（水产品加工及贮藏工程专业论文）芽孢杆菌m21β甘露聚糖酶的产生、纯化与性质研究.pdf

芽孢杆菌m - 2 1 争甘露聚糖酶的 产生、纯化与性质研究 摘要 争甘露聚糖酶是一类能够水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖的生 物活性酶。在食品、医药、饲料、造纸、石油等方面已得到广泛应用；近年来， 它在降解植物胶生产功能性甘露低聚糖以及作为食品和饲料添加剂等方面倍受 关注。 本研究从土壤中分离、选育出弘甘露聚糖酶产生菌株，对其进行初步鉴定， 考查了不同因素对菌株发酵产酶的影响，对酶进行了分离纯化与性质研究，并 用此酶降解制备甘露低聚糖，对甘露低聚糖进行了分离纯化和结构分析鉴定。 主要研究成果如下： ( 1 ) 通过富集培养、分离纯化、选择性平板分离、平板水解圈初筛和摇瓶 复筛，从土壤中筛选出一株具较高产p 甘露聚糖酶能力的菌株( 编号为m - 2 1 ) ， 经初步鉴定为芽孢杆菌属( b a c i l l u ss p ) 。 ( 2 ) 通过单因素实验和正交优化实验，确定了b a c i l l u s s p m - 2 1 最佳发酵产 酶条件。菌株的产酶最适培养基组成包括( g l ) 碳源：瓜尔豆胶4 ，复合氮源： 豆粉2 0 、( n h 4 h h p 0 45 ，其他无机盐组分：k 2 i - i p 0 4 3 h 2 0l 、m g s 0 4 7 h 2 00 5 、 n a c l 0 5 、c a c h 0 1 、f e s 0 4 - 7 h 2 0 0 0 0 1 。产酶最适培养条件：培养基初始p n8 0 ， 接种量4 ，装液量5 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶，3 2 1 8 0r r a i n 振荡培养3 6h 。此 条件下酶活力最高可达1 4 8 7u m l 。 ( 3 ) b a c i l l u ss p m - 2 1 产p - 甘露聚糖酶经1 4 倍丙酮沉淀、q - s e p h a r o s e 阴离 子交换柱后分离纯化，s d s p a g e 电泳确定酶的分子量为3 3 4k d a 。相比之下， 此p 甘露聚糖酶的分离步骤简单，酶的比活力和回收率( 7 0 1 ) 都很高，具有工 业上大量制备的前提。 ( 4 ) 此p - 甘露聚糖酶最适反应的p h 为7 0 ，且耐受的p n 范围较宽( 5 0 1 1 o ) ， 具有一定的耐碱性；最适反应温度为5 0 1 2 ，5 0 c 以下酶活力稳定。金属离子 b a 2 + 、c a 2 + 、k ? 、m 矿、n a + 、m n 2 + 对酶有不同程度的激活作用；z n 2 + 、p b 2 + 、 f e 2 + 、c u 2 + 、h 矿、a g + 有对酶有抑制作用。酶对魔芋胶、刺槐豆胶和瓜尔豆胶 的k m 值分别为3 9 7 、8 7 9 和1 7 5 6 m g m l ，v m a x 值分别为9 0 2 、1 2 4 4 和2 0 9 2 v a n o l ( m i n - m e ) 。菌株m - 2 1 所分泌的p 甘露聚糖酶的最适底物为魔芋胶。 ( 5 ) 酶降解魔芋胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶制备甘露低聚糖，通过乙醇分级 沉淀、凝胶过滤层析( b i o - g e lp - 4 e x t r af i n e ) 对寡糖进行分离纯化，经t l c 、质 谱分析，魔芋胶酶解产物由二糖、三糖、四糖等一系列寡糖片段组成，单糖很 少。 本研究为b 一甘露聚糖酶的工业化生产和甘露低聚糖的酶法制备提供了一定 的理论和实践依据。 关键词：b - 甘露聚糖酶，芽孢杆菌，发酵条件，甘露低聚糖 s t u d i e so nt h ep r o d u c t i o n ，p u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no fp - m a n n a n a s ef r o mb a c i l l u ss p m - 2 1 a b s t r a c t 肛m 舡m 触a s ei sa ne n z y m ec a p a b l eo fh y d r o l y z i n gp 一1 ，4 一d m a n n o - p y a n o s y l l i n k a g e so fm a n n a n sw i t hm a i np r o d u c tm a n n o - o l i g o s a c c h a r i d e m a n n s n a s eh a s w i d ec o m m e r c i a l a p p l i c a t i o n s i n i n d u s t r yp r o c e s s e s s u c ha sf o o d s t u f f , p h a r m a c e u t i c a l ，f e e d , p a p e ra n dp u l p ，a n do i li n d u s t r y p m a n n a n a s