（环境科学专业论文）中国近海典型赤潮生物种间及生理指示生物标志物研究.pdf

2 1 、2 3 2 6 、2 8 、3 0 号，在消亡期几乎不表达；在链状亚历山大藻种也发现 了多个蛋白，3 卜3 5 ，4 6 4 8 、6 1 - 7 0 号蛋白在消亡期表达量明显下降。这些 蛋白可作为指示细胞不同生长期的一类潜在的特异性生物标志物； 4 比较不同营养状态下的细胞蛋白质组的差异表达发现，在氮或磷限制的条件 下，东海原甲藻细胞中的一些蛋白，如p c i 、p c 3 、p c 5 和p c 7 9 不表达，而 一组酸性蛋白，p c 2 表达明显增加，这些蛋白可作为指示氮或磷限制的生物 标志物；而一些蛋白仅在氮限制时表达明显减弱( p c 4 、p c 6 ) 或不表达( p p l - 3 ) ， 这些蛋白可作为指示氮限制的生物标志物：在链状亚历山大藻中也发现了一 个与氮限制相关的蛋白a n l ：一些蛋白，如a n l 5 、a p l 和a c l 在添加氮或磷 后表达明显增强，并在藻细胞处于良好生长状态时也有很强的表达，这些蛋 白可作为指示藻细胞处于良好营养状态的生物标志物； 5 在环境胁迫条件下的东海原甲藻中发现了一些特异性蛋白，如对光胁迫产生 响应的热休克蛋白l - i s p 7 8 ( 1 0 号蛋白) ，对低温胁迫产生响应的蛋白，如1 3 和1 4 号蛋白。在链状亚历山大藻中也发现两组蛋白，3 6 4 5 和4 9 5 1 号蛋白 在连续光照条件下表达特别明显，而在连续光暗和氮限制条件下都不表达， 且在正常生长条件、磷限制和低温处理条件下虽有表达，但含量较低。这些 蛋白可作为指示藻细胞处于胁迫状态的潜在的一类生物标志物。 关键词：赤潮生物；生物标志物；蛋白质组；双向电泳；生物质谱 i i a b s t r a c t p r o r o c e n t r m nd o n g h a i e n s el ua n da i e x a n d r i m nc a t e n e l l aa r et w ok e yh a r m f u l a l g a lb l o o m ( h a b ) s p e c i e sw i d e l ys p r e a da l o n gt h ec o a s t a lw a t e r so fc h i n a i nt h e p a s tf e wy e a r s ，t h i st w oh a bs p e c i e sh a v ef o r m e de x t e n s i v eb l o o m si nt h ec o a s to f t h es o u t h e a s tc h i n as e a , a n db e c o m eo fe c o n o m i ca n dp u b l i cc o n c e r nd u et oi t s i m p a c to nt h em a r i n ee c o s y s t e m ，a q u a c u l t u r ea n dp u b l i ch e a l t h t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dt h et o t a lp r o t e i np r e p a r m i o nm e t h o df o r p r o t e o m i cs t u d yo f d i n o f l a g e l l a t e s ，c o m p a r e dt h ed i f f e r e n t i a lp r o t e i ne x p r e s s i o n so fpd o n g h a i e n s el u a n da c a t e n e l l au n d e rv a r i o u sg r o w t hp h a s e sa n dg r o w t hc o n d i t i o n su s i n gp r o t e o m i c a p p r o a c h ，i d e n t i f i e da n dc h a r a c t e r i z e dp h y s i o l o g i c a li n d i c a t o rp r o t e i n sr e l a t e dt oc e l l g r o w t hp h a s ea n de n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s t h em a i nr e s u l t sw e f ea sf o l l o w i n g s ： 1 e s t a b l i s h e da n do p t i m i z e dt h et o t a lp r o t e i np r e p a r a t i o nm e t h o df o rp r o t e o m i c s t u d yi n h a bs p e c i e s f o u rp r o t e i n p r e p a r a t i o