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原位交联聚富马酸酯水凝胶 中文摘要中文摘要 组织工程学科的进展加速了对具有生物相容性、生物降解性和一定力学性能 且可与目标组织整合的新型生物材料的需求。从仿生学角度考虑，可注射水凝胶 是研究开发新型组织工程材料的一种有效策略。 本论文研究了富马酸聚乙二醇酯预聚物( o p f ) 的合成方法，讨论了聚乙二 醇( p e g ) 相对分子质量对预聚物结构与性能的影响。采用傅立叶变换红外光谱 ( f t _ m ) 、核磁共振波谱( n m r ) 、差示扫描量热分析( d s c ) 、凝胶渗透色谱 ( g p c ) 等测试手段对其结构进行了表征。随后，以水溶性引发剂( 过硫酸铵一 抗坏血酸) 引发共聚o p f 和二甲基丙烯酸聚乙二醇酯( p e g - d m a ) 或二丙烯酸 聚乙二醇酯( p e g d a ) ，制备出可在生理条件下凝固的原位交联水凝胶，并探 讨了p e g 分子量、原料组成和反应条件对水凝胶理化性能和溶胀特性的影响。 f t - i r 分析结果表明，o p f 与p e g d m a 或p e g d a 经共交联形成的水凝胶是以 p e g 为主体结构的聚酯化合物。随着p e g d m a p e g 。d a 加入量的增多，水凝 胶的压缩强度逐步提高，但凝胶时间逐渐缩短。随着引发剂加入量的增多，水凝 胶的凝胶时间缩短，同时由于交联程度提高，水凝胶的抗压缩性能加强。当选择 适宜的物料配比时，水凝胶在凝胶过程中始终保持3 7 3 9 5 c 范围的温度，与人 体的生理体温非常接近。流变性能测试结果显示四种不同相对分子质量的p e g 制备的水凝胶的凝胶起始点一致，但p e g 相对分子质量较高的水凝胶完全交联 所需的时间较短。 以巯基乙酸( t g a ) 和4 一丁巯内酯( b t l ) 对壳聚糖( c s ) 和明胶( g e l ) 进行了巯基化改性。结果表明，在水溶性碳二亚胺( e d a c ) 或眯唑的促进作用 下，巯基被共价键合到c s 或g e l 上。x p s 分析证实c s 上的氨基与t g a 上的羰 基反应形成了酰胺键，从而将巯基引入到c s 中，但巯基大部分被氧化而失去活 性。随着贮存时间的延长，各改性物中的巯基含量逐步降低。向c s - t g a 加入 p e g d a 后其自由巯基大部分消失，预测巯基与双键发生了m i c h a e l 加成反应。 关键词：富马酸聚乙二醇酯预聚物，聚乙二醇，水凝胶，壳聚糖，明胶，巯基化 原位交联聚富马酸酯水凝胶 a b s t r a c t t h ee x p a n d i n gf i e l do ft i s s u ee n g i n e e r i n ga p p l i c a t i o n sh a sa c c e l e r a t e dt h e n e e do fm a t e r i a l sw h i c ha r et i s s u ec o m p a t i b l e b i o d e g r a d a b l ea n dw i lm e c h a n i c a l p r o p e r t i e ss i m i l a rt ot h et a r g e tt i s s u e s f r o mt h eb i o m i m e t i cp o i n to fv i e w , d e v e l o p m e n to fh y b r i di n j e c t a b l e h y d r o g e l sm i g h tb e a l le f f e c t i v es t r a t e g yi nc o n s t i t u t i o no f t i s s u ee n g i n e e r i n gm a t e r i a l s i nt h i sw o r k ，an o v e lo l i g o m e rb a s e do na l t e r n a t i n gf u m a r i ca c i da n dp o l y ( e t h y l e n e g l y c 0 1 ) ( p e g ) u n i t sw a ss y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yu s i n gf t - i r , n m r ，d s c a n dg p c s u b s e q u e n t l y , o l i g o ( p e gf u m a r a t 0 ( o p f ) a n dp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) d i m e t h a c r y l a t e ( p e g - d m a ) o rp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) d i a c r y l a t e ( p e g - d