（农产品加工及贮藏工程专业论文）鳙鱼和秘鲁鱿鱼肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究.pdf

鳙鱼( a r i s t i c h t h y s 刀d 6 以d 和秘鲁鱿鱼( d o s i d i c u sg i g a s ) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 摘要 鳙鱼( a r i s t i c h t h y s n o b i l i s ) 和秘鲁鱿鱼( d o s i d i c u s g 细) 属于低值水产品 原料，产量大，鱼肉蛋自质丰富，其利用具有重要的意义。本论文以鳙 鱼及秘鲁鱿鱼为原料。研究了其肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性，为工 业化生产提供理论依据。 研究了不同冻藏温度条件下鳙鱼鱼糜蛋白质的变化在- l o 、- 2 0 和3 0 冻藏过程中，鳙鱼肌原纤维蛋白质c a 2 + - a t p a s e 活性和总s h 含量不 断下降，冻藏2 0 周后分别下降至初始样品的1 6 9 ，6 4 1 、7 7 4 和5 3 1 、 6 0 2 、6 6 1 ，其鱼糜的凝胶强度也呈现下降趋势。鱼糜微结构表明，不同冻 藏温度条件下，鱼肉蛋白质中冰结晶大小有很大差异，冻藏温度越低，冰晶颗粒 越小。利用木瓜蛋白酶、低温碱性蛋白酶，风味蛋白酶酶解红鱼( s c i a e n o p s o c e l l a t u s ) 鱼排，分别获得木瓜蛋白酶酶解物0 p p 码，低温碱性蛋白酶酶解物( l p h ) 和风味蛋白酶酶解物a p p h ) 。3 种酶解物化学成分及氨基酸组成分析的结果表明 3 种酶解物中总氨基酸含量都在7 0 以上将酶解物作为抗冻变性剂以5 添 加量加入鳙鱼鱼糜中，并进行冷冻保藏。测定了冻藏样品肌原纤维蛋白质盐溶性、 c a 2 + - a t p 黜活性和凝胶弹性的变化，并对凝胶结构进行扫描电镜观察，抗冻效 果同商业抗冻剂( 4 蔗糖、4 山梨醇、o 3 多聚磷酸盐) 相比较。结果表明，3 种酶解物都能够抑制鱼糜蛋白质的冷冻变性，延缓肌原纤维蛋白质盐溶性降低 和c a 2 + - a t p a s e 活性的下降，其中木瓜蛋白酶酶解物对鳙鱼鱼糜具有最好的抗 冻变性效果。 本文研究了水、植酸、e d t a - n a 2 和六偏磷酸盐漂洗工艺对秘鲁鱿鱼肌肉蛋 白质及其凝胶特性的影响。通过s d s - - p a g e 分析漂洗前后鱿鱼肌原纤维蛋白质 的变化和鱼糜在不同温度条件下加热蛋白质的降解变化。结果表明，鱿鱼鱼肉中 蛋白酶的存在，秘鲁鱿鱼肌球蛋白重链会发生降解，在1 3 0 k d a 和9 7 k d a 处产生 新的蛋白质条带。鱿鱼鱼肉经漂洗后，肌球蛋白重链降解被明显抑制，六偏磷酸 盐对肌球蛋白重链降解的抑制效果最佳。鱼糜凝胶强度随加热温度升高而增加， 4 0 c 附近未出现凝胶化现象，6 0 1 2 附近未出现凝胶劣化( 解胶化) 现象。经4 种抑制剂漂洗得到的鱿鱼鱼糜凝胶破断强度差异较大，但弹性差异不明显，其中 以六偏磷酸盐溶液漂洗获得鱼糜的凝胶强度达3 9 6 2 9 c m 。扫描电镜结果显示， 水漂洗获得鱼糜凝胶微结构排列无规律，而经其他3 种抑制剂漂洗制得的鱿鱼鱼 糜凝胶微结构致密，空间网状结构明显，表明蛋白质之间交联程度高。 关键词：鳙鱼；秘鲁鱿鱼；鱼糜；肌原纤维蛋白质；凝胶特性；冻藏 s t u d yo nt h ep r o t einc h a r a c t e ra n dg ei p r o p e r t yo f b i g h e a dc a r pa n dg a i n ts q u i d a b s t r a c t b i g h e a dc a r p ( a r i s t i c h t h y sn o b i l i s ) a n dg a i n t s q t f i d ( d o s i d i c u sg i g a s ) a r e u n d e m f i t i z e df i s hr e $ o u r c 髓i nc h i n a t h e i rp r o t e i nc h a r a e t e 砖a n dg e lp r o p e r t i e so f b i g h e a dc a r pa n dg a i n ts q u i dw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r p h y s i c o c h e m i c a lc h a n g e si nb i g h e a dc a r ps u r i m id u r i n gl 臣o z e ns t o l - a g ea t i o c 、 - 2 0 c a n d - 3 0 w e t es t u d i e d c a 2 + - a t p a s e a c t i v i t ya n dt o t a l _ s hc o n t e n to f m e , h e a dc a r pm y