（遗传学专业论文）新信号分子sh2a相互作用的蛋白质筛选.pdf

中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的 研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标 注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责 任。 论文作者签名：垄鱼日期：出丑苎：! f 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即： 研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大 学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署 名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦 署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以 公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、 缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名：查生 指导教师签名：坌玺i 乡 日 期：兰1 2 ：t 让 中文论著摘要 新信号分子s h 2 a 相互作用的蛋白质筛选 目的 蛋白质问的相互作用形成的复杂网络细胞信号转导，是研究细胞利用“生 物信号转导网络”对外界刺激做出反应的分子机制。这个复杂的细胞信号网络如同 细胞的神经系统，控制着正常生物细胞的生长、分化和凋亡。细胞信号转导的失 控可导致许多人类疾病，已经成为生物学研究的一个重要领域，并对未来药物的 开发具有重要意义。因此，蛋白质间的相互作用作为信号转导研究的主要内容而 被广泛关注，许多研究蛋白质间相互作用的方法应运而生，其中酵母双杂交技术 是目前应用最广泛的用于研究已知和未知蛋白质相互作用、蛋白质功能域、蛋白 质与小分子间相互作用以及药物靶点筛选和设计的方法。 本实验室利用外显子捕获和外显子拼接技术在富含疾病基因的人染色体8 p 2 2 区域克隆的新基因s 陀4 ，应用蛋白质结构分析软件( s m a r t ) 分析显示其 编码产物具有一个s h 2 结构域，因此推测其是s h 2 信号蛋白家族成员之一。s h 2 结 构域是一种广泛存在于蛋白质的结合基序，结构高度保守，特异识别磷酸化酪氨 酸残基，是细胞内信号转导的重要组件，主要参与酪氨酸蛋白激酶相关受体介导 的信号转导过程，是上游与下游信号分子联系的分子基础，参与细胞的生长、增 殖和分化等过程的调节，并与某些疾病的发生关系密切。因此研究含有s h 2 结构 域的蛋白质在生理和病理条件下的作用机制，将为临床药物开发提供重要依据。 前期工作中，已经将s h 2 a 亚细胞定位在细胞质中，并且研究发现野生型s h 2 a 能 够强烈抑制细胞蛋白激酶c ( p k c ) 活性，而缺失型载体对细胞的p k c 活性几乎没 有影响，提示s h 2 a 可能阻止了p k c 信号通路向下传递。迄今为止，s h 2 a 的确切 生物学功能尚不清楚。 为了深入研究s h 2 a 的生物学功能，明确其在信号传导通路中与其他蛋白质的 相互作用，本实验利用酵母双杂交系统，用体外构建的p g b k t 7 s h 2 a 诱饵蛋白重 组表达载体筛选人类肾脏e d n a 文库，初步筛选出与s h 2 a 相互作用的五种蛋白质， 从而为进一步研究s h 2 a 在信号转导中的生物学功能提供了信息。 实验方法 1 、构建i ) 3 b k t 7 s h 2 a 诱饵蛋白重组表达载体。 2 、扩增人肾脏e d n a 文库。 3 、共转化酵母并进行酵母双杂交筛选。 4 、筛选出阳性克隆，d n a 测序，序列比对。 5 、预测筛查出的蛋白质的磷酸化酪氨酸位点。 实验结果 l 、将s h 2 a 克隆入含有b d 的p g b k t 7 载体中，构建了p g b k t 7 s h 2 a 诱 饵蛋白重组表达载体。 2 、扩增了约3 2 5 l 人肾脏e d n a 文库。 3 、提取扩增后的人肾脏c d n a 文库和p g b k t 7 s h 2 a 质粒，共转化酵母感 受态，经过三步筛选，在s d - a d e - h i s - l e u - t r p 培养后，挑选了6 1 个克隆，再 经s d - a d e - _ h i s ，_ i 棚，- r i 砷a g a l 检测，共得到4 6 个蓝色的阳性菌落。 4 、对阳性克隆进行测序，所得测序结果进行比对分析，推测其所编码的蛋 白质，共筛选得到五种s h 2 a 相互作用蛋白质：a z g p l 、d a d l 、h s d l 7 8 1 0 、h t a t i p 和p k m 2 以及两种非编码序列：c a r d l 4 和r a s - l i k e ，e s t r o g e n - r e g u l a t e d ，g r o w t h i n h i b i t o r 。 