入恒压滴液管，用移液管移取l m l 液b r z ( o 0 2 m 0 1 ) 加入滴液管中， 打开滴液管缓慢滴加液b r z ，同时冷凝搅拌。1 h 后液b r 2 滴加完毕，取下恒压 滴液管，用磨1 ：3 玻璃塞密封烧瓶。秤取f e 粉o 1 6 5 9 ( b d e l 5 质量的5 ) 加 入到三口烧瓶中作为催化剂。油浴加热，油浴温度控制在7 6 7 8 。c ，c c l 4 回 流冷凝，反应5 h 后停止加热，继续搅拌至溶液体系冷却。 待反应液冷却后，依次用5 n a s 0 3 、1 m n a o h 、蒸馏水、5 n a s 0 3 、 蒸馏水洗涤分液后旋蒸出溶剂c c l 4 ，粗产品先用纯乙醇重结晶一次，再用乙 2 3 中央民旅人学帧i 论文 醇c c l 4 重结晶两次，干燥后称得白色产物2 1 9 9 ，理论产量4 8 6 9 ，产率4 5 熔点7 9 ( 2 ( 7 8 5 - - 一7 9 。c 胡) 。 ( 三)产品定性及含量检测方法 1 溶液配制 ( 1 ) 标准品溶液配制精密吸取b d e 4 7 标准溶液( 溶剂异辛烷) 2 0 1 x l ，用色 谱乙腈稀释到l m l ，配制成浓度l g m l - 1 标准品溶液。 ( 2 ) 样品溶液配制精密秤取产物o o l g ，用色谱乙腈溶解，容量瓶定容至 2 5 m l ，配成浓度4 0 0 “g m l 。样品液待用。精密吸取样品待用液1 1 t l ，加 入色谱乙腈稀释至4 0 0 肛l ，配制成终浓度1 斗g m l j 样品溶液。 ( 3 ) 样品与标准品混合液配制分别取出配好的1 1 t g - m l - 1 标准品溶液和 l “g m l 1 样品溶液各2 0 0 p l 混合均匀，待测。 2 检测方法 色谱条件高效液相色谱仪( l c i o a t 型，日本岛津公司) ，色谱柱w a t e r s s y m m e t r y c l 8 柱( 1 5 0 m m x 4 6 m m ，5 u m ) ，流动相为乙腈一水( 9 2 ：8 ，v v ) ， 检测波长2 4 0 n m ，流速为0 8 m l m i n 一，进样量2 0 u l ，柱温3 5 。 二、实验结果与讨论 将配好的三种溶液分别进样2 0 “l ，每种溶液平行进两针，谱图如下。 j 标准晶”含成样牖 i i 图2 一l合成样品、混合样品及标准品色谱叠加图 f i g 2 - lo v e r l a yc h r o m a t o g r a p h yo fs a m p l e ，m i x e ds a m p l e sa n ds t a n d a r d 中央民族人学坝l j 论义 图2 - 2 样品与标准品紫外叠加图 f i g 2 2o v e r l a yu l t r a v i o l e ts p e c t r o g r a mo fs a m p l ea n ds t a n d a r d 从样品溶液和混合溶液与标准品溶液色谱图的叠加来看，三个物质的出峰 时间基本一致，混合进样没有出现第二个峰，可以初步判断样品和标准品是同一 物质。另外从三个物质的紫外光谱的叠加来看，也是吻合的，由此可以肯定该样 品与标准品是同一成分，即合成产物为b d e 4 7 纯品。 第二节b d e 4 7 光化学降解研究 一、实验材料与方法 ( 一)实验材料 1 主要化学试剂 b d e 4 7 标准品5 0 1 x g m l ( a c c u s