（遗传学专业论文）透明颤菌血红蛋白基因在短小芽孢杆菌中的表达.pdf

不同基匿启动子对血红蛋白基因表达的影响 血红蛋白在基因工程菌改造中的应用前景 短小芽孢杆菌u n 一3 卜c 一1 1 作为表达系统的潜力 血红蛋白在细胞中的定位， 参考文献 文献综述 透明颤菌血红蛋白基因的研究进展 摘要 v g b 基因的结构 透明蓟菌血红蛋白的结构与功能 v g b 基因表达的调控 透明颤菌血红蛋白基因的应用， 4 1 血红蛋白基因在微生物中的研究和应用 4 2 血红蛋白基因在植物中的研究和应用 4 3 血红蛋白基因启动子的研究和应用 5 展望， 参考文献， 在读期f b j 发表及待发表的论文 声 明， 致 谢， 图形目录 l 穿梭载体p s u o v 4 的物理图谱 2p m d l 8 一t 载体物理图谱， ， 3 p n k l 图谱， 4 p s u w b p a p ， j 表达质粒的构建及其物理图谱， 6 p s u p 4 3 v g b 的p c r 和酶切鉴定，p s u w b p v g b 的双酶切鉴定 7 接种量转基因菌的生长情况， 8 转基因短小芽孢杆菌可溶性蛋白质的s d s p a g e 分析， 9 转基因菌枯草杆菌和大肠杆菌的胞内蛋白的s d s p a g e 分析 1 0 转基因短小芽孢杆菌c 0 差异光谱检测， 1 1 转基因大肠杆菌c o 差异光谱检测 12 限氧条件下血红蛋白基因的表达对碱性蛋白酶产量的影响 3 3 3 3 3 4 3 4 3 6 4 ( 】 4 0 4 l 4 2 4 2 4 5 4 8 q 8 5 3 5 4 p ob 5 6 6 2 6 3 6 4 o加船明朗鹪四如 图图图图图图图图图图图图 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 沦文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四 川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的慌明并表示谢 意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的， 论文成果归四川大学所有，特此声明。 硕士研究生：张风豪 导师： 2 0 0 6 5 透明颤菌血红蛋白基因在短小芽孢杆菌中的表达 专业遗传学 硕士生张风豪导师张义正教授 中文摘要 血红蛋白基因能能使低氧条件下细胞的生长和蛋白质的合成速度不 会受到太大的影响，并且在定条件下还能促进目的基因的表达。本研 究将透明颤菌血红蛋白基因成熟肽编码区序列分别与枯草芽孢丰t 菌的 p 4 3 双启动子和短小芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子w b p 连接，重组成融合 基因，然后利用大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭载体p s u g v 4 分别构建组成 型表达质粒p s u p 4 3 v g b 和p s u w b p v g b 。将表达质粒分别转化短小芽孢 杆菌b a c i l l u s p u m i l u s u n 3 1 c 一1 1 、枯草芽孢杆菌b a c i l l u ss u b t i l i sw b 6 0 0 和大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，经s d s p a g e 和c 0 差异光谱 检测表明融合基因在3 种宿主菌中均得到了表达。融合基因的表达使宿 主菌模拟通氧充分或者低氧培养条件下均表现出相对于对照菌株的生长 优势。在短小芽孢杆菌中，表达质粒使重组菌株在低氧条件下的生长量 在生长后期超对照菌株2 0 以上，而且血红蛋白的表达促进了短小芽孢 杆菌蛋白酶基因的表达和分泌，碱性蛋白酶的产量高于对照3 0 以上。 结果还显示，基因启动子p 4 3 比w b p 对融合基因在短小芽孢杆菌中的表 达有更好的启动效果。 关键词：透明颤菌，血红蛋白基因，短小芽孢杆菌，穿梭载体，启动 子，基因表达 4 本课题为固家8 6 3 计划( 2 0 0 4 a a 2 1 4 1 1 1 ) 和四j ij 省“十五”重点攻关项目( 0 2 n g 0 0 2 0 0 5 ) 资助。 5 s t u d yo nt h ee x p r e s s i o no fv i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ng e n ei n b a c i l l u sp u m i l u s a b s t r a c t c o e x p r e s s i o n + o fv i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ng e n e ( v g b ) c o u l de n h a n c e p r o d u c t i o no fp r o t e i n s i ns e v e r a lb a c t e r i a lg r o w t hu 。