5 、蛋白质预测工具预测筛选得到的五种蛋白质的酪氨酸磷酸化位点，除了 p k m 2 未预测到酪氨酸磷酸化位点外，其他四种蛋白质a z g p l 、d a d l 、 h s d l 7 8 1 0 和h t a t i p 均存在酪氨酸磷酸化位点。 结论 1 、成功应用酵母双杂交技术进行蛋白质相互作用研究。 2 、筛查到五种可能与s h 2 a 相互作用的蛋白质。 关键词 s h 2 a ；酵母双杂交系统；相互作用蛋白质 2 英文论著摘要 s c r e e n i n gf o rp r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t hs h 2 a ，an e w s i g n a l i n gm o l e c u l e o b j e c t i v e s i g n a lt r a n s d u c t i o ni sac o m p l i c a t e dn c t w o r kw h i c hc o n s i s t so fi n t e r a c t i o n so f p r o t e i n i tr e s e a r c h e si n t o t h em o l e c u l a rm e c h a n i s m ，w h i c hc e l l sr e s p o n dt o o u t o r s t i m u l i b y s i g n a lt r a n s d u c t i o nn e t w o r k a sc o r p u s c u l a rn e r v o u ss y s t e m , t h e c o m p l i c a t e dn e t w o r ko f s i g n a lt r a n s d u c t i o nc o n t r o l sc o r p u s c u l a rg r o w t h , d i f f e r e n t i a t i o n a n da p o p t o s i s ，t h ed y s f u n c t i o no f t h ec e l l u l a rs i g r l a jt r a _ n s d u c t i o nc o u l dr e s u l ti nm a n y h u m a nd i s e a s e s t h er e s e a r c ho ft h ec e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o nh a sb e e nav e r y i m p o r t a n tf i e l dt ot h ef u t u r ep h a r m a p r o j e c t s t h e r e f o r e “h a sb e e ng e n e r a lt os t u d y p r o t e i ni n t e r a c t i o n sw h i c ha r et h em a i nc o n t e n to ft h es i pt r a n s d u c t i o n m a n y m e t h o d so fs t u d y i n gi n t e r a c t i o n so fp r o t e i nc o m ei n t ob e i n gb e c a u s eo ft h ed e m a n d a m o n gt h e m ，t h ey e a s tt w o - h y b r i ds y s t e mi sc u r r e n t l ym o s te x t e n s i v e l yu s e di nt h e s t u d yo fp r o t e i ni n t e r a c t i o n s ，p r o t e i nf u n c t i o nd o m a i n s ，i n t e r a c t i o nw i t hn n k n o w n p r o t e i na n ds m a l lm o l e c u l e s , a sw e l la si nt h es c r e e n i n ga n dd e s i g n i n gt a r g e t so f p h a r m a c o l o g i c a lt h e r a p y i nt h ep r e v i o u sw o r k , w eh a v ec l o n e dan e w g e n e ，s h 2 a ，i nt h e8 p 2 2o fh u m a n d i s e a s eg e n e sr e g i o nb ye x o nt r a p p i n ga n de x o nl i n k i n g t h ee x p r e s s i o np r o d t m to f t h i s n e wg e n ew a sd e d u c e dt ob ei