（生物医学工程专业论文）肾上腺嗜铬细胞上胞吐与胞吞及其蛋白激酶c的调控研究.pdf

华中理工大学博士学位论文 同类物c 6 - d c c e r 则对不能抑制胞吐和胞吞。这一结果表明，并非神经酰胺本 身而是其某种代谢物为胞吐与胞吞过程所必需。说明鞘脂类在分泌中起着非常 重要的作用。 最后，根据实验结果，提出了一种新的胞吞模型，对现有的两种胞吞， 尤其是过胞吞过程，均给出了较好的解释。其特点是将电生理学中测量到的各 种类型的胞吞和囊泡的再生周期循环互相联系起来，统筹考虑，使得过胞吞、 等胞吞回收回来的囊泡具有各自的循环通路。这一模型提出了根据胞吞类型来 划分囊泡循环的通路这一新思路，弥补了旧有模型的缺陷，较全面地对现有的 实验结果作出了解释。h 一 关键词1 分泌胞吐v ，胞蛋白激酶c 丫矗电容碳纤电极，安培测量 立即可释放囊泡库立即可回收囊泡库，神经酰胺，胞吞模型v n 华中理工大学博士学位论文 a b s t r a c t t h ee x o c y t o s i sa n de n d o c y t o s i s8 1 et w oo ft h eh o t t e s tt o p i c so fe e l ib i o l o g ya n d n e u r o s c i e n c e t h e s et w op r o c e s s e si n v o l v ei nt h em e m b r a n ef u s i o n ，h o r m o n er e l e a s e v e s i c l er e t r i e v a la n dr e c y c l i n g ，a n dt h e i rr e g u l a t i o nb yi n t r a c e u u l a rs c c o n dm e s s e n g e r c a 2 + a sw e l la so t h e r p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s f o c u s e do nt h eh o t s p o ta n dt h ec u t t i n ge d g ei nt h ef i e l do fs e c r e t i o na n ds y n a p t i c t r a n s m i s s i o n ，w er e c r u i t e dt h ep e r f o r a t e dp a t c hc l a m pt e c h n i q u e ，c o m b i n e dh i g ht i m e r e s o l u t i o nc a p a c i t a n c em e a s u r e m e n tw i t ha m p e r o m e t r y , i n v e s t i g a t e dt h ee x o c y t o s i s a n de n d o c y t o s i sa n dt h e i rr e g u l a t i o nb yp r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) t h em a i nc r e a t i v e r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： p h o r b o le s t e r ( p m a ) e n h a n c e sd e p o l a r i z a t i o n e v o k e dc a t e c h o l a m i n er e l e a s e2 5f o l dw h i l ea c t u a l l yd e c r e a s i n gt h ec a 2 + c u r r e n tb ya c t i v a t i n gp r o t e i nk i n a s ec t h i s e f f e c ti st r a n s i e n t t h er e l e a s e dc a t e c h o l a m i n ea c h i e v e dt oi t sm a x i m u mv a l u et w o m i n u t e sa f t e rb a t ha p p l i c a t i o no fp m a ，t h e ni t g r a d u a l l yr e t u r n e dt o t h ep r e - p m a l e v e l7m i n u t e sa f t e ra d d i n gp m a t h ep o s s i b l em e c h a n i s mi st h a tp k c a d p e a r st o i n c r e a s et h ec a ”s e n s i t i v i t yo fc a t e c h o l a m i n er e l e a s e 1 0 w e rt h