n d e rt h el o wl e v e l o x y g e n i n o u rr e s e a r c h ，t w or e c o m a i n a n tp l a s m i d sw e r ec o n s t r u c t e db y i n s e r t i n gt h em a t u r ep e p t i d e c o d i n gs e q u e n c eo ft h ev i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n g e n ed o w n s t r e a mo ft h eb a c i l l u ss u b t i l i sp r o m o t e rp 4 3a n db a c i l l u sp u r n i l u s a l k a l i n ep r o t e a s ep r o m o t e rw b pt ot h es h u t t l ev c c t o rr e s p e c t i v e l y ，a n dc a l l e d p s u p 4 3 v g ba n dp s u w b p v g b t os t u d yt h e e f f e c to fv h bo i 】c e l lg r o w t h t h e s e e x p r e s s i o np l a s i d s w e r et r a n s f o r m e d i n t o b p u m i l u s u n - 3 1 - c 一1 1 ，b s u b t i l i sw b 6 0 0a n de s c h e r i c h i ac o l i b l 2 1 s d s p a g ea n d c a r b o nm o n o x i d eb i n d i n ga s s a yd e m o n s t r a t e dt h a tv h bw a se x p r e s s e di na 1 1 t h r e es p e c i e s 1 tw a sa l s of o u n dt h a tr e c o m b i n a n tp l a s m i d sc o u l di m p r o v e e e l lg r o w t hi nt h r e eh o s ts t r a i n s ；e s p e c i a l l ye n h a n c et h ep r o d u c t i o no ft h e a l k a l i n ep r o t e a s e ，a n dp r o t e i ns e c r e t e s e c r e t ei nu n - 3 1 c 1 1 u n d e rn o r m a l 0 2o rl o w0 2c o n d i t i o n ，t h e s et r a n s f o r m a n t ss h o w e dd i f f e r e n to p t i c a ld e n s i t y c o m p a r i n gw i t ht h ec o n t r 0 1 i nb p u m i l u s ，c e l l sc o m i n gf r o mr e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i d sh a d2 0 e e l id e n s i t yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lj nt h el a t e e x p o n e n t i a lp h a s e m e a n w h i l e r e c o m b i n a n tp l a s m i d sc o u l di n c r e a s ct h e a l k a l i n ep r o t e a s ep r o d u c t i o n3 0 h i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 t h er e s u l t sa l s o d i s p l a y e dt h a tp 4 3p r o m o t e rh a de f f e c th i g h e rt h a nw b pi np r o m o t i n gt h e e x p r e s s i o no ff u s e dv g bg e n e k e y w o r d s ：m t r e o s c i l l a ，h e m o g l o b i ng e n e ，b a c i l l u sp u m i l u s ，s h u t t l ev e c t o r ， p r o m o t e r ，g e n ee x p r e s s i o n 6 透明颤菌血红蛋白基因在短小芽孢杆菌中 的表达 1 引言 研究表明，在低氧条件下生物的生理特性改变因其细胞种类不同而 不同，特别是在高密度发酵的生物反应器中，供氧问题尤为突出【孙。