（材料学专业论文）壳聚糖衍生物水凝胶的合成和性能表征.pdf

摘要 壳聚糖衍生物水凝胶合成和性能表征 摘要 组织工程技术白2 0 世纪8 0 年代飞速发展，尤其是近几年，可以 说是日新且异。壳聚糖由于其非常优良的生物相容性和可降解性，无 刺激性，无免疫原性具有创面愈合功能，在生物材料和组织工程材料 中都有广泛应用，但由于分子内和分子间的氢键作用使它不溶于水， 所以在应用时需对其改性。 本论文首先迈克尔加成合成了一种水溶性可反应型壳聚糖衍生 物一甲基丙烯酰氧基乙基羧乙基壳聚糖，再利用这种衍生物在紫外光 照射的条件下生成两种水凝胶体系，制备了性能优良的骨组织工程凝 胶载体。具体内容如下： 1 紫外光聚合制备甲基丙烯酰氧基乙基羧乙基壳聚糖聚乙 二醇双甲基丙烯酸酯水凝胶，对其进行了聚合动力学、热稳定性、 溶胀动力学、水含量分析、结晶性分析、形貌分析以及细胞毒性 分析等测试。该水凝胶在3 0 m w c m 2 光强的紫外光照射下，1 5 m i n 基本完成聚合，双键转化率约为8 0 。该水凝胶具有p h 响应性， 良好的热稳定性和生物相容性。 2 紫外光聚合制备甲基丙烯酰氧基乙基羧乙基壳聚糖聚乙 二醇双丙烯酸酯n ，n 一二甲基丙烯酰胺互穿网络水凝胶，主要考察 了其聚合动力学、热稳定性、溶胀动力学、形貌分析、机械性能 等性质。该水凝胶在同样的条件下8 分钟内完成聚合，双键转化 i 北京化工大学硕上学位论文 率9 0 以上。该水凝胶具有良好的微观结构、热稳定性、并且改善 了上一体系机械性能差的缺点，适合做骨组织工程支架材料，也 可做药物释放的载体。 关键词：壳聚糖，组织工程，水凝胶，光聚合 s y n t h e s i sa n dp r o p e r t i e so fh y d r o g e l sb a s e d o nw a t e r s o l u b l ec h i t o s a nd e r i v a t i v e a b s t r a c t b o n dt i s s u ee n g i n e e r i n gh a sd e v e l o p e dq u i c k l ys i n c et h em i d d l eo f 2 0c e n t u r y , e s p e c i a l l yi nr e c e n tf e wy e a r s c h i t o s a ni sc u r r e n t l yr e c e i v i n g ag r e a td e a lo fi n t e r e s tf o rb i o m e d i c a la n dt i s s u ee n g i n e e r i n gd u et oi t s b i o c o m p a t i b i l i t y ；b i o d e g r a d a b i l i t y ；a n t i b a c t e r i a l a n d w o u n d h e a l i n g a c t i v i t y h o w e v e r , t h ea p p l i c a t i o no fc h i t o s a ni su s u a l l yl i m i t e df o rl o w s o l u b l ep r o p e r t yw h i c hw a sc a u s e db yi n t r a a n d o ri n t e r m o l e c u l a r h y d r o g e nb o n d i n g i nt h i s p a p e r ，a w a t e rs o l u b l ec h i t o s a nd e r i v a t i v ew h i c hi s ( m e t h a c r y l o y l o x y ) e t h y lc a r b o x y e t h y lc h i t o s a n ( c s e g a m a ) w a s s y n t h e s i z e db ym i c h a e l a d d i t i o na n dt w ok i n d so fg e l sf o rt i s s u e e n g i n e e r i n gw e r ep r e p a r e db yp h o t o p o l y m e r i z a t i o nt e c h n i q u e t h em a i n c o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s 1 p h o t o c r o s s l i n k a b l ec h i t o s a n h y d r o g e l s b a s e do nw a t e r - s o l u b l e c s e g a m aa n dp o l y e t h y l e n eg l y c o ld i a m e t h a c r y l a t e ( p e g d