a ) w e r e c r o s s - l i n k e di np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n 、v i mar a d i c a li n i t i a t o rt of o r mp o l y f u m a r a t e h y d r o g e l t h es t u d i e sw e r ed e s i g n e dt od e t e r m i n et h ee f f e c t so fc h a n g e si ns t a r t i n g c o m p o n e n t s ，f o ri n s t a n c et h ew e i g h tr a t i oo fo p fa n dp e g d m a ( o rp e g - d a ) o n p h y s i c o - c h e m i c a lp r o p e r t i e so ff o r m e dh y d r o g e l s t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h eo p f h a de n dp e gc h a i n sa n dm u l t i p l ef u m a r a t eg r o u p sa l o n gi t sm a e r o m o l e c u l a rc h a i n f t - i rs p e c t r as h o w e dt h a to p fa n dp e g d m a p e g d aw e r ec r o s s l i n k e dt of o r m p o l y f u m a r a t eh y d r o g e l s a ni n c r e a s ei nt h ei n i t i a t o ra n dp e g d m a ( o rp e g - d a ) r e s u l t e dad e c r e a s eo fg e l a t i o nt i m ea n de n h a n c e m e n to ft h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e s t h et e m p e r a t u r ew a sm a i n t a i n e da t3 7 - 3 9 5 c d u r i n gc r o s s l i n k i n gr e a c t i o ni n a p p r o p r i a t ef o r m u l a t i o n s r h e o l o g i c a la n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h e f o u rf o r m u l a t i o n s w i t hd i f f e r e n ti n i t i a lp e gm o l e c u l a rw e i g h th a dt h es a l n eo n s e to fg e l a t i o nb u tt h a tt h e o p fh y d r o g e lw i t hh i g h e ri n i t i a lp e gm o l e c u l a rw e i g h tf i n i s h e dc r o s s l i n k i n gi na s i g n i f i c a n t l ys h o r t e rt i m e a d d i t i o n a l l y , t h i o l a t e d c h i t o s a na n dg e l a t i nw e r es y n t h e s i z e db yu s i n g t h i o g l y c o l i ca c i d ( t g a ) o r4 - b u t y r o t l l i o l a e t o n e ( b t l ) t h a ta l l o w e dh o m o g e n e o u s m o d i f i c a t i o nw i t h o u ts h a r pd e c r e a s eo f p o l y m e rp r o p e r t i e s m e d i a t e db yc a r b o d i i m i d e ( e d a c ) o ri m i d a z o l e ，m e r c a p t og r o u pc o v a l e n t l ya t t a c h e dt oc h i t o s a n ( c s ) a n d g e l a t i n ( g e l ) x p sa n a l y s i sc o n f i r m e dt h ef o r m a t i o n o fa m i d