o f i b d l l a rp r o t e i nd e c r e a s e dd u r i n gf r o z e ns t o r a g e , w h i c hd e c r e a s e d t o1 6 9 、6 4 1 、7 7 4 a n d5 3 1 、6 0 2 、6 6 1 a f t e r 2 0 w e e k s o f f i - o z e ns t o r a g e t h ed e c l i n ei ng e l - f o r m i n ga b i u t yw d 8a s s o c i a t e dw i t ht h ed e c r e a s ei nc a 2 + - a t p a s e a c t i v i t ya n dt o t a l s hc o n t e n t m i e r o s t r u e m r a ls t u d yr e v e a l e dt h a tt h es h a p eo fi c e c r y s t a lw a sd i f f e r e n ta td i 您删f r o z e nt e m p e r a t u r e ，w h i c hw a st h em a j o rr e a s o no f p r o t e i nd e n a t u r a t i o n e f f e c to f e n z y m a t i cp r o t e i nh y d r o l y s a t e so l ld e n a t u r a t i o no f a i g h c a d c a r ps u r i m i d u r i n gf r o z e ns t o t a g ow a ss t u d i e x lt h r e ep r o t e i nh y d r o l y s a t e sw e l q ep r e p a r e df r o mr e d d r u m ( s c i a e n o p so c e l l a t u s ) f f a n l eb y t h r e e o n z y n e s ，w h i c h w e r o p a p a i n ， l o w - t e m p e r a t u r ea l k a l i n ep r o t c a s ea n df l a v o u r z y m e t h e i rm a j o rc o m p o n e n t sa n d 黜洳a c i dc o m p o s i t i o nw c r l ga n a l y z e d b i g h e a dc a r ps u r i m ic o n t a i n i n g5 ( w w ) p r o t e i nh y d r o l y s a t e sw a ss t o r e da t - 2 0 c s a l ts o l u b i l i t ya n dc a 2 + - a t p a s ea c t i v i t yo f m y o f i b r i l sa n dg e lb r e a k i n gs a e n t hw e r em e a s u r e dd u r i n gf r o z e ns t o r a g e t h e s t r u c t u r eo f l 宙o z e ns a m p l e sw e r eo b s e r v e du n d e r s c a n n i n ge l e c t r o nm i e r o s c o p e ( s e m ) t h e i re f f e c t sw e c o m p a r e dw i t hc o m m e r c i a lc r y o p r o t e c t a n t ( 4 s u c r o s e 4 s o r b i t o l a n d0 3 p o l y p h o s p h a t e ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp e p t i d c sw e r et h e m a j o rc o m p o n e n t o fp r o t e i nh y & o l y 鳓t e s , w h i c ha c e o t m t e df o r8 2 1 2 8 4 6 1 t h ec o n t a n to f p r o t a i nw a s1 3 1 4 1 3 5 4 h y d r o p h i l i ca m i n oa c i d sw e t h em o s ta b u n d a n t i nt h el l n l i l l oa c i dc o m p o s i t i o n g l yh a dt h eh i g h e s tc o n t e n t , f o l l o w e db ya s p a d d i t i o