m a ) t h ec h a r a c t e r i z a t i o nw a ss t u d i e db yf t i r ，t g , d s cs e m ，s w e l lt e s t ， i i i 北京化工大学硕十学位论文 x r d ，c y t o t o x i c i t ya n dc e l l u l a rc o m p a t i b i l i t y t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h eh y d r o g e l sw e r es e n s i t i v et op ho ft h em e d i u m ，n oc y t o t o x i c i t y f o rl 9 2 9a n ds w l 3 5 3 ，s a t i s f a c t o r yf o rt h ec o m p o s i t et ob eu s e di n b i o a p p l i c a t i o n s 2 p h o t o c r o s s l i n k a b l ec h i t o s a n h y d r o g e l s b a s e do nc s e g a m a ， p o l y e t h y l e n eg l y c o ld i a c r y l a t e ( p e g d a ) a n d n ，n - d i m e t h y l a c r y l a m i d e ( d a a ) t h ec h a r a c t e r i z a t i o nw a ss t u d i e db y f t i r ，t gd s cs e m ，s w e l lt e s t ，d m a ，c y t o t o x i c i t ya n dc e l l u l a r c o m p a t i b i l i t y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh y d r o g e l sw e r ec r o s s l i n k i n8 m i nw i t h3 0 m w c m 2c o n d i t i o na n d9 0 d o u b l eb o n dc o n v e r s i o n ， g o o dh e a ts t a b i l i t ya n ds t r e n g t h t h eh y d r o g e lc o u l db eu s e da s a t i s s u ee n g i n e e r e ds c a f f o l d sf o rc e l lt r a n s p l a n t k e y w o r d s ：c h i t o s a n ，t i s s u ee n g i n e e r i n g ，h y d r o g e l s ，p h o t o c r o s s l i n k i v 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注n o i 用的内容外，本论文不含任 何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 作者签名：么查! 日期：孳：丝： 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在一年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名： 导师签名： 日期： 霉： ：生一 日期：擎生l 第一章绪论 第一章绪论 1 1 组织工程材料的发展及现状 1 1 1 组织工程材料的定义 组织工程的思想早在2 0 世多7 8 0 年代初就已经有所涉及，是应用生命科学和工 程学的原理与方法，研究用于修复增进或改善人体组织或器官损伤后功能和形态 的一门交叉学科。几十年来器官移植技术和人工器官技术作为解决人体器官功能 丧失或组织严重缺失的有效手段，但由于免疫排斥、供体严重不足不能满足人类 在这方面的需求。【l 】在这样的背景下，兼具工程科学和生物医学科学的由细胞构 筑组织器官原理的组织工程科学迅速崛起，发展成为崭新的医疗技术。 组织工程的基本原理和方法是将体外扩增的自体或异体细胞种植于体外构 建的细胞外基质模拟物中，形成细胞支架复合物。组织工程培养支架材料的典 型方式是将种子细胞( 培养细胞或干细胞) 种植在人工细胞外基质( e c m s ) 组成 结构物，在体外培养扩增，形成新组织后再植入患者体内，与组织整合，使组织 重建。1 2 】 理想的组织工程材料应该具有以下优点：( 1 ) 良好的生物相容性，无毒、不 引起炎症、有利于细胞的粘附和增殖、能激活细胞特异的细胞表达、维持细胞生 长的条件。( 2 ) 良好的生物降解性，支架材料在受损组织修复后能降解，并且降 解速度与细胞再生速度相匹配。( 3 ) 具有三维网状结构。