nm e t h o d s ，t r i t o n x 10 0 u r e a e x t r a c t i o nm e t h o d ，t c a - a c e t o np r e c i p i t a t i o nm e t h o d , 4 0 m mw i t h5 g l y c e r o l e x t r a c t i o nm e t h o da n d4 0 m m t r i se x t r a c t i o nm e t h o dw e r ec o m p a r e du s i n g2 - d e m e t h o d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt r i t o n x 10 0 u r e am e t h o dw a st h eb e s tm e t h o dt o p r e p a r et o t a lp r o t e i n sf o rp r o t e o m i cs t u d i e s , t h eh i g hq u a l i t yo f2 - d ep r o t e i n p r o f i l ep a t t e ma n dm a x i m u mp r o t e i ns p o t s ( m o r et h a n1 , 0 0 0s p o t s ) w e r ea c h i e v e d ， m e a n w h i l ea l k a l i n ep r o t e i n sa n dh i 曲e rm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n sw e r ee x t r a c t e d o u tu s i n gt h i sm e t h o d m o r e o v e r , t h i sm e t h o dp r o v i d e sas i m p l ea n dc o n v e n i e n t p r o t o c o lf o rp r e p a r i n gp r o t e i n sf o rp r o t e o m i cs t u d yi nd i n o f l a g e l l a t e s ； 2 c o m p a r a t i v es t u d i e so np r o t e i ne x p r e s s i o no ft w oa l e x a n d r i u ms p e c i e s ，a t a m a r e n s ed h 01a n da c a t e n e l l ad h 0 1 g r o w ni nt h es a m ec u l t u r ec o n d i t i o n u s i n g2 - d em e t h o dt o g e t h e rw i t hm o r p h o l o g ya n di t ss e q u e n c er e s u l t ss h o w e d t h a t ，9 9 o fp r o t e i np r o f i l e si n2 - d eo ft w oa l e x a n d r i u ms p e c i e sw e r es a m e ， i n d i c a t i n gt h a ta t a m a r e n s ed h 0 1a n da c a t e n e l l ad h 01s h o u l db ec o n s i d e r e d a sc o n s p e c i f i c w h i l es e v e r a ld i s t i n c t i v ep r o t e i n sw e r ea l s of o u n di nt w os p e c i e s r e s p e c t i v e l y ，p r o t e i ns p o t sa t i 5w e r eo n l yo b s e r v e di na t a m a r e n s ed h 0 1a n d i i i p r o t e i ns p o t sa c l - 3o n l yi na c a t e n e l l ad h 0 1 ，t h e s ep r o t e i n sc o u l db eu s e da s p o t e n t i a li n d i c a t o r sf o rs p e c i e s - s p e c i f i cd i s c r i m i n a t i o n ； 3 t h er e s u l t sf r o m2 - d ep r o t e i n sp r o f i l e so fpd o n g h a i e n s el ua n da c a t e n e l l a c o l l e c t e di nv a r i o u sg r o w t hp h a