（农产品加工及贮藏工程专业论文）谷氨酰胺转氨酶对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响.pdfVIP

浙江工商大学硕士研究生学位论文 谷氨酰胺转氨酶对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 摘要 肉制品的质地在很大程度上依赖于肌原纤维蛋白凝胶的性质。由于秘鲁鱿鱼 肌肉含有能分解腑球蛋白的高活性的蛋白酶，所以其凝胶形成能力很弱。本文研 究的目的就是通过添加谷氨酰胺转氨酶( t g a s e ) 提高秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白的 凝胶特性。 我们研究了催化凝胶形成的条件，包括1 g a s e 的浓度、作用温度、作 用时间和p h 。同时运用聚丙烯酰胺凝胶和环境扫描电子显微镜手段x 姐 g a s e 改善 凝胶特性的机理进行了探索。最后应用响应面法，将 r c r a s e 的浓度、作用温度、 作用时间三个因素结合起来从整体上动态揭示各因素之间的相互关系及对凝胶 特性的影响，并确定t g a s e 提高凝胶特性的优化条件。以期为秘鲁鱿鱼鱼糜制品 和重组制品的生产提供理论基础和应用指导。实验结果表明： 1 t c j a s e 浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶的硬度和弹性有显著影响( p 0 0 5 ) 。酶浓度为1 时，凝胶硬度达到最大值。酶浓度为0 5 时，凝胶弹性达 到最大值。从电泳图谱中看出，随着酶浓度的增加，肌球蛋白重链( m h c ) 带 和副肌球蛋白( p a ) 带强度都减小。从环境扫描电镜发现，随着酶浓度的增加， 凝胶形成的三维网络结构更致密、均匀。 2 t c , a s e 作用时间对凝胶硬度和弹性有显著影响( p o 0 5 ) 。作用时间2 小时凝胶硬度达到最大值。弹性只在最初半个小时显著增加，其余时间无显著 变化。随着作用时间的延长，m h c 带和p a 带强度都减小，凝胶形成的三维网 络结构更致密、均匀。 3 t g a s e 作用温度对凝胶硬度和弹性有显著影响( p o 0 5 ) 。两者变化规律 一致，4 0 达到最大值，在2 0 4 0 时显著增加，4 0 6 0 c 时显著减小。m h c 带和p a 带强度的变化与凝胶质构特性的变化相一致。微观结构上，4 0 形成 的凝胶结构多孔性和均一性较好，2 0 和6 0 形成的凝胶结构粗糙，多孔性差 浙江工商大学硕士研究生学位论文 4 p h 对凝胶硬度和弹性有显著影响( p 0 0 5 ) 。硬度和弹性都在p h 7 0 达 到最大值，升高或降低p h 都使硬度和弹性急剧下降。实验结果进一步论证m t - i c 带和p a 带强度与凝胶质构特性具有相关性。微观结构上，p h s 0 和p h 7 0 差异 不明显。p h 9 0 失去了网络结构。 5 通过响应面法对t g 酶提高秘鲁鱿鱼凝胶特性的作用条件进行了优化， 对于硬度响应值，各因素的优化条件为：t g 酶浓度为1 0 叮；作用温度为4 2 1 ； 作用时间为2 1 8 h 。相应的硬度为4 3 4 2 。对于弹性响应值，各因素的优化条件为： t g 酶浓度为0 7 5 ；作用温度为4 4 3 1 2 ；作用时间为1 6 1 h 。相应的弹性为0 9 7 3 。 关键词；秘鲁鱿鱼，肌原纤维，谷氨酰胺转氨酶，凝胶特性，响应面法 浙江工商大学硪士研究生学位论文 t 霸匝e f f e c to ft ra n s g i ，ir r a n a s eo ng e l p r o p 巳i u 】e so fm y o f ；r i a rp r o t e i n s o fj u m b o s q u i d ( d o s i d i c u sg i g a s ) a b s t r a c t t oag r e a te x t e n t , t e x t u r eo fm e a tp r o d u c t sw a sd e p e n d e n to nt h e g e l a t i o n c h a r a c t e r i s t i c so f m y o f i b r i l l a rp r o t e i n a st h em u s c l eo f j u m b os q u i dh a sh i g hp r o t e a s e a c t i v i t y , w h i c hc a u s e sd e g r a d a t i o no f m y o s i n , i th a sb e e nc h a r a c t e r i z e db yal o w g e l - f o m a i n gc a p a c i t y 1 1 l ea i mo f t h i ss t u d yw a st oi m p r o v et h eg e lp r o p e r t i e so ft h e m u s c l eo f j u m b os q u i db ya d d i n gn a n s g l u t a m a m e ( t g a s e ) t h ee f f e c to ft g a s eo i