eb o n db e t w e e nt h e p r i m a r ya m i n og r o u p so ft h ec sa n dt h ec a r b o x y l i cg r o u po ft g a ，h o w e v e rt h e a t t a c h e dm e r c a p t og r o u p sw e r eo x i d i z e dm o s t l y i na d d i t i o n ，as i g n i f i c a n td e c r e a s i n g i nt h em e r c a p t og r o u pc o n t e n t sw a go b s e r v e da tu s u a ls t o r ec o n d i t i o n c s t g aw a s 原位交联聚富马酸酯水凝胶 c o u p l e dt op e g d av i am i c h a e l - t y p ea d d i t i o nw h i l em e r c a p t og r o u p so fc s - t g a w e r er a p i d l yd i s a p p e a r e d k e y w o r d s ：o l i g o ( p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) f u m a r a t e ) ，p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ，h y d r o z e l ， c h i t o s a n ，g e l a t i n ，t h i o l a t e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨壅盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 靴敝储戤：弘嚏辩醐：蛳月加 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤壅盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权盘注盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 一躲歹娩一名：早蛾 签字日期：2 胡歹璋 ，月，3 日 签字曰期啦年 月i 只 第一章绪论 1 1引言 第一章绪论 应用工程科学和生命科学方法构筑人工结构物以引导组织重建的组织工程 日益引起人们的关注。人们期望以低侵入性较小痛苦方式治疗疾患。组织工程常 用的策略是从患者的小块活体组织中分离出特异细胞，在精确控制的培养条件下 使细胞在三维多孔支架内生长、扩增形成结构物，再将细胞，支架结构物植入到 体内所需部位，引导新组织在支架内形成，而支架随着组织的形成而逐渐降解消 失，损伤的器官或组织得以重建。生物材料支架起着细胞生长和干细胞分化成特 异细胞的力学支撑作用，也发挥着细胞活性因子控制释放载体的功能1 1 j 。 生物材料在大多数组织工程策略中起着重要作用。理想的生物材料支架即合 成细胞外基质应能使细胞组织构成三维结构，提供刺激，引导期望组织形成及生 长。针对不同组织的特性和功能，所设计的支架材料及其性能也应有所不同。常 用的支架材料如聚( 丙交酯共乙交酯) 或聚( 乳酸共乙醇酸) ( p l g ) 已被美 国食品与药物管理局( f d a ) 批准用于体内，但因其疏水性过强，在较苛刻条件 下才能加工，不利于生长因子的负载和活细胞的转载，因此使用高度水合的聚合 物材料( 水含量 3 0 w t ) 水凝胶作为支架材料，便成为组织工程的另一种选择。 水凝胶是由亲水性聚合物链构筑的网络。此类聚合物链既可以是天然源亦可以是 合成聚合物。水凝胶的结构整合性与其大分子交联机理相关。它们的交联机理包 括各种化学键以及物理性的超分子相互作用。水凝胶大都能降解，并能在较温和 条件下加工成型。水凝胶的力学性质和结构特性类似于许多组织和细胞外基质 2 i 1 2 水凝胶的形成 许多天然源聚合物及合成聚合物均可形成水凝胶而作为组织工程支架使用 ( 表1 1 ) 3 1 。天然水凝胶因其来源不同 ( 表1 1 ) 3 1 。天然水凝胶因其来源不同 结构与性能存在批次间差异，因此有 结构与性能存在批次问差异，因此有 第一章绪论 一定的局限性，这就促使人们考虑使用合成水凝胶的可行性。合成水凝胶由于结 构与性能可精确调控，避免了不同批次间的差异。 表卜1构建水凝胶的几种亲水性聚合物 t a b l e i l h y d r o p h i l i cp o l y m e rf o rh y d r o g e l s 天然聚合物合成聚合物杂化物聚乙二醇多肽共聚物，海藻酸接枝p e o p p o p e o ，海 藻酸。