大的孔隙率和比表面积 可以提供宽大的空间，利于细胞粘附生长、细胞外基质沉淀、营养和氧气进入、 代谢产物排出。( 4 ) 适当的机械强度，为新生组织提供支撑。( 5 ) 易于消毒和保 存。目前为止，有两种构型的支架被大量应用，即织态结构型和水凝胶型。水凝 胶型支架的突出特点是可发生溶胶凝胶转变，通过注射的方法把复合有种子细 胞的聚合物溶液注射到所需部位，生成水凝胶，从而将细胞包埋并促使其生长分 化，避免了创伤性外科手术，但缺点是机械强度小、形状保持能力差。 北京化1 = 硕 ：学位论文 1 1 2 组织工程研究内容 由组织工程的基本原理和方法可知，组织工程组织或器官的构建涉及三方面 内容：种子细胞、支架材料、细胞、支架复合物构建组织工程化组织或器官。 种子细胞是组织工程的前提与基础，再生组织或器官的结构与功能的实现最 终取决于支架中种子细胞的增殖与细胞外基质的分泌。按照来源，种子细胞可分 为原代细胞和细胞系细胞。从免疫学的角度，自体细胞是最理想的种子细胞，但 因其数量限制，纯化和扩增都需要一定的时间。干细胞作为组织工程种子细胞的 研究得到了快速发展，对未来的组织器官修复和替代具有极其重要的作用和深远 的影响。另外，组织工程对种子细胞种植数量往往需求较高，如何在短时间内 获得足够数量的细胞是是决定组织工程发展的关键因素。 从材料学的角度看，生物体的组织或器官可被认为是由一定细胞及其分泌的 细胞外基质( e c m ) 所组合成的复合材料。人工构建的细胞外基质组织工程支 架在构建组织工程化组织或器官的主要作用包括：为细胞的粘附提供物理支撑， 并将细胞准确投递到受损部位；为细胞增殖、代谢提供空间；提供特定的宏观与 微观结构，引导细胞构建特定功能的组织或器官；传递化学或力学信号，调控细 胞表形。具有天然降解性能的天然或合成高分子材料是组织工程支架的首选材 料。 组织工程化组织或器官构建的主要内容包括：实现种子细胞与支架材料间有 效的复合，细胞、支架复合物体外培养条件的控制等。目前，种子细胞与支架材 料的复合方法主要包括：浸渍法、沉淀法、吸附法、注射法。细胞支架在体外 的培养方法不同，对最终构建的组织工程化组织或器官的结构和功能都将产生巨 大的影响。 近年来组织工程支架制备研究中出现了一些新的热点：一是不同材料间的复 合，以模拟细胞外基质的结构。天然的组织和器官均不是由单一的化学物质组成。 有机材料无机材料、天然材料合成材料、天然材料天然材料的相互复合，以及 对复合物微观结构的控制，是组织工程材料的一个发展趋势。二是生长因子的引 入。在人工合成的高分子和大部分天然高分子中，缺乏这些生长因子。将这些生 长因子负载到组织工程支架上，或将表达生长因子的基因片段负载到支架上进行 基因治疗将是非常有意义的工作。三是物理结构的仿生化。从纳米尺度上对支架 进行设计和加工是组织工程支架的一个重要内容。在“硬支架”发展的同时，可注 射支架，也就是“软支架”，由于其体内的培养环境以及微创伤性而备受关注。 与“硬支架”相比，可注射水凝胶支架能够为细胞的分裂与分化提供更接近于 天然细胞外基质的化学与物理环境。材料通过注射在缺损部位原位生成具有一定 2 第一章绪论 机械强度、一定形状并且可以与体液进行交换的支架，细胞在支架中生长并最终 形成组织。由于是原位生长，与正常组织相同的生理环境与有利于植入细胞的分 化和功能表达，并且液体的流动性和原位成形性可以满足不同创伤的复杂形状。 注射型支架的研究在临床应用中降低了手术难度，减少了手术创伤，目前主要应 用于骨组织和软骨组织的再生修复治疗。 组织工程支架的最终目的是用于临床治疗，因此有必要在设计制备中考虑到 材料的机械性能是否有利于手术操作、材料是否利于消毒、支架是否可以实现大 规模生产使用、操作过程是否相对简单等。这些因素在实验中往往被忽视，而在 临床使用中却非常重要，它决定了支架材料的价值和有效性，是组织工程材料研 究的根本目的。 1 2 水凝胶概述 1 2 1 水凝胶的定义及分类 凝胶可以定义为不溶于任何溶剂的三维网状结构的高分子及其溶胀体，当具 有三维网状结构的高分子与溶剂相互作用时发生溶胀，但由于具有交联结构使其 溶胀行为受到限制。【3 】溶胀凝胶一般呈现出固体和液体之间的中间物质状态，随 着化学组成以及其他各种因素的改变，凝胶形态可以再粘性液体和较硬固体之间 变化。凝胶化可定义为可溶的高分子溶胶转变为不溶的凝胶现象。 水凝胶按来源可分为天然水凝胶和人工合成水凝胶。【4 】 天然水凝胶材料包括胶原、海藻酸盐、壳聚糖、纤维蛋白、琼脂糖、透明质 酸等。【5 】天然水凝胶广泛存在于人体的组织和器官中。 天然胶原蛋白是生物机体结缔组织的主要成分，骨组织的主要细胞外基质成 分，可促进新骨的形成。胶原是人体中含量最丰富的种结构蛋白，约占机体总 蛋白含量的2 5 。目前已发现的胶原不下1 9 种【6 】，常用作组织工程材料的主要是i 型、i i 型和i i i 型胶原。 海藻酸盐在交联剂作用下，通过氨基和羧基的脱水缩合反应得到稳定的共 价交联水凝胶，也可在钙离子存在下交联，形成开放的网状藻酸钙离子水凝胶， 为细胞生长提供三维空间，且具有良好的亲水性和塑形能力。 壳聚糖为甲壳素n 脱乙酰基所得的产物，在天然高分子中的含量仅次于纤维 素，因其良好的生物相容性，已用作组织工程软骨支架材料。 