s es h o w e dt h a tt h e r ew e r es o m es p e c i f i cp r o t e i n s r e l a t e dt og r o w t hp h a s e i npd o n g h a i e n s el u ，c d c 2 一r e l a t e dp r o t e i nk i n a s e1w a s f o u n dt oh i 曲l ye x p r e s si nt h ee x p o n e n t i a lp h a s ea n dd e c r e a s ei nt h ed i s s i p a t i o n p h a s e ，w h i l es o m ep r o t e i n ss u c ha ss p o t s1 7 1 9 ( r u b i s c o ) a n d2 1 ，2 3 - 2 6 ，2 8a n d 3 0w e r ea l m o s td i s a p p e a r e di nt h ed i s s i p a t i o np h a s e i na c a t e n e l l a ，t h e e x p r e s s i o n so fs e v e r a lp r o t e i n s ，s p o t s31 - 3 5 ，4 6 - 4 8a n d 6 1 7 0w e r ed e c l i n e d s i g n i f i c a n t l yi nt h ed i s s i p a t i o np h a s e t h e s ep r o t e i n sc o u l db ea p p l i e da st h e b i o m a r k e r st oi n d ic a t ed i f f e r e n tg r o w t hp h a s eo fc e l l s ； 4 c o m p a r i s o no fd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n so fp r o t e o m i c so f pd o n g h a i e n s el ua n d a c a t e n e l l ag r o w ni nv a r i o u sn u t r i e n tc o n d i t i o n ss h o w e dt h a t ，s e v e r a lp r o t e i n s ，p c i ， p c 3 ，p c 5a n dp c 7 9w e r en o to b s e r v e di nn i t r o g e no rp h o s p h a t e - s t a r v e dp d o n g h a i e n s el uw h i l et h ee x p r e s s i o no fp c 2 ，aa c i d i f i cp r o t e i nw a se n h a n c e d s i g n i f i c a n t l y , t h e s ep r o t e i n sc o u l db eu s e da sp o t e n t i a li n d i c a t o r sf o rn i t r o g e no r p h o s p h a t e - s t a r v e dc o n d i t i o n s h o w e v e r , s o m es p e c i f i cp r o t e i nc o n t e n t s ，s u c ha s p c 4a n dp c 6d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y , o rd i dn o te x p r e s s e d , s u c ha s p p - 13u n d e r n i t r o g e n s t a r v e dc e l l s ，a n dc o u l db e u s e da si n d i c a t o r so fn i t r o g e n s t a r v e d c o n d i t i o n i na c a t e n e l l a ，ap r o t e i nr e l a t e dt on i t r o g e n - s t a r v e d , a n lw a sf o u n d w h i l es o m ep r o t e i n se x p r e s s i o n s ，a n l 5 ，a p la n da c lw e r ee n h a n c e dw h e n n i t r o g e no rp h o s p h a t ea d d e dt ot h en u t r i e n t - s t a r v e da c a t e n e l l a t h e s ep r o t e i n s c o u l