丙烯酸共聚物、透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺 注：p a a m - 聚丙烯酰胺，p e g - 聚己二醇，p l a - 聚乳酸，p l g a 景( 乳酸珙- 乙醇酸) ，p c l - 聚已内酯，p e o - 聚氧化乙烯，p p o 聚氧化丙烯，p h e m a - 聚甲基丙烯酸羟乙酯，p n l p a a m 聚异丙基丙烯酰胺，p x a - 聚乙 烯醇，p p f - 聚富马酸丙二酵酯 这些水凝胶中琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、胶原、血纤蛋白、明胶和透明质 酸以及p e o 、p v a 、p ( p f e g ) 等在组织工程中应用较广。 1 2 1 天然衍生材料水凝胶 天然衍生的聚合物水凝胶由于其组成与结构类似于天然细胞外基质，因此常 用于组织工程领域。例如胶原是哺乳动物组织细胞外基质的主要蛋白质，明胶则 是其变性衍生物，而透明质酸常存在于成年动物的各种组织中。此外，海藻酸盐 和壳聚糖均是亲水性的线性多糖，结构类似于糖胺聚糖，植入体内后异体反应小， 一2 一 第一章绪论 故可作为组织工程支架材料使用。根据需要它们之间可共混使用，如胶原和壳聚 糖的共混物制各的多孔支架可作为人工皮肤。而明胶和壳聚糖以戊二醛【4 】共交联 后通过冷冻干燥也可制各多孔支架，可望将其用于皮肤和软骨组织工程。明胶的 加入改善了壳聚糖的细胞相容性，利于成纤维细胞的黏附与增殖，而壳聚糖的引 入则能提高明胶膜材的力学性能1 5 】。 透明质酸( h a ) 是哺乳动物组织和液体中最常见的糖胺聚糖，由( 1 3 ) 和( 1 4 ) 键合b - d 葡萄糖醛酸和n 乙酰基一b - d 葡萄糖胺重复二糖单元组成 ( 图1 - l a ) 。h a 经化学或物理交联可形成水凝胶。h a 及其衍生物广泛作为细胞 生长和组织修复的生物材料使用。而h a 生物材料的强亲水性和大量的阴离子宫 能团不利于阴离子性细胞表面的黏附。细胞通常在中性、疏水性或聚阳离子表面 黏附较好。p r c s t w i c h 等 q 用3 3 二硫代双( 丙酰肼) 修饰h a 后再用二硫苏糖 醇还原制备出h a 的硫醇衍生物，与明胶的硫醇衍生物共混后经空气氧化能形成 二硫键交联的h a - 明胶水凝胶，其薄膜适于鼠3 t 3 成纤维细胞的培养。 、穆珂靓。 ggm ( b ) 恒释h 2 0 h 寸 ( c ) 图1 1天然衍生聚合物水凝胶的结构式 ( a ) 透明质酸：( b ) 海藻酸盐；( c ) 壳聚糖 f i g u r e l 一1 s t r u c t u r eo f n a t u r a l l yd e r i v e dh y d r o g e lf o r m i n gp o l y m e r s ( b ) h a( ”a l g i n a t e( c ) c h i t o s a n 第一章绪 论 姚等【7 】将h a 引入到壳聚糖明胶体系中，通过鼠成纤维细胞的细胞周期和细 胞凋亡分析确认，h a 的加入可缩短细胞在壳聚糖明胶水凝胶薄膜表面的适应时 间，使细胞尽快进入正常的细胞周期；h a 能有效地抑制材料诱发的细胞凋亡， 其效果与组织培养聚苯乙烯板无显著差异。值得指出的是，适宜的h a 量( o o l o 1 ) 才能促进人成纤维细胞的黏附，迁移和增殖，这可能与膜材的适宜电荷密 度相关悼j 。 海藻酸盐是由褐藻中提取的多糖，它是b d 甘露糖醛酸( m 单元) 和a l - 古洛糖醛酸( g 单元) 无规共聚的线性多糖( 见图1 1 b ) ，其碳6 位上的羧基能 形成盐。二价离子如c a 2 + 、b a 2 + 或s ，与海藻酸盐的g 单元嵌段发生协同相互作 用，从而在不同聚合物链间形成离子桥而转变成水凝胶。通过改变m g 比率及 聚合物的相对分子质量可调控水凝胶的交联密度、孔隙及力学性质。离子交换反 应将影响水凝胶的刚性，从而使海藻酸盐水凝胶逐渐溶出。海藻酸盐部分氧化得 到的氧化海藻酸盐，由聚醛基古洛糖醛酸( p a g ) 赋予其降解性能1 9 j 。 1 2 2 合成聚合物水凝胶 合成聚合物水凝胶因其结构与性能可控，重复性好，故适用于组织工程。聚 氧化乙烯0 e o ) 是f d a 批准的用于组织工程的常用水凝胶聚合物。聚氧化乙烯及 与其相似结构的聚乙二醇( p e g ) 均是亲水性聚合物( 图l - 2 a 和b ) ，它们的两 端被丙烯酸或甲基丙烯酸修饰后通过紫外辐照交联可形成水凝胶。将p e o 与氧 化丙烯( p p o ) 或聚( l 乳酸) 共聚可制备嵌段共聚物( p e o p p o p e o 或 p e g - p l l a ) ，它们均是热可逆性水凝胶，由疏水性嵌段聚集而形成物理交联结 构。聚乙烯醇( p v a ) 水溶液经反复冷冻熔融后可形成水凝胶，还可由戊二醛 或二元羧酸( 丁二酸、己二酸) 的酰氯衍生物化学交联而形成水凝胶。 聚富马酸丙二醇酯( p p f ) 是疏水性线形聚酯( 图1 - 2 d ) ，其酯键可参与水解。 p p f 与亲水性p e g 共聚可制备嵌段共聚物，进而通过化学交联或紫外辐照而形 成亲水性网络结构。如聚富马酸丙二醇酯双丙烯酸酯( p p f d a ) 与p p f 共混后 经光辐照即可制得交联水凝胶，其降解产物主要包括富马酸、丙二醇等生物相容 性物质。