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浙江大学硕士学位论文 摘要 聚合物功能纳米粒子的制备及性能 摘要 本文旨在制备分别具有温度敏感和生物黏附功能的两种纳米粒子体系，并研 究它们作为药物释放体系的性能。 通过在温敏聚合物p n i p a a m 中引入聚电解质形成共聚物，可以赋予其对温 度和p h 值的双重响应性。这种共聚物若进一步与带相反电荷的聚电解质以静电 力结合，则能形成结构稳定的温敏性纳米粒子；通过物理吸附对药物进行包埋， 在温度调控下释放药物。采用端羧基偶氮类引发剂引发n 一异丙基丙烯酰胺 ( n i p a a m ) 聚合，合成了端羧基p n i p a a m 齐聚物。通过碳化二亚胺缩合反应， 将p n i p a a m 齐聚物接枝到聚烯丙基胺( p a h ) 侧链上，获得了p a h g p n i p a a m 。 不同接枝率的p a h g p n i p a a m 具有相同的最低临界溶液温度( l c s t ) ，在l c s t 附近都呈现可逆的聚集和溶解行为。l c s t 随盐溶液浓度的增大而线性减小，粒 径随p h 的升高而减小。通过聚苯乙烯磺酸钠( p s s ) 的引入得到结构稳定的 p a i l - g - p n i p a a m p s s 粒子，其粒径随温度的升高，降低呈现收缩溶胀的可逆变 化。比较了p a h g p n i p a a m p s s 粒子分别在溶胀和收缩状态时对罗丹明的释放 性能，证明p a h g p n i p a a m p s s 的内部体积可由温度的改变加以调控。 壳聚糖中的氨基和羟基使其能与含羟基的物质形成氢键，或通过静电作用与 带负电的表面相互吸引，有望成为对牙齿表面有较好黏附能力的药物释放载体。 通过对牙膏活性物质的包埋和释放，延长活性物质在牙齿表面的滞留时间。以乳 化交联法制备了具有生物黏附功能，并对牙膏活性成分有包埋能力的壳聚糖纳米 粒子体系。该体系具有良好的细胞相容性。用该体系对牙膏活性物质氯化十六烷 基吡啶、氟化钠进行了包埋。包埋在粒子中的活性成分可以持续而稳定地释放。 空白壳聚糖纳米粒子和负载了活性物质的壳聚糖纳米粒子都对羟基磷灰石或玻 璃表面具有良好的黏附能力，且空白壳聚糖纳米粒子和n a f 壳聚糖纳米粒子在 牙膏基质中具有良好的稳定性。 关键词：聚n 异丙基丙烯酰胺；温敏；壳聚糖；黏附；药物释放 浙江大学硕l 学位论文a b s t r a c t p r e p a r a t i o na n dp r o p e r t i e so ff u n c t i o n a lp o l y m e r n a n o p a r t i c l e s a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h i sw o r ki st o p r e p a r en a n o p a r t i c l e sw i mt h e r m o s e n s i t i v eo r b i o - a d h e s i v ep r o p e r t i e sf o rd r u gd e l i v e r y c o p o l y m e r so fp o l y 附一i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ) ( p n i p a a m ) a n dp o l y e l e c t r o l y t e sa r e e x p e c t e dt or e s p o n db o t ht ot e m p e r a t u r ea n dp h w h e nc h a r g e de o p o l y m e r so f p n i p a a ma n dp o l y e l e c t r o l y t e si n t e r a c tw i t ho p p o s i t e l yc h a r g e dp o l y m e r s ，r o b u s t t h e r m o s e n s k i v ep a r t i c l e sc a nb ef o r m e d a f t e rl o a d i n gac e r t a i nd r u gb yp h y s i c a l a d s o r p t i o n ，t h ep a r t i c l e s c a l le x h i b i tat h e r m o s e n s i t i v e d r u g r e l e a s e p r o p e r t y p o l y r a l l y l a m i n e ) - g - p n i p a a m w a s s y n t h