san o v e lm e m b e ro fs h 2s i g n a i ip r o t e i nf a m i l yu s i n g s m a r ts o f t w a r e t h es r ch o m o l o g y2d o m a i n ( o rs h 2 d o m a i n ) i sap r o t e i nd o m a i no f a b o u t1 0 0a m i n oa c i dr e s i d u e s ，t y p i c a l l yb i n dt oap h o s p h o r y l a t e dt y r o s i n er e s i d u ei n t h ec o n t e x to fal o n g e rp e p t i d em o t i fw i t h i nat a r g e tp r o t e i n , a n ds h 2d o m a i n s r e p r e s e n tt h el a r g e s tc l a s so fk n o w np t y r - r e c o g n i t i o nd o m a i n s p r o t e i n sh a v i n gs i - 1 2 d o m a i np l a ya ni m p o r t a n tr o l ei ns i g n a lt r a n s d u c t i o no ft y r o s i n ep r o t e i nk i n a s e s h 2 d o m a i n sm e d i a t ei n t e r a c t i o n so f p r o t e i na s r e c o g n i t i o nc o d e s ，w h i c hr e g u l a t et h ec e l l s 3 a p o p t o s i s ，d i f f e r e n t i a t i o n , p r o l i f e r a t i o na n df u n c t i o n s ，a n dh a v ec l o s e l yr e l a t i o n s h i p 谢t ht h eo c c u r r e n c eo f s o m ed i s e n s e s c o n s i d e r a b l ee v i d e n c ei n d i c a t e dt h a tt l l ed i s o r d e r o fs h 2d o m a i n sc o n t r i b u t e dt ot h ed e v e l o p m e n to fm a n yd i s e a s e s f o rt h i sr e a s o n , e l u c i d a t i n gt h em e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o n sb e t w e e np r o t e i n sc o n t a i n i n gs h 2d o m a i n s a n do t h e rp r o t e i n sw i l lb ev e r yi m p o r t a n tf o rc l i n i c a l p a r m a p r o j e c t s w eh a v e s u b l o c a t e dt h es h 2 ap r o t e i ni nc y t o p l a s ma n dw ea l s of o u n dt h ew i l dt y p es h 2 a c o u l ds t r o n g l yi n h i b i tt h ea c t i v i t yo f p r o t e i nk i n a s ec f o l l o w i n gt r a n s i e n t l yt r a n s f e c t i o n n l i ss u g g e s t e dt h a ts h 2 am i g h tb l o c kt h es i g n a lt m n s d u c t i o no fp k cp a t h w a y t o d a t a , t h ee x a c tf u n c t i o no f s h 2 ag e n ew a ss t i l ln o tu n d e r s t o o d t oi n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fs h 2 a , d e t e r m i n et h ei n t e r a c t i n gp r o t e i n i nt h ec e l ls i g n a lp a t h w a ya n de l u c i d a t et h ef u n c t i o no fs h 2 a , i nt h i sw