et h r e s h o l df o rv e s i c l e s t oe n t e rt h er e a d i l yr e l e a s a b l ep o o lo fg r a n u l e s ( r r p ) ，i n c r e a s et h es i z eo fi u 避t h i s l c a d st ot h ee n h a n c e m e n to f c a t e c h o l a m i n er e l e a s e t h e e x o c y t o s i s e x c e s se n d o c y t o s i s - e x o c y t o s i sc y c l e w a sf o u n d i nt h e c a p a c i t a n c e m e a s u r e m e n t e x p e r i m e n t s b a s e d o n t h i s ，ah y p o t h e s i s o fr e a d i l y r e t r i e v a b i ep o o lo fv e s i c l e s ( p e p ) w a sp r o p o s e dw i t hi t sd e f i n i t i o n ，m e a s u r e m e n t a n dc a l c u l a t i o nm e t h o d t h ed a t as h o w st h a tr e pc a nr e t r i e v ea n dr e c o v e r w h e n t h r e ec o n d i t i o n sa r es a t i s f i e d ，i e ，t h ec a 2 + i n f l u xi s l a r g e r t h a n 8 0 p c ，e v o k e d c a p a c i t a n c ej u m pl a r g e rt h a n1 0 0 i f , a n d t h er e c o v e r yt i m ei sl o n g e rt h a n8 0 0s e c o n d s ， t h er e t r i e v a la n dr e c o v c r yo fr e pc a nb er e p e a t e d a f t e rb a t ha p p l i c a t i o no fp m aa n da c t i v a t i o no fp k c i tw a sf o u n dt h a tp k c n o to n l ye n h a n c e st h em e m b r a n ef u s i o na n dt h ec a t e c h o l a m i n er e l e a s e ，i ta l s oi n d u c e s c a ”d e p e n d e n te x c e s se n d o c y t o s i s ，w h i c hi sas l o wc o m p o n e n te x c e s se n d o c y t o s i s w i t ht h ea v e r a g et i m ec o n s t a n to f a b o u t1 4 5s e c o n d s 。t h ep o s s i b l em e c h a n i s mo f t h i s e f f e c ti st h a tp m ai n c r e a s e st h en u m b e ra n dt h ed e e p n e s so fi n v a g i n m i o n so nw h i c h v e s i c l e sa r ed o c k e d t h i sl c a d st ot h ei n c r e a s eo fr e p s i z e i na d d i t i o n ，at h r e s h o l d m o d e lf o rt h eh a p p e n i n go f e x c e s se n d o c y t o s i sw a sp r o p o s e d t h er o l eo fs p h i n g o l i p i d so nc e l ls e c r e t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t a l d a t as h o w st h a tc 6 c e c e r , an o n m e t a b o l i z a b l ea n a l o go fc e r a m i d e ，t h ep r e c u r s o rf o r a l lc e l l u l a rs p h i n g o l i p i d s ，i n h i b i t st h ee x o c y