2 0 世纪7 0 年代，美国科学家t y r r e e 等在透明颤菌( i 矗t r e o s c i l l a ) 的专性好 氧菌中发现了血红蛋白。该蛋白为同型二聚体，亚基分子量是1 5 7 k d ， 各含有一分子的b 型血红素，它无论在光谱学性质还是氧结合动力学性 质都与真核生物血红蛋白极为相似，简称v h b 3 7 1 。 透明颤菌血红蛋白基因v g b 于1 9 8 8 年被成功克隆，并在大肠杆菌得到表 达，实验证明，血红蛋白基因表达能明显促进细胞在低氧条件下的生长 和蛋白质合成能力1 2 ”。随后，v h b 应用研究得到广泛开展，尤其是它本 身功能开发，v h b 为解决溶氧问题提供了新的途径。传统解决通氧问题 有加大搅拌速率或优化搅拌配置，或者提高液相中氧的溶解度，如加入 e 十二烷或者全氟碳等方法【2 l 。但是这在解决供养的同时增加了生产成 本。 解决氧需求的另一途径就是利用生物技术来提高细胞自身对氧的吸 收转运效率。v h b 蛋白被证明在透明颤菌的贫氧环境中生存起着重要的 作用，随着更深入的研究发现，利用v g b 基因在其他菌种中的外源表达 来解决需氧发酵过程中供氧问题是可行的，在节能方面就可能带来巨大 的经济效益。v g b 基因在a 一淀粉酶基因工程菌中的表达可将细胞密度和 a 一淀粉酶产率提高1 4 和3 3 倍 1 1 , 3 7 1 v g b 基因在链霉菌中的表达可促进菌体生长1 1 2 】；v g b 基因的表达还 能有效提高头孢菌素c 在顶头孢霉菌中的产量1 1 9 本实验室李听曾构建 血红蛋白基因表达质粒，提高几丁质酶基因在大肠杆菌的表达【5 】。此外， 有一些发酵产物的合成对氧十分敏感，给发酵过程控制带来困难，而v g b 7 的表达可降低产物合成时对氧的敏感性，降低过程能耗，这已在青霉素 酰化酶基因工程菌的发酵实验中得到证实【儿j 。现在，v g b 基因已经在动 物细胞及高等植物中( 烟草、矮牵牛) 表达，也取得了显著效果 4 , 2 5 , 3 2 。 毛自朝等将透明颤菌血红蛋白基因转进矮牵牛，矮牵牛在水培条件下生 长增强了抗涝能力1 4 j 。 h o l m b e r g 等通过引入编码细菌血红蛋白的单个基因使转基因植物 较早发芽和增强植物生长i ”】。 本实验室从成都市垃圾中分离得到脱毛蛋白酶产生菌一短小芽孢杆 菌a c i l l u s p u m i l u s ) b a ( 0 6 ) 菌株【2 “，对其进行数次诱变，已经得到高产 脱毛蛋白酶菌株u n 3 1 c 1 1 ，其蛋白酶产量比出发菌株高t 0 倍。由于 该菌株发酵液脱毛效果很好，且胶原水解活性很低，并且与传统的皮革 脱毛帽比具有产生污染少，原料利用率高等特点，因此在皮革工业中将 有很好的应用前景 3 , 8 , 9 , 1 3 , 1 4 】。 已有的研究结果还表明，该菌在发酵过程中的通氧效果越好，碱性 蛋白酶的产量越高，一般都会增加2 0 以上。但在大规模的发酵过程中， 由于搅拌而产生大量的泡沫会影响发酵，因此如果能用血红蛋白基因的 表达来促进氧的传递，就可以降低搅拌速度，从而减少泡沫的产生，提 高酶的产量，降低能耗，降低生产成本。本研究将透明颤菌血红蛋白基 因和不同的芽孢杆菌基因启动子进行重组，构建v g b 基因表达质粒，然 后将其转入短小芽孢杆菌中，以期提高该菌的氧传递效率，最终提高碱 性蛋白酶的产量。 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 菌株 短小芽孢杆菌( b p u m i l u s ) u n 3 1 c 1 1 ：碱性蛋白酶高产菌株，本 室分离构建，用于血红蛋白基因表达。 大肠杆菌e c o l id h 5 c t s u p e 4 4a l a cu 1 6 9 ( 巾8 0 k c z m 1 5 ) h s d r l 7 r e c a le n d a lg y r a 9 6t h i lr e l a l 为本室保存，用于克隆基因。 大肠杆菌e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，f o m p th s d s b ( r b m b ) g a l ( 九ci8 5 7 ， s i n d l ，s a m 7 ，n i n 5 ，i a c u v 5 t 7g e n e l ) ，d c m ( d e 3 ) ，用于血红蛋白基因表达。 枯草芽孢杆菌b ，s u b t i l i sw b 6 0 0 ( n p r e ，a r p a ，e p r ，b p f ，即r ，n p r b c m 7 ) ，用于血红蛋白基因的表达，由加拿大c a l g a r y 大学d r w o n g 惠赠。 