e s i z e db y c o n d e n s a t i o nb e t w e e n p o l y 叫l y l a m i n e ) ( p a h ) a n dp n i p a a m c o o h t h ec o p o l y m e r se x h i b i t e dt h es a r n e l o w e rc r i t i c a ls o l u t i o nt e m p e r a t u r e ( l c s t ) r e g a r d l e s so ft h e i rg r a f t i n gr a t i o s a t e m p e r a t u r ec y c l er e v e a l e dc o m p l e t e l yr e v e r s i b l ep o l y m e ra g g r e g a t i o na n dd i s s o l u t i o n a r o u n dt h el c s t t h el c s to ft h ec o p o l y m e r sd e c r e a s e dl i n e a r l ya saf i m c t i o no f n a c lc o n c e n t r a t i o n t h ep a r t i c l es i z ed e c r e a s e da l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo f p h r o b u s t p a h - g p n i p a a m p s sp a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db yp h y s i c a lc r o s s l i n i n k i n go ft h e p a h g - p n i p a a mn a n o p a r t i c l e sb yp o l y ( s t y r e n es u l p h o n a t e ) f p s s ) at e m p e r a t u r e c y c l ec a u s e dc o m p l e t e l yr e v e r s i b l ep a r t i c l ed e s w e l l i n ga n ds w e l l i n g d i f f e r e n tr e l e a s e p e r f o r m a n c eo fr h o d a m i n e6 ga tt h es w e l l i n ga n dd e s w e l l i n gs t a t e so ft h ep a r t i c l e s i n d i c a t e dt h ei n t e r n a lv o l u m eo f t h ep o l y m e rn e t w o r kw a st e m p e r a t u r e - t u n a b l e t h ee x i s t e n c eo fa m i n oa n dh y d r o x y lg r o u p si nt h em o l e c u l a rc h a i n so fc h i t o s a nc a n g i v er i s et oh y d r o g e nb o n d i n gw i ms u b s t a n c e sh a v i n gh y d r o x y lg r o u p s w h i l et h e c a t i o n i cn a t u r eo fc h i t o s a nc o u l dp r o v i d ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nw i t hn e g a t i v e l y c h a r g e ds u r f a c e s t h e r e f o r e ，c h i t o s a ni s ap r o m i s i n gc a n d i d a t em a t e r i a lf o rt o o t h a d h e s i v ed r u gd e l i v e r yb yt h el o a d i n ga n dr e l e a s eo ft o o t h p a s t ea c t i v e s ，s ot h a tt h e e f f e c to ft h ea c t i v e sc a nb ep r o l o n g e d b i o a d h e s i v ec h i t