纤维蛋白在人体中是血液的组成成分之一，由于凝血酶的作用，酶聚合反应 北京化t 硕十学位论文 得到纤维蛋白凝胶，能进一步促进细胞增殖、赫附和基质分泌，为细胞的生存提 供三维空间支持，成为聚合生物支架材料。透明质酸是细胞外基质之一，是由g a g 组成的一种多糖。 透明质酸是一种高度保守的不分支阴离子多糖类物质，广泛存在于细胞外基 质中，尤其在结缔组织中含量丰富，是氨基葡萄糖的一种，具有高度的水化性能， 在维持组织内部水分平衡及稳定软骨基质等方面具有重要作用。目前，透明质酸 在药物佐剂、骨固定物及皮肤覆盖物等方面已有应用，但由于透明质酸力学强度 不够，无法单独应用于组织工程支架的构建，大多数情况需要与其他种类的支架 复合使用。 天然水凝胶大多具有良好的生物性能、无毒、细胞亲和性好。但天然水凝胶 材料的降解速度一般都较快，机械性能也无法满足组织工程的需要，与不同生物 个体的材料组成和性能有较大的差别，天然生物材料的质量也难以实现标准化和 稳定化。 人工合成水凝胶是由聚乙烯醇、聚氧乙烯及其衍生物、聚丙烯酸、聚丙烯酸 盐、聚丙烯酰胺及其衍生物、多肽等通过物理交联或化学交联聚合形成的凝胶【4 5 1 。丙烯酸、甲基丙烯酸及衍生物以及一些丙烯酸酯，如甲基丙烯酸丁酯、甲基 丙烯酸丙二醇酯等单体同时含有乙烯基和羧基等官能团，赋予该分子进行聚合、 交联、修饰改型等的结构基础。乙烯基的存在使该类单体具有进行自由基聚合反 应的结构基础，而由于羧基的可电离性，溶液中电解质浓度、酸碱度的变化，会 改变高分子链在溶液中的伸展和蜷曲程度，从而造成不同分子量或聚合度的聚丙 烯酸类化合物的亲水性、强度、附着力等性能差别很大。丙烯酸及其衍生物单体 非常易于和其它单体共聚。聚丙烯酸类高分子互相交联，构成三维网络结构后， 既可吸收大量水分，作为超吸水材料，又具有刺激响应性的特点。水凝胶有很好 的通透性，能够允许诸如氧气、营养物质以及其它的水溶性代谢物的扩散运输， 这一点对于维持细胞活性至关重要。 水是自然界最广泛大量存在的物质，人体中含有7 0 8 0 的水，眼球、血管 等软组织实际上都可看作是水凝胶体，它们在低应力下容易变形但其断裂强度却 相当高。很多年前人们就开始期待可以人工合成具有这种特性的水凝胶，兼具高 含水量和高强度。已经产业化应用水凝胶材料的领域有：食品加工和保存、农林 用保水剂、妇女儿童的卫生用品、工业用的分离浓缩材料、除水剂、建筑业用的 防漏密闭材料以及医疗方面的各种用途。 4 第一章绪论 1 2 2 水凝胶的在医学领域应用 由于水凝胶具有的良好的生物相容性、亲水性、可生物降解，柔软类似生物 体组织等性质，并且生物稳定性高，不易长菌，不会在离子作用下严重收缩【3 1 ， 目前水凝胶在医学领域已经被广泛使用。 1 2 2 1 用于人工皮肤i 7 】 皮肤是相对软组织，覆盖了人体的整个体表，重量达到人体总重的8 ，是 一种再生能力很强的组织，是维持人体环境平衡、阻止有害微生物入侵的重要保 障，由表皮和真皮两部分组成。人造皮肤的主要作用有三：一是防止水分与体液 从创面的蒸发与流失；二是防止感染；三是使肉芽或上皮能逐渐生长，促进愈合。 好的人工皮肤应具有于皮肤接近的柔软性，保证一定的形态和强度，良好的吸水 性、透气性，可提供有利于创面愈合的环境，不会造成人造皮肤与创面间的积液， 对人体不发生有害的反应和刺激。传统的人工皮肤主要用动物尸体皮或羊膜。水 凝胶做人工皮肤是新近开发的，具有良好的发展前景。人工皮肤使用的生物材料 除了胶原外就是壳聚糖或甲壳素。壳聚糖凝胶做的人工皮肤柔软舒适，与创面的 结合性好，既透气又吸水，具有抑制疼痛和止血的功能，有益菌消炎作用，随着 伤口愈合能自行降解而被机体吸收，还会促进皮肤再生。 s 1 1 9 8 8 年以来，人们开 始研制以壳聚糖为主的人工皮肤。甲壳质具有动物骨胶原组织和植物纤维组织的 双重特性，对动植物细胞均具有良好的适应性。【9 l s p a r k e s t l o 】等用壳聚糖、明胶制成一种人工皮肤，能有效抑制伤口收缩，防 止产生硬伤疤，形状可控，对于大面积烧伤很有效果。这是壳聚糖水凝胶做人工 皮肤较早的研究。 顾华【l l 】等在胶原海绵支架两侧接种人角质形成细胞和成纤维细胞培养出厚 约2 - - - 3 m m 人工皮肤，构建以牛l 型胶原为细胞外基质的具有表皮层及真皮层的人 工全层皮肤。这种构建出的人工皮肤具有类似于人类皮肤的表皮层和真皮层，其 韧性较好，不易破裂。 1 2 2 2 药物控释 可用作药物控释的载体有很多种，比如颗粒剂、片剂、缓释膜、缓释凝胶、 微胶囊纳米粒等。在医药领域，大多数高分子凝胶是被当作药物的载体使用，可 以更有效的发挥药物的治疗效果。药物控释是一种控制药物释放速度和靶向释放 的技术，防止药物在摄入体内短时间浓度升高又下降的现象，往往达不到持续的 疗效。缓释技术主要是利用物理包埋固定化技术，将酶、药物等与聚合物单体的 水溶液在室温下进行交联或聚合，药物在自身扩散和水凝胶降解的双重作用下， 可以长期的缓慢的以所需要的速率释放出来，大大提高了药物的利用率。