t o s i sa n de x c e s se n d o c y t o s i ss i g n i f i c a n t l y , b u tk e e pt h ec o m p e n s a t o r ye n d o c y t o s i su n t o u c h e d a n o t h e rm e t a b o l i z a b l ea n a l o go f 华中理工大学博士学位论文 c e r a m i d e ，c 6 - d e - c e r , d o e sn o ti n h i b i t b o t h e x o c y t o s i s a n de x c e s s e n d o c y t o s i s ， s u g g e s t i n gt h a t ，n o tt h e c e r a m i d ei t s e l fb u to n eo rm o r eo fi t s m e t a b o l i t e s ，a r e n e c e s s a r yi ne x o c y t o s i sa n de x c e s se n d o c y t o s i s ，t h i si m p l i e st h a tt h es y n t h e s e so f s p h i n g o l i p i d sp l a yak e y r o l ei nt h ep r o c e s so f s e c r e t i o n f i n a l l y , b a s e do n t h ea b o v e e x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，an e w m o d e lf o rt h er e c y c l i n g p a t h w a y o f e n d o c y t i cv e s i c l e s ，e s p e c i a l l yf o rt h ee x c e s se n d o c y t o s i s ，w a sp r o p o s e d i t c o n n e c t st w om a i n t y p e o f e n d o c y t o s i s r e s u l t e df r o m e l e t r o p h y s i o l o g i c a l m e a s u r e m e n t sw i t ht h ev e s i c l er e c y c l i n g ，e a c ht y p eo fe n d o c y t i cv e s i c l e sh a st h e i r o w nr e c y c l i n gp a t h w a y t h i sm o d e lp r o v i d e san e wi d e af o rc l a s s i f y i n gt h ev e s i c l e r e c y c l i n gp a t h w a yw i t he a c ht y p eo fe n d o c y t o s i s ，g i v e san e we x p l a n a t i o nf o rt h e c u r r e n te x p e r i m e n t a lr e s u l t s k e y w o r d s ： s e c r e t i o n ，e x o c y t o s i s ，e n d o c y t o s i s ，p r o t e i n k i n a s e c ，m e m b r a n ec a p a c i t a n c e ， c a r b o nf i b e re l e c t r o d e ，a m p e r o m e t r y , r e a d i l yr e l e a s a b l ep o o lo fv e s i c l e s ，r e a d i l y r e t r i e v a b l ep o o lo f v e s i c l e s ，c e r a m i d e ，m o d e lo f e n d o c y t o s i s 华中理工大学博士学位论文 主要缩略符号表 含义 p k c p m a c f e l u 心 r e p c e r c d e c e r c c l t - c e r n e m n s f s n a p s n a r e s n a p 2 5 p r o t e i nk i n a s ec ，蛋白激酶c p h o r b o l - 1 2 - - m y r i s t a t e - 1 3 - a c e t a t e 佛波醇酯 c a r b o nf i b e re l e c t r o d e ，碳纤微电极 r e a d i l y r e l e a s a b l ep o o lo fv