此类p p f 水凝胶抗压缩性能好，适于做可注射支架材料。 第一章绪 论 斗卜唾巾一 任hf h 乇 。制一十n 一矿。_ h f i g u r e l - 2 s t r u c t u r eo f s y n t h e t i ch y d r o g e lf o r m i n gp o l y m e r s 1 3 水凝胶的应用 在组织工程领域水凝胶有许多不同的功能。它们被用来填充缺损、传递生物 活性分子和组织细胞，最终形成所期望的三维组织结构。缺损填充物是最简单的 支架，常常应用于很多方面，包括填充剂、防粘连剂和生物“胶”，水凝胶支架 传递的生物活性分子包括促进血管形成的因子，也包括对分泌性细胞的包囊。水 凝胶支架还被用来移植细胞以及工程化几乎体内的所有组织，包括软骨、骨和光 滑肌等。 1 3 1 缺损填充物支架 缺损填充物支架是指那些能提供填充、防粘连和类似生物“胶”性能的支架。 此时对水凝胶最基本的设计要求是能够在治疗期间维持所希望的体积和结构整 合性。作为一种膨胀材料，这些植入物被用来治疗如尿失禁和膀胱、输尿管反流 等疾病，而整形外科也需要同样的材料u 0 1 。人们发现它们还可以防止术后粘连， 也可做为软组织的生物粘合剂使用。 海藻酸盐、壳聚糖和胶原水凝胶支架显示出在缺损填充方面的应用潜力。精 氨酸甘氨酸天冬氨酸( r g d ) 多肽序列改性的海藻酸盐多孔支架已经被成功地 植入n d , 鼠体内，几乎没有发生炎症反应，也没有形成包囊，组织生长良好u o j 。 第一章绪论 多孔壳聚糖支架植入到小鼠体内后，也几乎观察不到炎症反应，也没有发现包囊 的形成，但支架边缘的组织生长受到抑制【i ”。戊二醛交联的胶原水凝胶支架作为 填充物已经成功地用于治疗尿失禁1 2 l ，但需要不断注射以维持其功能。使用胶 原类水凝胶时需要考虑由胶原酶引起的材料的部分降解，而用戊二醛交联后会延 缓降解过程，但并不能完全解决这个问题。聚糖酐透明质酸共聚物被用作治疗 膀胱、输尿管反流的填充物，此时要求这类共聚物不但具有可注射性，还具有可 降解性。 1 3 2 生物活性分子控制释放载体 与缺损填充物不同，水凝胶支架也常常被用于固定和传递生物活性分子或包 囊分泌性细胞。目前，大部分进入病人体内的大分子或小分子药物通常采用口服 或静脉注射方式。由于药物的酶解以及对其他组织的毒副作用，大剂量用药时通 常要求产生预期的局部效应。例如，大量血管内皮细胞生长因子( v e g f ) 的系 统传输会促进局部血管的形成，但也可能造成非目标组织的血管再生、动脉粥样 硬化斑块的出现或肿瘤生成等严重的副作用【1 3 1 。此外，对某一种组织必需或有 益的许多因子对其他组织可能是有害的。因此，将药物局部或特定传递到选定组 织的载体或支架的研究与开发具有重要意义。 很多水凝胶支架可成功地结合蛋白质并将其释放出来。目前研究最多的蛋白 质之就是v e g f 。掺有v e g f 的离子交联型海藻酸盐水凝胶 1 4 , 1 5 1 和戊二醛交联 的胶原海绵【1 6 1 都有报道。海藻酸盐支架中的v e g f 通过扩散或机械刺激释放出 来，而胶原凝胶中的v e g f 则是通过水凝胶的降解被释放出来。体内实验确认 血管在移植部位形成，表明这类体系的有效性。另一种血管形成促进因子如成纤 维细胞生长因子( f g f ) 也可以从肝素凝胶【1 7 l 中缓慢释放出来，起到促进血管形 成的作用。 许多其他水凝胶体系也被研究用于药物传递，包括热敏感的可降解性 p e o p l l a 凝胶 1 4 , 1 8 j 、丙烯酸乳糖酯- n 一乙烯，2 一吡咯烷酮水凝胶 1 9 1 、热响应性 p e g p l l a 凝胶2 0 1 以及戊二醛交联的壳聚糖微球等。 通过使细胞分泌所期望活性物质的细胞包囊技术可构建长期释放型药物控 释体系。目前，大多数由酶或激素不足引起的疾病都可通过口服或注射所缺的活 第一章绪论 性物质来治疗。细胞包囊技术提供了一种根据身体需要长期释放活性物质的方 法。很多分泌性细胞包括胰岛细胞【2 1 , 2 2 1 、肝细胞、肾上腺皮质细胞以及被转移以 表达特定的酶和生长因子的细胞都以水凝胶包囊的形式用于治疗相应的疾患。 由于离子交联型海藻酸水凝胶降解缓慢，与细胞容易混合，在温和条件下可 以凝胶，因此常被选作细胞包囊支架材料。已经研究出c a 2 + 或b a 2 + 交联海藻酸 盐微球脚1 和表面包有海藻酸的p l l a 微囊 2 4 j 。此外，p e g 也用于包覆海藻酸盐 微囊2 5 1 ，有人还直接将细胞包于其中【2 6 1 。包于离子交联型海藻酸盐微囊中的胰 岛可被免疫隔离并稳定释放出对葡萄糖敏感的胰岛素。而包囊于光交联p e g 水 凝胶中的胰岛也显示出类似的功能。此时扩散限制，尤其是氧的扩散限制降低了 包囊中心部位细胞的活性，从而阻碍了包囊尺寸的增加。此外，海藻酸盐植入物 周围形成的纤维变性包囊也使其通透性降低，造成胰岛素释放量减少并导致细胞 死亡【2 3 1 。抑制纤维变性包囊形成的一种方法是在海藻酸盐聚赖氨酸( p l l ) 微 球的外部再包一层光交联的p e g 。研究表明，海藻酸盐中的不纯物是造成移植 物过渡生长的根本原因。因此良好的纯化过程可以延长被包埋胰岛的功能。有研 究人员正在试图通过将血红蛋白固定在微囊的海藻酸盐基体中以提高氧的传输 能力【翻。 