db eu s e da sp o t e n t i a lb i o m a r k e r sf o rn u t r i e n tn i l - l i m i t a t i o ne n v i r o n m e n t ； 5 i npd o n g h a i e n s el u ，s o m es p e c i f i cp r o t e i n s ，s u c ha sh e a ts h o c kp r o t e i n7 8 ( s p o t 1 0 ) a n dp r o t e i n ss p o t s1 3a n d l 4w e r ef o u n du n d e rc o n t i n u o u sl i g h ta n dl o w e r t e m p e r a t u r e ，r e s p e c t i v e l y i na c a t e n e l l a ，t w og r o u pp r o t e i n s ，g r o u p l ，s p o t s3 6 - 4 5 a n dg r o u p 2 ，s p o t s4 9 - 51e x p r e s s i o nw e r ee n h a n c e ds i g n i f i c a n t l yi nc o n t i n u o u s l i g h t ，w h i l et h e yw e r en o to b s e r v e di nc o n t i n u o u sd a r ka n dn i t r o g e n s t a r v e d c o n d i t i o n s ，a n dt h e i re x p r e s s i o n sw e r el o wi nn o r m a lc u l t u r e ，p h o s p h a t e s t a r v e d a n dl o w e rt e m p e r a t u r ec o n d i t i o n s t h e s ep r o t e i n sc o u l db eu s e da sp o t e n t i a l i v b i o m a r k e r so fc e l l st oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s k e yw o r d s ：h a r m f u la l g a e ；b i o m a r k e r ；p r o t e o m i c ；t w od i m e n s i o ne l e c t r o p h o r e s i s ； m a s ss p e c t r o m e t r y v 缩略词表 a p s ：a m m o n i u mp e r s u l f a t e ，过硫酸铵 a t p ：a d e n o s i n e - t r i p h o s p h a t e ，三磷酸腺苷 b s a ：b o v i n es e r u ma l b u m i n s ，牛血清蛋白 c h a p s ：3 一【( 3 一c h o l a m i d o p r o p y l ) d i m e t h y l a m m o n i o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d ，3 一【3 一( 胆 酰胺丙基) 二甲氨基】丙磺酸内盐 d n a ：d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，脱氧核糖核酸 d t t ：d i t h i o t h r e i t o l ，二硫苏糖醇 2 - d e ：t w od i m e n t i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，双向电泳 e d t a ：e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 h a b ：h a r m f u la l g a lb l o o m ，有害赤潮 h s p ：h e a ts h o c kp r o t e i n ，热休克蛋白 r d n a ：r i b o s o m ed e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，核糖体脱氧核糖核酸 r n a ：r i b o n u c l e i ca c i d ，核糖核酸 s d s ：s o d i u md e c d e c y ls u l s f a t e ，十二烷基磺酸钠 s d s p a g e ：s o d i u md e c d e c y ls u l s f a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，十二烷 基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 