ep r o d u c i n g b a c t e r i a ls t r a i nm - 2 1w a si s o l a t e df r o mt h es o i l s a m p l e s a r e ri d e n t i f i c 撕o no f t h es t r a i n , t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e da n dt h ep u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n so ft h ep - m a n n a n a s ew e r e s t u d i e d t h eb m 锄m l a w a sa l s oa p p l i e dt oh y d r o l y z es e v e r a lm 舡i 啪g u m s y i e l d i n gm a n n o - o l i g o s a c c h a r i d e s 1 1 抢r e s u l t ss h o w e dt h a t 1 i ，- m a n n a n a s ep r o d u c i n gs t r a i nm - 2 1w a si s o l a t e df r o mt h es o i ls a m p l e su s i n gt h e m e t h o d so f e n r i c h i n gc u l t u r e , i s o l a t i o na n ds e l e c t i v ep l a t ec u l t u r e ，f i r s ts c r e e n i n g b yd e a rc i r c l e so ns e l e c t i v ep a r e s , a n ds e c o n ds c r e e n i n gb ys h a k i n gc u l t u r e i t w a si d e n t i f i e dp r i m a r i l ya sb a c i l l u ss p 2 t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e di no r d e rt oi m p r o v et h ep r o d u c t i o n o ft h e 髓匕可m e t h eo p t i m a ll i q u i dm e d i u mc o n s i s t e do f4g 几g u a rg t u na s c a r b o ns o u r e 2 ，2 0 班s o y b e a np o w d e ra n d5 班( n i 山) 2 h p 0 4 嬲n i t r o g e ns o u r o 君 a n do t h e ri n o r g a n i cs a l t s ( g & ) ：k z h p 0 4 3 i - 1 2 01 ，m g s 0 4 7 i - 1 2 00 5 ，n a c l0 5 ， c a c h0 1 ，f e s 0 4 7 i - 1 2 00 0 0 1 t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ei n i t i a lp h8 0 ， i n o c u l a t i o nv o l u m e4 m e d i u mv o l u m e5 0m li n2 5 0m lf l a s k , a g i t a t i o ns p e e d 1 8 0r m i r a 胁i n c u b a t i o na t3 2 f o r3 6 h , t h ee l l z y m es h o w e dt h eh i g h e s t a c t i v i t yo f1 4 8 7u m l 3 t h ei j - m a n n a n a s ew a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yb ya c e t o n ep r e c i p i t a t i o na n d q - s e p h a r o s ei o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a m p h y t h ee n z y m ew a ss h o w n t oh a v ea i r e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h t o f3 3 4k d a b y s d sp o l y a e r y l a m i d e g e l e l e e t r o p h o r e s i s 4 t h el l l a x i i n u n le n z y m ea c t i v i t ye x i s t e da t5 5 ( 2a n dt h eo p t i m i