1 3 3 组织细胞转载系统 亲水性聚合物的三维结构为细胞的黏附与增殖提供了三维空间，因此水凝胶 支架被广泛应用于传递细胞以及组织工程产品的开发。通过加入生长因子，水凝 胶可以提供化学信号，而通过对材料机械性能的调控可提供力学信号。目前，水 凝胶支架已被广泛地应用于组织工程领域，包括软骨、骨、肌肉、脂肪、肝和神 经等方面。 水凝胶具有与软骨相似的大分子结构。软骨是软骨细胞包埋于型胶原和糖 胺聚糖( g a g ) 形成的交联网络中的高度水合组织。研究者们已合成了大量载 有软骨细胞的水凝胶支架，并通过体外和体内实验确认了它们的有效性。体外实 验结果证实支架的机械强度、生长因子的传递能力和支架材料的化学结构对所包 埋软骨细胞的表型表达起到关键作用。光交联形成的p e o 和冻干后的壳聚糖支 架具有较高模量( 5 0 0 k p a ) ，而研究表明使软骨细胞增殖而抑制其分化功能的较 一，一 第一章绪论 硬基体材料会导致i i 型胶原合成量的降低1 2 7 1 。类胰岛素生长因子( i g f i ) 和转 化生长因子( t g f 1 31 ) 的双释放可促进软骨细胞的增殖l 。而只含有海藻酸盐 和透明质酸的强度较低的水凝胶增强了软骨细胞表型和i i 型胶原的表达 2 9 i 。也 有研究表明透明质酸的存在并不足以增强软骨细胞的增殖和特征蛋白质的合成 能力。一般来说，为了确保细胞的数量，初始的细胞增殖是重要的，但软骨 的最终形成取决于g a g 的合成和i i 型胶原的表达能力。 在软骨组织工程中，一种新型的可降解线型水凝胶聚( 富马酸聚乙二醇酯) ( o p f ) 引起人们的关注。可将o p f 和r g d 肽混合后注射到目标部位或定型后 将其移植【3 “。动物实验结果表明植入物周围形成纤维包囊，且只引发小范围的 炎症反应。研究显示通过控制o p f 水凝胶的大分子结构可以达到调控植入物降 解行为的目的。尽管吸收大量的体液，但它们维持了自身的有机形态，恰当填充 了软骨缺损。s h i n 3 2 1 等的研究表明o p f 是一类较好的可注射材料，并且极适合 作为可降解的生物支架材料和细胞载体 3 3 应用于组织工程领域。 以上研究都没有涉及控制支架中的细胞存活量问题。强亲水性的水凝胶用于 组织工程时的一个缺点是缺乏和细胞的结合位点，因此必须对这类水凝胶进行改 性修饰，以增强材料和细胞的相互作用。如将黏附肽和信号肽共价偶联于海藻酸 盐水凝胶中，可影响细胞的黏附和组织的形成。相对于空白凝胶，粘附肽r o d 的存在可明显提高海藻酸盐水凝胶支架中的骨生成量。而将低聚肽如骨形态发生 蛋白( b m p 一2 ) 固定在海藻酸盐凝胶中可促进异位骨的形成p 。 p e g 水凝胶在工程化血管方面也有相当的应用。相对于没有修饰的p e g 水 凝胶，掺入黏附蛋白质、酶降解位点和生长因子的p e g 支架已经被证实可加强 光滑肌细胞分泌胶原蛋白的能力。而酶降解位点的存在可促使细胞通过凝胶迁 移，与不可降解凝胶上的细胞相比合成更多的胶原蛋白。可以设想，采用此类水 凝胶支架，结合外部力学信号可开发出与人体血管相近的血管光滑肌。有迹象表 明通过该途径可增强工程光滑肌的强度和功能【3 5 ，3 “。 除了应用于工程化的骨、软骨和光滑肌外，水凝胶支架已经应用于工程化人 体几乎所有的组织。例如，固定有胶原和肽的海藻酸盐 3 7 1 已经用于骨骼肌的工 程化。而种植有猪脂肪细胞的胶原凝胶已经被广泛应用于工程化大血管p 。海 藻酸盐水凝胶也可作为修复神经的雪旺细胞和促进肝细胞功能的【3 9 】支架。通过 第一章绪论 加深对这些水凝胶材料与人体组织及其中的生物活性因子相互作用的认知，可设 计出性能优化的工程化组织。 1 4 聚富马酸酯类聚合物 近几十年来，随着各学科领域之间的不断渗透，生物医用材料的研究与开发 进展迅速，人工骨、人工脏器的研究开发和不断的完善成为新世纪科研领域的新 的亮点，人们在寻求合理有效治疗方法的同时，也开始注重手术过程和所用材料 制备的简单易行。聚富马酸酯以其良好的可注射性、可生物降解性和生物相容性 而备受瞩目。近几年来，欧美部分科学家己对聚富马酸丙二醇酯( p p f ) 、富马 酸聚e , - - 醇酯预聚物( o p f ) 及由其合成的复合材料的生物学特性和力学性能等 做了大量的研究，并取得了一定的成果。 1 4 1 聚富马酸丙二醇酯( p p f ) 聚富马酸丙二醇酯( p p f ) 作为一种不饱和线性聚酯，其良好的水解性、可 注射性逐渐引起了人们的关注。经过科学家们的不断摸索和实践，目前p p f 的 制备一般采用两种合成途径。第一种是通过两步反应法合成聚富马酸丙二醇酯 【4 0 1 。将富马酸二乙酯( d i e t h y lf u m a r a t e ，简称d e f ) 、丙二醇( p r o p y l e n eg l y c o l ， 简称p o ) 、氯化锌和氢醌按一定比例在真空条件下加热使之进行酯交换反应，洗 涤后经真空干燥和旋转蒸发等工序制得p p f 。第二种p p f 的合成方法是将d e f 、 p g 、氯化锌按一定比例在通氮条件下形成中间产物，然后在低压下将其酯交换 成p p f ，当达到预期相对分子质量时停止反应，经洗涤提纯、旋转蒸发和真空干 燥得到最终的p p f 。