o r k , w e s c r e e n e dt h eh u m a n k i d n e y c d n a l i b r a r yw i t hb a i t i n ge x p r e s s i n g v e c t o r p g b k t 7 s h 2 ab yy e a s tt w o - h y b r i ds y s t e ma n df o u n ds o m es h 2 ai n t e r a c t i n gp r o t e i n t h u sp r o v i d ef u r t h e ri n f o r m a t i o no nt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fs h 2 ai nt h ec e l ls i g n a l t r a n s u d a t i o np a t h w a y m e t h o d s 1 c o n s t r u c tt h ep g b k t 7 - s h 2 a p l a s m i d 2 a m p l i f i c a t i o no f h m n a nk i d n e ye d n al i b r a r y 3 c o - t r a n s f o r my e a s tc o m p e t e mc e l la n ds o f t e nf o ri n t e r a c t i n gp r o t e i no fs h 2 a b yy e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m 4 s e l e c tp o s i t i v ec l o n e st os e q u e n c ea n db l a s t a n a l y s i s 5 p r e d i c tt h es i t e so f t y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o no f t h ef i v ep r o t e i n s r e s u l t s 1 c l o n e ds h 2 4i n t op g b k t 7v e c t o rc o n t a i n i n gb dt 0c o n s t r u c tp g b k t 7 s - 2 a b a i tp r o t e i ne x p r e s s i o nv e c t o r 2 a m p l i f i e dt h eh u m a nk i d n e ye d n al i b r a r y 3 e x t r a c t e dt h eh u m a nk i d n e yc d n al i b r a r ya n dp g b k t 7 - s h 2 ap l a s m i d s ， e , o - t r a n s f o r m e dy e a s tc o m p e t e n tc e l l ，s e l e c t e d6 1c l o n e sf o l l o w i n gt h ec u l t u r i n gi n 4 s d a d e ，- h i 止l e u _ 1 印a n d o b t a i n e d 4 6 p o s i t i v e c l o n e s b y t h e s d 仁a d e - 壬l i s l e u ，- 1 砸，) ( 廿g a ld e t e c t i o n 4 t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r es e q u e n c e da n du n d e r w e n tb l a s ta n a l y s i s f i v e s h 2 ai n t e r a c t i n gp r o t e i n s ( a l p h a - 2 - g l y e o p r o t e i n1 ，z i n c ，a z g p l ；d e f e n d e ra g a i n s tc e l l d e a t h1 ，d a d l ，h y d r o x y s t e r o i d1 7 一b e t a , h s d l 7 8 1 0 ；h 1 v - 1t a ti n t e r a c t i v ep r o t e i n , 6 0 k d a , h t a t i pa n dp y r u v a t ek i n a s e ，m u s c l e ，p k m 2 ) a n dt w on o n - c o d i n gs e q u e n c e s ( c a r d l 4a n dr a s l i k e e s t r o g e n - r e g u l a t e d , g r o w t hi n h i b i t o r ) w e r ei