【4 】药物 北京化工硕上学位论文 控释有几种情况：当凝胶中的浓度梯度为一定值，药物的释放速度不随时间发生 变化，而保持一定，这样的制剂方法经常被用在经皮给药制剂，是一种能以一定 速率释放药物的缓释制剂：凝胶中的药物浓度梯度发生变化，由f i c k 缓释定律可 知，这样的释放过程是很复杂的，分散在凝胶载体的药物不以一定值释放，这种 制剂可以用在那些要求药物初期释放速率高的体系。随着基因工程、移植研究的 发展，药物控释体系将更加复杂化和敏感化，水凝胶在药物缓释方面的应用将成 为国内外研究的焦点。 目前常用的甲壳素或壳聚糖缓释凝胶，在运送药物上能发挥以下几方面特殊 作用：稳定或保护药物中的成分；促进药物的吸收；延缓或控制药物释放； 帮助药物送达目的器官。影响释放的因素主要有以下几点：药物的含量、交联 度、壳聚糖分子量、壳聚糖的脱乙酰度、凝胶厚度、释放环境的p h 值、溶菌酶 或生长因子的作用。 徐甲坤【1 2 】等研究羧甲基壳聚糖水凝胶对阿司匹林的吸附性能及其在药物控 释系统中的应用。以羧甲基壳聚糖作为骨架材料，采用戊二醛交联法制备阿司匹 林载药凝胶。测定凝胶在人工肠液中的溶胀动力学特点，观察到在p h = 7 4 的人 工肠液中达最大溶胀度1 3 8 。凝胶在人工肠液中9 6 h 的累积释放度为9 9 9 1 ， 具有优良的缓释性能，体外释放模型符合一级动力学方程。 z h o u 1 3 】等用n 羧乙基化壳聚糖与聚甲基丙稀酸羟乙酯进行紫外光聚合制备 半互穿网络水凝胶，并研究了其作为药物载体的释放性能和生物性能。5 氟脲嘧 啶( 5 - f u ) 作为试验的模型药物，干凝胶浸泡在0 0 2 9 m l5 氟脲嘧啶的缓冲溶液 中2 天，然后将瓶移至冷冻回转震荡箱中进行药物释放测试，计算药物累计释放 量及累计释放百分比。药物释放初期出现了“暴释”现象，暗示着聚合物链具有一 定程度的刚性。该水凝胶对药物具有缓释性，药物释放动力学符合h i g u c h i 模型， 并具有良好的细胞相容性。该水凝胶能作为透皮药物控释、眼科药物控释载体。 按照给药途径的不同，水凝胶的传送体系可以用于口腔、直肠、眼睛、表皮、 皮下组织等部位。 1 2 2 3 组织工程 组织工程所选用的支架应与骨组织结构相似，需要注意支架材料的性质、表 面结构、孔隙率、可供细胞的黏附和生长功能等。在组织工程支架的制备过程中， 最关键的因素是多孔支架的微观结构，可以从几大因素对其进行评价：( 1 ) 孔 径及孔径分布。不同组织和器官的细胞不但在形状和大小上有所不同，在细胞生 长是的取向及结构密度也不相同。一般来说，皮肤组织重建需要支架的孔径在 2 0 1 5 0 1 a m ，而骨组织工程则需要1 0 0 2 5 0 p m 的孔径。( 2 ) 孔隙率。孔隙率关 系到多孔支架中空问的多少，影响到支架的细胞负载数量，材料的机械性能，要 6 第一章绪论 综合考虑。( 3 ) 孔间连通性。组织工程要求支架中的微孔应大部分或全部为开 放型的结构，为种子细胞引入或生长提供所需养分和代谢排除渠道。( 4 ) 支架 应具备一定的机械强度和解刨学外形，并与所要修复的组织相吻合。 s t e v e n s 等【1 4 】开发了一种快速治愈海藻酸盐水凝胶，用作骨膜衍生的软骨形 成支架，具有高的力学强度和抗压模量。这个凝胶系统适于注射极大地减小了 对机体的侵入。适于作软骨修复材料。 c h i n e t e 等【l5 】以碱性盐伊甘油磷酸二钠为原料制备了壳聚糖甘油磷酸盐水 溶液组成物，皮下注射入鼠的背部，体系有良好的生物相容性。另外，c h ( 盐酸化 壳聚糖) 与g p ( 伊甘油磷酸二钠 二元体系和c h + 侈- g p + f l - t c p ( 伊磷酸钙) 三 元体系水凝胶在注射入小鼠体内都可以快速凝胶，且生物相容性良好。 w e b b t l 6 】和j a s i o n o w s k i 等【1 7 1 研究了聚( 异丙基丙烯酰胺丙烯酸) 水凝胶作为 三维基质，用于软骨细胞的培养，这种水凝胶可用于细胞的体外培养和作为组织 工程对细胞生长具有良好作用。 组织工程的研究集中在细胞、生物材料和组织工程化组织构建三个方面。组 织工程支架为细胞和组织生长提供适宜的环境，随着细胞的分裂而逐渐降解和消 失，从而将新的空间提供给组织和细胞，并使新生成的组织和器官具备了与支架 相同的几何外形。研究表明，可注射原位生成支架的水凝胶由于其操作简单、塑 型随意、创伤小等优点4 在近年来的研究中被广泛重视。 1 3 壳聚糖作生物材料 1 3 1 壳聚糖概述 1 3 1 1 壳聚糖的发现和存在 在自然界，甲壳素广泛的存在于甲壳纲动物虾和蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真 菌( 酵母、霉菌) 的细胞壁和植物( 蘑菇) 的细胞壁中，是一种天然有机高分 子多糖，蕴藏量在地球上是天然有机高分子中的第二位，年产量约为1 1 0 4 吨。 甲壳质在强碱溶液中脱去n 乙酰基得到壳聚糖，壳聚糖及其衍生物是近年来广泛 研究的新型医用高分子材料。i s 】它广泛存在于自然界，是少见的带正电的聚合物。 其结构如图1 1 所示。 从1 8 1 1 年发现壳聚糖到1 9 世纪中期，壳聚糖并未引起重视。直到1 9 4 1 年美国 制备出壳聚糖手术缝合线和人造皮肤，对壳聚糖的研究才被重视。2 0 世纪7 0 年代 北京化t 硕上学位论文 以前，主要是欧美国家在研究甲壳素和壳聚糖，其后重心便移到日本。