no f p r o t e i nh y d r o l y s a t e st os u r i m is u p p r e s s e dt h ed e e r e s eo f t h es a l ts o l u b i l i t y a n dc a 2 + - a t p a s ea c t i v i t yo fm y o f i b r i l s t w o - s t e pf r e e z ed e n a t u r a t i o np a t t e r n 吣 e o n v e r t e di n t oo n e - s t e pd e n a t u r a t i o np a t t e r n a t t e r6 0d a y so ff r o z e ns t o r a g e ，t h e b r e a l d n gs 巾r e n g t hv a l u eo ft h eg e l sw i t h o u tp r o t e i nh y d r o l y s a t e sw a so n l y4 7 6 w h i l et h ev a l u eo fg e l sc o n t a i n i n gp r o t e i nh y d r o l y s a t e sw c r ca l lo v e r7 1 9 1 1 峙 d e n a t u r a t i o no f s u r i m ip r o t e i nm i g h tb es u p p r e s s e db yt h ea d d i t i o no f t h eh y d r o l y s a t e s ， e s p e c i a l l yt h eh y d r o l y s a t ep r e p a r e db yp a p a i n e f f e c t so fd i f f e r e n tr i l l s i n gt e e l m i q u e so nt h ep r o t e i nc h a r a c t e ra n dg e lp r o p e r t y o f d o s i d i e u sg i g a sm a n t e lm u s c l ew e l es t u d i e d c o l dw a t e ro rs o l u t i o no f p h y t i ea c i d ， e d t a - n a 2o r ( n a p 0 3 ) 6w a su s e d 嬲r i n s i n gr e a g e n t s 耵1 ec h a n g e so fs q u i dm u s c l e m y o f i b r i l l a rw e 舱a n a l y z e db ys d s - p a g e t h eg dp r o p e r t i e so ff o u rg r o u ps i l r i m i $ w e l ec o m p a r e d 1 1 ”r e s u l t ss h o w e dt h a tm y o s i nh e a v yc h a i ni n d u c e dd e g r a d a t i o n d u r i n gi n c u b a t i o na tv a r i o u st e m p e r a t u r e i tw a sp r e f e r e n t i a l l yd e g r a d e di n t o1 3 2 k d a a n d9 7 k d af r a g m e n t sa tl l no p t i m u mt e m p e r a t u r eo f3 0 c 1 1 1 ed e g r a d a t i o nw a s m a r k e d l yr e d u c e d a b o v e4 0 1 2 1 1 1 ed e g r a d a t i o no f m y o s i nh e a v yc h a i nw a si n h i b i t e d a f t e rt h em a n t l em u s c l ew a sr i n s e d , e s p e c i a l l yb y ( n a p 0 3 ) 6s o l u t i o n t h eg e l 姗e n g t l a o fs u r i m ii n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo ft e m p e r a t u r e t h e r ew e n os t r u c t u r e - s e t t i n g r e a c t i o na t3 0 c - 4 0 1 2a n ds l r u e t u r e - d i s i n t e g r a t i o nr e a c t i o l la t6 0 t h ed i f f e r e n c ei n b r e a