2 1 2 载体与质粒 2 1 2 1 裁体p s u g v 4 1 6 l 该载体大小为6 0 k b ( k a n ，a m p ，l a c z a l ，是c 口z f 毋s u b t i l i s 穿 梭载体，由本实验室构建，其多克隆位点区( m c s ) 与p u c l 8 的多克隆 位点区相同。用于表达质粒构建，o r i + 为枯草杆菌复制起点，o r i 。为大肠 杆菌复制起点。 呈璺! 竖曼竺曼兰! 璺旦璺巳坚。_ _ _ 。- _ _ - 。_ _ _ _ - 。- _ _ _ _ _ _ _ _ 。- - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - 。_ 1 | 4 0 7 4 0 7 圈1 穿梭载体p s u g v 4 的物理图谱 b b a m h i ：ee c o r i ：h h i n d i i i ：k k p n l ：p p s t l ：s s a i l ：s 1 s a c l ：s p s p i n ；s m s m a l ：x b x b a l 注：以下各图中的限制酶缩写同此图 2 1 2 2 裁体p m d l 8 t p m d l 8 - t 是一种高效克隆p c r 产物( t ac l o n i n g ) 的专用载体，用 于克隆p c r 扩增得到的产物，购自t a k a r a 公司。其物理图谱见图2 。 9 围3p n k l 图谱 2 1 2 4 质粒p s u w b p a p 由本室杨春晖构建，含有全长碱性蛋白酶基因，包括约8 0 0 b p 的基因 启动子区，用于表达质粒的构建，其物理图谱如下： l o 圈4p s u w b p a p 2 1 3 培养基【7 】 2 ，1 3 1 l b 培养5 ( 1 0 0 0m l 、 胰蛋白胨1 0g 酵母粉 5g n a c l5g 7 加6 6m l1 nn a o h 调p h 到7 5 。 固体培养基在相应的液体培养基中加入1 5 琼脂粉。 s o b 培养基( 1 0 0 0m l ) 胰蛋白胨 酵母粉 n a c l k c l 2 0g 5g 0 5 8g 0 3 8g 1 0 0 x m g “母液 1 0m l 加3m l1 nn a o h 调p h 到7 0 。 1 0 0 x m g “母液( 1 0 0m l ) m g c l 2 6 h 2 0 2 0 3 3g m g s 0 4 。7 h 2 0 2 4 6 5g 加水至1 0 0 m l s o c 培养基( 1 0 m l ) s o b9 8 2 m l 2 0 葡萄糖 o 1 8m l 2 1 3 4 枯草芽孢杆菌感受态转化的培养基和溶液 1 5 , 3 s 1 ) p c 缓冲液( 1 0 x ) k h z p 0 4 4 4m m o l l k 2 h p 0 4 6 0m m o l l 柠檬酸三钠3 0m m o l l 2 ) 0 5 m o l l 的天门冬氨酸钾 l m o l l 的d 天门冬氨酸与2m o l l k o h 等体积混合而成。 31 坚里堕菱薹f ! q 里垡! 成分使用浓度加量( m l ) 上述各成份单独灭菌后混合。 2 1 4 溶液和缓冲液【3 4 】 2 1 4 1 s o l u t i o n i ( s l n i ) 5 0m m o l l 葡萄糖 2 5m m o l lt r i s h c i ( p h 8 o 、 1 0m m o l le d t a ( p h 8 0 、 2 。1 4 2s o l u t i o n l l ( s l n l i ) o 2m o l ln a o h 与1 s d s 等体积混合。 2 1 4 ，3 s o l u t i o n l l i ( s l n i i i ) 3m o l lk a c ( p h 4 8 1 2 1 4 4 t e 缓冲液 1 2 1 0m m o l lt r i s h c l ( p h 8 0 ) l m m o l le d t a ( p h 8 0 ) 2 1 4 5t r i s h c i 缓冲液 在8 0 0m lh 2 0 中溶解1 2 1gt r i s 碱，用浓盐酸调至所需的p h 值， 混匀后加水至1 l 。 2 1 4 6 聚丙烯酰胺凝胶电泳用各种相关溶液 2 1 4 6 1 聚丙烯酰胺母液 3 0 丙烯酰胺，0 8 亚甲双丙烯酰胺。 2 1 4 6 2 4 x t r i s c 1 s d s ( p i - i8 8 1 在3 0 0m lh 2 0 中溶解9 1 9t r i s 碱( 1 5t o o l l ) ，用l m o l lh c l 调节 p h 值至8 8 ，补加h 2 0 至总体积达到5 0 0m l ，再加入2 0 9s d s ，于4 可以保存1 个月。 2 1 4 6 3 4 x t r i s c i $ d s ( p n6 8 、 在4 0m lh 2 0 中溶解6 0 5 9t r i s 碱( o 5 t o o l l ) ，用l m o l lh c l 调节p h 值至6 8 ，补加h 2 0 至总体积达到1 0 0 m l ，再加入0 4 9s d s ，于4 可 以保存1 个月。 