根据研究目的和测试手段的不同，研究人员采用不同的制各 途径，但与以上两种方法大致相同。 大量研究结果显示细胞并不能在可注射型骨修复材料中成功存活。而p e t e r 等【4 1 1 的研究表明，尽管骨髓间质细胞诱导的成骨细胞不能在未完全交联的p p f 材料上存活，但完全交联的p p f 复合材料却非常适合此类细胞的黏附和增殖。 基于此，r i c h a r d 等【4 2 】作了大量的工作，他们以n 吡咯烷酮( n v p ) 为交联剂 通过光交联制备了p p f 复合材料，并将骨髓间质细胞诱导的成骨细胞植入其中， 第一章绪论 进行了有关细胞增殖和细胞功能的研究。他们使用脱氧核糖核酸、h 一胸( 腺嘧啶 脱氧核) 苷( h - t h y m i d i n e ) 、磷酸钙、骨钙蛋白和钙量测定来研究种植于完全交联 p p f 中的被包细胞和未被包细胞在2 8 天内的活性、增殖状况和表型表现。虽然 设计实验的目的主要是对被包细胞和未被包细胞活性的对比，但研究结果也表明 完全交联且没有沥滤的p p f 复合材料与交联不完全的p p f 复合材料以及组织培 养聚苯乙烯( t c p s ) 相比，完全交联p p f 非常适于细胞的生长和成骨细胞表型 的表现。他们的进一步研究表明【4 引，包有细胞的水凝胶微粒的存在并不影响p p f 复合材料的交联能力，随着p p f 交联程度的加深，细胞的活性和增殖能力加强。 但完全交联p p f 上的细胞数目少于t c p s 上的细胞。最初p e t e r 等对这一观点提 出异议，他们认为未被包细胞的数目在t c p s 和p p f b t c p 复合材料上没有区 别。但他们所使用的复合材料的制备方法并不相同。在p e t e r 等的研究中，复合 材料是在个模具中聚合固化2 4 h 后分段，而后沥滤4 天再灭菌后种植细胞。而 在r i c h a r d 等的实验中将灭菌处理的未完全交联p p f 直接放入细胞培养皿中，之 前没有经过沥滤，因此可溶性有毒成份可能对细胞产生毒副作用。即使如此，他 们的研究都表明，当无法采用t c p s 时，p p f 复合材料仍不失为一种很好的细胞 培养表面。 为了解p p f 在这一领域是否有发展前景，w o l f e 等l 进行了旨在考察p p f 1 3 t c p 支架在3 7 。c 、p h 为7 4 的磷酸盐缓冲溶液( p b s ) 中的降解情况的研究。 实验中不断更换p b s 溶液以模拟生理环境，这样也可避免导致聚合物自催化效 应的酸性降解产物的积累。他们的结果表明，通过进一步增加p p f 的相对分子 质量可提高材料的断裂强度，然而实验结果也表明这样会导致吸收率的降低。 p p f 的断裂强度比人体脊椎骨的断裂强度( 1 7 1 3 4 7 m p a ) 低一个数量级，而与 软骨的相当。实验表明p p f 很适合作为种可吸收材料，扫描电镜照片证实其 结构始终保持多孔性，实验数据支持将这些多层p p f b t c p 支架进一步应用于 颅骨缺损修复中。t i m m e r 等1 4 5 1 也进行了同类实验，他们在5 2 周内通过观察复合 物的重量、几何形状和力学性能的变化对p p f p p f - d a 的光交联网络体外降解性 能进行了评价。由于材料中的水分有限，低p h 值也会加速降解但没有交联密度 影响大。向聚合体基体中加入b t c p 会延长p p f p p f d a 的降解过程，而其压 缩性能和缓冲液p h 值不会降低。加入b t c p 的另一好处在于它在组织工程应 第一章绪论 用中起到了骨传导作用。 1 4 2 富马酸丙二醇r 旨- 7 - - 醇共聚物p ( p f c o e g ) 直到1 9 9 8 年，脑内疾病都是美国第四大致命疾病。颅内动静脉畸形或动脉 瘤的破裂都是致命的。研究表明，如果在动脉瘤的管壁上无法观察到血管光滑肌 细胞及其细胞外基质成分如弹性蛋白，通常管壁会由于太薄而无法承受正常的血 压，很容易破裂。为了防止动脉瘤破裂，临床上一般采用外科夹，但是这样不仅 会伤害到病人，而且无法到达脑内血管深处。现在临床上也使用一种叫做介入导 管拴塞术的方法，它所使用的是一种高分子材料或一种金属线圈。氰基丙烯酸酯 已经被应用于栓塞术，然而这种单体聚合过快，很难操作。同时此类材料并不具 有生物降解性或生物可吸收性，从而将长期存在于人脑中。因此迫切需要一种栓 塞生物材料，这种材料应是可注射的，在一定条件下可聚合或交联，同时具有生 物相容性和生物降解性或生物可吸收性。聚富马酸丙二醇酯是一类不饱和的线型 聚酯，通过双键交联而形成坚硬的固体。而聚乙二醇则因其低相对分子质量( 小 于2 0 0 0 0 ) 、无毒副作用、易于被人体排出而作为生物材料大量使用。所以，普遍 认为含有这两种均聚物的嵌段共聚物将是可降解或可生物吸收的聚合物。从上世 纪末开始，一些科学家将p p f 的研究重点放在了富马酸丙二醇酯一乙二醇共聚物 ( p o l y ( p r o p y l e n ef u m a r a t e c o e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ，简称p ( p f - c o e g ) ) 的研究上，并进 行了不懈韵探索。 