k i n gf o r c eo ff o u rg r o u ps l n i r l i $ w a so b v i o u s l y , b u tt h ed e f o r m a t i o nw a sn o t a f f e c t e do b v i o u s l y n l es u r i m im a d eb yr i n s i n go f ( n a t 0 3 ) 6s o l u t i o nh a dt h eb e s tg e l s t r e n g t h , w h i c hw a s3 9 6 2 9 c 血t h e r e s u l t so fs e ms h o w e dt h a tt h e g e l m i c r o s m l c t u r eo fs u r i m im a d eb yr i m i n go fc o l dw a t e fw a si r r e g u l a ra g g r e g a t e n e t w o r k , w h i l eo t h e r3g r o u ps u r i m ig e l sh a df i n ef i b r o u sm a t r i x t h ec r o s s l i n k i n go f p r o t e i nm o l e c u l e sc o u l db ei a e r e a s e db yr i n s i n go fp l a y t i ea c i d ，e d t a - n a 2o r ( n a p 0 3 ) 6s o l u t i o m - r， k o yw o r d s ：a r i s t 缸h t h y sn o b i l i s ；d o s i d i c u sg i g a s ；s u r i m i ；m y o f i b r i u a r ；g e l p r o p e r t y ；f r o z e ns t o l a g e 鳙鱼“施斑m 筘m 6 妇) 和秘鲁鱿鱼( d 谢出w g f g h ) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 _土_上_jl。 刖舌 鱼糜是鱼肉经过漂洗、脱水、加添加剂制得，可以称为是“浓缩的 肌原纤维蛋白”。以鱼糜为原料，进一步添加调味剂等辅助材料，再成 型，并加热制成各种各样具有独特风味、富有弹性，能适应贮藏、运输， 满足消费者需要的凝胶性食品，统称为“鱼糜制品”。鱼糜制品【l 】种类 繁多，根据加热方法，可以分为蒸煮制品、焙烤制品( 如烤鱼卷、烤鱼 糕) 、油煎油炸制品、水煮制品等，主要品种有鱼丸、虾饼、鱼糕、鱼 香肠、鱼卷、模拟虾蟹肉、鱼面等。传统的鱼糜制品都从鱼肉开始制作， 而1 9 6 0 年，日本北海道水产实验场西谷氏为首的实验小组，以研究狭 鳕鱼的利用为契机，开发了无盐冷冻鱼糜，几乎在同时，京都大学的池 内氏等人也成功地开发了加盐冷冻鱼糜，解决了原料鱼蛋白质冷冻变性 的问题这一重大突破带动了鱼糜工业的重大发展。我国鱼糜制品也久 负盛名，国内有很多鱼糜制品生产线，随着人民生活水平的提高和消费 观念的改变，鱼糜制品越来越受到消费者的欢迎，生产量大幅提高。 冷冻鱼糜加工是水产品加工业的重要产业之一，2 0 0 2 年至今我国 每年生产的鱼糜及鱼糜制品都在l o 万吨以上，用于鱼糜加工的鱼类为 主要海水鱼类，包括鳕鱼、金线鱼、沙丁鱼以及一些小杂鱼类随着渔 业捕捞量的增加，海洋鱼类产量开始出现下降趋势，这种变化必将引起 冷冻鱼糜产量的下降淡水鱼的加工利用越来越受到重视，但目前我国 淡水鱼的加工量占淡水鱼产量的比例还不足1 0 。淡水鱼加工产品只是初 加工的速冻品、罐头、盐干品等。由于缺乏先进的淡水鱼深加工技术， 精加工方面还未深入，还缺少定型产品，致使国内淡水鱼市场呆滞迟缓， 产品价格下降，尤其是占淡水鱼养殖产量一半的低值淡水鱼一鲢、鳙鱼出 现压塘，产品价格下降，渔农增产不增收，挫伤了渔农养殖积极性；这些 都成了困扰效益农业尤其是淡水渔业发展的一大难题。 因此，有针对性的研究鱼肉蛋白质的理化性质，结合淡水鱼及多种 海产鱼类自身的特点，合理利用低值水产品资源，开发切实有效的加工 途径，解决鱼糜原料日益衰减的危机，满足消费者需求，已成为当前水 鳙鱼( d r i s t i c h l h y s n o b i l t s ) 和秘鲁鱿鱼( d 甜i d i c u s g i g a s ) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 产加工工作的当务之急。 1 鱼肉蛋白质研究现状 淡水鱼具有肉质鲜美，营养丰富等特点，供销部门均用活鱼运输车 将鱼运往市场后进行销售，一般人们的习惯也以活杀加工后食用但由 于当前淡水鱼养殖量大，已无法适应供销矛盾，但起捕后的淡水鱼如不 及时加工处理，又将很快腐败变质，为此，水产品加工部门已开始将淡 水鱼作原料鱼生产鱼糜制品如鱼丸、鱼香肠、鱼肉火腿、鱼排等供应市 场，取得了较好的效果。但淡水鱼在冷藏过程中鱼肉性质将发生很大的 变化，这些由于鱼肉肌原纤维蛋白变化所引起性质的变化，称之为鱼肉 蛋白质的冷冻变性，冷冻变性的结果使鱼肉失去它固有的柔软性、保水 力，凝胶形成能下降。