我国在1 9 5 2 年开始研究壳聚糖。2 0 世纪8 0 年代上半期，国内开始逐渐宣传甲壳素和壳聚糖， 这一时期很多报纸和科普杂志上发表了不少这方面文章，对8 0 年代后期开始的壳 聚糖热起到了推动作用。在其后的二十几年里，壳聚糖在国内外都被当作热点广 泛研究。甲壳素及壳聚糖在功能材料、食品、化妆品、农业、水处理、环保、日 用化学品上都已有应用，并且其生物相容性好，毒性低，可生物降解，能促进创 面愈合【l8 1 9 】在生物医学领域具有广阔的临床应用前景。 i o = c c h 3 图1 1 壳聚糖的分子结构 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo f c h i t i na n dc h i t o s a n 1 3 1 2 壳聚糖的结构及性质8 1 a ) 壳聚糖的结构 甲壳素及壳聚糖是以n 乙酰氨基葡萄糖残基形成的长链高分子化合物，由 于链的规整性大和具有刚性，并形成分子内和分子间相当强的氢键，因此，此种 分子结构有利于晶态的形成。目前认为甲壳素存在着q 、b 、丫三种晶型。这三种 晶型是因为分子内和分子间不同的氢键而形成的。a 甲壳素具有紧密的组成，大 多数是由两条反向的糖苷链排列而成的晶型；b 甲壳素的多晶型是由两条平行的 糖苷链而成；丫甲壳素则是由三条糖苷链排列而成，其中两条糖苷链同向、一条 糖苷链反向且上、下排列。 甲壳素和壳聚糖分子链中分布着许多的羟基、n 乙酰氨基和氨基，它们能形 成各类分子内和分子间的氢键。正是由于这些氢键的存在，形成了甲壳素和壳聚 糖的高分子的二级结构，即甲壳素和壳聚糖的高分子的二级结构指的是糖链之间 以氢键结合形成各种聚合体。 b ) 壳聚糖的物理性质 壳聚糖为白色或淡黄色无定形、半透明、略有珍珠光泽的固体，因原料或制 备方法不同分子量从数千到数十万不等，与其他多糖一样分子链也呈螺旋型，不 第一章绪论 溶于水和碱溶液，可溶于稀酸。壳聚糖的糖苷键是半缩醛结构，在酸性作用下主 链会缓慢水解，粘度越来越低、分子量越来越小、最后被水解成寡糖和单糖。壳 聚糖有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性、吸湿性和保湿性。 根据壳聚糖的脱乙酰度可以分为三类：低脱乙酰度壳聚糖( 5 5 7 0 ) 、中脱 乙酰度壳聚糖( 7 0 8 5 ) 、高脱乙酰度壳聚糖( 8 5 9 5 ) 。壳聚糖溶于酸性水溶 液呈粘稠液体，具有一定的粘度。高分子化合物的分子量常用粘度法测定，当溶 剂、浓度、温度等条件一定时，壳聚糖溶液的粘度变化即可视为溶液中壳聚糖的 相对分子质量的变化。根据溶液( 1 壳聚糖乙酸溶液) 粘度不同，壳聚糖通常分为 三类：高粘度壳聚糖( 粘度 l p a s ) 、中粘度壳聚糖( 粘度在1 0 1 p a s ) 、低粘度壳 聚糖( 粘度低于0 1 p a s ) 。 与纤维素类似，甲壳素和壳聚糖在细胞壁中构成一种称为微纤维的生物学结 构单元，排列成为亚晶相结构。壳聚糖的性质受晶型、脱乙酰度、分子量、溶液 粘度等因素的共同影响。 1 3 2 水溶性壳聚糖的研究 由于其分子链规整性大和具有刚性，以及氨基和羟基之间存在较强的氢键【2 0 1 造成壳聚糖内部存在晶型和非晶型，导致不溶于水和碱溶液等，只可溶于稀盐酸、 乙酸等无机酸和部分有机酸，其应用受到了很大的限制。我们需要对它进行化学 改性，得到水溶性的且具有良好性能的壳聚糖衍生物。 1 3 2 1 酰化 此类反应是壳聚糖研究得最多的一类反应，这类反应既可以发生在壳聚糖的 羟基上生成酯，也可以发生在壳聚糖的氨基上生成酰胺。 a ) n - 酰化 酰化反应在壳聚糖水溶性研究中是被广泛重视的一种反应。壳聚糖分子链上 有大量的氨基等活性基团，易与酸酐、酰氯等发生酯化反应而引入酰基基团，氢 键的束缚能力相对减弱，所以n 酰化较易进行。 k u b o t a 等【2 l 】通过较简便的方法制备出水溶性壳聚糖( 部分n 乙酰化壳聚糖) ， 并详细分析了n 乙酰化壳聚糖的溶解性结果表明，乙酰度y 可5 0 的衍生物，其水溶 性随着分子量的降低而增强。 l us h a o j i e 等【2 2 】用乙酸酐制备得到水溶性的n 乙酰化壳聚糖。此方法反应时 间短，参加反应的原料种类少，生成的产物在具有较高分子量的同时具有较好的水 9 北京化t 硕卜学位论文 溶性。 s h i g e h i r oh i r a n o 等【2 3 】研究了一系列不同酰化基团及不同脱乙酰度壳聚糖制 成的壳聚糖衍生物在水、2 乙酸水溶液及碱溶液中的溶解度，得出脱乙酰度越高 的壳聚糖和碳原子数越少的酰基生成的衍生物的水溶性越差。 王爱勤等【2 4 1 用壳聚糖与卤代烷通过酰化反应，制备了乙基壳聚糖、丁基壳聚糖、 辛基壳聚糖等具有不同长度烷基取代的壳聚糖衍生物，烷基取代基的引入削弱了 壳聚糖分子间的氢键作用，可改善其溶解性能。 b ) o 一酰化 o 酰化比n 酰化要困难，因为氨基的活性比羟基大。c a nz h a n g 等【2 5 】通过 三步过程制备得n o 琥珀酰化壳聚糖。