e s i c l e s 立即可释放囊泡库 r e a d i l yr e t r i e v a b l ep o o lo f v e s i c l e s 立即可回收囊泡库 c e r a m i d e ，神经酰胺 n h e x a n o y l - d e r y t h r o s p h i n g o s i n e 一种可代谢的神经酰胺同类物 n - h e x a n o y l l - t h r o s p h i n g o s i n e 一种不可代谢的神经酰胺同类物 n - e t h y l m a l e i m i d e 一种硫氢试剂 n e ms e n s i t i v ef u s i o np r o t e i n s o l u b l en s fa t t a c h m e n tp r o t e i n s n a p r e c e p t o r ，由细胞膜上的s y n t a x i n ， s n a p 2 5 以及囊泡膜上的s y n a p t o b r e v i n 所构成 2 5 - k ds y n a p o s o m a l a s s o c i s t e dp r o t e i n 华中理工大学博士学位论文 第一章绪论 1 1 分泌细胞上的胞吐与胞吞 ，1 臆肚与胞吞的周期镛环 细胞的分泌活动是人体和其它动物最基本的生理功能之一。如内分泌腺把 激素分泌到细胞外液中，外分泌腺把酶原颗粒和粘液等分泌到腺管的管腔中， 以及神经细胞的轴突末梢把神经递质分泌到突触间隙中。神经细胞之间的通讯 正是通过一种叫做神经突触的特殊结构来进行信号传递与调控的。 其过程如下： 1 动作电位传入突触前，突触前质膜上的c a + 通道打开，外钙进入胞内。 2 突触前发生胞吐，并向突触间隙中释放出神经递质。 3 突触后质膜上的神经递质受体接收到递质并引起胞内反应。 4 突触后产生兴奋性( 或抑制性) 电位( 或电流) 并向下一级神经网络 传递信息。 这个过程是一个电信号刺激_ + 化学反应寸新的电信号的耦联过程。其中突 触前通过胞吐把电信号转换为化学信号向后传递，而突触后质膜上的受体感受 器是一个灵敏度高、选择性好的传感器，它将突触间隙中的化学信号转换为电 位( 或电流) 信号并向下级传递。 神经内分泌细胞在受到外界的定刺激时，会通过分泌囊泡的胞吐向外释 放出神经荷尔蒙。如肾上腺嗜铬细胞会通过胞吐向胞外释放出儿茶酚胺，胰腺 1 3 细胞会向胞外释放出胰岛素等等。这些激素通过血管等向其它特定靶细胞或 组织器官施加影响，调节机体的生理功能。神经纽胞和神经内分泌细胞在完成 胞吐这一步骤后，通常紧接着会发生另一个步骤，即臆吞，也称膜回收。回收 入胞内的膜形成新的囊泡，以便重复利用，进行新的胞吐。这一胞吐胞吞胞 吐过程形成了一个周期循环。图1 1 所示即为一个胞吐胞吞的周期循环过程。 其具体过程如下： 华中理工大学博士学位论文 弋f u s i o n 阿 、 9 c a v 。a t p 唣雄哩1 图1 1 细胞分泌的胞吐胞吞周期循环过程 图中分泌循环周期发生的各步骤依次为：停定( d o c k i n g ) ；在a t p 参与下进行胞 吐准备( p r i m i n g ) ；在c a 2 + 的触发下胞吐( e x o c y t o s i s ) 发生，囊泡与细胞质膜进行 膜融合( f u s i o n ) ；随后紧接着胞吞( e n d o c y t o s i s ) 发生，回收入胞内的囊泡转运到 胞内体( e n d o s o m c ) 附近并与之融合；胞内体上重新生长( b u d d i n g ) 新的囊泡出 来，并摄入神经递质( t r a n s m i t t e r u p t a k e ) ；然后转移到细胞质膜附近，在c a 2 + 和 a t p 的参与下停定在质膜上，从而开始了新的一轮分泌周期 分泌囊泡在未受触发前停定在细胞质膜内表面，在a t p 的参与作用下进行 胞吐的准备而达到成熟阶段，即具有膜融合活性。当细胞受到外界刺激时，如 神经细胞接收到传递过来的动作电位时，或嗜铬细胞在去极化脉冲电压的作用 下，细胞膜上的c a 2 + 通道打开，外c a 2 + 内流，使胞内自由c a 2 + 浓度迅速升高， 由原来静息时的1 0 0 r i m 左右，升高到受刺激后的l “m 以上，从而触发了细胞 的胞吐发生。此时分泌囊泡膜与细胞质膜进行膜融合。形成一个融合孔，通过 此融合孔向胞外排放出囊泡内容物一神经递质或神经激素。紧接着胞吞过程发 国一z) o 华中理工大学博士学位论文 生，即膜融合的过程发生逆转而导致膜分离，将胞吐时融合入质膜的囊泡膜进 行膜回收。回收到胞内的膜形成新的囊泡，然后转运到胞内体附近并与之融合 以进行囊泡内容物的重新交换和补充。胞内体外膜上再生成新的囊泡雏形，摄 入神经递质或激素并转运到细胞质膜附近在c a 2 + 和a t p 的参与下停定，从而开 始了第二轮的胞吐胞吞周期循环。 1 1 21 膏上腺嗜铬细胞中的分泌囊泡 肾上腺髓质上的嗜铬细胞是一种神经内分泌细胞，在胚胎期和交感神经元 有着共同的起源，由神经嵴经过交感成神经细胞分化而来。