2 1 4 6 45 x s d s 电泳缓冲液 t r i s 碱( o 1 2 5 m o l l ) 1 5 1g 甘氨酸( 0 9 6 m o l l ) 7 2 0g s d s5 og 加去离子蒸馏水至1 0 0 0 m l ，使用前稀释至l x s d s 电泳缓冲液。 2 1 4 6 52 s d s 样品缓冲液 4 x t r i s c 1 s d s ，p h 6 8 2 5m l 2 0 甘油【( w v ) 2 0m l d t t 3 1 9 溴酚蓝lmg 加去离子蒸馏水至1 0 0 m l 并混匀。等量分装成1 m l 并于7 0 0 贮存。 2 1 4 6 6 考马斯亮蓝r 2 5 0 染色液 甲醇 5 0 ( v v ) 考马斯亮蓝r 2 5 0 o 。0 5 ( v v ) 乙酸 1 0 ( v v ) 】3 h 2 0 4 0 2 1 4 6 7 固定液 甲醇( 或乙醇) 5 0 ( v v ) 乙酸 1 0 ( v v ) h 2 0 4 0 ( v v ) 于室温可保存1 个月 2 1 4 6 8 银染液( 1 2 5m l ) 硝酸银0 1 5 9 溶于1 0 0m l 水中，加入甲醛( 5 0 ) 0 0 2 5m l 混合均 匀后使用。 注：硝酸银见光易分解，银染液最好在使用前配置。 2 1 4 6 9 银染显色液( 1 5 0m l ) n a 2 c 0 3 3 5g 甲醛0025 i n l 加水至1 5 0 m l 2 1 4 6 1 0 脱色液 乙酸 5 ( v v ) 甲醇( 或乙醇) 1 6 5 ( v v ) h 2 0 7 8 5 2 1 4 6 1 1 银染终止液0 2 5m l ) e d t a n a 2 1 8 2 5g 加h 2 0 至1 2 5m l 注：所有电泳所需的溶液及缓冲液均用重蒸去离子水配制 2 1 5 分子克隆工具酶及重要生化试剂 限制性内切酶，r n a s e a ，蛋白酶k ，牛小肠碱性磷酸酶( c i p ) ，t 4 d n a 连接酶，t a qd n a 聚合酶等购自成都晶美公司和大连宝生物公司。 其它试剂为国产分析纯试剂。用于扩增血红蛋白基因片段v g b 和p 4 3 启 动子的p c r 引物和由i n v i t r o g e n e 公司合成。 2 1 6 重要实验仪器 1 4 所有的凝胶照相和数据处理均用英国u v p 公司的u v pg e l d o c u m e n t a t i o na n da n a l y s i ss y s t e mg d s l 8 0 0 0 系统进行：c o 差异光谱扫 描用岛津u v 2 4 5 0 紫外分光光度计进行。用于扩增v g b 和p 4 3 启动子的 引物由i n v i t r o g e n e 公司合成。 2 2 实验方法 以下各种d n a 操作技术，除特别注明出处外，均采用本实验室已经 规范化的研究方法。生长量的测定以样品在波长5 6 0r i m 的o d 值为准。 2 2 1 细菌生长量的测定 生长量的测定以一定时间的样品在波长5 6 0a m 的o d 值为依据。 2 2 1 11 接种量培养 1 每个菌株挑1 环菌苔，接种于装有1 0m ll b 培养基的1 0 0m l 三 角瓶中，3 4 和1 8 0r m i n 培养1 5 1 8h 。 2 取o 5m l 培养物，转入装有5 0m ll b 培养基的2 5 0m l 三角瓶中 ( 接种量为1 ) 。每个菌株接种3 瓶，混匀后取样0 5m l 用于o d 5 6 0 值 测定。 3 在3 4 和1 0 0r r a i n 条件下培养，每隔6h 取样0 5 m l 用于o d 5 6 0 值测定。 2 2 1 21 0 接种量培养 1 每个菌株挑1 环菌苔，接种于装有1 8m ll b 培养基的1 0 0m l 三角瓶中，3 4 和1 8 0r m i n 培养1 5 1 8h 。 2 取5 0m l 培养物，转入装有5 0m ll b 培养基的2 5 0m l 三角瓶 中( 接种量为1 0 ) 。每个菌株接种3 瓶，混匀后取样o 。5 m l 用于o d s 6 0 值测定。 3 在3 4 c 和1 0 0r m i n 条件下培养，每隔6h 取样o 5 m l 用于o d 5 6 0 值测定， 2 2 1 31 0 0 接种量培养 1 每个菌株挑1 环菌苔，接种于装有1 5m ll b 培养基的1 0 0m l 三 角瓶中，3 4 和1 8 0r r a i n 培养1 5 1 8h 。 2 将每个菌株的全部培养物转入装有1 5 0m ll b 培养基的5 0 0m l 三 角瓶中，3 4 和1 8 0r r a i n 培养1 8 - 2 4h 。 3 离心全部培养液，每个菌株的菌体重新与1 5 0m l 培养液混匀，然 后将其分装在3 个装有5 0m l 培养液的2 5 0m l 三角瓶中( 接种量为 1 0 0 ) 。