o s a nn a n o p a r t i c l e sw e r e p r e p a r e dv i ae m u l s i f i c a t i o n c r o s s l i n k i n gm e t h o d c e t y l p y r i d i n ec h l o r i d ea n dn a f t t 浙江大学碗士学位论文 w e r el o a d e d ，s h o w i n gs u s t a i n e dr e l e a s ep r o p e r t i e s b o t hb l a n ka n da c t i v el o a d e d c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e sh a dg o o da d h e s i v ep r o p e r t i e so nh y d r o x y a p a t i t e o rg l a s s s u r f a c e f u r t h e r m o r e ，b l a n ka n dn a fl o a d e dc h i t o s a nn a n o p a r t i c l e ss h o w e dg o o d s t a b i l i t yw i t h i nt h et o o t h p a s t em a t r i x k e yw o r d s ：p o l y ( n i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ) ；t h e r m o s e n s i t i v e ；c h i t o s a n ；a d h e s i v e ；d r u g d e l i v e r y 1 1 1 浙江大学硕士学位论文 第章 第一章文献综述 1 1 聚n - 异丙基丙烯酰胺的温敏性及其应用 1 1 1 引言 智能聚合物的物理和化学性质在外界因素的刺激下会发生突变。它们可以是 聚合物水溶液，也可以是固定于载体表面的聚合物或交联的水凝胶。影响智能聚 台物性质的因素有p h 值、温度、离子强度、溶剂、光强度、电场、磁场等。当 这些因素发生变化时，智能聚合物的性质如相、形态、光学性能、力学性能、表 面能等会随之变化【l _ 5 】。 温敏聚合物是能够对温度刺激产生响应的智能聚合物。由于其对环境刺激特 别是温度的变化具有智能的可逆的响应而受到了广泛的关注。在外界的温度变化 下，温敏聚合物能产生相应的物理结构及化学性质的变化，响应过程中往往有显 著的溶胀变化。温敏聚合物的水溶液在受热后的溶解度变化呈现与一般物质截然 相反的规律：即当温度升高至某一特定温度后，聚合物的溶解度反而下降，甚至 发生相分离而从水溶液中沉淀出来。这一特定温度称为最低临界溶液温度 ( l c s t ) 。具有这一性质的温敏聚合物有n 取代丙烯酰胺类聚合物、羟丙基甲 基丙烯酸甲酯、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯基甲基醚等【6 】。 温敏聚合物在基础研究中有着重要意义，它们形成的纳米或微米尺度的智能 材料诸如凝胶、粒子、胶束、微囊等也有重要的应用价值。在温度、离子强度、 p h 值、溶剂、光等因素的调控下，这些不同物理形态的温敏材料可以对药物、 蛋白质、纳米粒子、d n a 等进行包埋和释放【7 _ l ”。 在各种温敏聚合物中，聚n 异丙基丙烯酰胺( p n i p a a m ) 由于l c s t 为常 温且低于人体体温，相转变明显且随温度变化可逆，因而受到广泛的重视。对 p n i p a a m 的研究始于1 9 5 6 年。1 9 6 7 年，s c a r p a 等人首次观察到了线型的 p n i p a a m 水溶液具有最低临界溶液温度的温敏现象。t a n a k a 等在1 9 7 8 年发现 了p n i p a a m 水凝胶有温敏性，并提出第一个关于水凝胶相转变的热力学理论。 8 0 年代初，日本学者伊藤昭二等人合成了聚甲基丙烯酰胺类聚合物。h i r o k a w a 、 t a n a k a 等人于1 9 8 4 年首次报道了非离子型p n i p a a m 在二甲基亚砜的水溶液中 浙江大学硕上学位论义第章 有体积相转变发生。目前，p n i p a a m 以及n 烷基取代丙烯酰胺聚合物是温敏高 分子领域的个研究热点。 1 1 2p n i p a a m 的结构与性质 n 一异丙基丙烯酰胺单体( n i p a a m ) 及聚合物的结构式如图1 1 所示，单体 含有不饱和c = c 双键，很容易打开进行自由基聚合，此外还含有亲水性的酰胺 基和疏水性的异丙基。单体常温下为白色片状晶体，分子量为1 1 3 1 ，熔点为6 0 6 3 ，沸点为8 9 9 20 c 2m m h g 。 