因而具有许多神经 元的共性，在分泌机制上也与神经元较为相似，因此不失为一种较理想的研究 分泌的模型细胞。图1 2 为一例牛肾上腺嗜铬细胞在电子显微镜( e l e c t r o n m i c r o s c o p y ) 下的剖面图。 图1 2 肾上腺嗜铬细胞在电镜下的剖面图 图中在左上角有两个电子致密囊( e l e c t r o nd e n s e c o r eg r a n u l e ) 停定在质膜 上，中段有两个囊泡相距与质膜约有5 0 - 1 0 0 n m ，其它囊泡则随机地分布在胞内 标度尺为2 0 0 h m 3 华中理工大学博士学位论文 1 1 3 立即可释放囊泡库横型 近年来，立即可释放囊泡库( r e a d i l yr e l e a s a b l ep o o lo fv e s i c l e s ，r r p ) 这个 概念用来解释突触传递的强度和胞牡幅度变化已变得越来越重要 n e h e r 和 z u c k e r , 1 9 9 3 ，p a r s o n s 等，1 9 9 5 ，v i t a l e 等，1 9 9 5 ，g i l l i s 等，1 9 9 6 ，s t e v e n s 和 s u l l i v a n ，1 9 9 8 】。所谓立即可释放囊泡库是指这样一些囊泡，它们在功能上处于 立即可释放状态，在空间位置上停定在质膜内表面附近，当触发信号到来时， 这些特定的囊泡可以立即被激活而进行胞吐，释放神经递质和激素。一旦这些 特定的囊泡全部释放完毕后，即使此时再进行触发也不会有胞吐发生了。但是 实际上细胞不会终止分泌的发生，它会在c a 2 + 的参与下源源不断地将新的囊泡 送入立即可释放囊泡库( s m i t h 等，1 9 9 8 ) ，以供下次胞吐释放时使用。因而实际上 的立即可释放囊泡库的库容量是动态变化的。根据h e i n e m a n n 和n e h e r 等所提 出的两步模型法，即 k l k 2 a 气亨b 号c 式中，c 库表示在一定的外界刺激下已经进行胞吐的囊泡；b 库表示已准备好接 收刺激信号而进行胞吐的那部分囊泡；a 库表示所有那些可以而且将要进入b 库的囊泡。 立即可释放囊泡库相当于模型中的b 库，其库容量变化由以下因素所调控： 1 通过胞吐而释放出来的囊泡数，即库c 的大小( 速率为局j 。 2 库a 向库b 补充进来的囊泡数( 速率为妫) 。 3 从库b 中反向自由移动回到库a 的囊泡数( 速率为k ，) 。 因此a 、b 、c 三个库之间的相互关系决定着, - r a 0 可释放囊泡库的库容量大 小。在生理功能上，进入和释放出r r p 的囊泡受许多因素的调控，如c a 2 + 浓度、 温度、p h 值，p k c 浓度、m g a t p 、l i p i d s 等等。有关r r p 的调控本文在第三 章中还将继续讨论。 华中理工大学博士学位论文 1 1 4 细胞胞吞的三种模式 - c l a s s i c a lb s a n dr u nc b u l ke n d o c y t o s l s 掣 图1 3 囊泡的周期循环及细胞胞吞的三种模式 早期的科学家们用电子显微镜观察到在胞吐时融合入质膜的囊泡膜会重新 回收到胞内，如l 谕所述，这一膜回收的过程称为胞吞，其速度较膜融合的过程 为慢。胞吞的详细变化过程和囊泡循环通道以及胞吞的动力学过程等还不是很 清楚。一般认为胞吞发生存在三种模式( s c h w e i z e r 等，1 9 9 5 ) ： 1 经典型( c l a s s i c a l ) 这种模式认为胞吐后融合了的囊泡膜会形成一个小 凹陷并被包涵蛋白( c l a t h r i n ) 所包裹，这些小凹陷逐渐深陷并最后断离而 进入细胞体内成为一个完整的经过包裹的囊泡，如图1 3 a 所示。 2 “k i s sa n dr u n 型这种模式认为融合了的囊泡通过胞吐后立即被回收 入胞内，不经过包涵蛋白的包裹而直接到达分泌位点，进入新的一轮胞 吐胞吞周期循环，如图1 3 b 所示。它受动蛋白d y n a m i n 的磷酸化所调 控。 3 宏胞吞( b u l ke n d o c y t o s i s ) 在这种模式中，当多个囊泡的膜融合入细胞 膜后，可以通过非包涵蛋白调制的“宏胞吞”回收到胞内来，如i 璺| 1 3 c 华中理工大学博士学位论文 所示。 以上各种模式各有证据支持，它们不一定同时发生，经常是组合性发生， 或先后发生。“k i s sa n dr u n ”型胞吞可在零点几秒内完成，而宏胞吞则通常需要 数秒钟、十数秒钟乃至数十秒种之久才能完成，对此我们将在第四章中进一步 讨论。 1 2 研究单细胞分泌的几种新技术 1 2 1 细胞歧电謇测量 当神经细胞或神经内分泌细胞受到外界的刺激时胞吐发生，胞内的囊泡与 细胞质膜相融合，从而增加了膜表面面积；而当胞吞发生时，质膜内陷裂变而 导致囊泡回收，因而减少了膜表面面积。因此对细胞表- 呵面积大小进行监测则 可以知道是否发生了胞吐或胞吞，其发生的幅度大小如何，从而可进行精确量 化的研究洲e h e r 和m a r t y , 1 9 8 2 ；l i n d a u 和n e h e r , 1 9 8 8 ) 。