z e dp hw a s7 0 i t w a ss t a b l eb e t w e e na p h r a n g eo f 5 0a n d1 1 0 ，b e l o w5 0 c t h em e t a li o n s 勐2 + p b 2 + ，f e 2 + ，c l h fa n da g + i n h i b i t e dp - m a n n a n a s ea c t i v i t ys t r o n g l y , b u tb a c a 2 + , k + m 9 2 + ，n a + a n dm n 2 + a c t i v a t e dt h ee l l z y n l e k i n e t i c so fp - m a n n a n a s e w a se x a n l i n e d t h ek mv a l u e sf o rk o n j a kg u m , l o c u s tb e a ng u ma n dg u a rg u m w e l e3 9 7 ，8 7 9a n d1 7 5 6m e d m l , a n dv m a xw e l e9 0 2 ，1 2 4 4a n d2 0 9 2 l u n o l ( m i n n a t , ) i t so p t i m a ls u b s t r a t ew s sk o n j a kg u m 5 k o n j a kg u m , l o c u s tb e a ng u ma n dg u a rg u mw 雠h y d r o l y z e db yt h ec r u d e 1 3 - m a n n a n a s ef r o mb a c i l l u ss p m - 2 1t oy i e l ds e r i a lm a n n o - o l i g o s a c c h a r i d e sa s t h em a i np r o d u c t si nd i f f e r e n tv e l o c i t ya n dd e g r e e t h eh y d r o l y s a t e1 ) l 榔 s e p a r a t e db ye t h a n o lg r a d i n gp r e c i p i t a t i o na n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y 仍i o - g e lp - 4e x t r af i n e ) b ym e a n so ft l ca n dm sm e t h o d s , t h ek o n j a k o l i g o s a c c h a r i d e sw e r ei d e n t i f i e d 鹤as e r i e so f d i - t r i a n dt e t r a - s a e c h a r i d e sw i t h l i t t l em o n o s a c c h a r i d e t h i sw o r km i g h tb eh e l p f u lf o rb e t ht h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fp - m a n n a n a s e a n dm 卸脚一o l i g o s a e e h a r i d eh y d r o l y s i sc a t a l y s e db yb - 墙n n 趾a s e k e yw o r d s ：p m a 皿a n a s e b a c u $ )f e r m e n t a t i o n ，m a n n o - o l i g o s a e e h a r i d e w 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 洼! 堑遨直墓丝置要挂型虚盟笪：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名：7 司芎签字日期：碑5 月二日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适 用本授权书) 学位论文作者签名：7 司茅 签字日期：唧年5 月21 3 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字： 签字日期：t ，7 年, e lv 日 电话： 邮编 芽孢杆菌m - 2 18 - 甘露聚糖酶的产生、纯化与性质研究 0 前言 o 1 立题背景和意义 植物半纤维素是继纤维素之后自然界最丰富的多糖类化合物。甘露聚糖是植 物半纤维素的主要成分，也是许多豆科植物胚乳和一些非豆科植物成熟种子的 成分之- ( v i i i 【a x ie ta 1 ，1 9 9 2 ) 。自然界中丰富的甘露聚糖资源，为争甘露聚糖酶 的研究带来广阔的前景。 