混匀后取样o 5 m l 用于o d 5 6 0 值测定。 4 3 4 和1 0 0r r a i n 条件下培养，每隔4h 取样o 5m l 用于o d 5 6 0 值 测定 2 2 2 大肠杆菌的转化 接种1 环e c o l i 于2m ls o b 中，3 7 振荡培养1 2 1 5h 。取o 。5m l 培养物于5 0m ls o b 中，1 8 振荡培养1 8 2 4h ，使o d 5 6 0 约为0 6 。培 养物在冰上放置1 0m i n ，倒入预冷的5 0m l 离心管中，3 ，5 0 0r r a i n 离心 1 0m i n 收集菌体。加入1 5m l 已在冰上预冷的t b 缓冲液( 0 2m o l l k c l ， 5 4m m o l lm n c l 2 ，1 5m m o l lc a c l 2 ，1 2 5m m o l lk m e sp h6 4 1 ，混匀， 冰上放置1 0r a i n ，3 ，0 0 0r m i n 离心5r a i n 。弃上清后加入4m l t b 缓冲液， 轻轻混匀，加入o 2 8m ld m s o 使其终浓度为7 。在冰上放置1 0m i n ， 将感受态细胞分装于e p 管中，每管0 5 1m l 。把细胞浸于液氮中约3 0 r a i n 。取出细胞，使之在室温下融化，与已在冰上预冷的1 1 0 u ld n a 混 匀，冰上放置3 0r a i n 。4 5 热冲击3 0s 或4 2 热冲击9 0s ，在冰上放置 1 2m i n ，加入o 8m l s o c ，混匀，3 7 振荡培养1h 。4 ，0 0 0r r a i n 离心3 r a i n ，倒去约0 8m l 上清液，将细胞和余下的上清液混匀后涂在含适当 抗生素的平板上，3 7 培养过夜。 2 2 3 枯草芽孢杆菌的感受态转化法 从新制备的平板上挑1 个枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 单菌落，接种于2m l l b 液体培养基( c m l2 0 # g m l ) 中，3 7 ( 2 剧烈振荡( 2 0 0r r a i n ，下同) 培养1 2 1 6h ，将0 2m l 培养物接至装于三角瓶的1 0m ll b 培养基( 不 含抗生素) 中，3 7 剧烈振荡培养3 4h 至o d 6 0 0 = 1 0 左右。取0 2m l 此培养物加入到1 0m l m d 基本培养基中，于3 7 剧烈振荡培养约3 - 4h 至o d 6 0 0 = 1 0 左右，此时细胞进入感受态。取3 5m lm d 培养物于1 0 0m l 三角瓶中，加1 2 肛gd n a ，3 7 剧烈振荡培养1h ，加入0 3 - 0 5m l1 0 xl b ，于3 7 剧烈振荡恢复培养1 5h ，涂布于加有抗生素的选择平板 ( c m l 2 0 # g m l ，k a n2 0 “g m l ) ，3 7 培养过夜至转化子菌落出现。 2 2 4 大肠杆菌质粒的大批量提取 接1 环含质粒的e c o l i 细胞于5 0m l l b 液体培养基中，3 7 c 振荡培 养1 2 1 5h ，4 ，0 0 0r r a i n 离心1 0r a i n ，弃上清液。加入3m l 溶液i 充分 混合，置于室温下5m i n ，加入6m l 溶液i i ，轻轻混匀，冰浴5r a i n ，加 入4 5m l 溶液i i i ，混匀，冰浴2 0r a i n 。4 ，0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，取上清 液，加入2 7m l 2 0 无水乙醇，于2 0 静置3 0m i n ，4 ，0 0 0r r a i n 离心 1 5m i n ，弃上清液。沉淀干燥后溶于1m l l 0m m o l l t r i s h c i ( p h 7 5 ) ( 或 t e 缓冲液) 中，加入2 z l l om g m l r n a s e a ，3 7 保温1 0r a i n 。转入两个 e p 管中，用等体积的苯酚，苯酚：氯仿( 1 ：1 ) ，氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 名- 抽提1 次。加入1 1 0 体积的3m o l l k a c ( p h 4 8 、和2 倍体积的无水乙醇，于- 2 0 静置3 0m i n ，1 5 ，0 0 0r m i n 离心1 5m i n ，弃上清，用7 0 乙醇沈沉淀2 次， 待干燥后溶于o 5m ld d h 2 0 或t e 中。 2 2 5 大肠杆菌质粒d n a 的小批量提取 取1 5m l 用上述方法培养的菌液于e p 管中，1 0 ，0 0 0r m i n 离心2 m i n ，弃上清液。加入0 1m l 溶液i ，充分混合，静置5m i n ，加入0 2m l 溶液i i ，混匀，黄于冰上5m i n ，加入o 1 5m l 溶液i i i ，混匀后置于冰上 2 0m i n 。1 2 ，0 0 0r m i n 离心5m i n ，取上清液，加入2 倍体积的无水乙醇， 混匀后于2 0 静置3 0 m i n 。