膜电容监测法的高时 间分辨率和商幅度分辨率可以使得人们对细胞分泌过程的许多细传进行详尽的 测量与分析，从而得出许多有意义的结果( a l m e r s 和t s e ，1 9 9 0 ；t o l e d o 等，1 9 9 3 ； h e k e l 和a l m e r s ，1 9 9 6 ；s m i t h 和n e h e r , 1 9 9 7 ) 。值得一提的是l i n d a u 等人近年 来致力于改进提高膜电容监测技术，已取得了很大的进展。在贴附式膜片钳记 录模式下，膜电容监测的幅度分辨率可达几百个a f ( 1 0 4 f ) 数量级，这使得 对单个嗜铬颗粒融合的测量( 约等于2 5 f f ) 成为可能，a n d e r e a sh e n k e l 等人已成 功地用此方法在肾上腺嗜铬细胞上进行了膜电容测量，测出了单个囊泡胞吐与 胞吞的动态过程( 未发表数据，与笔者的个人通讯) 。 1 2 2 安培测量法 可氧化的物质如儿茶酚胺，五羟色胺等可以通过生物化学方法用碳纤微电 极检测得到。嗜铬细胞囊泡中所储存的激素儿茶酚胺分子在一定的电压作用下， 会发生氧化反应，同时释放出两个质子和两个电子。这些电子能被碳纤微电极 所检测到，然后送到放大器中进行放大和处理。单个囊泡中激素释放出来时， 对应的安培法电流为一个尖峰状的电流波形。有时，这些尖峰电流前丽有一个 幅度较小的基座( p e d e s t a l ，也叫f o o ts i g n a l ) ，称为基座信号。一般认为，基座 6 华中理工大学博士学位论文 信号的产生是因为新形成的融合孔( f u s i o np o r e ) 直径还较小，因而激素释放 量与释放速度较低。随着融合孔迅速扩大，激素大量地释放出来，从而在碳纤 微电极上可记录到一个尖峰波形。有时会记录到基座信号发生上下波动及快速 闪烁的情形。这意味融合孔在快速地开启和关闭( n e h e l1 9 9 3 ；t o l e d o 等，1 9 9 3 ) 。 当这些较窄的融合孔关闭后不再扣开时。则测量到的是一个独立基座信号( s t a n d a l o n ef o o t ) ：若其关闭后又重新开启并扩张到足够大时，则记录到的是基座加尖 峰r 乜流信号。通常囊泡尺寸的大小( 直径或容积) ，基座信号的宽度与在丛座信 号期间所释放出来的内容物成一定的比例关系。即囊泡越大，基座信号就越宽， 释放出来的激素也就越多。反过来说，如果测得的囊泡内容物越多，基座信号 的宽度越长，则被测囊泡的尺寸也越大。特别值得一提的是，l i n d a u 等人最近 新开发出一种新技术，称为膜片安培法( p a t c ha m p e r o m e t r y ) ，( a l b i l l o s 等， 1 9 9 7 ) ，将碳纤微电极插入膜片钳玻璃微电极内，在贴附式( c e l la t t a c h e d ) 记录 模式下，成功地记录到了阶跃型的膜电容增长与安培法尖峰电流之间的一一对 应关系。其膜电容测量的幅度分辨率可达几百个a f ，堪称世界之最。 1 2 3f 州钓荧光戚像技术 f m i 4 3 是一种s t y r y i 荧光染料，在溶液中能很好地嵌入细胞质膜的外层， 从而大大地增加了膜的荧光强度。当胞吐发生时，囊泡膜融合进入细胞质膜表 面这时细胞外液中的f m i 4 3 会被吸收到这部分囊泡膜上来。当这部分囊泡 膜通过胞吞回收到胞内时，形成了一个经过荧光染色的囊泡库( v e s i c l ep 0 0 1 ) 。然 后将细胞质膜上的f m i 4 3 通过在胞外液中恒定灌流漂洗掉，这样胞内囊泡膜 所染上的荧光染料就成了细胞荧光物质的主要来源了。当下次胞吐发生后，一 部分染了色的新囊泡重新融合入质膜，其染料随即被胞外溶液漂洗走，其荧光 强度也相应成比例地降低，此时再测量细胞荧光强度的减少量就可以确知经过 荧光染色的囊泡确实参与了新的胞吐胞吞循环。b e t z 和b e w i c k 等人( 1 9 9 2 ) 用 该方法首次证实了神经肌肉接头( n e u r o m u s c u l a rj u n c t i o n ) 上通过胞吞回收的部分 新囊泡经过1 分钟左右就又可以进入下一轮的胞吐胞吞周期循环。 全内反射显微镜( t o t a l i n t e r n a lr e f l e c t i o n m i c r o s c o p y ) 也叫瞬逝波显微镜 ( e v a n e s c e n tw a v em i c r o s c o p y ) ，它可以探查载物片之上3 0 0 n m 厚度之内的细胞 内单个囊泡的活动情况。应用这项技术，将肾上腺嗜铬细胞内的分泌囊泡染上 华中理工大学博士学位论文 荧光染料a c r i d i n eo r a n g e ( s t e y e r 等，1 9 9 7 ) 或a c i d o t r o p i c 染料( o h e i m 等，1 9 9 8 ) ， 可以观察到胞内囊泡的移动、停定、胞吐等分泌的详细过程。