c h 2 = c h i o = = c n h i c h h 3 c j c h f c h z c h 土 。一亡 i h 3 c j c h 3 图1 - 1n 异丙基丙烯酰胺单体及其聚合物结构式示意图 n i p a a m 单体聚合得到的聚n 一异丙基丙烯酰胺的大分予链上亦同时具有亲 水性的酰胺基和疏水性的异丙基，这种结构使线型p n i p a a m 的水溶液及交联后 的p n i p a a m 水凝胶呈现温度响应性，表现出最低临界溶液温度( l c s t ) ，亦称 浊点温度、雾点温度【l5 1 。当温度在l c s t ( 3 2 c 左右) 以下时，线型p n i p a a m 溶于水形成均相的溶液，以自由线团的构象存在：随着温度的升高，高分子链上 酰胺侧基和水形成的氢键结构被破坏，此时水分子被排出高分子链，高分子链上 的憎水基团发生聚集，使聚合物发生收缩 1 6 - 1 7 】；当温度升高至l c s t 时，聚合物 就沉淀出来，溶液发生相分离【l 。 在n i p a a m 聚合过程中加入交联剂( 如n ，n 亚甲基双丙烯酰胺) 或经处理 产生化学交联后，就成为p n i p a a m 水凝胶1 1 9 - 2 0 l 。它在室温下溶胀，而在3 2 。c 左 右，温度变化不到1 摄氏度就可以引发高达百倍的体积收缩变化。p n i p a a m 水 凝胶温敏相转变过程如图1 2 z ”。除了溶胀体积有这种突跃性变化之外，凝胶的 浙江大学硕士学位论文第一耄 其它性质如折射率、力学模量、表面能等也会同时发生突变，并且这些性质的变 化往往具有可逆性。 球 鱼 一一 永 图1 2p n i p a a m 水凝胶相转变过程示意图 承 1 1 3p n i p a a m 温敏机理的深入探讨 在对p n i p a a m 的研究中，人们关心的问题之一即是p n i p a a m 的温敏性机 理。对此，目前比较广泛接受的观点是：p n i p a a m 分子内具有一定比例的疏水 和亲水基团，它们与水在分子内、分子闻产生相互作用。低温时，p n i p a a m 与 水之间的相互作用主要是酰胺基团与水分子间的氢键作用。p n i p a a m 分子链在 l c s t 以下溶于水时，由于氢键及范德华力的作用，大分子链周围的水分子将形 成一种由氢键连接的、有序化程度较高的溶剂化壳层，聚合物分子在溶液中呈现 为被有序水分子包裹的伸展的无规线团状，使得体系的熵降低。随着温度上升， p n i p a a m 与水的相互作用参数改变，其分子内及大分子间疏水相互作用加强， 形成疏水层，部分氢键、大分子链疏水部分的溶剂化层、伸展的无规线团状结构 随之被破坏，体系的熵增加，聚合物线团呈现出紧缩的球状结构而从溶液中沉积 出来口2 1 。 其中，温度升高对疏水基团的影响表现在两方面：一方面疏水基团问的缔合 作用是吸热的熵驱动过程，即随温度升高，聚合物溶液体系的熵增加，疏水基团 的缔合作用增强；另一方面，疏水基团的热运动加剧，缔合作用减弱，同时，水 分子的热运动加剧，从而改变了疏水基团周围水分子的结构与状态，使水与疏水 基团的作用发生变化，疏水缔合作用进一步被削弱。总的结果是p n i p a a m 大分 子内及分子间疏水作用加强，形成疏水层，水分子从溶剂化层排出，表现为相变， 此时高分子由疏松的线团结构变为紧密的胶粒状结构，即发生c o i l g l o b u l e 转变 浙江大学硕上学位论文 第一章 口，从而产生温敏性。 p n i p a a m 水凝胶的温敏相转变是由交联网络的亲水性疏水性平衡受外界 条件变化而引起的，是大分子链构象变化的表现【2 4 1 。定性来看，水凝胶的溶胀 过程是水分子向凝胶内部扩散与凝胶侧链上亲水基团形成氢键的过程。当温度升 高时，氢键振动能增加，破坏氢键的束缚，使之断裂，水凝胶溶胀比则明显减少。 这是一个吸热过程，因为大量的结合水从高分子骨架上脱离出来，使水凝胶一水 体系熵增加l ”1 。 也有人对p n i p a a m 水溶液的温敏现象用聚合物溶解的热力学解释：根据 n e m e t h y s c h e r a g a 疏水相互作用理论，由于氢键的形成，其溶解过程的焓变h 为负值，即放热溶解。同时在溶解过程中，由于水分子包裹在分子链的疏水部分 形成较为规则的笼子结构，致使熵变as 也为负值。由于a g = h t s ，当温 度较低时，焓和熵的共同作用可以使g 0 ，从而发生相变口5 1 。 水中无机盐或有机盐的存在会影响p n i p a a m 水凝胶的溶胀行为，其中无机 盐对水凝胶l c s t 值的影响主要与阴离子的种类有关，而有机盐对l c s t 值的影 响与其烷基链长度有关。y o s h i o k a 认为温敏水凝胶的l c s t 受加入的盐的种类 和数量的影响2 刀，当提高盐浓度时，能造成盐析( s a l t o u t ) 的盐类会降低l c s t 值，而能引起盐溶( s a l ti n ) 的盐类会提高l c s t 值。