t c a ：t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ，三氯乙酸 t c e p ：t r i s ( 2 一c h l o r o e t h y l ) p h o s p h a t e ，磷酸三( 2 一氯乙基) 酯 t e m e d ： n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ，n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 i r i s ：h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷 v i 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权 利和责任。 声明人( 签名) ：摊剖艮 印年皿月z 多日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 l 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 ， 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名：僦蚺 导师签名：_ 加 日 日 以以 月 月 n r 2 年 年 门，内 一叫洳 期 期 丌1 习 第一章前言 第一章前言 赤潮，是由于海洋环境变化导致海水中某些生物( 如浮游植物、原生动物或细 菌) 短时间内大量聚集和爆发性增殖而引起水域变色并对生物和环境造成影响的一 种生态异常现象。有一部分赤潮对人类和海洋生态系统具有危害作用，通常称这类 赤潮为有害赤潮( h a r m f u la l g a lb l o o m s ，h a b s ) 。近年来，由于海洋污染的加剧和 人类海上活动加强等的影响，近岸海区有害赤潮的发生频率日趋增加，已对近海生 态系统、海洋养殖业和人类健康等构成了严重威胁。赤潮造成的损失越来越大，造 成的危害也越来越严重，因而有害赤潮已成为国际社会共同关注的重大海洋环境问 题和生态灾害( h a l l e g r a e f f , 1 9 9 3 ，2 0 0 5 ；a n d e r s o n ，1 9 9 7 ) 。许多国际性机构和国 家都启动了一些国际性和区域性项目，如g l o b a le c o l o g ya n do c e a n o g r a p h yo f h a r m f u la l g a lb l o o m s ( g e o h a b ) ，e c o l o g ya n do c e a n o g r a p h yo fh a r m f u la l g a l b l o o m so fe u r o p e ( e u e o h a b ) 和h a r m f u la l g a lr e s e a r c h & r e s p o n s en a t i o n a l e n v i r o n m e n t a ls c i e n c es t r a t e g y ( h a r n e s s ) 等，重点对全球性和区域性有害赤潮进 行研究，以减轻、消除有害赤潮给人类带来的危害。 在海洋中，甲藻是形成有害赤潮的主要原因种。据报道，全球范围内形成有害 赤潮的甲藻有9 3 1 2 7 种，而且多数甲藻( 4 5 5 7 种) 可生产对生物和人类具有致毒甚 至致死作用的毒素，因而甲藻赤潮已成为当前危害最大、研究最多的一类赤潮( 齐 雨藻，2 0 0 3 ) 。过去的半个多世纪，围绕有害甲藻赤潮开展了大量的工作，对甲藻 赤潮形成的生态学和海洋学机制都有了一定程度的认识，在有害赤潮生物的形态、 生理、生态和分类( 包括分子分类) 等方面都取得了一定的成果。但由于甲藻特殊 的进化地位( 间核生物) 、生活习性( 运动性) 和庞大的基因组( 约为人类的5 0 倍) ， 以及研究方法和技术手段的限制，目前全球范围内甲藻基因库的缺乏，我们对甲藻 的了解还非常有限，对甲藻的一些基本的生命活动规律还不是很清楚，这在一定程 度上也阻碍了我们对甲藻赤潮发生机理的研究( 梁松等，2 0 0 0 ；周名江等，2 0 0 1 ， 2 0 0 6 ；俞志明等，2 0 0 2 ) 。 在过去的诸多研究中，人们更多地关注赤潮生物与环境因子的相互作用，从海 洋学、生态学和生理学等角度探讨赤潮发生的机制，对一些海区赤潮形成过程、机 第一章前言 制和环境调控等都有了较为深入的认识，但这些研究并末从根本上阐释赤潮发生的 机理。再有，由于研究方法和技术手段的限制，对赤潮发生的内部机制还了解甚少， 如细胞内哪些过程控制赤潮生物的生长和繁殖? 赤潮生物适应低营养盐及恶劣环境 的机制如何? 即它们如何应对这些环境胁迫? 赤潮生物对营养盐补充的响应机理如 何? 等等，这些问题的回答对揭示赤潮发生机理具有重要的理论价值。 