p - 1 ，4 - d 一甘露聚糖酶 1 3 1 , 4 - d - m a n n a nm a n n a n o h y d r o l a s e ，e c 3 2 1 7 8 ) ，又 简称为p 甘露聚糖酶或b 甘露聚糖酶( b d - m a n n a a a s c ，1 3 - m a n m a a s e ) ，是一 类能够水解含有b 1 ，4 - d 甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖( 包括均一甘露聚糖、 半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等) 的水解内切酶，它属于半纤维素酶类( s c h o m b u g & s a l z m a n n , 1 9 9 1 ) 。广泛存在于动植物和微生物中。 早在上个世纪初，就有分解植物甘露聚糖酶的最初报道，直n s 0 年代以后， 才有许多产b - 甘露聚糖酶的微生物陆续被发现报道，其研究逐渐深入起来，步入 了一个黄金时期( c o u r t i o sc ta 1 ，1 9 5 8 ) 。微生物1 3 甘露聚糖酶研究工作包括产酶菌 株的选育、发酵条件的优化、酶的纯化和理化性质、酶水解作用机理、酶的基 因表达和克隆等方面。 在b 甘露聚糖酶基础研究取得重要成果的同时，其应用研究也进入一个新 高潮。现在b 甘露聚糖酶已在食品、医药、造纸、纺织、饲料、石油开采及生 物技术研究等多方面得到广泛应用( 吴襟& 何秉旺，1 9 9 9 ) 。如在造纸工业中，p 甘露聚糖酶和木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，处理纸浆，能明显改善 纸质，降低氯漂和碱提取带来的环境污染；肛甘露聚糖酶是油井石油压裂液的优 质生物破胶剂；而对资源丰富的生物质，可转化为具有重要商业价值的甘露寡 糖，具有极大的应用潜力，是一种新型的工业酶制剂。 魔芋胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶等是自然界中含甘露聚糖较丰富的可食性植 物胶，作为半纤维素食品这些植物胶已有悠久的历史。近年来，许多文献已报 道由微生物产生的p 一甘露聚糖酶能将植物胶中甘露聚糖主链的p 1 ，4 糖苷键水 解成由2 1 0 个单糖分子构成的甘露低聚糖( o d ac ta 1 ，1 9 9 3 ；a k i n oe ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 甘露低聚糖可有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道有益菌群的特异性增 殖，并具有抑制体内病原菌生长、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝 脏、抗肿瘤及增强机体免疫力等多种生理功能。此外，甘露低聚糖还具有不被 人体降解、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度等特点，是新一代功能性食 品。 随着对自然界半纤维素资源的开发和甘露低聚糖药用价值的发现，争甘露聚 糖酶的研究已经成为生物技术领域的重要课题，对于b - 甘露聚糖酶的研究具有 十分重要的理论意义和现实意义。 本课题的研究内容和目标： ( 1 ) 产酶菌株的筛选和鉴定 以采集的土壤样品为实验材料，经过富集和初筛，采用选择性培养基定向 筛选出产b 甘露聚糖酶的菌株；再经摇瓶复筛和酶活测定，筛选出p 甘露聚糖 酶活性最高的菌株。对该菌株进行初步鉴定。 ( 2 ) 菌株发酵产酶条件的优化 对筛选到的菌株进行发酵条件的优化，包括碳氮源，初始p n ，培养温度等 条件的优化，得到该菌株的最佳产酶培养基，使其酶活达到一个较高的水平； 掌握菌株发酵的动力学规律。 ( 3 ) p 甘露聚糖酶的分离纯化和酶学性质研究 运用硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、离子交换层析等常规分离纯化方法对该菌株 所产的b 甘露聚糖酶进行分离纯化，并最终得到s d s - p a g e 所确认的电泳纯纯 酶。对该酶的最适反应温度、温度稳定性、最适p h 值、p h 稳定性、酶反应动 力学进行研究。 ( 4 ) 甘露低聚糖的制各和分析 将8 甘露聚糖酶作用于三种不同的甘露聚糖底物( 魔芋胶、刺槐豆胶、瓜 尔豆胶) ，制备其相应的甘露寡糖。通过乙醇沉淀和凝胶过滤层析对寡糖进行分 离纯化，重点对魔芋葡甘露寡糖进行薄层色谱和质谱分析，研究了寡糖的组成。 0 2b 一甘露聚糖酶的研究进展 0 2 1d 一甘露聚糖酶的来源及其性质 2 芽孢杆菌m - 2 1b - 甘露聚糖酶的产生、纯化与性质研究 b 一甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物、植物、微生物中都有发现。其 中来源于微生物的b 甘露聚糖酶最多，并且大多数微生物中的p - 甘露聚糖酶已 被提纯鉴定，有部分p 甘露聚糖酶己经用于生产。不同来源的b 一甘露聚糖酶其 结构和性质有很多的不同，也使得它们在应用上有着不同的领域。 