1 2 ，0 0 0r m i n 离心5m i n ，弃上清液，待沉淀 干燥后溶于5 0 “ld d h 2 0 或t e 中。 2 2 6 枯草芽孢杆菌质粒d n a 的小批量提取 取2 0m l 用上述方法培养的菌液于e p 管中，1 0 ，0 0 0r m i n 离心2 1 7 r a i n ，弃上清液。加入0 1r a l 溶液i ，加入溶菌酶至终浓度为1 0m g m l ， 充分混合，3 7 c 静置1 0r a i n ，加入o 2m l 溶液i i ，轻柔混匀，待茵体完 全裂解后置于冰上，加入0 1 5 m l 溶液i i i ，混匀后冰上放置1 0 m i n 。1 2 ，0 0 0 r r a i n 离心5r a i n ，转移上清液于新的离心管中，加入2 倍体积的无水乙 醇，混匀后于2 0 静置1 0r a i n 。1 2 ，0 0 0r r a i n 离心5r a i n ，弃上清液，使 用o 5m l 的7 0 乙醇洗涤沉淀2 次，待沉淀干燥后溶于3 0 肛ld d h 2 0 或 t e 中。 2 2 7 芽孢杆菌总d n a 的提取 接种1 坏菌于2m ll b 液体培养基中，3 7 振荡培养过夜。取培养 液转种于5 0 m l l b 培养基中，3 7 振荡培养4h 。4 。0 0 0r m i n 离心1 0 m i n ， 弃上清液。加入1 0m l 裂解液( 1 葡萄糖：5 0m m o l le d t a ，p h 8 0 ； 2 5m m o l l t r i s h c i ，p h 8 0 ；5 0m g 溶菌酶) 充分混合，3 7 振荡培养1h 。 加入0 5m l1 0 s d s 溶液，轻轻混匀，6 5 保温直至细胞悬液完全澄清。 将清液转移至若干e p 管中，每管0 5m l 。每管用等体积的苯酚，苯酚： 氯仿( 1 ：1 ) ，氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提1 次。加入1 1 0 体积的3m o l l k a c ( p h 4 8 1 和2 倍体积的无水乙醇，于2 0 静置3 0m i n ，4 ，0 0 0r r a i n 离 心1 5m i n ，弃上清液。沉淀干燥后溶于1m l1 0m m o l lt r i s h c i ( p h 7 5 ) 或t e 缓冲液中，加入2 “l1 0m g m l r n a s e a ，3 7 保温1 0m i n 。转入2 个e p 管中，加入1 1 0 体积的3m o l l k a e ( p i - 1 4 8 1 和2 倍体积的无水乙醇， 于2 0 静置3 0m i n ，1 5 ，0 0 0r r a i n 离心1 5m i n ，弃上清，用7 0 乙醇洗 沉淀2 次，待干燥后溶于5 0 口ld d h 2 0 或t e 中。 2 2 8 限制酶切和凝胶电泳 d n a 的限制酶切采用各家供应商提供的缓冲液和推荐的方法；d n a 片段大小的检测和分离采用适当浓度的琼脂糖凝胶常规电泳，并在紫外 灯下或凝胶分析系统( g d s ) 上观察并拍照记录。 2 2 9 载体的去磷酸化和d n a 连接 载体d n a 的去磷酸化和d n a 的连接反应依照供应商推荐的方法和 1 8 提供的缓冲液进行。 2 2 1 0 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳( s i ) s p a g e ) 用2 块干净的玻璃平板和垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并 固定在灌胶支架上。在2 5m l 量杯中，先后加入2 3m lh 2 0 ；2 5m l 1 5 m o l lt r i s c i ( p h 8 8 ) ；5 0m l 3 0 聚丙烯酰胺母液：0 1m l 的1 0 s d s ， 混匀后加入0 1m l1 0 过硫酸铵和0 0 0 4m l t e m e d 。将配好的分离胶 溶液沿夹层中一片垫片的边缘加入于玻璃夹层中。分别从两边垫片往夹 层中缓慢加入一层重蒸去离子水。让凝胶在室温下聚合3 0 6 0r a i n 。倾去 顶层的水，并以l x t r i s - c i s d s ( p h 8 8 ) 缓冲液冲洗凝胶的顶部表面。 在2 5m l 量杯中，混匀3 4m lh 2 0 ：0 6 3m lt r is - c 1 s d s ( p h 6 8 ) ：0 8 3 m l 聚丙烯酰胺母液；0 0 5m l 的1 0 s d s ，混匀后加入o 0 5m l1 0 过 硫酸铵和o 0 0 5m lt e m e d 。将配好的积层胶溶液沿夹层中一片挚片的 边缘加入于玻璃夹层中，直至离夹层的项部约1c m 高为止。将梳子插入 夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶溶液充盈剩余空间。让积 层胶在室温下聚合3 0 4 5m i n 。