生物标志物( b i o m a r k e r ) ，是指能反映潜在有害因素同生物体之间相互作用的 所有分析和测定，或是反映机体与环境因子( 物理的、化学的或生物的) 交互作用 引起的所有可测定的改变，包括生化的、生理的、行为的、免疫的、细胞的、遗传 的等多方面的改变，这些指标的改变与有机体本身系统及生存的环境相关联，反应 了有机体对环境变动的一种特异性响应。生物标志物研究是当前生命科学和环境科 学领域一个重要的研究方向。目前生物标志物已被广泛应用于生物学、医学、病理 学和毒理学等诸多领域的研究。 大量研究表明，在不利的环境条件下( 如低营养、低温和低光强等) ，赤潮生 物细胞内会合成一些特异性的蛋白或酶，如热休克蛋白等以适应恶劣环境导致的负 效应，维持细胞及种群的生存( j e a n i n ee ta l ，2 0 0 4 ) 。通过研究不同环境下赤潮生 物生理指示生物标志物可为我们揭示赤潮生物重要生命活动规律和赤潮形成机制提 供理论依据。但由于研究方法和技术手段的限制，赤潮生物生理指示生物标志物研 究一直进展很慢。近年来，随着一些新方法和技术的出现，如蛋白质组学及其技术， 为有害赤潮研究提供了有力的工具。一些学者已将蛋白质组学的相关理论和技术应 用到有害赤潮研究领域( 2 0 0 2 ，2 0 0 4 ，2 0 0 4 ，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) ，发现了一系列具有重要 生理功能的生理指示生物标志物，如种问指示蛋白、生长周期指示蛋白以及毒素指 示蛋白等，为探讨赤潮发生的分子机制和毒素合成机理提供了新的思路。因而开展 赤潮生物生理指示生物标志物的研究，将有助于增加我们对赤潮生物新的认识，可 能对揭示赤潮生物重要生命活动和赤潮发生机理有重要意义。 1 1 赤潮生物生理指示生物标志物研究 1 1 1 赤潮生物生理指示生物标志物研究方法一蛋白质组学 早期生物标志物的研究方法主要为一些传统的生物化学方法及分子生物学等方 2 第一章前言 法，这些方法都存在一定的局限性，或筛选的通量偏小，如生物化学方法，只能针 对某一个或某一类生物标志物进行研究：或因非模式生物基因库的缺乏，无法得到 确切可靠的信息。再有，一些基因水平上发生的变化却不能反映在蛋白的水平。这 些都为生物标志物的研究带来了困难，急需引入新的方法和技术以推动该领域的研 究。 蛋白质组学及其技术是近l o 年来新出现的一个研究领域，它是后基因组时代的 产物( w i l k i n s ，1 9 9 6 ) 。它以双向电泳技术、液相色谱技术和生物质谱技术等为主 要研究手段，以全基因组在某个细胞或组织中某个特定条件下所表达的全部蛋白质 为研究对象，对蛋白质的功能及蛋白质蛋白质之间的相互作用进行研究，以揭示生 命的本质( 成海平，2 0 0 0 ；李林，2 0 0 0 ) 。近年来，由于生物质谱技术和生物信息学 的快速发展，蛋白质组学研究发展迅速。目前，最现实、最有效的技术是采用双向 电泳技术分离、纯化蛋白质，结合计算机定量分析电泳图谱，运用质谱技术对所分 离的蛋白质进行鉴定，并进一步运用现代生物信息学知识和技术对所得的数据进行 处理，对蛋白质以及它们执行的生命活动作出尽可能最精细、最精确、最本质的阐 述。 近来c h a ne ta l ( 2 0 0 2 ) 将蛋白质组学技术引入到有害赤潮研究，对赤潮生物蛋 白质组学研究方法进行了较为详细地研究。他们从细胞破碎方法、蛋白质提取方法 和蛋白双向电泳条件等方面，比较研究了不同研究方法下赤潮生物蛋白质组图谱的 表达、蛋白分离效果、蛋白点总数、微量蛋白和碱性蛋白的差异，建立优化了适于 赤潮生物蛋白质组学的研究方法，并用建立的方法对一些赤潮生物生理指示生物标 志物进行了初步研究，为赤潮生物蛋白质组学研究奠定了基础( 2 0 0 2 ，2 0 0 4 ，2 0 0 4 ， 2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) 。黄旭光等( 2 0 0 6 ) 建立了基于表面抗原的全细胞免疫荧光法和免疫 蛋白质组学方法，并运用该方法对赤潮生物细胞表面蛋白进行了研究，鉴定确认了 1 0 0 多个细胞表面蛋白，并对其中的5 个蛋白进行了鉴定，发现了一些具有重要生理 功能的蛋白。 目前一种结合荧光标记的新方法荧光差异凝胶电泳法，已用于赤潮生物蛋 白质组学研究。该原理是利用两种不同的荧光标记物，分别对两个不同的蛋白样品 进行标记，然后将二者等蛋白量混合在一起进行2 d e 分析。最后利用不同的激发波 3 第一章前言 长扫描图谱，并用相应的软件进行分析。该方法可避免不同胶条干h s d s - p a g e 差异 的干扰，重复性高，可作为赤潮生物蛋白组学研究的一个新方法。 上述研究表明，蛋白质组学及其方法可作为有害赤潮研究的一个非常有效的方 法，特别是在当前甲藻基因组库缺乏的状况下，从蛋白组角度对赤潮生物进行研究 可克服当前传统生物化学和分子生物学研究方法的不足，从而为有害赤潮研究带来 一些新的突破。 1 1 2 赤潮生物种间指示生物标志物研究 细胞形态特征是传统形态分类学上的一个重要依据。在传统的甲藻形态分类学 上，细胞表面钙板的形状、腹孑l ( v e n t r a lp o r e ) 的存在与否以及链的形成是区别亚 历山大藻不同种的一些主要特征( s t e i d i n g e r e ta l ，1 9 9 0 ) ，其中腹孔被认为是最重 要的一个分类依据( f u k u y o ，1 9 8 5 ) 。