0 2 1 1 动物来源的b - 甘露聚糖酶 动物b 甘露聚糖酶主要来源于一些低等动物，如海洋软体动物紫贻贝 ( m y t i l u se d u l i s ) ，m u ds n a i l ( p o m a c e ai n s u l a r u s ) ，亮大蜗t l ：( h e l i xl u e o r u m ) ，短 滨螺( l i t t o r i n ab r e v i c u l a ) ，p a c i f i ca b a l o n e ( h a l i o t i sd i s c u sh a n n a o ( o o t s u k ae ta 1 ， 2 0 0 6 ) 等，主要是从其肠道分泌液物中分离纯化的，其主要性质见表o 1 。 表0 1 部分动物来源的b 甘露聚糖酶的性质 t a b o 1p r o p e r t i e so f b - i n a n n a n a s ep r o d u c e db ys o m ea n i m a l s 注：m 2 表示甘露二糖、m 3 表示甘露三糖 o 2 1 2 植物来源的b 甘露聚糖酶 植物p 甘露聚糖酶主要存在于植物的储藏器官( 如魔芋球茎) 和种子中( 南欧 紫荆、番茄、莴苣等) ，与种子的萌发密切相关( b e w l e y , 1 9 9 7 ) 。其主要性质见表 o 2 。 植物细胞产生的b 甘露聚糖酶分子量大小约为3 5 k d a - - 4 5 k d a ，最适反应温 度和耐热性比细菌和真菌低，最适反应p h4 p 5 5 ，略显酸性，这些特点是由植 物生长环境和生理条件决定的。不同的植物、植物器官的不同时期产生的b 甘 露聚糖酶的性质和量都可能不同( n o n o g a k ic ta 1 ，1 9 9 6 ；s a m o n t e e ta 1 ，1 9 8 9 ； k o n t o se ta 1 1 9 9 5 ) 。n o n o g a l d 等( 1 9 9 6 ) 报道，西红柿的种子萌发前后，期间共有 m 。m b 、m 1 、m 2 、m 3 等多种形式，在植物中的作用也是不相同的：m d 主要是 降解胚乳细胞壁，而萌发后产生的m 1 、m 2 、m 3 则是对储存的半乳甘露糖的降 解，促使物质的流动。b c w l e y 等( 2 0 0 0 ) 发现b 甘露聚糖酶在曼陀罗种子萌发 过程中与光敏色素有关。d r i k 等( 1 9 9 5 ) 用等电聚焦活性染色方法发现1 9 种植 物的种子均存在b 甘露聚糖酶同工酶，推测它们是种子成熟的一种形式。 表0 2 部分植物来源的6 一甘露聚糖酶的性质 t a b 0 2 p r o p e r t i e so f b - 玎珊l a n 嬲ep r o d u c e db ys o m ef l a n t s 0 2 1 3 微生物来源的b _ 甘露聚糖酶 微生物是产生b 甘露聚糖酶的主要来源，已报道的如细菌中的芽孢杆菌、 假单胞菌、弧菌，真菌的曲霉、木霉、酵母、青霉、多孔菌、核盘菌和放线菌 的链霉菌都是产p 甘露聚糖酶的常见类群。表o 3 列出了产p 甘露聚糖酶的微生 物种类。 不同微生物产生的b 甘露聚糖酶的组分数、相对分子质量、等电点、酶动 力学特性、底物专一性等都有一定的差异。酶相对分子质量小的只有2 2k d a ( e m i e la 1 ，1 9 7 2 ) ，大的可达到1 6 2k d a ( t a l b o t & s y g u s c h , 1 9 9 0 ) ，相差十分悬殊。细菌 中，研究最为详细的要数芽孢杆菌( 表o 4 ) ，其产生的p 甘露聚糖酶分子量一般 为3 0k d a 5 5k d a ，等电点0 i ) 2 5 巧5 ，最适反应温度5 0 _ 1 u - 7 0 c ，一般都有较强 的耐热性。最适反应p h 除嗜碱芽孢杆菌高至9 0 , - , 1 0 0 外，多为5 0 。真菌 来源的b 一甘露聚糖酶分子量约为4 5k d a 5 5k d a ，等电点4 o 5 0 ，最适反应 p h 4 5 5 5 ，最适反应温度5 5 - 7 5 c ，相对细菌来源，真菌来源的b 一甘露聚糖酶 4 芽孢杆菌m - 2 11 3 - 甘露聚糖酶的产生、纯化与性质研究 p h 稳定范围、最适反应p h 都偏低，耐热性也比芽孢杆菌差。 表o 3 产b - 甘露聚糖酶的微生物种类 t a b 0 3s o m em i c r o o r g a n i s m sp r o d u c i n gb m 卸m 埔n a s e 微生物名参考文献微生物名参考文献 嗜碱芽孢杆菌 a k i l l 0c ta 1 ，1 9 8 8 ；杨清香 地衣芽孢杆菌杨文博等，1 9 9 5 b a c i l l u sa l k a l o p h i l i c等，1 9 9 9 ；田新玉等，1 9 9 3b a c i l l u al i e h e n i f o r m i s 枯草芽孢杆菌 崔福绵等，1 9 9 9 ；余红英 解淀粉芽孢杆菌熊邰& 干信， b a c i l l u s8 u b a l i s 等，2 0 0 3 ：j i a n ge ta 1 ， b a c i l l u s 2 0 0 4 2 0 0 6 ；m e n d o z ae ta 1 ，1 9 9 4 a m y l o l i q u e f a c