此外，还有文献报道了d h 值、聚电解质等对p n i p a a m 及其水凝胶温敏行为的影响，多数认为是由于加入 的物质影响了温敏聚合物或其水凝胶内部的疏水相互作用，从而影响它们的温敏 行为。 1 1 4p n i p a a m 的共聚改性 p n i p a a m 水溶液在l c s t 之上，聚合物分予间的疏水相互作用占主导地位， 使聚合物从水相中沉积出来。但是，沉积的p n i p a a m 上8 3 羰基仍然与水分子 形成氢键。如果得到异丙基丙烯酰胺与其它单体的共聚物，便可以由另一单体的 亲疏水性来调节共聚物的l c s t 。共聚单体疏水性越强，共聚物的l c s t 就越低。 t a k e i 等【2 8 1 分别把n i p a a m 与疏水性的甲基丙烯酸丁脂( b m a ) 和亲水性的n n 一 二甲基丙烯酰胺( d m a a m ) 共聚，发现聚合物的l c s t 随前者比例的增加而降 浙江大学硕士学位论文第一章 ，从而产生濡敏性。 p n i p a a m 水凝胶的温敏相转变是出交联网络的亲水性疏水性平衔受外界 条什变化而引起的，是大分子链构象变化的表现i “1 。定性来看，水凝胶的溶胀 过程是水分子向凝胶内部扩散与凝胶侧链上亲水基团形成氢键的过程。当温度升 高时，氢键振动能增加，破坏氢键的束缚，使之断裂，水凝胶溶胀0 n 明显减少。 这是一个吸热过程，因为大量的结合水从高分子骨絮上脱离出来，使水凝胶一水 体系熵增加 2 5 1 。 也有人对p n i p a a m 水溶液的温敏现象用聚台物溶解的热力学解释：根据 n e m e t h y s e h e r a g a 疏水相互作用理沦，南十氢键的形成，其溶解过程的焓变h 为负值，即放热溶解。同时在溶解过程中，由于水分子包裹在分子链的疏水部分 形成较为规则的笼子结构，致使熵变s 也为负值。由于a g = a h t as ，当温 度较低时，焓和熵的共同作用可以使g 0 ，从而发生相变2 ”。 水中无机盐或有机盐的存在会影响p n i p a a m 水凝胶的溶胀行为，其中无机 盐对水凝胶l c s t 值的影响主要与阴离子的种类有关，而有机盐对l c s t 值的影 响与其烷基链长度有关2 ”。y o s h i o k a 认为温敏水凝胶的l c s t 受加入的盐的种类 和数量的影响口q ，当提高盐浓度时，能造成盐析( s a l t o u t ) 的盐类会降低l c s t 值，而能引起盐溶( s a l ti n ) 的盐类会提高l c s t 值。此外，还有文献报道了口h 值、聚电解质等对p n i p a a m 及其水凝胶温敏行为的影响，多数认为是由于加入 的物质影响了温敏聚合物或其水凝胶内部的疏水相互作用，从而影响它们的湿敏 行为。 1 1 4p n i p a a m 的共聚改性 p n i p a a m 水溶液在l c s t 之上，聚合物分子间的疏水相互作用占主导地位， 使聚合物从水相中沉积出来。但是，沉积的p n i p a a m 上8 3 0 蝴基仍然与水分子 形成氢键。如果得到异丙基丙烯酰胺与其它单体的共聚物，便可以由另一单体的 亲疏水眭来调节共聚物的l c s t 。共聚单体疏水性越强，共聚物的l c s t 就越低。 t a k e i 等口8 吩别把n i p a a m 与疏水性的甲基丙烯酸丁腊( b m a ) 和亲水性的n n 二甲基丙烯酰脏( d m a a m ) 共聚，发现聚合物的l c s t 随前者比例的增加而降 二甲基丙烯酰脏( d m a a m ) 共聚，发现聚合物的l c s t 随前者比例的增加而降 浙江大学硕士学位论文 第一章 低，随后者比例的增加而上升。k u r a m o t o l 2 9 1 制备了n i p a a a n 与乙烯基二茂铁的 共聚物，其l c s t 随二茂铁的含量增加而下降；而将二茂铁氧化则能使l c s t 明 显升高，因为此时的二茂铁基团由疏水性变成亲水性，这个l c s t 的改变过程是 可逆的，并且l c s t 的变化幅度随二茂铁的含量增加而增大。 n i p a a m 与其它单体共聚所得水凝胶的性质也会随共聚单体的种类和配比 的不同而变化。文献报道n i p a a m 与丙烯酸( a a ) 或甲基丙烯酸( m a a ) 3 0 - 3 3 的共聚物水凝胶具有温敏和p h 敏感的双重性质，共聚物中a a 的含量对水凝胶 的温敏性会有影响。吉静i m l 采用明胶( g e l a t i n ) 和n i p a a m 为原料，制备交联结 构不同的g e l a t i n p n i p a a m 水凝胶，研究了不同的p h 值、温度对它们的溶胀度 和溶胀速率的影响，从而理解明胶的交联结构对水凝胶的温敏性、p h 敏感性的 影响。 