早期的研究发现，a t a m a r e n s e 壳板的项板上 存在腹孑l ，而么c a t e n e l l a 没有( f u k u y o ，1 9 8 5 ) 。但是，k i me ta l ( 2 0 0 2 ) 发现一 些4 c a t e n e l l a 的壳板项板上也存在腹孔。h a n s e n ( 2 0 0 3 ) 也发现，作为区别微小亚 历山大溯m i n u t u m 和另一种亚历山大溯a n g u s t i t a b u l a t u m 的主要分类标志腹 孔在丹麦近海的许多彳m i n u t u m 细胞中缺失，他们认为腹孔并不是一个可靠的分类 依据，需要其他的方法去验证、鉴别这些种类间差异，照传统的方法已不能区别这 两种藻类。从分子生物学的角度，先前的研究也证明，基于1 8 s r d n a 和2 8 s r d n a 的 d 1 d 2 区不能区另归t a m a r e n s e 和d a c a t e n e l l a ，但可用来区分不同的地域种( s c h o l i n ， a n d e r s o n ，1 9 9 4 ；s c h o l i ne ta l ，1 9 9 4 ) 。 近来，香港学者c h a r t 及其合作者将蛋白质组学技术应用到有害赤潮分类学的研 究，试图寻找种间差异特异性生物标志物种间指示蛋白，并将其作为赤潮生物 种、株问分类的一个重要依据( 2 0 0 2 ) 。c h a ne ta l 应用双向电泳技术分析了l o 种株 赤潮生物，只t r i e s t i n u m 、pm i c a n s 、 尸m i n i m u m 、 ps i g m o i d s 、pd e n t a t u m 、 s c r i p p s i e l l at r o c h o i d e a 、k a r e n i al o n g i c a n a l i s 、ka i g i t a t a 、km i k i m o t o i 以及美国 分离的一株足b r e v i s ( f l o r i d a ，u s a ) 蛋白质组的差异表达，结果显示，在相同的生 长环境下无壳壁的甲藻蛋白质表达点数和分布的区域明显少于有壳壁的甲藻细胞， 也有一些相同的蛋白点同时在有壳壁和无壳壁的藻株内表达，有相当多的蛋白点是 唯一分布在特定的甲藻中，这些种间特异蛋白可作为赤潮生物分类的一类特异性生 4 第一章前言 物标志物，特别是在对一些疑难种的鉴定方面( c h a r te ta l ，2 0 0 2 ：c h a ne ta l ，2 0 0 4 ) 。 利用建立的蛋白质组图库，c h a r te ta l ( 2 0 0 4 ) 研究了混合样品中甲藻的种类，证明 蛋白质组技术可用于混合样品中有害赤潮生物的识别，该技术不仅能识别不同属、 也能识别到同属的不同种。他们认为双向电泳技术可以作为分类学的一个重要的技 术方法。但该技术仍需要更加精细的比对工作，从而最终将该技术应用在全球水平 上对藻类进行鉴定和识别。 1 1 3 与赤潮生物生长调控相关的生物标志物研究 在自然海区，赤潮从形成到衰亡的整个过程包括孕育期、爆发期、维持期和消 散期等几个阶段。一些研究表明，赤潮过程中的上述进程不仅受到环境因子的调控， 与细胞内部的调控机制也密切相关，但目前对其了解还非常有限。f r a n c e se ta l ( i n p r e s s ) 在实验室和现场研究了赤潮生物短凯伦藻kb r e v i s 的细胞周期行为，它们的 研究表明，在所有研究条件下，kb r e v i s 细胞分裂都表现出一种昼夜节律，细胞周 期的s 期常发生在光照后的六小时并持续1 2 1 4 d x 时，细胞分裂期m 期常出现在黑暗 期，并于下一个光暗周期前完成，但他们对细胞这种周期性节律的调控机制还不是 很清楚，推测与细胞周期蛋白的调控有关。一些学者运用分子生物学和免疫学的方 法对甲藻细胞周期调控进行了研究，发现了一些控制细胞生长的周期蛋白，如d 型 细胞周期蛋白、c d c 2 激酶抑制物和p c n a 1 i k e 蛋白，它们调控着细胞周期的进程， 在细胞生长过程中起着非常重要的作用( a h r e n se ta l ，1 9 9 7 ：g u e r i n ie ta l ，2 0 0 0 ： 1 w a ie ta l ，2 0 0 0 ：l i n & c o r s t j e n s ，2 0 0 2 ) ，可作为评估细胞生长的一类有用的生物 标志物。在所知道的细胞周期蛋白中，p c n a 是研究较多的一类细胞周期蛋白，它 是一种高度保守的蛋白，已经在一些甲藻，如微小原甲洳m i n i m u m 和h e t e r o c a p s a t r i q u e t r a 发现，分子量在3 6 k d 左右( c a r p e n t e re ta l ，1 9 9 8 ) ，在其他一些甲藻 c r y p t h e c o d i n i u mc o h n i i 和g y m n o d i n i u mc a t e n a t u m 也发现了类p c n a 蛋白，它的分子量 在5 5 k d a 左右。