在具螺口盖的微量离心管中，用2 s d s 加样缓冲液按1 ：1 ( v v ) 稀释待测蛋白质样品，于1 0 0 煮沸3 5m i n 。同样 缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。小心地拔出梳子，避免撕裂聚丙 烯酰胺凝胶的加样孔。将玻璃平板安装在电泳装置上倒入1 s d s 电泳 电极缓冲液，使之淹没凝胶的加样孔。微量注射器将同样浓度的蛋白质样 品等体积加入到样品孔中，对照孔中加入蛋白质分子量标准样品，若有空 置的加样孔，须加等体积的空白1 s d s 样品缓冲液，以防相邻泳道样品的 扩散。连接电源，先在1 0m a 恒流下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分 离胶，再将电流调至1 5m a 至溴酚蓝到达凝胶底部为止。关闭电源并撤 去导线，弃去电极缓冲液。在不损坏凝胶的基础上，将凝胶剥离出来并 切去凝胶的一角做上标记。接着就可以进行蛋白质的检测。 2 2 1 1s i ) s 聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色 将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器中并以3 5 倍体积的固定液覆盖， 在旋转摇床上缓慢摇动2h 。倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶， 1 9 并缓慢摇动4h 。倾去染色液，用约5 0m l 固定液冲洗凝胶。倾去固定 液，以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动2h ，倾去脱色液，在加入新脱色液同 时至获得蓝色条带及干净的背景。凝胶可放于7 乙酸或水中保存。 2 2 1 2s d s 聚丙烯酰胺凝胶的银染 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后，用至少5 倍于凝胶体积的银染固 定液固定蛋白质，其间应于室温平缓摇动4 1 2h 。废弃固定液，用去离 子水冲洗2 次，加入不少于5 倍凝胶体积浸泡液，室温平缓摇动3 0r a i n 。 废弃浸泡液，加入1 0 倍凝胶体积的去离子水，于室温平缓摇动5r a i n 。 重复2 次。废弃最后一批洗涤用水。戴上手套，加入5 倍凝胶体积银染 溶液，于室温缓缓摇动3 0r a i n 。废弃银染溶液溶液，用去离子水多次流 动冲洗凝胶两面( 每次2 0s ) 。加入5 倍凝胶体积的新鲜配置的显色溶液， 于室温缓缓摇动，进行温育。仔细观察凝胶，数分钟内可以呈现蛋白染 色带，继续温育直至达到所需对比度。用终止液洗涤凝胶数分钟以终止 显色反应，然后用去离子水洗涤凝胶数次。 2 2 1 3 血红蛋白的光谱测定【2 0 l 将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液( p h 7 5 ) 中，浓度为3 0m g m l ，加入 融菌酶至终浓度1 0i i 【g , m l ，3 7 作用1 0m i n 。超声波破碎2m i n 后，1 2 ，0 0 0 r m i n 离心去除沉淀，加入还原剂连二亚硫酸钠终浓度为4 0m g m l ，通 入c o3r a i n 后，在4 0 0n m 5 0 0n m 扫描光吸收值。注意：样品在结合c o 后，迅速置于暗处，并在通气后5m i n 内进行扫描，以减少非特异吸收 峰的产生。 v h b 的浓度为c = o d ( l * e ) ， e = 2 7 4 m m c m 。 c 为v h b 的浓度，l 为比色杯厚度，e 为v h b 的摩尔消光系数，它 在一定波长下是物质的特征参数。 2 2 1 4 碱性蛋白酶活力测定1 2 6 】 接种后在指定条件下摇瓶培养( 文中未做特别说明的情况下，在 3 4 、2 0 0r m i n 条件下摇瓶培养4 8h ) ，将发酵液过滤、离心，取上清 液，采用改良的f o l i n 试剂显色法测定酶活力：用o 1m o l l ( p h7 5 ) 磷酸缓冲液将酶液按定比例稀释：稀释酶液与底物1 酪蛋白溶液在 4 0 水浴中预热3r a i n ：取1m l 稀释酶液加入2m l1 酪蛋白溶液，混 合后于4 0 反应1 5r a i n ；加3m l1 0 三氯乙酸( t c a ) 终止反应，继 续于水浴上保温1 5r a i n ；对照是l m l 稀释酶液先加入3 m l1 0 t c a 使 酶失活，在1 5r a i n 后再加1 酪蛋白溶液保温1 5r a i n ，以及进行其他操 作步骤；完全沉淀后，用滤纸过滤除去沉淀，得滤液；取1m l 滤液加 入5m lo 5 5 m o l l 碳酸钠溶液以及1m l f o i l n 工作液，摇匀后水浴中显 色2 0m i n ；用7 5 2 型分光光度计测6 8 0l l l i l 处光密度值。酶活定义：以酶 液在一定条件下催化酪蛋白水解，每m i n 释放出1p g 酪氨酸所需要的酶 量为1 个酶活