i e n s 短小芽孢杆菌 a r a u j o & w a r d ，1 9 9 0 多粘芽孢杆菌 a r a u j o & w a r d ， b a c i l l u s p r a n i l u sb a c i l l u s p o l y m y x a 1 9 9 0 嗜热脂肪芽孢杆菌t a l b o t & s y g u s c b , 1 9 9 0 环状芽孢杆菌杨新建等，2 0 0 6 b a c i l l u se r e a r o t h e r m o p h i l u sb a c i l l u sc i r e u l a n s 卵形拟杆菌 g h e r a r d i n i产气杆菌a 础，1 9 8 3 b a c t e o i d e so p a t t 口 & s a l y e r s ，1 9 8 7 a e r o m o n as p f - 2 5 纤维单胞菌属d o m i n i k e ta 1 ，1 9 9 9弧菌t a m a r ue c e l l u l o m o n a s f i m i h b r i o a 1 ，1 9 9 5 诺卡氏菌形放线菌吴襟& 何秉旺，2 0 0 0链霉菌t a k a h a s h i e t n o c a r d i o f o r ma c t i n o r a y e e t e s s t r e p t o m y c e sa 1 ，1 9 8 4 齐整小核菌 s a c h s l e l m e re ta 1 ，1 9 9 8 ； 酵母菌k r m n i c k ye t s e l e r o t w nm 蜘n g n b i t ze ta 1 ，1 9 9 6 y e a s t a 1 ，1 9 9 6 雪白根霉h a s h i m o t o 木霉 王和平等，2 0 0 3 ； r h z o p u si v d a n s f u k u m o t o ，1 9 6 9 t r i c h o d e r m ar e e s e i & a m f d e t a t 1 9 9 5 青霉p a r k e t a l ，1 9 8 7黑曲霉 李剑芳等，2 0 0 2 ： p e n i c i l l i n m p u r p u r o g e n u m a s p e r g i l l u sn i g e r l i n & c h e r t , 2 0 0 4 溜曲霉c i v a se ta 1 ，1 9 8 4 a s p e r g i l l u st a m a r i i 前言 表0 4 芽孢杆菌产生的b - 甘露聚糖酶性质 t a b 0 4p r o p e r t i e so f p r l l a l 揪p r o d u c e db yb a c i l l u ss p 嗜碱芽孢杆菌 n 1 6 5 嗜碱芽孢杆菌 a h 【0 0 l 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 n m 3 9 枯草芽孢杆菌 嗍 枯草芽孢杆菌 w y 3 4 地衣芽孢杆菌 n k 2 7 环状芽孢杆菌 w x y1 0 0 芽孢杆菌 k k o l 嗜热脂肪 芽孢杆菌 短小芽孢 杆菌a b 3 4 ，弘5 l9 p l o o7 08 - 1 08 0 ( 失活)2 5 4 3 4 2 5 88 o6 0 2 26印 3 85” 3 7 5 0 - 6 0 6 o醪 2 69卯 5 06 0 z o 曲o( 失活)5 1 5 9 5 9 - - - 9 o8 0 ( 失活)5 2 a g + 、 矿， 蛐p 逋 4 9 - 9 0 5 54 8 a g + 、h 矿、 舻 5 o - 8 0 5 0 5 1 。5 o 5 5 5 5 - - 1 0 1 6 0 a g + 、m r 、 m u 2 6 o 母0 4 0 5 矿，矿、矿， t 甚矿 4-860 c p 、c 0 ” 7 15 0 - 6 05 5 7 0 1 的菌株共1 2 株。 在初筛过程中设计了选择性培养基，采用主要成分为甘露聚糖的植物胶 ( k g m 、l b g 、g g ) 作单一碳源，无机盐作氮源，淘汰了绝大部分不能产生争甘 露聚糖酶的菌的生长，使工作量大量减少。选择性平板上脱比值的大小，与酶 活力的高低有着正相关性，是一种快速简便的筛选方法。 通过实验发现初筛平板中，魔芋胶可被刚果红水溶液染成红色，刺槐豆胶、 瓜尔豆胶能被碘液染成深褐色，当被降解后颜色变浅，故在菌落周围形成大小不 一的黄色水解圈。根据水解圈的直径大小可以很直观地比较和挑选菌株。 图1 2 平板透明圈法初筛b _ 甘露聚糖酶产生菌 f i g 1 2 p r a n a r ys c r e e n i n g f o rs t m i m w i t h p m a n i l a n a a c t i v i t y u s i n gc l e a t i n g z o l l e $ m e t h o d 1 4 2 2 产酶菌株的复筛 将初筛得到的产酶菌株接种于三种不同甘露聚糖的培养基，进行发酵产酶实 验。