lt h eg e lp r o p e r t i e s ，i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o no ft c y d s e ， r e a c t i o nt e m p e r a t u r e , x e a c t i o nt i m ea n dp hw e l es t u d i e d m e a n w h i l e ，t h em e c h a n i s m o fh o wt h et o a s ei m p r o v eg e lp r o p e r t i e sw a sp r o b e db yu s i n gs d s - p a g ea n d o b s e r v i n gw i t he s e m a tl a s t , t h ec o n d i t i o n sf o rs t r e n g t h e n i n gt h eg e lp r o p e r t i e so f j u m b os q u i dw 讹o p t i m i z e dt h r e n l g hr e s p o n s es u r f a c em e t h o d ( r s m ) 珏er e s u l t s a i es h o w na sf o l l o w s ： 1 t h ec o n c e n t r a t i o no ft g a s eh a s s i g n i f i c a n te f f e c to nt h e h a r d n e s sa n d s p r i n g i n e s so fm y o f i b r i l s ( p o 0 5 ) t h eh a r d n e s sr e a c h e st h em a x i m u mw h e nt h e c o n e e n w a f i o nr e a c h e s1 a n dt h es p r i n g i n e s sr e a c h e st h el l l a x i n l u n lw h e nt h e c o n e e n w a t i o nr e a c h e s0 5 w i t ht h ei n c r e a s eo ft g a s ec o n c e n t r a t i o n , t h es n e n g t ho f b o t hm 时ca n dp ad e c l i n ea n dt h et h r e ed i m e n s i o n a ln e t w o r ks t r u c t u r e sb o c o m o d e n s e ra n de v e n e y 2 r e a c t i o nt i m eo ft g a s eh a ss i g n i f i c a n te f f e c to ft h eh a r d n e s sa n ds p a n g i n e s s o fg e tp r o p e r t i e s ( ( p o 0 5 ) t h eh a l d n e s $ r e a c h e st h el l l a x m mw h e nt h er e a c t i o n t i m er e a c h e s2h o u r s 1 1 地s p r i n g i n e s so n l yi n c r e a s e ss i g n i f i c a n t l yi nt h ef i r s th a l fh o u r a n ds h o w s1 1 0c j m n g ei nl t a el e s to ft i 眦t h es t r e n g t ho fb o t hm h ca n dp ad e c r e a 浙江工商大学硕士研究生学位论文 w i t ht h et i m e , a n dt h et h r e ed i m e n s i o n a ln e t w o r ks l z u c 加t e sb e c o l 珈8d e n s e ra n d e v e n e r 3 r e a c t i o n 把呻p e 翱m 地o ft c r a s eh a ss i g n m e a n te f f e c t0 1 1t h eh a r d n e s sa n d s p r i n g i n e s s o fg e lp r o p e r t i e s q 0 0 5 ) b o t hb a d n e s sa n ds p r i n g i n e s si n c r e a s e s i g n i f i c a n t l y a t2 0 4 0 ，a n dg e tt h em a x i m l l mn u m b e ra t 4 0 ，d e c r e a s e s i g n i f i c a n t l ya t4 0 6 0 s d s - p a g ei sc l o s e l yl e l a t e dt ot h et e x t u r ep r o