d e n t i f i e d 5 p r e d i c tt h es i t e so ft y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o no ft h ef i v ep r o t e i n ss c r e e n e db y y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m e x c e p t t h ep k m 2w i t h o u tt h es i t e so ft y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n , t h eo t h e r s ，a z g p l ，d a d l ，h s d l 7 8 1 0a n dh t a t i ea l lh a v et h es i t e s o f t y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o n c o n c l u s i o n s 1 a p p l i e dt h ey e a s tt w o - h y b r i ds y s t e mi np r o t e i ni n t e r a c t i o n ss t u d y 2 s c r e e n e df i v es h 2 ai n t e r a c t i n gp r o t e i n s k e yw o r d s s h 2 a ；y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ：i n t e r a c t i n gp r o t e i n 5 英文缩略语 6 论文 新信号分子s h 2 a 相互作用的蛋白质筛选 前言 随着人类基因组计划的完成，生命科学研究已经进入了以蛋白质组学为代表 的后基因组学时代。由于蛋白质是基因功能的最终实施者，因此研究蛋白质的结 构和功能才能真实地解释各种生命现象。蛋白质一蛋白质相互作用研究是揭示未 知蛋白生物学功能的重要途径之一，随之发展了许多研究蛋白质间相互作用的方 法，如：酵母双杂交系统、免疫共沉淀、g s tp u l ld o w n 技术、噬菌体展示、蛋白 质芯片和生物信息学等【l 】，其中，酵母双杂交系统是目前应用最广泛的方法之一。 酵母双杂交系统是基于对真核生物转录因子研究的基础上建立的，通过在酵 母细胞内表达待检测蛋白，而实现对蛋白质之间相互作用的研究【2 ，3 1 。真核生物转 录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的 结构域组成。例如，g a l 4 蛋白是半乳糖苷酶基因的转录激活因子，包括两个分离 的功能性结构域，其中，n 末端的d n a 结合域( b d ) 能结合特异的d n a 序列，而 c 末端的转录激活域( a d ) 为激活转录所必需。这两个结构域只有同时存在，并 且在空间上足够接近，才能发挥激活基因转录的作用。酵母双杂交系统正是根据 g a l 4 转录因子的这一特点建立的：g a l 4 的d n a 结合域( b d ) 与蛋白质x ( 诱饵 蛋白) 形成融合蛋白；g a l 4 的转录激活域( a d ) 与蛋白质y ( 靶蛋白目的蛋白) 形成融合蛋白；如果蛋白质x 和y 之间存在相互作用，并形成一个蛋白质复合物， 则g a l 4 的两个结构域( b d 和a d ) 在空间上相互接近，完成转录因子的功能重建， 进而激活报告基因的转录。因此，通过对报告基因表达产物的检测就可判断“诱饵 蛋白”和“靶蛋白”之间是否存在相互作用 4 1 。 s i - 1 2 结构域广泛存在于多种信号蛋白分子中，是细胞内信号转导的重要组件。 该结构域能特异性识别磷酸化酪氨酸残基，参与酪氨酸蛋白激酶相关受体介导的 信号转导，是蛋白质问相互作用中的“蛋白质识别密码”i s 。研究表明，s h 2 结构域 介导的信号通路参与调节细胞的生长、增殖和分化等过程，该通路的异常与多种 疾病的发生、发展密切相关。因此，明确与含有s h 2 结构域的蛋白质相互作用的 靶蛋白，将为阐明该类蛋白生理病理条件下的作用机制，以及开发临床药物靶点 提供重要依据。 s h 2 a 基因是本实验室利用外显子捕获技术在富含疾病基因的人染色体8 p 2 2 区域克隆的新基因。蛋白质结构分析软件( s m a r t ) 分析显示，该新基因编码的 产物具有一个s h 2 结构域。在本实验室的前期工作中，我们已明确s h 2 a 的亚细胞 定位【6 】，并发现野生型s h 2 a 表达载体转染细胞后，能够强烈抑制细胞的蛋白激酶 c ( p k c ) 活性，而不影响丝裂原激活蛋白激酶( m a p k ) 和酪氨酸蛋白激酶( t p k ) 的活性，提示s h 2 a 可能在p k c 信号通路中发挥作用。