其变性的速度往往受到各种条件的影响，如原料 鱼的种类、处理方法、冻结温度、贮藏温度、解冻方法等而有所不同。 所以如何防止和延缓淡水鱼鱼肉蛋白质的冷冻变性问题，是当前能否将 淡水鱼作为原料鱼进行扩大加工生产的关键所在。 在国外，尤其是日本，于6 0 年代就研究了用抗冻剂有效防止鳕鱼 鱼糜蛋白质的冷冻变性【l l ，川岛( 1 9 7 3 ) 首次采用肌动球蛋白( a m ) c a 2 + _ a t p a s e 总活性作为冷藏鱼糜质量判断指标。加藤( 1 9 7 9 ) 进一步 研究了冻藏过程中鱼肉肌原纤维蛋白质的镁离子a t p 酶 ( m f m 9 2 + a t p a s e ) 总活性的变化，并认为m f m 9 2 + a t p a s e 总活性是判 定鱼糜质量的有效指标。岩田( 1 9 7 1 ) 和1 w a t n ( 1 9 7 1 ) 等用蛋白质溶 解度判定冻藏中鱼糜品质的变化。此外，新井等( 1 9 7 3 ) 、桥本等( 1 9 8 3 ) 、 福田等( 1 9 8 1 ) 和j i a n g 等( 1 9 8 5 ) 直接用肌原纤维蛋白质的a t p a s e 活性和溶解度两个指标来考察冷藏过程中蛋白质的变性。在有关抗冻剂 的研究中，英国的j r h e r r e r a 和i m m a c k i e 2 l 研究了用蔗糖、山梨醇 作鱼糜抗冻剂。最近的报道中，日本的k i y o s h l0 s a t o m i 等人已经 开始尝试将水解蛋白添加到鱼糜中作抗冻剂【3 1 。 r 国内在鱼肉蛋白质和鱼糜的研究中，曾名勇 4 - 5 1 等研究了鳙肌肉蛋 白质生化特性在冻藏过程中的变化和鲫鱼肌原纤维蛋白生化特性在冻 藏过程中的变化，以肌球蛋白盐溶性、a t p a s e 活性和s h 含量为评价 2 鳙鱼( 一廊础概帆h 0 6 船) 和秘鲁鱿鱼( d 岫船埘譬蛐) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 指标，指出其蛋白质均易发生冷冻变性。丁玉庭【6 】等用肌原纤维a t p a s e 活性和溶解度变化作为指标考察了鲢、鳙、鳊、鲫四种淡水鱼的冷藏稳 定性；陶妍【7 l 等研究了生长环境的温度变化对肌原纤维蛋白热稳定性的 影响；上海水产大学中日合作研究室在加热时间和加热方法对凝胶形成 的影响及鲢的鲜度变化与凝胶作用能力的关系上作了一定的研究【8 】。汪 之和和王健在漂洗次数，漂洗液p h 和漂洗液种类等因素对蛋白质冷冻 变性【9 1 和凝胶强度”1 的影响作过详细研究；冻结速率和冻藏温度对具 有完整肌纤维的鱼肌蛋白质的冷冻变性也已有研究【1 1 1 。此外，王箐磊 等人用正交实验法研究了白鲢鱼糜蛋白经漂洗后，添加食品磷酸盐和蔗 糖作为抗冻剂防止冷冻变性的效果f 1 2 】，从而在防止淡水鱼鱼糜冷冻变 性的研究方面又迈进了一步。但从总体上看，对淡水鱼的加工利用仍然 停留在初级阶段，原因是淡水鱼蛋白质冻藏稳定性差，士腥味严重，作 为鱼糜加工不能满足工业要求，质量同优质鱼糜差别较大，市场上流通 量较少。 1 1 鱼肉凝胶形成机理 鱼肉中加入2 一3 的食盐进行擂溃时，会产生非常黏稠状的肉 糊，这主要是肌动蛋白和肌球蛋白由于食盐的盐溶作用而溶解，在加热 条件下，二者之间发生交联，蛋白质之间相互缠绕凝聚，形成空间网状 结构，游离水被封闭于网络结构中，从而形成富有弹性的凝胶【”1 从溶胶的肉糊到凝胶的鱼糕的变化包含了两个反应，一是通过5 0 以下的温度域时，在此温度过程中进行的凝胶结构形成的反应，另一 是以6 0 为中心的5 0 一7 0 温度带所发生的凝胶结构劣化的反应。前 者称为凝胶化( s u w a r i ) ，后者称为凝胶劣化( m o d o r i ) 。即便是最终加 热温度相同，但由于到达终点温度的过程不同，所形成的凝胶物性亦不 同，这是鱼糜凝胶化的重要特征。凝胶化现象是指肌动球蛋白被加热时， 其高级结构发生松散，分子问产生架桥形成了三维网状结构。由于热的 作用，网状结构中的自由水被封锁在网目中不能流动，从而形成了具有 弹性的凝胶状物。架桥与疏水基和二硫键的形成有关，特别是前者作用。 3 鳙鱼( 哺恤 哟学n o b i l i s ) 和秘鲁鱿鱼( d o s i d i c u s g r g a s ) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 凝胶化的形成即使在室温下也能发生，而温度越高，其凝胶化的速度也 越快。 凝胶劣化是指在凝胶化温度带中已形成的凝胶结构，在7 0 c 以下 温度域中逐渐劣化、崩溃的一种现象。6 0 ( 2 附近最易发生，即使在5 0 以下，如放置时间长，也同样发生。其发生机制有蛋白酶的分解学说 和凝胶劣化诱发性蛋白质学说，前者因蛋白酶的活性分布同鱼种不同而 产生的凝胶劣化的难易度并不完全吻合，而后者不能很好地说明凝胶劣 化现象随时问的推移进行到何种程度。第一种学说得到了较多学者的认 可，认为凝胶劣化是由于内源性热稳定性蛋白酶对肌球蛋白的迅速降解 造成的。肌肉蛋白酶活性在温度高于5 0 时活性很高，引起肌原纤维， 特别是肌球蛋白迅速而严重的降解，这种降解会降低鱼糜质量，进一步 会降低凝胶强度。 