p e r t i e s i n m i c r o s 扛i l e t u r e , t h ep o r o s i t ya n du n f f o r m i 哆o fg e lk f l m c t m - e 锄s 如f 妫呜a t4 0 ， w h i l et h eg e l s t r u c t u r ei sr o u g ha n dp o r o s i t yi sw 0 1 1 3 0a t2 0 ca n d 6 0 1 2 4 p hh a ss i g n i f i c a n te f f e c to i lt h eh a r d n e s sa n ds p n n g m 嘲o fg e lp r o p e r t i e s ( ( p o 0 5 ) b o t hb a d n e s sa n ds p n n g i n e s sg e tt h em a x i m u mn u m b e ra tp h7 0 a n yp h n t l m b 日a b o v eo rb e l o w7 0w o u l dl e th a r d n e s sa n ds p r i n g i n e s sd r o ps h a r p l y 皿e m i e r o s t r u e t u r e sa tp h 5 0a n dp h7 0h a v en oo b v i o u sd i f f e r e n c e t h e r ei sn oo b v i o u s n e t w o r ks 拄u c t u r ea tp h 9 0 5 慨c o n d i t i o n sf o rs u e n g t h e u i n gt h eg dp r o p e r t i e so fj u m b os q u i dw e l e o p t i m i z e dt h r o u g hr s m t h eb e s tc o n d i t i o nf o rh a r d n e s si s1 0 7 o ft g - a s e c o n c e n t r a t i o n , 4 2 1 、o f 娜t t t r e a n d 2 1 8h o u r s 。a o f w h i c h m a k e s t h e h a r d n e s s 4 3 4 2a e c o r d i n g l y t h eb e s tc o n d i t i o nf o rs p r i n g i n e s si s0 7 6 5 o ft g a s e c o n c e n w a t i o n , 辑3 o ft e m p e r a t u r ea n d1 6 1h o u r s a o fw h i c hm a k e st h e s p r i n g i n e s s0 9 7 3a c c o r d i n g l y k e y w o r d s ：j u m b os q u i d ，d o s i d i e u s 百g 嬲，m y o f i b r i l s ，t r a n s g l u t a m i n a s e ，g e l p r o p e r t i e s ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y i v 浙江工商大学硕士研究生学位论文 英文缩写 a c a n o v a a p s 册 ，b s a e s e m 姗c m i g p a g e p m - r s m s d s t c a t e m 暇d t g 1 1 r i s 缩略词表 英文全称中文译名 a c d n肌动蛋白 a n a l y s i so fv a r i a n c e方差分析 a m m o n i u mp e r s u l p h a t e 过硫酸铵 a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e三磷酸腺苷 a l b p m i nb o v i n e 牛血清白蛋白 ， e n v i r o m e n t a ls c a n n i n ge l e c 廿o nm i c r o s c o p e 环境扫描电子显微镜 m y o s i nh e a v yc h a i n肌球蛋白重链 m i c r o b i a lt r a m # u m m i n a s e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c 佃o p h o r e s i s p a r a m y o s i n r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y s o d i u md o d e c y l s u l f a t e t r i c h l o r oa c e t i ca c i d n ，n ，n ，n - t e w a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ，t r a n s g l u t a m i n a t r i s ( 2 - c h l o r o p r o p y l ) p h o s p h a t e 微生物谷氨酰胺转氨酶 聚丙烯酰胺凝胶电泳 副肌球蛋白 响应面法 十二烷基磺酸钠 三氯乙酸 四甲基二乙胺 谷氨酰胺转氨酶 三羟甲基氨基甲烷 浙江工商大学硕士研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得浙江工商大学或其 它教育机构的学位或证书面使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名：i 鱼：重翌日期：。