p ( p f c o e g ) 是一种可注射的可生物降解聚酯。富马酸双键使聚合物可交 联。由于在水环境中交联反应温度升高有限，使得p ( p f - c o - e g ) 适合作为一种注 射性生物材料或细胞包埋载体。这种共聚物除了可用于动脉瘤的栓塞化外，也可 用于细胞转载。t a n a h a s h i 等【4 6 】认为，p ( p f c o e o ) 共聚物的组成决定交联水凝胶 的亲水性，而亲水性是决定细胞对水凝胶黏附的重要因素。为了解物料组成对交 联共聚物表面性能和亲水性的影响，他们考察了水凝胶的溶胀性能和水接触角以 及含水量。同时他们也研究了黏附于水凝胶上的光滑肌细胞和血小板的数目。实 验结果表明，p ( p f c o e g ) 的亲水性是影响细胞黏附性的重要因素，作为良好的 细胞载体，此类共聚物还需进行改性以增强其细胞亲和性。 s u g g s 等4 t4 8 1 详细研究了内皮细胞和炎症细胞对p ( p f c o e g ) 水凝胶膜的 一l l 第一章绪 论 反应。他们通过改变p e g 的组成和相对分子质量以确定它们对组织反应的影响。 在体外实验中，特别研究了共聚物膜中可溶解有毒产物的影响。实验结果表明， 可作为可注射心血管导管使用的p ( p f g o e g ) ，由于可溶解小分子导致的毒性 和生物材料造成的炎症反应最终会影响移植物的生物相容性，但是p ( p f c o e g ) 水凝胶仍具有作为一种可注射生物材料的潜力。他们为了考察相对分子质量和高 聚物组成对交联水凝胶降解反应的影响，还研究了p ( p f c o - e g ) 在体内和体外的 降解行为。实验结果显示，p ( p f c o e g ) 在体内和体外的降解最初是本体降解。 由于水解导致溶胀，高聚物膜的体积没有减小反而增大。并且前3 周高聚物的机 械性能明显下降，到1 2 周变化已不明显。6 周后体内实验和体外实验所测的力 学性能表现出不同趋势。 1 4 3 喜马酸聚乙二醇酯预聚物( 0 p f ) o p f 作为一种与p p f 类似的预聚物，也极具开发价值，正日益被材料界和医 学界所关注。适宜聚合度的o p f 能在体温条件下固化，通过控制其相对分子质 量可得到具有良好力学性能的材料。此外o p f 可生物降解，并在体温下能任意 塑形，o p f 固化前具有良好的流动性，将其作为一种可注射式填充材料，能很好 的应用于不规则缺损部位的修复和重建。目前主要通过聚乙二醇和富马酰氯的缩 聚反应得到o p f 。o p f 上酯键的水解促使其最终降解成富马酸和聚7 _ , - - 醇，而 体内实验也显示由不同相对分子质量p e g 制得的o p f 具有良好的生物相容性。 富马酸类大分子具有高度不饱和性，这就使得它们不仅可以自聚，也可以与 交联剂共聚形成聚合物网络【4 9 1 。目前多采用二丙烯酸酯类聚合物作为交联剂使 用，它们不仅可以增强共聚物网络的力学性能，还会对网络的某些性能产生影响。 然而，这种多组分体系网络结构也更复杂、更难定义1 50 1 。就我们目前所掌握的 知识，还没有方式定义这些通过丙烯酸酯基交联剂形成的富马酸基聚合物网络的 结构。 对p f p f c o e g ) 的研究成果也引起人们对o p f 和p e g d a 交联形成的水凝胶 的研究。以m i k o s 为代表的部分学者首先着手研究了以p e g d a 为交联剂，过 硫酸铵和抗坏血酸为引发剂所发生的自由基聚合，以及所形成的聚富马酸酯水凝 胶网络。反应形成的水凝胶正被人们研究用于骨组织工程，并被考虑用细胞黏附 第一章绪 论 配体改性后使用【5 1 l 。而o p f 水凝胶也被用作促进软骨再生的可注射细胞载体。 o p f 与其它单体的共聚反应也可用来制备具有不同物理性能的聚合物凝胶。 但由于o p f 中的富马酸双键被有限的p e g 嵌段隔离，交联o p f 具有与 p e g - d m a f p ( p f c o e g ) 水凝胶不同的溶胀性能。因此，o p f 水凝胶更适用于制 各特定结构的生物材料。丽且多酯键和亲水性p e g 链也有助于在水溶液环境中 o p f 水凝胶的降解。乙烯基单体如n 乙烯一2 一吡咯烷酮和苯乙烯也可作为富马酸 酯的共聚单体。富马酸酯和此类乙烯基单体之间的q 、e 值和竞聚率( o l ，1 2 ) 也 显示这些组合更利于形成共聚物。 对于一种希望应用于组织工程的水凝胶，必须对其生物相容性和细胞毒性做 出评价。水凝胶的毒性可能来自线型大分子本身，也可能来自交联剂或促进剂 在交联反应中这些组分都可能对细胞产生毒副作用。此外，自由基聚合反应剩余 的不饱和结构和产生的副产物也会对细胞活性产生影响。同时，对于降解反应来 说，其降解产物的毒性也是需要评价的一个因素。鉴于以上种种考虑，s h i n 等人 对此类水凝胶进行了毒性评价。结果表明，即使改变p e g 的相对分子质量和浓 度，2 小时后仍会有5 0 以上的骨髓间质细胞存活。对于交联剂而言，则是 p e g - d a 的相对分子质量越大，植入其中的细胞活性越强，促进剂过硫酸铵和抗 坏血酸的浓度提高也会达到同样的效果。t e m e n o f f 等【5 2 】也进行了相关实验，研 究显示p h 值的降低