由于反应一定程度上破坏了壳聚糖原有的 分子内氢键和结晶状态，故此产物一定浓度下可在蒸馏水、1 乙酸液和1 n a o h 液中溶解，显示了良好的水溶性，可作为进一步化学改性的中间体。 n i s h i m u r a 等【2 6 】j 哿壳聚糖和邻苯二甲酰于二甲基甲酰胺中1 3 0 反应，定量 且选择性地制备得到邻苯二甲酰壳聚糖。产物具有较好的溶解性，可溶于多种有 机溶剂中。 s a s h i w a 2 7 1 用丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、聚乙二醇丙烯酸酯这些带有亲 水性羟基基团不饱和酯，和壳聚糖上氨基发生迈克尔加成发应，产物具有良好的 水溶性，并且这些水溶性的壳聚糖衍生物具有良好的生物可降解性。 1 3 2 2n 一烷基化 n 烷基化是除n 酰化外另一类重要的反应。壳聚糖的氨基是一级氨基，有一 对孤对电子，具有很强的亲核性，能发生许多反应。用环氧衍生物与壳聚糖的氨 基进行反应，当环氧衍生物过量时，氨基上的两个h 都会被取代，生成的壳聚糖 衍生物大多可溶于水以其他有机溶剂。这个反应的特点是同时引入了两个亲水性 的羟基。 d u m a 等用n ( 2 溴乙基) 邻苯二甲酰亚胺，n ( 3 溴丙基) 邻苯二甲酰亚胺及 n ( 4 溴丁基) 邻苯二甲酰亚胺对壳聚糖进行烷基化改性，将产物n 邻苯二亚甲基 酰亚胺烷基化壳聚糖用联氨脱去邻苯二亚甲基酰亚胺基团得终产物n 氨基烷基 化壳聚糖。 a v a d i 等【2 9 】通过改进两步法制备得n n 二乙基甲基壳聚糖。通过最优化设 计所制备的产物，所得n 烷基化产物能在室温下快速溶于水中，增加壳聚糖的溶 解性能。 l o 第一章绪论 1 3 2 3 氧化 甲壳素和壳聚糖可以被氧化剂氧化，氧化机理很复杂，氧化剂不同、反应的 p h 不同，氧化机理和氧化产物也不同，即可使c 6 o h 氧化成醛基或羧基，也可使 c 3 o h 氧化成羰基，还可能发生部分脱氨基或脱乙酰氨基，甚至破坏吡喃环及糖 苷键。壳聚糖和氯乙酸在碱性条件下进行羧基化反应是较早被研究的，水溶性羧 基化壳聚糖由于其分子链上含有阳离子( n h 3 + ) 和阴离子( c o o ) 基团，为两性 聚电解质，具有良好的水溶性、成膜性和极强的重金属螯合能力【5 】，并且具有良好 的生物性能，调节免疫能力，促进细胞生长等作用【3 0 1 。 g o m e s 3 1 】将缩氨酸配合体接枝到壳聚糖分子链上，实现了水溶性，并且此 产物具有良好的保湿性。 l i a n g 等【3 2 】将壳聚糖与异丙醇、氯乙酸在碱性条件下反应得到羧甲基壳聚 糖。研究发现将羧甲基壳聚糖引入到磷酸钙的研究中可能对骨修复材料的研究产 生一定的作用。 r i c c a r d o 等【3 3 】将壳聚糖与乙醛酸进行羧基化反应，制得n ，n 而羧甲基壳聚 糖，此产物对镁离子和钙离子具有强螯合作用，并且兼具壳聚糖的骨诱导性和非 晶形磷酸钙盐的矿化作用，可以加速新骨形成。 h i t o s h is a s h i w a 等【3 4 】用将壳聚糖与丙烯酸乙酯进行迈克尔加成，羧基化制备 得到n 羧乙基壳聚糖。 1 3 2 4 含氧无机酸酯化 壳聚糖上的氨基和羟基，尤其是c 6 o h ，可与一些含氧无机酸或酸酐发生酯 化反应，类似于纤维素的反应。如在壳聚糖分子链上引入磺酸基、磷酸基、硝酸 基等基团，不仅能改变壳聚糖分子结构使其水溶，也可使其具有增强机体免疫力、 抑制肿瘤、抑制病毒、降糖降脂等生理功能。在含氧无机酸的酯化反应中，研究 最多的是壳聚糖的硫酸酯，其原因是这些酯类的结构与肝素相似，也具有抗凝血 作用。壳聚糖的硫酸酯化试剂主要有浓硫酸、二氧化硫、三氧化硫、氯磺酸等， 反应一般在非均相进行。 y o u n 等【3 5 】用s 0 3 h 。作硫酸酯化剂与壳聚糖反应生成了一种具有生长调节 性能的新的硫酸酯化壳聚糖衍生物。 x i a oh o n gw a n g 等【3 6 】将壳聚糖在甲烷磺酸中用p 2 0 5 处理，得到壳聚糖磷酸 酯基衍生物，易溶于水中。此种衍生物与磷酸钙基骨水泥复合可大大提高固化时 间。 v m r a m o s 等【3 7 】制备出n 磷酸基壳聚糖，观察到粘度及分子质量明显降低， 且此衍生物具有很强的螫合作用，特别是对于碱金属离子，用于体内代谢调节， 北京化工硕l 学位论文 可能成为潜在的肝靶向基因载体。 1 3 2 5 醚化 甲壳素与壳聚糖的羟基可与烃基化试剂反应生成醚，如甲基醚、乙基醚、苄 基醚、羟乙基醚、氰乙基醚、羧甲基醚等。壳聚糖可在碱性介质中与硫酸二甲酯 反应生成甲基醚。醚化反应的位置控制在理论上是很有意义的。壳聚糖是一种结 构复杂的高分子化合物，结晶度高、分子量大，尤其不能在均相中反应。近年来 对这类反应比较重视，可开发出一些新材料。 1 3 2 6 接枝共聚 在大分子主链上引入支链，而且主链与支链的化学组成不同称为接枝共聚。 甲壳素和壳聚糖分子链上的活性集团很多，可以进行接枝共聚反应，改善聚合物 性能。接枝共聚物具有与均聚物不同的性质，也兼具均聚物的一些特性。壳聚糖 的接枝共聚物是以多糖链为主链、以合成聚合物为侧链的半合成聚合物。将一种 水溶性大分子接枝到壳聚糖分子链上，破坏氨基和羟基之间的氢键作用，使壳聚 糖水溶，最常用的是聚乙二醇及其衍生物。