同时这项技术可 以和g f p ( g r e e n f l u o r e s c a n tp r o t e i n ，绿色荧光蛋白) 染色技术相结合，将g f p 和 分泌肽类融合在一起，作为分泌囊泡的荧光标记物，研究活细胞内单个的分泌 囊泡在分泌过程中的转运、停定、胞吐情况( l a n g 等，1 9 9 7 ) 。 运用这项技术还可以较好地研究细胞骨架中的肌动蛋白网络f f - a c t i n n e t w o r k ) 、肌球蛋i 刍( m y o c i n ) 及微管( m i c r o t u b u l e ) 等蛋白对分泌囊泡移动的影 响以及对分泌的调控作用。 1 2 5 闪光分解镶定化合鞠技术 在研究分泌的时候，常常需要了解c a ”和其它胞内第二信使，如c a m p 等 与胞吐的定量关系。为此，需要将胞内的游离c d + 浓度【c a 2 + 】；钳制在不同的浓 度水平上，以研究不同浓度的c a 2 + 所触发的胞吐和胞吞的大小。光可分解的锁 定化合物( c a g e dc o m p o u n d ) 的出现正好满足了这种需要。d m - n i t r o p h e n 和 n i t r o p h e n y le g t a ( e l l i s d a v i s e t a l ，1 9 9 6 ) 是两种光可分解的钙离子螯合剂 ( p h o t a l a b l ec a l c i u mc h e l a t o r , 也即c a g e dc o m p u n d ) ，把它们和钙离子螫合在一 起，通过膜片钳玻璃微电极扩散或微注射方式导入单个细胞内。通过紫外光的 闪光分解。使这些锁定化合物对钙离子的亲和力由高变低，从而使锁定的钙离 子被释放出来，成为自由钙离子，导致胞内自由钙离子浓度的迅速升高，并且 均匀地分稚在胞内的空间上( n a r a g h i ，e ta l ，1 9 9 8 ) 。通过设计不同的电极内液，改 变紫外光的强度，以及在光路中加入中性密度滤光片等措施，可以稳定地获得 从静态时的【c a 2 + 1 ；= 1 0 0 n m 到大于2 0 0 p m 甚至更高的各个水平的 c a 2 + 】i ( n e h e r 和z u c k e r 1 9 9 3 ) 。将此项技术与膜电容测量和安培测量法结合起来，可以对分 泌中的多个动力学参量进行定量测量，以及分泌时程的监测，因而成为分泌研 究中的一项强有力的工具。 1 2 6 多光子荧光敝发技术 多光子荧光激发技术( m u l t i p h o t o nf l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o n ) 是近年来新开发出 来的一项光学技术并首次应用于激光扫描荧光显微镜d g ( d e n k 等，1 9 9 0 ) 。通常， 激发荧光( e x c i t i n gf l u o r e s c e n c e ) l 拘波长，总是比受激发物( 如荧光染料) 的发射 荧光( e m i s s i o nf l u o r e s c e n c e ) 波长要短一螳，但在多光子激发技术巾，激发光源 的波长为通常的两倍，激发光则为高强度的短脉冲形式。激发荧光与光源强度 3 华中理工大学博士学位论文 的2 次或更高次方成正比。同时荧光染料受激发后吸收了两个或更多的长波长 r l o n g w a v e l e n g t h ) ) 匕予。当这种多光子激发应用于激光扫描荧光显微镜上时， 可带来两项优点：第一、由于激光的波长较通常的光源波长更长，根据物理学 的光散射定理，这种光能穿透进入更深的组织中这一优点尤其适合于在做脑 切片和在体动物实验中应用。第二、荧光激发仅仅发生在焦平面上，而焦平面 以外的光不需要共焦小孔就可以消除掉。同时，由于受焦平酾的限制，对其它 组织的光损伤( p h o t o d a m a g e ) 也将被限制在最小的范围以内。这一特点划在较厚 组织的扫描过程中显得尤为重要。这两项优点使得这项技术最近成功地用于测 量脑切片中的钙离子分布图像( c a 2 + i m a g i n g ) ( y u s t e a n d d e n k ，1 9 9 5 ) 。 以上几项技术的联合运用，将比单一方法的独自运用能得到更多更详细的 信息。随着对这些方法的改进，以及新技术的出现将会对细胞生物学和神经科 学的研究提供更强有力的工具。并将带来新发现与新突破，如同当初膜片钳技 术的出现一样。 1 3 细胞分泌的p k c 调控 。 蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 是一种广泛存在于体内的酶，它受d a g 及i 如的协同激活。无d a g 时，p k c 激活就需要高于生理浓度的c a ”；当d a g 存在时，p k c 对c a 2 + 水平的需要降低，即使生理范围内的c a 2 + 也足以激活它。 如果d a g 浓度足够高，甚至可以把c a 2 + 浓度降低到静息细胞内c a 2 + 浓度的水平 o o 7 m ) 。p k c 的激活包括形成一个含有膜脂质、c a 2 + 、d a g 及p k c 蛋白的复 ，合物，必然伴有p k c 与膜的结合。