加热的温度和时间直接关系到鱼糜制品弹性形成的强弱，即在6 0 以上的加热中，6 0 7 0 ( 2 的低温长时间加热和8 0 9 0 的高温短时 间加热的制品，弹性有明显的差别，高温短时间加热的制品富有弹性， 而低温长时间加热的却相对要差一些。这是因为任何一种蛋白质都是热 凝固的，在肌动球蛋白溶胶向凝胶转化的过程中所形成的结构将因加热 方法不同而产生差异，在高温短时加热中，肌动球蛋白形成的网状结构 可即刻固定下来，分布均匀，因而弹性强；而低温长时间加热，有一部 分肌动球蛋白和肌动蛋白就会聚集成团，因而在制品中形成的网状结构 分布就不均匀，易与水分分离，所以弹性就要差些。 1 2 鱼肉蛋白质变性研究进展 鱼肉蛋白质一般由水溶性的肌浆蛋白、盐溶性的肌原纤维蛋白和不 溶性的基质蛋白组成【1 4 】在加工过程中，这些蛋白质及其分解产物对 食品风味和质量都有一定影响，在鱼的冷藏保鲜过程中，品质的变化也 与鱼肉蛋白质的变化有关 关于蛋白质的冷冻交性机理有多种学说，但且前较有说服力的有三 种【”】：一是受蛋白质束缚的结合水因冻结造成的脱离引起的蛋白质变 鳙鱼( 埔饿慨j j 9 4n o b l a ) 和秘鲁鱿鱼( n 蚵觑w g 净) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 性学说，二是水和水合水的相互作用引起蛋白质变性的水化作用学说， 三是冰结晶的形成使体液浓缩引起的蛋白质变性学说。 一、结合水的脱离肌肉组织中的水分，根据同蛋白质的相互关 系分为结合水和自由水。结合水是在蛋白质的活性基上形成单分子层被 牢固束缚的水，而自由水是不受蛋白质束缚的水，可作为溶媒，移动扩 散。冻结时首先结冰的是自由水，而结合水很难结冰。如果仅自由水结 冰再解冻的话，蛋白质和水之间的相互关系不发生任何变化。但冻结率 提高，结合水的一部分也形成冰晶，水同蛋白质的支链和支链之间的相 互关系就会发生不可逆的变化而使蛋白质变性。 二、冰和蛋白质亲和水之间的相互作用蛋白质分子中复杂的三 级、四级结构是由非极性集团的疏水键和分子内氢键来维持的。这些键 的分布状态与周围的水分子所形成的结构、状态密切相关。一般认为， 冰的生成导致了水合层的破坏，从而引起了这些非极性结合的破坏和新 结合的生成。由于结冰，非极性基周边的水失去，疏水键被破坏。此外 又由于冰晶之间的相互作用，为了维持亲和水的稳定结构，氢键的切断 和生成必然波及到蛋白质分子内部，使得蛋白质变性。 三、细胞液的浓缩由于冰晶的析出，未冻结细胞液的浓度被浓 缩，其结果使液相中的离子浓度上升和p h 的变化，引起蛋白质的变性。 这种观点往往被用来说明细胞内外冰的生成量及生成状态同蛋白质变 性之间的密切关系 国外有学者研究认为，由于冰晶的形成，鱼肉蛋白质在冻藏过程中 主要会发生两种变性，一是蛋白质分子的聚集，二是蛋白质多肽链的展 开。图1 为具有a - 螺旋结构的蛋白质在冻藏中的聚集变性模型。该模 型指出，当蛋白质冷却到冰点以下时，温度较低部分的水分子开始结晶， 而其他部位的未冻结水分子则向冰晶处迁移，引起冰晶生长，最终蛋白 质表面功能基团所结合的水分也会被移去，使这些功能基团游离出来而 相互作用，从而使蛋白质分子间发生聚集。鱼肉肌原纤维蛋白中的肌球 蛋白、肌动球蛋白中的肌球蛋白部分都具有a 螺旋结构，在冻藏中易 发生聚集变性。r a g n a r s s o n 1 5 等采用s d s 聚丙稀酰胺凝胶电泳分析了 5 鳙鱼( a r i s t i c h t h y sn o b h 妇) 和秘鲁鱿鱼( d 哪诚嘶g 辔嚣) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 鳕类鱼和非鳕类鱼的肌球蛋白在冻藏中的变化，结果发现鳕类鱼的肌球 蛋白在冻藏中发生了聚集，表现在电泳图谱中有一相对分子质量为 2 8 0 k d a 的聚合物的形成。b u t t k u s 、j a n g 1 8 】等对参与肌球蛋白或肌动 球蛋白聚集的各种键进行了详细的研究，指出氢键、离子键、疏水键和 二硫键是参与聚集的主要化学键。 一 图1 具有a 一螺旋结构的蛋白质在冻藏中的变性模型 图2 为非螺旋结构( 球形结构) 蛋白质在冻藏中的开链变性模型。 未冻结时，蛋白质分子以高度水化的折叠状蛋白质存在，在此状态，蛋 白质多肽链上的非极性基团位于分子内部而避免了与水分接触，因此具 有较高的墒，在热力学上是较稳定的，而且蛋白质分子内部的非极性基 团相互作用形成的非极性键可使这种状态更稳定。当蛋白质冻结时，由 于冰晶的形成会使蛋白质的水化程度大大降低从而使其链展开，形成水 化程度很低的开链蛋白质。这种机理较好的解释了球形( 如肌动蛋白) 或非螺旋结构蛋白质在冻藏中的开链变性。 图2 非螺旋结构蛋白质在冻藏中的变性模型 蛋白质分子的聚集和展开变性会引起其一些重要的物化特性如溶 解度、表面疏水性、活性巯基含量、溶液粘度、紫外光谱特征等发生改 变，这些变化也必然导致其凝胶特性发生改变检测冻藏过程中蛋白质 的物理化学特征和凝胶特性的变化成为判断蛋白质变形程度的重要手 段。常见的检测指标有以下几种； 鳙鱼( 加纽翻咖n o b i f l s ) 和秘鲁鱿鱼( n 嘲抛埘g 女g 珊) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 1 肌原纤维蛋白盐溶性的变化在冻藏过程中，肌原纤维蛋白分子 之间由于氢键、疏水键，二硫键的形成而聚集变性，因而其盐溶性下降。 