为了进一步阐明s h 2 a 在信 号传导通路中的作用，明确与s h 2 a 相互作用的蛋白质，根据上述酵母双杂交系统 的原理，将本实验室前期克隆的新基因s h 2 a 克隆入含有g a i ab d 的表达载体中， 形成s h 2 a b d 融合蛋白，与人肾脏e d n a 文库a d 融合蛋白表达载体共转染酵母细 胞，当s h 2 a 与文库中某种e d n a 所编码的蛋白质存在相互作用时，就会使b d 和 a d 在空间上相互接近，重新具有转录激活的功能，进而激活报告基因( 上嬲，a d e ， 尬j 或z 口以) 的转录。因此，通过选取有报告基因表达的阳性克隆进行b d 和a d 重组载体的分离培养，并对a d 重组载体进行d 1 q a 测序，初步筛选出与s h 2 a 相互 作用的蛋白质，为深入研究s h 2 a 的生物学功能及其在信号转导中的作用提供信 息。 实验材料 一、主要实验材料 1 、m a t c h m a k e rg a i at w o h y b r i ds y s t e m3 ( c l o n t e c h 公司) ，包括： ( 1 ) 载体：p g b k t 7 克隆载体，p g b k t 7 5 3 克隆载体，p g b k t 7 - l a i n 克隆 载体，p c l l 克隆载体； ( 2 ) 人肾脏e d n a 文库( p a c t 2 一e d n a ) ( 3 ) 菌株：a h l 0 9 ； ( 4 ) 酵母菌培养基：m i n i m a ls db a s e ，l e u - t r pd os u p p l e m e n t ， - h i s _ l e u _ t r pd os u p p l e m e n t ，_ a d 以h i 虬e 村r pd os u p p l e m e n t ； 8 ( 5 ) x - a - g a l ； ( 6 ) h e r r i n gt e s t e sc a r r i e rd n a ； 2 、大肠杆菌d h 5 a ( t a k a r a 公司) ； 3 、胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉( o x o i d 公司) ； 4 、s d s ，过硫酸铵，p e g 4 0 0 0 ，d m s 0 ( s i g m a 公司) ； 5 、限制性核酸内切酶x h o i 和e e o r i ，琼脂糖( t a k a r a 公司) ； 6 、中量质粒提取试剂盒，胶回收纯化试剂盒( q i a g e n 公司) ； 7 、酵母菌裂解酶( s i g m a 公司) 。 二、主要仪器设备 1 、凝胶自动成像仪g d s 8 0 0 0 ( b i o r a d 公司) ； 2 、p c r 扩增仪( p e 公司) ； 3 、r c 5 c 低温超速离心机( d u p o n t 公司) ； 4 、3 - 1 6 k 台式高速离心机( s i g m a 公司) ； 5 、u v - 1 7 0 0 紫外分光光度计( h 1 1 a c h i 公司) ； 6 、冷冻真空浓缩仪( l a b c o n c d 公司) ； 7 、电泳仪( b i o r a d 公司) ： 8 、细菌恒温培养箱( 上海生物仪器厂) ； 9 、超净工作台( 上海医用仪器厂) ； 1 0 、b s 1 e 数显振荡培养箱( 常州国华仪器厂) 。 三、生物信息学工具和计算机软件 1 、基因组数据库： h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n o m e 2 、蛋白质分析数据库： h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c e s n e t p h o s d h t t p ：s m a r t e m b l h e i d e l b e r g d e 9 实验方法 一、构建p g b k t 7 - s h 2 a 载体 c m y ce 口i t o p e 协g 图1 ，p g b k t 7 一s h 2 a 重组载体示意图：s h 2 a 片段插入p g b k t 7 载体m c s ( s f ii 和s a li 之间) 。该载体上含有编码g a l ab d 的基因，将与s h 2 a 融合， 表达融合的诱饵蛋白。 l 、p c r 扩增s h 2 a 的编码序列 ( 1 ) 引物设计与合成： 上游引物引入s f ii 限制酶识别序列( 大写字母表示) ： 5 - a t a t g c 论c a t g g a g g c c a t g t t g g c a g a t t - 3 下游引物引入s a li 限制酶识别序列( 大写字母表示) ： 5 - c t a g t g t c g a c t t g g a g g c t g t a g g a t g a c e 一3 ( 2 ) p c r 反应体系： t a q d n a 多聚酶 o 2 肛l 1 0 p c r 缓冲液2 5 “l d n t p2 0u l 引物 各1 0 p l 模板 2 0u l ( p e d n a 3 1 s h 2 a 载体) 双蒸水1 6 3 l 总体积 25 l a l l o ( 3 ) p c r 反应条件： 首先，9 5 。