这就可以解释为什麽许多被p k c 磷酸化的 蛋白都是膜蛋白。p k c 参与调节一系列广泛的生理功能。包括：海马峰电位放 电的调控，门控离子通道，受体脱敏及海马中长时程增强的诱导。佛波醇酯p m a 可以从细胞外弥散入细胞内，模拟d a o 的作用。p m a 常被用作为一种药理学 工具用来探测p k c 是否参与某项生理事件。 p k c 是一族7 7 8 7 k d 单聚体蛋白，至少有七个不同的形式。其中6 个同 功酶，o 、b 、v ( 有时分别称为r i l l ，r 1 1 ，rj ) 及6 、e 、e 都是4 ；i 刊基凼的产 物。编码b 的基因转录本经交互剪切。产生bi 、bi i 两种同功酶，此两者在 羟基端不同。p k c 各同功酶在激活要求亚细胞定位及底物特异性方丽均有细 微差异，这可能与不同神经元的信号特征的精细调控有关，例如，y 同功酶仅 9 华中理工大学博士学位论文 在脑及脊髓表达，它可被p m 级的花生四烯酸激活，而后者经磷脂酶a ，的作用 自脂质释出的6 、e 、e 同功酶被d a g 激活但不受c a 2 + 的调节。 p k c 的作用是把a t p 上的y 磷酸催化转移到蛋白质分子中的特殊残基上。 由于磷酸根的大量负电荷，它与蛋白质结合后，就改变了蛋白质多肽链的折叠， 从而改变了它的功能。通过改变蛋白构象，即可调节受体、离子通道及结构蛋 白的功能。 p k c 对细胞分泌有增强作用，但它在刺激一分泌耦联中的作用位点仍然 不是很清楚。一般认为p k c 通过增加立即可释放囊泡库而增强了胞t t 止( o i l l s 等， 1 9 9 6 ) 也有人认为p m a 激活了p k c ，打掉了细胞骨架中的肌动蛋白网络，使 分泌囊泡减少了物理障碍，更易到达质膜内表面，因而使分泌增加。本论文将 对此作出探讨，并对p k c 在胞吞中的作用作出详细的实验记录与分析并导出若 干有意义的结果。 n e h e r 研究室近年来就p k c 对胞吐的调控作用用电生理的方法进行了深 入的研究( o i l l i s 等，1 9 9 6 ) ，本论文中第三章内容即为其继续部分。其目的不仅 想测量出p k c 对胞吐时膜融合的作用，同时还希望测量出激素释放时的动态变 化过程，因此需要采用膜电容测量与安培测量法相结合的方法来进行。实验结 果与分析详见本文第三章内容。 1 4 本论文研究的内容与意义 虽然目前人们对细胞分泌的研究取得了很大的进展，但是仍然有n ：多基本 的问题不是很清楚。例如，胞吐时，立即可释放囊泡库中的囊泡受那些因素的 影响才能进入该库? 如何调控其库容量以控制细胞的分泌? 在一次刺激下和多 次刺激下细胞会呈现何种反应，有什麽不同? 以上问题用在胞吞上又会如何? 胞吞的动力学过程如何? 能否用一个统一的模型来描绘? 这些问题属于分泌研 究中的重要问题而又尚未解决，且有十分重要的意义，因此，成为本论文的选 题基础。 本论文根据同f ； 困际上对细胞分泌和突触传递研究的热点问题和曛点难 题，应用穿孔膜片钳记录技术，在电压钳制模式j f 。采用商时间分辨率的细胞 膜电容监测技术结合碳纤微电极进行安培法测量，对单个分离的牛肾上腺嗜铬 细胞胞吐与胞吞进行联合检测，可同时检测到在去极化脉冲电压刺激下，通过 电压门控型c a 2 + 通道进入胞内c a + 电流l c i 细胞分泌时的膜电容c m 的变化以 1 0 华中理工大学博士学位论文 及细胞中释放出儿茶酚胺激素时，在碳纤微电极上所记录到的安培电流l 。m p 。 对以下内容进行具体的研究： 1 通过定量检测细胞分泌时的c a 2 + 电流和膜融合变化，儿茶酚胺激素释放 的时程，对嗜铬细胞进行胞吐时的全细胞膜融合变化( 用膜电容c m 来 表征) 和细胞膜表面局部激素释放的动态过程( 用电流i 。，来表征) 进 行同时的联合检测，对测量结果进行互相比较印证，以期得到有关胞吐 的更加真实、准确、全面的信息。 2 通过比较c a 2 + 电流和i 。这两个独立的变量，分析分泌时的c a 2 + 通道与 分泌位点之间的空间分布与时程。 3 对单个刺激及多个间隔刺激情况下的胞吐与胞吞进行观察，找出胞吐与 胞吞之间的内在联系，以及刺激条件不同时的影响。 4 通过胞外施加p m a 激活胞内p k c ，观察p k c 列细胞j 胞吐h 、j 膜融合以 及儿茶酚胺释放的影响，并与未加药时的胞吐相比较。 5 研究p k c 对细胞胞吞的影响。特别是观察加药后对胞吞的时程的影l i | f ! j o 6 研究神经酰胺c e r a m i d e 对细胞胞吐与胞吞的影响。探讨鞘脂类 s p h i n g o l i p i d s 在分泌中所起的作用。 7 在以上实验观察的基础上对细胞胞吐找出其运行规律，并建立新的立即 可释放囊泡库的阙值模型。 8 在列实验数据进行分析的基础上，对细胞胞吞的模式及运行规律进j j ：总 结，并导出带有一定规律的模型出来，同时对胞吞的调控因素也加以考 虑。 华中理工大学博士学位论文 第二章应用膜电容监测和安培测量法对单个细胞分泌进行 同时检测 2 1 引言 肾上腺嗜铬细胞是一种神经内分泌细胞，具有j 兴奋性。当它受到外界的 刺激引起胞内的信号系统反应，因而触发分泌时，胞内的分泌囊泡迅速与质膜 融合，形成一个融合孔，并向胞外排放出儿