总之，通过改变单体组分从而改变共聚物中亲、疏水比例，可以影响共聚物 的l c s t ，并进一步探索温敏的机理；共聚单体的引入能够扩大p n i p a a m 的应 用范围，使其在具有温敏性的同时，还对其它刺激产生响应。 1 1 5p n i p a a m 及其衍生物的应用 1 1 5 1 药物释放体系 最理想的给药方式应该是为达到治疗目的，在需要的时刻，将所需剂量的药 物以合适的速率释放到人体所需要的部位，控制药物吸收，这种给药系统称为药 物释放体系( d d s ) 。智能凝胶是目前研究的药物释放体系中的主要材料之一。 在多种智能凝胶材料中，温敏水凝胶应用于药物控制释放具有其独特的优点：( 1 ) 温敏水凝胶对温度变化刺激产生响应，而体温变化是各种疾病常见的重要体征， 因此，温敏水凝胶控释药物应用范围非常广泛，可选择多种已有药物用温敏水凝 胶负载制成新的药物制剂，用于多种疾病治疗；( 2 ) 温敏水凝胶载体药物能够根 据患者体温的变化或在体外局部施加热场来实现药物的可控释放，控制方便。因 此温敏水凝胶在药物控制释放领域的应用前景十分广阔。在温敏水凝胶的相转变 温度l c s t 附近施加一个小的温度变化，凝胶的体积宏观上将发生突变，当撤 消外界施加的温度变化时，凝胶的体积会恢复原来的状态。利用这一特性，可以 浙江大学硕土学位论文第一毒 制成能定时、定量、定位释放药物的药物释放体系可以实现药物脉冲式释放( 药 物有一定的释药周期，一段时间释放药物，另外一段时问不释放药物，这样可以 免去多次服药) 、零级式释放( 在不需要释放药物的地方和时问不释放药物，这 样可以减少药物对人体其它部位的毒副作用) 。 用温敏水凝胶作载药基质，药物分子可以通过物理包埋或化学键合进入聚合 物网络中，凝胶中药物的通透性随凝胶含水率增加而增大，因此可利用凝胶的溶 胀度信号实施药物的释放控帛r j 3 5 1 。h o f f r n a n 等人认为p n i p a a m 水凝胶通过温度 调节实现对药物的控制释放有两种模式i 圳，即压榨式和皮壳式( 图1 3 ) 。 压榨式( 图1 - 3 a ) 是温度升高凝胶体积收缩，将其内部的溶液( 水和药物) 一起挤压出来，这是均聚p n i p a a m 水凝胶的释放方式，这种模式的缺点是溶胀 时药物也扩散，收缩时药物释放又太快，不能达到所希望的缓释、长效和零级释 放的要求。 当聚合物链中引入疏水组分后，p n i p a a m 共聚凝胶具有另一种释药模式， 即皮芯式模式( 图1 - 3 b ) 。当环境温度升高到其l c s t 以上时，水凝胶表面会收 缩成一个薄而致密的皮层，阻止凝胶内部的水分和药物向外扩散，即水凝胶处于 关闭状态；而当温度低于l c s t 时，皮层溶胀消失，水凝胶处于开放状态，内部 药物以自由扩散的形式向外释放。 药物溶液 t l c s t 时，水凝胶收缩而关闭反应，t l c s t 时，水凝胶又可溶胀而打开反应。 k o k u f u t a 等将兔肝脂肪酶固定于p n i p a a m 上，把这种凝胶放入丁酸乙酯 溶液中，其体积立即发生变化；但把不含酶的凝胶放入酶催化的反应物溶液中， 8 0 m i n 后才1 开始溶胀。h o s h i n o 【46 】等在碱性条件下，将淀粉酶固定在n i p a a 瑚甲 基丙烯酸缩水甘油酯共聚物上。与传统的酶固化法相比，该固定化酶的保留活性 高，并且能够重复使用。l 沁f e n g 等h7 】在n i p a a m 和n 丙烯酰琥珀酰亚胺( n a s ) 的共聚物凝胶上固定了嗜热菌蛋白酶( t h e r m o l y s i n ) ，固定了酶的水凝胶通过调 节体系温度下降或上升的循环可分别打开或关闭酶的活性，这样就可能实现酶活 性的开关。 1 1 5 4 转基因载体 虽然聚乙烯亚胺( p e i ) 及壳聚糖( c s ) 等是较常用的非病毒载体，但是p e i 表现出较强的膜破坏性和细胞毒性，并且同病毒载体相比，其转染效率也不高。 壳聚糖通过静电相互作用与d n a 形成复合物，限制了d n a 在细胞核内从载体 中的解离，影响了基因的表达效率。鉴于此，研究人员开始关注那些既能在运载 d n a 进入细胞核过程中与基因保持较高的结合力，又能在细胞核内降低与基因 的结合力以释放d n a 的新型载体。一个潜在的途径就是通过使用能够在不同温 度条件下发生构象变化或相变的温敏聚合物来调控其与d n a 的结合。 8 浙江大学硕士学位论文第一章 h i n r i c h s 等【4 8 】将异丙基丙烯酰胺与n ，n ( 二甲基胺乙基) 甲基丙烯酸酯的共 聚物( p n i p a a m c o d m a e m a ) 作为温度和p h 值响应的基因治疗载体。即使 d m a e m a 的含量只有1 5 ，在2 5 。c 时共聚物也能够与d n a 结合。光散射实验 显示，由于共聚物l c s t 降低，复合物中的共聚物可能形成沉淀。当共聚物中 n i p a a m 含量增加时，复合物的细胞毒性明显减小，且与共聚物分子量无关。