复筛酶活力测定时，为确定该酶的最适作用底物，取适量酶液分别作用于魔 芋胶、刺槐豆胶和瓜尔豆胶三种底物，其中酶活最高的5 株菌的实验结果见图1 3 。 初筛获得的这些产酶活力较高的菌株，均可降解这三种甘露聚糖，但都表现 出对魔芋胶的降解活力最高，这可能与不同植物胶中甘露糖主链与葡萄糖或半乳 糖支链中糖的分子比例不同有关，支链越多越不易被降解。魔芋胶中每间隔5 9 个甘露糖分布1 个弘1 ，6 糖苷键的葡萄糖支链；刺槐豆胶化学结构与瓜尔豆胶一 样，是以甘露糖为主链的半乳甘露聚糖，但连结的半乳糖支链数相对比瓜尔豆胶 少，甘露糖与半乳糖的比例为4 ：1 。瓜尔豆胶中每间隔1 个甘露糖分布1 个a 1 ，6 糖 2 l b - 甘露聚糖酶产生菌m - 2 1 的筛选和鉴定 苷键a - 1 ，6 糖苷键的半乳糖支链，支链较多不易被降解，以甘露糖计的还原糖含量 偏低e n n eda l ，1 9 9 5 ：m e c l e a r y ，1 9 8 3 ：杨文博等，1 9 9 5 ) 。 m l 瑚聃 菌株号 r 魔芋胶医刺槐豆胶口瓜尔豆胶 图1 3 复筛菌株对三种底物的酶活力 f i g 1 ，3p - m a n m a a s e 枷v 时舢h d a r y s c r e e n e ds t r a i n st o w a r d st h r e es l l b s 眦e s 根据复筛结果，菌株m 2 1 产酶时间短，产酶稳定，酶活性最高，因此将其 作为试验研究菌株。 1 4 3 菌株的初步鉴定 菌株m 2 1 初步鉴定结果如下，形态为( o 踮1 o x l 跳2 ) 岬的杆状，具运动性， 革兰氏染色阳性。芽孢中生，椭圆，孢囊膨大。m - 2 1 在肉汤平板培养基上培养 2 4h ，形成的菌落为圆形，边缘不规则，中间有突起，表面湿润，白色。好氧， 发酵产酸。其特征与芽孢杆菌属的典型特征一致，暂命名为b a c i l l u ss p m - 2 1 ， 菌株的鉴定工作有待进一步深入。 1 5 小结 本章报道了b - 甘露聚糖酶产生菌的选育的方法及过程。主要根据产p 一甘露 聚糖酶的菌株的特性，利用选择性培养基定向培养，获得产酶活性相对较高，产 酶时间短，产酶稳定性好的菌株，作为后续实验的目的菌；主要结果显示编号为 m 2 1 的菌株为最优，并进行了菌株的常规鉴定，确定了菌株为b a c i l l u ss p m - 2 1 。 m 娜 瑚 瑚 m 钟 o riilv罩v彝鞋 芽孢杆菌m - 2 1 雎甘露聚糖酶的产生、纯化与性质研究 2 芽孢杆菌m - 2 l 产p 甘露聚糖酶发酵条件的研究 2 1 引言 菌体的生长和其代谢产物( 包括酶) 的形成受到各种条件的影响，这些条件包 括培养基成分、配比、粘度以及各种环境因素，如培养温度、培养时间、装液量、 接种量等。提高酶产量的最直接的办法就是对培养基以及培养条件进行优化。 本章通过对培养基和培养条件的优化，以酶活为参考指标，经摇瓶发酵，得 到菌株b a c i l l u ss p m - 2 1 产p 甘露聚糖酶的最佳条件。考查了氮源、碳源、无机 盐、培养基初始p h 等对产酶的影响，结合正交实验确定最适产酶培养基的组成。 同时考查培养温度、装液量、接种量对产酶的影响，确定最适产酶的培养条件。 在最适培养条件下，利用最适产酶培养基发酵产酶，测定菌体的生长与产酶曲线， 确定菌株b a c i l l u ss p m 2 1 产酶的高峰期。 2 2 实验材料 2 2 1 主要试剂 魔芋胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、豆粉、玉米粉( 市售) 。 葡萄糖、半乳糖、甘露糖、n - h l 4 c 1 、k 2 h p 0 4 3 1 - 1 2 0 、m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 、n a c i 、 c a 0 2 、f e s 0 4 7 h 2 0 、尿素、淀粉等( 均为国产分析纯) 。 2 2 2 主要仪器 d r p - 9 0 5 2 型电热恒温培养箱上海森信实验仪器公司 h z q q 空气浴振荡器哈尔滨东联电子技术开发有限公司 l d z x - 4 0 型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂 d h g - 9 0 7 0 a 型电热恒温鼓风干燥器上海精宏实验设备有限公司 o h a u sa d e v e n t t t r e r 天平奥豪斯公司 温度控制仪北京长安科学仪器厂 p h s 3 c 精度p h 计上海雷磁仪器厂 7 2 2s 型分光光度计上海精密科学仪器有限公司 芽孢杆菌m - 2 1 产争甘露聚糖酶发酵条件的研究 2 2 3 菌种和培养基 2 2 3 1 菌种 经过第一章的筛选获得的芽孢杆菌m - 2 1 。 2 2 3 2 产酶基础培养基( g l ，( w ，- v ) ) 瓜尔豆胶3 ，n 1 4 c l1 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 0l ，m g s 0 4 7 1 4 2 00 5 ，n a c l0 5 ，c a c l 2 o 1 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 1 ，p h7 2 。 