近来，c h a ne ca l ( 2 0 0 4 ) 应用蛋白质组学技术比较研究了一种赤潮 生物pt r i e s t i n u m 在不同生长期的蛋白质组的差异表达，在细胞生长起始期发现了一 组特异性表达蛋白，p b i 、p b 2 和p b 3 ，它们在其它生长期则未发现，推测可能是启 动细胞分裂的一些重要蛋白，可能与核酸的合成有关。同时他们在指数生长期也发 现了一组特异性蛋白，b p l 和b p 2 ，在细胞其它期都未表达或表达不明显，比较浮游 5 第一章前言 植物生长及细胞分裂的模式推断这两个蛋白町能是控制细胞分裂的周期蛋白。另外， 他们还发现了一组与维持细胞生存相关的保守蛋白( h o u s ek e e p i n gp r o t e i n s ) ，这些 蛋白在整个细胞周期几乎没有变化，可能为些结构蛋白或维持细胞重要生理功能 的蛋白或酶。他们认为这些蛋白可作为指示藻类细胞生长和代谢状况的标志物，并 将这些蛋白的有无及变化用于解释甲藻适应环境的机制，这些蛋白的发现对揭示赤 潮发生机制和赤潮的预测具有最要理论意义。 1 1 4 赤潮生物营养指示生物标志物研究 在海洋中，营养盐的变动直接影响到浮游植物的生长和一切生理活动，与浮游 植物细胞营养状态相关的生物标志物研究已得到高度重视。一些指标已被用于评价 海区浮游植物营养状态，如g l u t a m a t e g l u t a m i n e 比率已广泛用于评价浮游植物氮限 制问题( f l y n n ，1 9 9 0 ) ，而总碱性磷酸酶和单细胞碱性磷酸酶被作为细胞磷营养状 态的一种特异性标志物( d y h r m a ne ta l ，2 0 0 5 ) 。但目前很少的研究涉及到蛋白作为 细胞营养状态的指示物。b r a i ne ta l ( 1 9 9 5 ) 运用荧光标志的方法研究了球石藻赫氏 藻细胞表面蛋白，发现了一种氮调控蛋白n 巾l ，它只在氮限制或尿素为氮源的条 件下出现，而在磷限制或以硝酸盐和氨盐为氮源的条件下则缺失，该蛋白可用来指 示细胞所处环境中氮的状况。 在有害赤潮研究中，人们已观察到，许多赤潮生物具有很强的适应低营养环境 及对营养盐补充的快速响应能力，但对其机制还不是很清楚。一些研究表明，碱性 磷酸酶在赤潮生物磷胁迫适应方面起着重要的作用。在磷限制或磷胁迫的条件下， 碱性磷酸酶会大量表达，用于降解周围环境中小分子有机磷，以缓解磷对细胞的胁 迫作用，碱性磷酸酶可作为赤潮生物对磷限制或胁迫的一类生物标志物( d y h r m a ne t a l ，2 0 0 6 ) 。c h a r te ta l ( 2 0 0 4 ) 比较研究了甲藻p t r i e s t i n u m 在不同营养盐条件下蛋 白质组的差异表达，发现氮、磷限制条件下的蛋白点数明显减少，但一组蛋白g r o u p l 不受营养盐限制的影响，这组蛋白可能与细胞维持生存有关，而另外一组蛋白 g r o u p 2 在氮、磷限制的条件下则消失，受环境中氮磷浓度的控制，可作为细胞对环 境营养胁迫的一类生物标志物。此外，他们还发现一种调节细胞生长的蛋白b p 2 在 氮限制的条件下其表达不受影响，而在磷限制的条件下则不表达，它可作为细胞缺 磷的一种标志物。近来，黄旭光( 2 0 0 6 ) 比较研究了不同氮营养条件下链状亚历山 6 第一章前言 大藻细胞表面蛋白质组的差异表达，发现在不同氮源环境( 硝酸盐，氨氮，尿素和 贫氮) 下细胞表而蛋白质组变化明显：在尿素培养条件下出现了两个明显的新蛋白 质点( a c u r l 和a c u r 2 ) ，铵盐条件下也出现了一组新蛋白a c n h g l 和一个新蛋 白质点a c n h l ，氮限制条件下，细胞表面蛋白的总量和蛋白点数不仅明显减少， 还出现了一些新的蛋白质点( a c l n l 、a c l n 2 、a c l n 3 、a c l n 4 、a c l n 5 和 a c l n 6 ) 。这些新出现的蛋白点反映了藻细胞表面对营养变动的一种响应，可作为 细胞对环境营养物质变动的一种生物标志物一营养指示蛋白。 上述研究表明，通过分析比较不同营养环境下细胞蛋白质组的差异表达，寻找、 确认特异性表达蛋白，可作为指示细胞营养状态的一类生物标志物一营养指示蛋白。 进一步研究这些蛋白的特性和功能，不仅对揭示赤潮发生机理具有重要的意义，而 且赤潮生物营养生理学研究也具有重要价值。 1 1 5 胁迫条件下的赤潮生物生理指示生物标志物研究 大量研究表明，一些赤潮生物具有很强的适应恶劣环境的能力，即使在低温低 光强的条件下，也能维持细胞的生存，甚至进行生长繁殖，但对它们的适应机制还 不是很清楚。j e a n i n ee ta l ( 2 0 0 4 ) 在对一种赤潮生物kb r e v i s 的研究表明，在环境 胁迫条件下，kb r e v i s 细胞内的热休克蛋白含量明显增加，一些参与保护细胞的酶， 如超氧化物歧化酶的含量和活性明显增加，它们共同构成了细胞内的抗氧化和保护 机制，这些热休克蛋白或酶可作为细胞对环境胁迫的一种生物标志物。 光作为调节赤潮生物生长的一种重要环境因子，强烈影响着赤潮生物的光合作 用和物质合成，从而调节细胞的生长。c h a ne