复 合物的转染效率和共聚物与质粒的比例有关，呈钟形曲线( 先增后减) ，但是其 转染后的基因表达效率低于p e i 。研究还发现，成功转染的一个必要条件是形成 稳定的粒径为2 0 0 n m 的复合物，另外降低复合物的z e t a 电位使得转染效率和细 胞毒性都有所减小。 k u r i s a w a 等 4 9 1 将疏水共聚单元甲基丙烯酸丁酯( b m a ) 引入到 p n i p a a m c o d m a e m a 体系中来调节相变温度，结果发现可以提高与d n a 的 结合力。通过琼脂糖凝胶电泳的方法，分析了共聚物与质粒形成复合物的稳定性。 当温度高于l c s t 时，复合物中的d n a 完全被滞留在孔中，当温度低于l c s t 时，复合物中的d n a 就会部分解离出来。这个实验清楚地展示了由温度变化控 制复合物的形成与解离。进而在不同的温度控制条件下用复合物转染c o s 一1 细 胞，发现通过温度的变化可调控基因的释放与表达。 此外，利用p n i p a a m 的温敏性还可以将其用于免疫分析技术、生物大分子 的分离提纯等。 1 2 壳聚糖及其在生物医学领域的应用 1 2 1 引言 多糖是另一种良好的生物医用材料，在自然界中广泛存在。多糖作为所有生 命有机体的重要组分，是一类非常重要的天然高分子，在控制细胞分裂和分化、 调节细胞生长和衰老以及维持生命有机体的正常代谢等方面有重要作用。同时， 多糖也具备作为生物医用材料的基本要求，能够在生物体中酶解成易被活体吸 收、无毒副作用的小分子物质，不会残留在活体内，是一类生物降解吸收型高分 子材料。如改性纤维素、淀粉、各种葡聚糖、藻朊酸、透明质酸、肝素、壳聚糖 9 浙江大学硕士学位论文第一章 等都可作生物材料 5 0 - 5 4 。其中壳聚糖( c h i t o s a n ) 是日前研究最多的多糖类天然 高分子。 1 2 2 壳聚糖的结构与性质 壳聚糖学名为聚( 1 ，4 ) 2 氨基2 一脱氧一p d 葡聚糖，为半透明、略有珍珠光泽 的片状固体。其来源丰富，制备简单，是甲壳素的脱乙酰基产物。甲壳素是地球 上仅次于纤维素的最丰富的天然聚合物，主要存在于蟹壳、虾壳等的甲壳中。在 虾、蟹壳中的甲壳素与蛋白共价结合，以蛋白聚糖形式存在，同时伴生着碳酸钙。 所以制备甲壳素的方法虽多，但是都很相近，主要提取方法是脱钙和脱蛋白。而 由甲壳素制备壳聚糖的主要方法一般是碱脱乙酰法。除了化学方法制备壳聚糖以 外，许多微生物具有的生物降解作用，通过自身合成的几丁质酶、壳聚糖酶、几 丁质脱乙酰基酶等，也能将甲壳素转化为壳聚糖。 从结构上说，甲壳素、壳聚糖与纤维素极其相似，即吡哺糖环碳二位置上纤 维素是羟基，甲壳素是n 乙酰基，而壳聚糖是氨基。壳聚糖分子结构中由于含 有大量羟基、氨基及部分乙酰氨基等基团，在分子内及分子间存在大量氢键，它 的化学结构式如图1 4 所示。壳聚糖的脱乙酰度是其重要性质之一，它表明在壳 聚糖中自由氨基的量。 图1 4 壳聚糖的化学结构 壳聚糖不溶于水和碱性溶液，因分子中有n h 2 ，呈碱性，可溶于酸中，形 成粘性溶液。在酸性条件下，壳聚糖是一种线性高分子电解质，其游离氨基的氮 l o 浙江大学硕士学位论文第一章 原予上还有一对未结合的电子，使氨基呈弱碱性，能结合一个氧离子，从而使壳 聚糖成为带正电荷的聚电解质。 壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有许多独特的物理、化学性质和生 物功能。它具有优良的生物相容性和降解性，将其植入体内后，引起的生物组织 反应小，在体内能被溶菌酶等降解并代谢。壳聚糖的体内代谢首先是在溶菌酶的 作用下分解成低聚物，然后经过一系列化学反应，一部分以二氧化碳的形式由呼 吸道排除体外，另一部分则以糖蛋白的形式为人体吸收利用。因此壳聚糖的分解 产物无毒性，对身体健康无害f 5 5 l 。壳聚糖的弱碱性使其表面仅带有弱的正电荷， 不会对周围的组织产生强烈的刺激作用 5 6 - 5 7 】。不仅如此，壳聚糖还有止痛、止血、 促进伤口愈合、抗菌、抗酸、抗溃疡、降血脂和降胆固醇等多种作用 5 8 - 6 1 】。o k a m o t o 等 6 2 】研究了壳聚糖对由于稀乙酸溶液诱发的炎症疼痛的止痛作用机理，发现壳 聚糖由于吸收了乙酸在发炎部位释放出来的质子而起到止痛作用。血液凝结实验 表明壳聚糖对人和动物血液中的红血球都有凝聚作用，认为是由于壳聚糖分子链 所带的正电荷和与细胞表面带负电荷的胞壁酸的相互吸引而产生粘合作用，由于 壳聚糖与红血球的粘合作用引起细胞的聚集，从而促进血液的凝结，起到止血的 作用 6 。壳聚糖的抗菌作用一方面来自分子中所带的正电荷和微生物细胞膜所 带的负电荷的相互作用，导致细菌的蛋白质和微生物细胞成分的破坏而产生抗菌 作用【删；另一方面壳聚糖分子内丰富的羟基和氨基，可以作为鳌合剂选择性地 键合微量金属从而抑制毒素的产生和微生物的生长【6 “。 壳聚糖还对生物粘膜具有很强的特异黏附作用i 。