c 预变性5 m i n ，然后以9 5 * ( 2 变性l m i n ，6 0 复性1 m i n ，7 2 c 延伸 l m i n ，进行3 0 个循环，最后7 2 延伸1 0 r a i n 。 ( 4 ) p c r 产物电泳检测及胶回收纯化： p c r 产物经1 o 琼脂糖凝胶 含0 5 i _ t g m l 溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ，e b ) 】 电泳2 0 m i n ( 1 0 0v ) 后紫外灯下观察。扩增产物大小为8 8 0 b p 。使用胶回收试剂 盒纯化s h 2 a p c r 产物。 2 、构建p g b k t 7 s h 2 a 重组载体 ( 1 ) 酶切：使用s f ii 和s a li 双酶切p g b k t 7 载体和s h 2 a 的p c r 回收产 物，琼脂糖电泳分离检测，胶回收试剂盒纯化。 酶切反应体系： 限制酶s f ii 1 1 0 x b u f f e r2 质粒d n a p c r 产物 5 双蒸水 1 2 “l p l u l “l 总体积 2 0 0g l 酶切反应条件：5 0 。c 水浴3 h 后，向产物中直接加入1 0 1 u 1s a li ，3 7 。c 继续水 浴2 h 。 ( 2 ) 连接反应： 连接反应体系： t 4 d n a 连接酶1 0 l 1 0 x b u f f e r2 0g l p g b k t 7 载体酶切产物 1 0 0 l s h 2 a c d n a 酶切产物3 0 l 双蒸水4 0 i t l 总体积 2 0 0i t l 连接反应条件：1 6 水浴过夜。 ( 3 ) 大肠杆菌d h 5 c t 感受态制备 氯化钙法制备d h 5 a 感受态细胞，方法如下： d h 5 a 划板于l b 琼脂培养基上，3 7 * ( 2 培养1 2 1 6 h ； 挑取透光好、边缘清晰的菌落于4 m l l b 培养基中，培养1 2 1 6 h ； 将上述培养过夜产物稀释1 0 3 倍，即取3 0 1 t l 过夜菌加液体培养基至3 0 m l ， 3 7 1 2 ，2 0 0 2 3 0 r p m 继续培养，直至o d 6 , o o = 0 3 o 5 ，约需2 5 h ； 将o d 6 0 0 = 0 3 0 5 的培养菌转入5 0 m l 离心管中，冰上放置1 0 m i r a 4 ，4 ，0 0 0 r p m ，离心1 0 m i r a 弃上清，倒置l m i m 加入6 1 0 m l 冰预冷的o 1 m 的c a c l 2 重悬沉淀，冰浴3 0 m i r a 4 ，4 ，0 0 0 r p m ，离心1 0 m i n ； 弃上清，倒置l m i n ； 加入6 0 0 p l 冰预冷的o 1 m 的c a c h 重悬沉淀，分装后7 04 c 保存或立即使 用。 ( 4 ) 转化d h 5 a 感受态细胞 将上述连接反应物转化d h 5 a 感受态细胞，方法如下： 取1 0 1 a l 连接液加入到1 0 0 1 t l 感受态d h 5 a 中，轻轻混合，冰上放置3 0 m i m 4 2 。c 热休克l m i n ，冰上放置2 m i r a 加入2 5 0 1 a ll b 培养液中，2 0 0 r p m ，3 7 。c ，l h 离心l m i n ，弃上清，取残余5 0 1 t i 菌液涂于l b a m p 上，3 7 。c ，培养1 8 2 4 h ： 挑取克隆，摇菌扩增，碱裂解法提取质粒d n a ，s f ii 和s a li 双酶切检测， 选取阳性克隆进行d n a 测序验证。 3 、中量制各p g b k t 7 s h 2 a 重组载体 使用中量质粒提取试剂盒制备p g b k t 7 s h 2 a 重组载体，方法如下： ( 1 ) 过夜培养4 0 m l 菌液； ( 2 ) 3 0 0 0 9 离心8 m i n ，弃上清； ( 3 ) 加入4 5 m ls 1 液，重悬菌斑； ( 4 ) 加入8 m ls 2 液，温和颠倒6 8 次混合； 1 2 ( 5 ) 加入8 m l n 液( 4 预冷) ，温和颠倒1 0 次混合； ( 6 ) 加入1 2 m lp i 液( 4 预冷) ，温和颠倒6 8 次，再快速颠倒以形成乳 浊液； ( 7 ) 1 0 0 0 0 9 离心8 m i n ，将下相转移至过滤柱中，过滤； ( 8 ) 向滤过液中加入6 m lb 液，混匀； ( 9 ) 将混合液移至d n a - p r e p 柱枷d i - c o l u m n 中，过柱； ( 1 0 ) 加入8 m l w l 液，洗柱； ( 1 1 ) 加入9 m l w 2 液，洗柱； ( 1 2 ) 将m i d i - e o l u m n 置入1 5 m l 微量离心管中，1 2 ，0 0 0 9 离心l m i m ( 1 3 ) 将m i d i - e o l u m n 置入另一干净1 5 m l 微量离心管中，在膜中央加入 3 5 0 9 l 双蒸水，室温静置l m i n ； ( 1 4 ) 1 2 0 0 0 9 离心l m i n ，洗脱d n a ，- 2 0 c 保存，备用； ( 1 5 ) 紫外分光光度计测质粒d n a 浓度和纯度。 