聚乙二醇及其衍生物具有良好的生物 活性和血液相容性，常用作药物载体和支架材料。一般，壳聚糖接枝共聚已报道 的有化学法和辐射法。从反应机理来说，又可分为自由基引发接枝共聚和离子引 发接枝共聚。 自由基接枝共聚的关键是产生自由基。目前，壳聚糖的自由基接枝共聚共涉 及n 4 种引发剂。( 1 ) 氧化还原引发体系。这是接枝共聚的常用方法，较多使用 铈离子做引发剂，引发壳聚糖与烯类单体，如丙烯酸、丙烯酸酯、丙烯酰胺等接 枝体系。( 2 ) 偶氮二异丁腈法。用偶氮二异丁腈引发只能在壳聚糖的氨基上发 生接枝，产物不溶于稀酸。( 3 ) 辐射引发接枝。此法目前只用y 射线照射法或低 压汞灯产生的紫外线照射法对甲壳质或壳聚糖进行接枝共聚。( 4 ) 紫外光聚合 法。紫外光聚合能在短时间内完成接枝共聚，可进行大量制备，并且体系接枝度 较高。 离子引发接枝共聚目前研究还较少，一个例子【3 8 】是碘代甲壳素分散在硝基苯 中，加入路易斯酸与苯乙烯按阳离子接枝共聚机理反应得到接枝共聚物。另一个 例子【3 9 】是壳聚糖与非烯类单体n 羧酸酐接枝共聚，将粉状壳聚糖分散在d m s o 中，反应可得到多糖肽的接种共聚物，接枝在氨基上进行。 h u h ，k a n gm o o 等【柏】将聚k , - - 醇和壳聚糖反应制得接枝共聚物，然后再与q 环糊精混合制得超分子聚合体水凝胶，并得出凝胶的性能和聚合物中聚乙二醇含 量、体系的浓度、温度和混合时的两聚合物比例等因素有关。 1 2 第一章绪论 1 3 3 光聚合壳聚糖水凝胶 1 3 3 1 光聚合原理及应用【4 l 】 光聚合技术是在光的照射下进行的化学反应。光化学反应与热化学反应其化 学变化同样遵循化学反应的基本规律，而光能引起物质分子中电子分布发生变 化，使分子处于激发态。光化学反应通常包括两个方面：一是激发过程，在这个 过程分子吸收光能从基态分子变成激发态分子；二是激发态分子发生化学反应生 成新产物。光聚合水凝胶就是在带有可反应基团的液相单体或低聚物体系中加入 光引发剂，光源照射使体系聚合形成水凝胶。具体过程如图1 2 所示： i r 、，厂v 1 ， p h o t o i n i f ia t o r r e a c t i v es p e c i e s c r o s s l i n k e d p o l y m e r 一一卜一p o l y m e r r a d i c a l i o n 图1 2 紫外光可见光引发聚合反应的具体步骤 f i g 1 - 2p r o c e s so fp h o t o p o l y m e r i z a t i o n 1 3 3 2 互穿网络水凝胶 互穿网络( i p n ) 即由两种或两种以上交联聚合物通过网络的互相贯穿、缠 结而成的聚合物共混物，这些网络中至少有一种网络是在其他线形高分子或网络 存在下独立合成或交联的。互穿网络按构成组分的性质可以分为全互穿网络和半 互穿网络，前者的所有组分都为网络高聚物，后者含有线形或非交联的高聚物组 分。 1 3 3 3 紫外光聚合制备壳聚糖互串网络水凝胶 将光聚合技术引用到水凝胶的制备技术，该体系具备以下优点：易于成形、 反应温度和p h 值类似人体环境、固化时间短、反应条件温和、放热较低等。利 用光聚合技术在体内原位生成水凝胶可最大限度的减小创伤面积，减少病人痛 苦。由于壳聚糖良好的生物相容性和水凝胶的特有的优点，光聚合技术制备壳聚 糖水凝胶在药物释放、伤口敷料、组织工程等领域已经有了广泛的应用。 y i n g s h a nz h o u 1 3 】用水溶性的n 羧以基化壳聚糖、交联剂三缩四乙二醇双甲 基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯，紫外光聚合制备n 羧乙基壳聚糖羟乙基甲基 北京化t 硕。j ：学位论文 丙烯酸酯多孔水凝胶体系，并研究了各项性能。m t t 和药物释放结果显示，此 凝胶具备良好的生物活性、p h 敏感性、促进细胞生长，可以作为透皮药物控释、 眼科药物控释载体。 g i o v a n n a p i t a r r e s i 4 2 】等将透明质酸、天冬氨酸、甲基丙烯酸酯紫外光聚合生 成一种水凝胶，这种凝胶体系中不加引发剂，在3 1 3 n m 条件下1 5 m i n 完成聚合。 主要研究了人体环境下凝血酶的释放性能，结果显示该凝胶具有良好的释放性 能，适合做药物缓释的载体。 l e a c h t 4 3 】等用紫外光交联制备了甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的透明质酸 ( g l y c i d y lm e t h a c r y l a t e h a ，g m h a ) 衍生物水凝胶，研究表明此水凝胶具有细 胞相容性和生物可降解性，既能保持透明质酸本身促进内皮细胞增殖的生物活 性，又能在一定程度上起到血纤维蛋白的作用。 y e o 】等深入研究了紫外光交联壳聚糖水凝胶在心肌梗塞治疗中的应用。此 凝胶体系由壳聚糖与丙烯酰聚乙二醇r g d 多肽( a c r - p e g r g d ) 组成，在预 聚物中加入血管内皮细