壳聚糖分子中的氨基与 羟基可与粘液中的糖蛋白形成氢键而产生黏附作用。且粘膜中粘蛋白带有负电 荷，壳聚糖能与粘膜之间的电荷相互吸引，延长壳聚糖在体内特定区域的滞留时 间。以壳聚糖制备生物黏附制剂，其黏附性受壳聚糖类型和介质条件的影响，相 对分子质量大的壳聚糖对黏膜有很好的黏附性，且在酸性环境下黏附力最强【6 ”。 壳聚糖分子中的羟基和氨基容易进行化学修饰，形成壳聚糖的衍生物。壳聚 糖的衍生化反应为增强材料的生物活性和改善机械性能提供了新的途径，继而可 制成各种类型的膜、凝胶、聚电解质复合物等材料。通过在壳聚糖侧链引入功能 基团，破坏结晶区结构，增加非结晶区比例，不但可以改变其溶解性，而且可以 改变其物理与化学性质。可在伯胺基、伯羟基以及仲羟基上进行种种化学反应， 浙江大学硕士学位论文 第一章 如酯化、醚化、氧化、磺化以及接枝共聚等对壳聚糖进行改性。还可以与其它材 料复合，如壳聚糖羟基磷灰石、壳聚糖聚乙二醇、壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮、 壳聚糖聚乳酸、壳聚糖聚甲基丙烯酸羟乙酯等复合材料。 1 2 3 壳聚糖在生物医学领域的应用 由于壳聚糖独特的物理、化学性质和生物功能，它已在药物控释载体、固定 化酶、絮凝剂、人工透析膜、吸收缝合线、伤口涂敷料、人造皮肤等生物医药方 面有了广泛应用。 1 2 3 1 药物缓释制剂6 9 】 壳聚糖具有良好的凝胶特性及生物相容性，因而可制成膜、水凝胶、微球、 微胶囊等制剂作为药物缓释体系，在医疗过程中，对一些患处进行持续给药，缓 慢释放从而达到治疗效果。 ( 1 ) 壳聚糖水凝胶 由于壳聚糖很容易交联形成凝胶，因此被广泛地用来制备具有药物控释性能 的水凝胶。壳聚糖凝胶为物理和化学交联的网络，在网络中引入超分子相互作用 使其智能化，而形成智能凝胶。它是一种亲水性但不溶于水的高分子交联网络， 根据不同环境如温度、p h 值、电场强度、离子强度的变化，通过体积的溶胀和 收缩来响应这些来自外界刺激，从而起到药物控制释放的作用。 ( 2 ) 壳聚糖微胶囊和微球 微胶囊和微球由于它们较大的比表面积以及对人体内特定器官和组织的靶 向性而成为研究开发壳聚糖药物缓释体系的热点。目前己经制备出了含有抗癌 药、消炎药以及生化制剂的壳聚糖微胶囊和微球，这些微胶囊和微球的性能也得 到了广泛的研究。 ( 3 ) 壳聚糖膜 壳聚糖成膜后具有良好的生物相容性和通透性，在缓释药物和定向运送药物 方面具有重要的开发和研究价值，常常被用作药物缓释的载体。许多药物如抗菌 性、抗病毒性、抗炎性的药物加入到薄膜中，使用时将其植入患病处或通过口、 浙江大学硕士学位弛文 第一章 鼻、粘膜给药。这样药物会在一个较长的时间内慢慢地释放出来，以达到持续给 药的目的，加强治疗的效果。 1 2 3 2 手术缝合线及医用敷料 用壳聚糖制成的外科手术缝合线具有良好的机械性能和促进伤口愈合等药 理作用，可被人体吸收，免去拆线感染，减轻病人痛苦，同时比人工合成纤维容 易打结，很好地保持其强度。还可以通过对壳聚糖的化学修饰进行功能化改性， 以改善天然材料在体内环境中抗张强度损耗快的缺点，同时也避免了较大的组织 反应。 由于壳聚糖具有止血、抗菌等作用，用壳聚糖制成细粉或膜片可以作为良好 的创伤敷料，用于烧伤、植皮等部位的创面保护，能够消炎止痛、促进伤口愈合、 减轻疤痕。由于壳聚糖所形成的膜较脆，力学性能不好，往往需要通过与其它材 料共混改善其力学性能。通过共混的方法也可以把不同材料的优异性能有效结 合，从而进一步改善伤口敷料的治疗效果。 1 2 3 3 组织工程材料【7 1 组织可视同细胞复合材料，它由起功能作用的细胞和其分泌的细胞外基质 ( e c m ) 组成。e c m 提供细胞信息，细胞则指导e c m 的合成。e c m 是由蛋白 质和糖胺聚糖( g a g ) 构建的物理和化学交联网络。壳聚糖的结构与g a g 有相 似之处，具有良好的生物相容性，可调节的生物降解性能，还能通过各种途径如 相分离、纤维连接和溶液浇注等方法制备成具有不同微观形貌和宏观形状，并且 具有一定力学强度适应不同部位的组织缺损修复要求的三维多孔支架。此类壳聚 糖支架可用作生物活性物质的载体使后者缓慢释放，支持种子细胞如成纤细胞、 角质形成细胞、内皮细胞、成骨细胞、软骨细和肝细胞等的黏附与分化。 同时，在修复过程中壳聚糖可以加快伤口愈合，因为它能刺激免疫细胞分泌 生长因子、细胞因子，使之作用于缺损周围的细胞，加快其增殖，从而加速植入 支架与正常组织的融合。 浙江人学硕士学位论文第一章 1 3 口腔药物缓释体系 口腔药物缓释体系是在口腔给药，通过黏附材料与口腔的黏附作用，延长制 剂在口腔中的滞留时间，从而发挥局部疗效或全身治疗作用，提高药物的生物利 用度。它具有缓释和定位的特点，是近年来发展的一种新型生物黏附给药系统。 1 3 1 口腔粘膜黏附给药系统 目前口腔药物缓释体系的研究主要集中在口腔粘膜黏附给药系统，它是利用 黏附性的聚合物为载体，与口腔粘膜产生黏附作用