曾名勇 4 - s 等研究发现，鳙鱼肌肉及鲫鱼肌肉在冻藏过程中，其肌动球 蛋白的盐溶性随着冻藏时间的延长呈下降趋势。 2 肌原纤维蛋白a t p a s e 活性的变化鱼肉肌原纤维蛋白具有 a t p a s e 活性。在冻藏过程中，由于蛋白质的变性会引起此活性发生改 变，因此，肌原纤维蛋白的a t p a s e 活性被广泛用来作为鱼肉或鱼糜蛋 白变性的指标。肌原纤维蛋白的a t p 酶活性包括c a 2 + - a t p a s e 、m 9 2 + a t p a s e 、c a 2 + m 9 2 + a t p a s e 、m 9 2 + e g t a a t p a s e ( e g t a 代表 n ，n ，n n 一四乙酸) 其中c a 2 + - a t p a s e 是反映肌球蛋白分子完整性的 良好指标，m 9 2 + a t p a s e 、c a 2 + m 9 2 + a t p a s e 分别反映在内源或外源 c a 2 + 离子存在下肌动球蛋白的完整性，而m 9 2 + e g t a a t p a s e 是反映肌 钙蛋白原肌球蛋白复合物完整性的指标。在冻藏过程中，这四种a t p a s e 活性的变化不同。b e n j a k u l i ”l 等研究发现，大眼海鲈在1 8 c 冻藏时， 其肌动球蛋白的c a 2 + - a t p a s e 活性随冻藏时间的增加而降低，m 9 2 + - e g t a a t p a s e 活性却增加，而m 9 2 + a t p a s e 和c a 2 + m 9 2 + a t p a s e 的 活性变化不明显。j a n g 1 7 】等研究发现遮目鱼肌动球蛋白的c a 2 + - a t p a s e 活性在2 0 和3 0 的冻藏过程中均随着冻藏时间的增加而显著下降， 冻藏8 周后活性依次下降了7 9 和3 4 。 3 肌原纤维蛋白活性巯基、总巯基及二硫键含量的变化肌球蛋 白分子中含有活性巯基，这些巯基可分为s h i 、s h 2 和s h a 三类。其 中s h l 、s h 2 分布在肌球蛋白的头部，与肌球蛋白的c a 2 + - a t p a s e 活性 密切相关【2 们而s h a 位于轻链酶解肌球蛋白( l m m ) 部分，与肌球蛋 白重链的氧化及二聚物的形成密切相关1 2 1 1 。此外，尚有一些巯基隐藏 于肌球蛋白分子内部。总巯基包括活性巯基和隐藏的巯基，研究表明， 在冻藏过程中，活性巯基易被氧化成二硫键，因此蛋白质冷冻变性往往 会使其活性巯基或总巯基的含量减少，而二硫键的含量上升f 2 2 2 3 1 4 肌原纤维蛋白凝胶形成能力的变化凝胶特性是反映鱼糜蛋白 在冻藏过程中是否发生变化及变性程度的最直接的指标。肌原纤维蛋白 7 鳙鱼( a r i s t i c h t h y s n o b i h s ) 和秘鲁鱿鱼( d o s t d w u s g i g a s ) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 的冻藏变性所引起的物理化学变化最终会导致其凝胶形成能力的下降。 b e n j a k u l1 1 9 】等指出，大眼海鲈在1 8 冻藏过程中，其所形成鱼糜的凝 胶形成能力都随着时间的增加而显著下降，表现在破断强度、凹陷度和 持水性都随时间的增加而下降。扫描电镜分析表明新鲜鱼肉所加工的鱼 糜凝胶结构比较均匀一致，而冻藏后所形成的凝胶结构孔隙较多，结构 疏松，排列没有规律性。 1 3 鱼肉蛋白质抗冷冻变性研究进展 自从1 9 5 9 年日本北海道中央水产实验场的西谷氏等专家利用蔗糖 成功解决狭鳕鱼糜蛋白的冷冻变性而开发了冷冻鱼糜的生产技术后，许 多学者对能够防止鱼肉或鱼糜蛋白冷冻变性的物质进一步开展了广泛 而深入的研究，并且把这些能够减轻或防止鱼糜蛋白质冷冻变性的物质 称作抗冻剂( c r y o p r o t e c t a n t s ) 。鱼肉以鱼糜形式冻结贮藏时，由于肌原 纤维大部分都已破裂，比整条鱼冻结贮藏更容易导致肌原纤维蛋白的变 性，因而即使在最佳加工工艺条件下，也必须添加抗冻剂才能有效地防 止鱼麋蛋白的冷冻变性。n o g u c h i 2 4 】在其博士论文中以抗冻效果显著的 谷氨酸为参比物对多种在结构上与谷氨酸近似的化合物的抗冻效果进 行了详细的研究，并结合别人的研究成果进一步对抗冻剂的分子结构特 点进行了研究，总结出对鱼肉蛋白质具有抗冻效果的化学物一般具有以 下一些特点：( 1 ) 分子中必须具有一个- c o o h 或o h 基团，及一个以 上的c o o h 、- o h 、- s h 、一n h 2 、- s 0 3 h 、- o p 0 3 h 2 辅助基团；( 2 ) 分 子中的功能性基团( 包括必须及辅助基团) 之间必须合理分布；( 3 ) 分 子相对较小。因此认为抗冻效果好的化合物主要是低分子质量的糖和糖 醇类、氨基酸类、羧酸类许多研究进一步表明，这些物质对鱼肉蛋白 确实有较好的抗冻效果 这些添加物对变性防止作用，主要是由于离子键或氢键的作用与蛋 白质分子的反应基结合，防止了蛋白质分子相互间的结合，同时封住了 水分子的移动，从而抑制冰晶的生长，达到防止蛋白质冷冻变性的效果。 