二、扩增人肾脏e d n a 文库 1 、文库滴度检测 ( 1 ) 将文库菌液以不同比例稀释：溶液a ( 1 0 - 3 ) ，溶液b ( 1 0 “) 和溶液 c ( 2 x 1 0 5 ) ： ( 2 ) 分别吸取1 0 0 1 x l 、1 0 0 i _ t l 和5 0 1 x l 的溶液a ，b 和c ，涂布于l b 琼脂培养基上， 3 7 培养1 8 2 0 h ； ( 3 ) 计算文库滴度： 溶液a ：克隆数x 1 0 3 1 0 3 = 克隆数m l 溶液b ：( 克隆数平m 1 ) x 1 0 3 x 1 0 3 x 1 0 3 = 克隆数m l ； 2 、计算所需扩增的数量 ( 1 ) 总克隆数= 文库原始的克隆数3 ； ( 2 ) 培养皿数= 总克隆数每个培养皿的克隆数； ( 3 ) 文库体积= 培养皿数文库滴度； ( 4 ) 总的液体培养基体积= 培养皿数x 3 0 0 9 l ； 3 、涂菌培养 文库分次扩增，每次取适量文库菌液( 1 0 p 1 ) 于适量l b 培养基( 3 0 m 1 ) 中， 混合均匀，吸取3 0 0 9 l 均匀涂布于培养皿上，直至液体全部渗入培养基，3 0 。c 培 养3 6 4 8 h 。 4 、增菌及冻存 选取克隆密度为2 0 ，0 0 0 个克隆平皿的培养皿，刮下菌落于含a m p ( 1 0 0 t t g m 1 ) 的l b 培养基中，3 0 ，2 0 0 r p m ，培养l 3 h 后加入甘油( 终浓度2 5 ) ，分装 于5 0 m l 冻存管，8 0 冻存。 5 、e d n a 文库质粒提取 图2 ，p a c t 2 载体示意图：e d n a 片段插入p a c t 2 载体m c s ( e e o r i 和x h o i 之间) 。该载体上含有编码g a l a a d 的基因，将与e d n a 片段融合，表达融合的 目的蛋白；带有适于抗生素筛选的抗性标记a m p ；带有用于营养缺陷型筛选 的l e u 基因。 使用中量质粒提取试剂盒制备扩增的人肾脏e d n a 文库，方法( 一、3 、) 。 三、酵母双杂交筛选 p g b k t 7 s h 2 a 与人肾脏e d n a 文库质粒共转化酵母菌进行筛选 l 、酵母感受态制备 ( 1 ) a h l 0 9 划板于y p d a 琼脂培养基上，3 0 培养5 7 天； ( 2 ) 挑取直径为2 3 m m a h l 0 9 的1 3 个菌落于l m l y p d a 液体培养基中， 涡旋打散所有菌块，将此菌液转入5 0 m ly p d a 液体培养基中，2 5 0 r p m ，3 0 * ( 2 培养 1 4 1 6 1 8 h ，使o d 6 0 0 1 5 ； ( 3 ) 将上述培养产物加入y p d a 液体培养基中稀释至o d 6 0 0 = o 2 o 3 ，约 3 0 0 m l ： ( 4 ) 2 3 0 r p m 2 7 0 r p m ，3 0 c ，继续培养3h ，使o d 6 0 0 达到o 5 士0 1 ； ( 5 ) 将上述培养液分装于5 0 m l 离心管中室温l ，0 0 呛离心5 m i r a ( 6 ) 弃上清，用2 5 5 0 m lt e 或三蒸水重悬细胞沉淀，于室温1 ，o o 吧离心 5 m i r a ( 7 ) 弃上清，无菌的1 5 “l t e l i a e 重悬细胞沉淀； 2 、共转化酵母感受态 ( 1 ) 在5 0 m l 离心管中加入下列成分混匀： p g b k t 7 一s h 2 a2 0 1 0 0 u g e d n a 文库质粒 1 0 5 0 u g h e r r i n gt e s t e sc a r r i e rd n a2 m g ( 2 ) 加入l m l 感受态酵母于上述混合物中，涡旋混匀；加入6 m li x p e g l i a e 溶液并涡旋混匀；摇床2 0 0 r p m ，3 0 培养3 0 m i n ； ( 3 ) 加入7 0 0 i _ t ld m s o 轻柔颠倒混合； ( 4 ) 4 2 水浴热休克1 5 r a i n ，不时地摇动混合； ( 5 ) 冰上放置1 2 m i n ：室温1 ，0 0 0 9 离心5 r a i n ( 6 ) 弃上清，重悬于l m li t e 中； 3 、营养缺陷型培养基筛选阳性克隆 ( 1 ) 将共转化后的感受态酵母涂布于s d - l e u - t r p 二缺琼脂培养基上( 每 个培养皿1 0 0 i _ d 菌液) ，3 0 c ，培养5 7 天，进行低度严格筛选，将所得直径 2 m m 的菌落刮下继续进行筛选或者冻存； ( 2 ) 将二缺筛选所得菌液涂布于s d - h i s - l e u 一唧三缺琼脂培养基上( 每 个培养皿1 0 0 9 l 菌液) ，3 0 c ，培养5 7 天，进行中度严格筛选将所得直径 2 m m 的菌落刮下继续进行筛选或者冻存；( 该步骤可省略而直接进行三缺筛选) ( 3 ) 将三缺筛选所得菌落点于s d ，- a d e - _ h i s - - l e u _ _ t r p 四缺培养基上，3 0 ， 5 7 天，进行高度严格筛选，选择直径 2 m