2 3 实验方法 2 3 1 摇瓶培养条件 接一环菌b a c i l l u s s p m - 2 1 到装有7 5 m l 液体培养基的2 5 0 m l 三角瓶中，3 0 条件下振荡培养1 6 也0h 作为种子，按5 ( v v ) 的量接入到7 5m l 液体培养基中， 3 0 、1 8 0r r a i n 振荡培养3 6h 。发酵液3 0 0 0r m i n 离, o 0 m i n ，取上清测定6 - 甘露 聚糖酶活力。 2 3 2 发酵产酶培养基的优化 2 3 2 1 碳源对产酶的影响 改变产酶基础培养基的碳源种类，分别以6 种碳源：葡萄糖、半乳糖、淀粉、 魔芋胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶为唯一碳源的培养基进行发酵产酶，测定酶活力， 考查碳源对产酶的影响。 最佳碳源确定后，改变其浓度，考查碳源浓度对产酶的影响。 2 3 2 ，2 氮源对产酶的影响 用不同的有机氮源或无机氮源作为唯一氮源，测定酶活力，考查氮源对产酶 的影响。有机氮源包括6 种：酵母膏、蛋白胨、豆粉、牛肉膏、玉米粉、尿素； 无机氮源包括7 种：n 扒0 3 、( n h 4 h s 0 4 、唧4 ) 3 p 0 4 、( n i - h ) 2 h p 0 4 、n h 4 h 2 p 0 4 、 l 斟0 3 、n h 4 c 1 。 2 3 2 3 主要营养源产酶的正交实验 选取碳源( 瓜尔豆胶) 、有机氮源( 豆粉) 、无机氮源( ( n h 4 h h p 0 4 ) 作3 因素3 水平的正交实验。 2 4 芽孢杆菌m - 2 1b _ 甘露聚糖酶的产生，纯化与性质研究 2 3 3 发酵产酶培养条件的优化 上述优化培养基碳氮源组成条件下，同时研究培养温度、初始p h 、装液量、 接种量四个条件对发酵产酶的影响；考查其中某一单项条件时，其余的培养条件 固定为( 初始p h 值7 2 、装液量7 5 2 5 0m l 、培养温度3 0 c ，接种量4 呦四者中 的另外三个。 2 3 3 1 培养温度对产酶的影响 采用不同温度下( 2 4 3 6 ) 发酵培养菌株，其它条件相同。测定酶活力，考 查培养温度对产酶的影响。 2 3 3 2 培养基初始p h 对产酶的影响 配制不同p h ( 5 8 0 ) 的培养基发酵产酶，考查培养基初始p h 对产酶的影响。 2 3 3 3 装液量对产酶的影响 调整2 5 0m l 三角瓶装液量( 5 0 1 2 5 m l ) ，考查不同装液量对产酶的影响。 2 3 3 4 接种量对产酶的影响 发酵培养基按不同的接种量( 和1 0 ，v v ) 接种，考查不同接种量对产酶的影 响。 2 3 4 生长曲线和产酶曲线的测定 将菌种b a c i l l u ss p m - 2 1 接入最适产酶培养基中，在上述最佳条件下培养， 每铀取样，测定生物量和b - 甘露聚糖酶活力。 2 3 5 菌体生物量的测定 发酵液经0 8 5 n a c l 溶液适当稀释后，使用7 2 2 s 分光光度计测6 0 0n l l l 处的 光吸收值。 2 3 6 酶活力测定方法( d n s 法) 芽孢杆菌m - 2 1 产 甘露聚糖酶发酵条件的研究 2 4 结果与讨论 2 4 1 产酶最适培养基的研究 2 4 1 1 不同碳源对菌株m - 2 1 产酶的影响 碳源主要是用来供给菌体生命活动所需要的能量和构成茵体细胞以及代谢 产品的物质基础，是产酶培养基的重要成分之一。能作为碳源的物质很多，本实 验选用魔芋胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、葡萄糖、半乳糖、淀粉等，目的是考查菌 株对各种碳源的利用和产酶情况，以及甘露聚糖对1 3 - 甘露聚糖酶的诱导性等。实 验结果见表2 1 表2 1 不同碳源对m - 2 1 产酶的影响 t a b 2 1e f f e c t so f c a r b o n $ o u l v 七$ o nt h ep r o d u c t i o no f f l m a n n a a a s e 碳源 浓度( g l ) 酶活( u m l ) 葡萄糖 5 o 半乳糖 5o 淀粉 52 3 魔芋胶 56 0 刺槐豆胶 54 3 瓜尔豆胶 32 8 4 52 4 7 1 01 9 0 从表2 1 中可看出，以3g l 的瓜尔豆胶为碳源时，b - 甘露聚糖酶活力最高， 魔芋胶、刺槐豆胶次之，而以葡萄糖、半乳糖为碳源时不产生d - 甘露聚糖酶，可 见该酶为诱导酶，只有在培养基中含有外源诱导物( p 甘露聚糖) 时才进行p - 甘露 聚糖酶的合成( 杨文博等，1 9 9 5 ；崔福绵等，1 9 9 9 ；杨幼慧等，2 0 0 1 ；s a c h s l e h n o r e ta i 。1 9 9 8 ) 。最适碳源为瓜尔豆胶。 尽管据报道( 表0 5 ) 多种菌株的诱导产酶碳源为刺槐豆胶或是魔芋胶。但是本 实验中，菌株m - 2 1 产酶的最适碳源为瓜尔豆胶，而该酶对于瓜尔豆胶的降解能 力却很低( 图1 3 ) 。k a t a o k a n & t o k i w ay ( 1 9 9 8 ) 报道，瓜尔豆胶因其高分支结构 而难以