而糖的作用并非是因为它直接和蛋白质发生作用而起作用的，而是因为 8 鳙鱼c 4 r i a t i e h t h y $ n o b i i l s ) 和秘鲁鱿鱼( d o s i d i c u s g i g a a ) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 糖类加入鱼糜中首先是溶解于鱼糜内所含的水中，使得这部分的水的性 质发生变化，然后影响蛋白质而起到防止冷冻变性的作用。 尽管许多低相对分子量的糖和糖醇、氨基酸、羧酸在很早就证实对 鱼肉蛋白质具有抗冻效果，但在鱼糜加工业中得到广泛应用的主要为4 蔗糖和4 山梨醇的混合物( 一般称。商业抗冻剂”) ，这种复合抗冻 剂被证实对鱼肉肌原纤维蛋白具有很好的抗冻效果【。加入的糖类并非 是和蛋白质分子直接结合或取代蛋白质分子表面的结合水，而是通过改 变蛋白质中存在的水的状态和性质间接的对蛋白质起到作用，从而防止 变性同其他糖类相比，蔗糖和山梨醇具有更强列的抗冻效果，一般认 为与糖类分子中- o h 基团配位有关。根据对肌原纤维悬浊液进行的试 验，证实糖类对鱼肉蛋白质的变性防止效果与悬浊液的蛋白质质量无 关，只决定于添加糖类的摩尔浓度，即如果与蛋白质共存的水中的糖类 摩尔浓度相同的话，防止蛋白质的冷冻变性效果就一样。因此，对水分 含量多的鱼糜要多添加一些糖类，对水分含量少的鱼糜则可少加些糖类 就能达到目的在添加糖类的同时，一般还要添加复合食品磷酸盐。在 添加效果上，以焦磷酸钠和三聚磷酸钠为最佳。 传统抗冻剂的抗冻效果虽然好，却会带来最终的鱼糜制品过高的甜 味和热量，不符合食品消费领域。低甜、低热”的需求趋势。因此寻找 低甜度甚至无甜度、低热量甚至无热量的抗冻剂成为近来鱼糜加工业的 重要课题已有初步研究表明一些分子量较大的多糖类如聚葡萄糖、麦 芽糊精、淀粉糖浆等也展现较好的抗冻效果 2 5 - 2 7 1 。p a r k 2 5 等报道了聚 葡萄糖能够代替蔗糖和山梨醇添加于鱼糜中作为等效的抗冻剂，在2 8 贮存8 个月后，添加了聚葡萄糖和蔗糖山梨醇的狭鳕鱼糜的盐溶性 蛋白含量下降程度相似，分别为2 0 和1 8 ja u h 等研究发现高度分 支的寡聚糖在8 浓度时，对狭鳕鱼糜的抗冻效果与商业抗冻剂接近 m a n d o n a l d 2 s 等曾研究过乳酸钠对罗非鱼肌动球蛋白冷冻解冻循环及 热变性的影响，发现乳酸钠是一种比蔗糖更为有效的抗冻剂，其抗冻效 果大约是蔗糖的4 倍p a r k 2 9 最近指出，海藻糖对鱼糜蛋白的热变性 具有较好的抑制作用，因而推测其对鱼麋蛋白的冷冻变性也可能有效 9 鳙鱼( a r l s t i 贮h t h y s n o b i l b ) 和秘鲁鱿鱼( d o s l d w u s g i g a a ) 肌肉蛋白质理化特性及凝胶特性的研究 果。 在抗冻剂作用机理方面，目前的研究还很有限，尚没有明确的研究 成果。一般认为，不同的化合物具有不同的抗冻机理。对于糖和糖醇类， 目前大多数学者认为它们的抗冻机理主要是由于它们能够借助其分子 中的羟基而提高蛋白质分子的水化程度【3 们。对于糖和糖醇以外的抗冻 剂，目前有学者认为其抗冻机理是由于它们能够借助分子中的功能性基 团和蛋白质分子表面的功能性基团相互作用形成蛋白质抗冻剂复合 物，而抗冻剂分子中的其它功能性基团能和水分子结合，这样每个蛋白 质分子表面就被水化了的抗冻剂分子覆盖，结果蛋白质和蛋白质之间的 相互作用就减少了，水化程度也得到了提高。例如阴离子化合物尤其是 羧酸类及含有两个羧酸基团的氨基酸类化合物，它们能够借助阴离子基 团和蛋白质分子形成复合物，结果蛋白质表面就覆盖了许多负电荷。这 些负电荷能在蛋白质分子间产生排斥力，有利于蛋白质分子的稳定。此 外，抗冻剂通过分子中其它阴离子基团能够和水结合，结果提高了蛋白 质的水化程度。 近年来，随着水产综合利用的深入研究，水产加工下脚料被充分利 用，通过酶解的方式可以获得酶解物，酶解物成分为多肽，多肽中大量 氨基酸含有暴露的一o h ，这部分氨基酸能够与水相互作用形成氢键， 保证了冻结过程中水的稳定性，避免了蛋白质空间构象的剧烈变化。 n o z a k i 3 h 研究了酶解鱼水产加工废弃物如鱼头、内脏、鱼皮、鱼骨等 的酶解物对鱼肉蛋白质的抗冷冻变性效果。结果发现，酶解物中肽的含 量达到8 2 3 8 5 8 ，以谷氨酸和谷氨酰胺含量最高，达到1 0 以 上，鱼糜蛋白质变性程度被明显抑制，c a 2 + - a t p a s e 活性保持稳定，凝 胶强度下降较小。h o s s a i n 3 2 1 研究了鱿鱼加工废弃物酶解物的抗冻活性， 得出了同n o z a k i 研究较一致的结果，多肽在冻藏过程中起到了抗冻剂 的作用。z h a n g n o n g l 3 3 1 等研究了南极磷虾酶解物对鱼肉中未冻结水分及 蛋白质特性的影响，指出酶解物能够增加未冻结水分含量，从而使蛋白 质特性稳定，保证了冻藏过程中各种理化性质的稳定性。 本文针对淡水鱼中产量较大的鳙鱼，研究了鳙鱼鱼糜冻藏过程中蛋 鳙鱼( 触a e z 0 , s 蝴) 和秘鲁鱿鱼( 姗o - n g a s ) 肌肉蛋白质理化