7 年占月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 日期：可年6 叻日 浙江工商大学硕士研究生学位论文 第一章引言 第一节秘鲁鱿鱼资源概况 鱿鱼是枪乌贼和柔鱼俗称，属于软体动物门( m o l l u s c a ) ，头足纲 ( c e p h a l o p o d a ) ，广泛分布于大西洋、印度洋及太平洋海域1 】囡。据e 渔业年 鉴统计翻，世界鱿鱼等头足类渔获量逐年增加，鱿鱼渔获量占世界总渔获量的比 重也随渔钓业的迅速发展而呈不断上升趋势。除了资源丰富以外，头足类具有成 熟时间短、生长速度快的特点，因此，是当今世界海洋生物种最具有开发潜力的 渔业资源之一j 鱿鱼具有较显著的品种特征：个体大、胴体长，肉质、颜色、风味与鲍鱼类 似，被称为“穷人的鲍鱼。鱿鱼营养丰富，高蛋白低脂肪，胴体部分约占体重的 5 0 ，头足部分约占体重的3 0 ，故鱿鱼可食部分达8 0 以上，比一般鱼类高出 2 0 左右，是良好的水产品加工原料。鱿鱼富含蛋白质及人体所需的多种氨基酸， 且必需氨基酸组成接近全蛋蛋白，是一种营养保健型且风味良好的水产品资源， 且含有丰富的钙、磷、铁元素，对骨骼发育和造血十分有益，可预防贫血。鱿鱼 内脏中含油量极高，而且含有大量高度不饱和脂肪酸，可从鱿鱼心脏中提取2 0 左右的二十碳五烯酸( e i ，a ) 及二十二碳六烯酸( d h a ) 。e p a 、d h a 有增加大 脑功能，提高记忆力，防止大脑衰老的功效。研究表明，水产品提取物中鱿鱼提 取物的抗氧化能力最强，同样在人体内则表现为抗衰老作用。经常食用鱿鱼，具 有很好的滋补作用，特别对腰肌劳损、风湿腰痛、产后体弱等有一定的疗效，另 外还有预防心脏病、高血压、脑血管疾病的作用。我国中医同样认为，鱿鱼有滋 阴养胃、补虚润肤的功能。 秘鲁鱿鱼是茎柔鱼( d o s i d i c u sg i g a s ) 的俗称，又称美洲大鱿鱼、巨鱿鱼。 英文名称为j u m b on y i n gs q u i d 。属软体动物门、头足纲、二鳃亚纲、枪形目、开 眼亚目、柔鱼科、柔鱼亚科、茎柔鱼属。秘鲁鱿鱼为高度洄游的大洋性浅海种， 体形较大，在秘鲁海域发现胴体长度主要在l l o - - 1 1 0 0 m m 范围内，不过个别的 胴体可达2 0 0 0 r a m 。该鱿鱼成长迅速，其寿命大都一年左右，分布集中在东部太 平洋，北至加利福尼亚湾，南至智利中部的智利群岛，其中在秘鲁海域分布尤为 集中。秘鲁鱿鱼是迄今为止发现的个体最大资源最丰富的鱿鱼种类之一嗍嘲。茎 浙江工商大学硕士研究生学位论文 柔鱼渔业起始于1 9 7 4 年，但是大规模开发利用始于二十世纪9 0 年代中期，主要 由日本和韩围等国家的鱿钓船所捕捞。我国鱿钓船于2 0 0 1 年开始在秘鲁外海作 业，到2 0 0 4 年在该海域生产的鱿钓船达到1 0 0 余艘，渔获产量超过2 0 1 0 4t ， 约占我国鱿钓总产量的7 0 以上，已经成为我国鱿钓船的重要捕捞对象嘲。 但我们国家对秘鲁鱿鱼及其加工后的废弃物的利用还只是处于初级阶段，加 工的技术含量较低。目前，我国鱿鱼的加工制品有十余种，产品有鱿鱼千、珍珠 鱿鱼干、鱿鱼丝、鱿鱼卷、鱿鱼丁、鱿鱼条、鱿鱼片、鱿鱼筒、鱿鱼丸子、冷冻 鱿鱼糜、调味煮熟品、鱿鱼罐头、烤鱿鱼等产品。日本的鱿鱼产量约占世界产量 一半，也是吃鱿鱼最多的国家，对鱿鱼的利用方式也及富变化，有生鲜消费( 生 吃、炒菜、沙拉等) 和加工品消费( 鱿鱼丝、调味鱿鱼片、熏制品等) 。目前对 鱿鱼的研究多集中在副产物的综合利用技术上，如王建中等f 7 】利用鱿鱼内脏自身 酶水解内脏及其它废弃物，开发出价廉的鱿鱼油、内脏水解液，并成功地低成本 解决i 从水解液中去除镉的难题。王海明等嘲以鱿鱼精巢组织中提取的核蛋白为 主要成分制成精核蛋白提取物，利用功能学评价实验方法对提取物进行抗疲芳、 抗氧化以及免疫调节实验。 第二节肌原纤维蛋白凝胶特性的研究进展 肌原纤维蛋白叫y 瓶嘶l s ) 是以肌球蛋白和肌动蛋白为主体组成的可支撑肌 肉运动的结构蛋白质，它是一类具有重要生物学功能的结构蛋白质群，占鱼类总 蛋白质的6 0 7 0 ，是水产食品加工中主要的研究利用对象凹。其作用除了参 与肌肉的收缩外，还与肉制品的流变学特性如黏结性、保水性、弹性、质地等有 着密切的关系螂。肌原纤维蛋白的热诱导凝胶对肉制品的结构特性起主要作用 h i l l 2 】。因此通过对肌原纤维蛋白凝胶特性的研究可以对肉制品的加工特性有更 深层次的理解。 肌原纤维蛋白中的几种重要蛋白质如肌球蛋白、肌动蛋白和肌动球蛋白的凝 胶机理已较清列1 3 】【1 4 1 1 5 】【l 司。肌球蛋白是形成凝胶必不可少的因素，单独条件下 可形成好的凝胶。其它的肌原纤维蛋白如肌动蛋白、调节蛋白和细胞骨骼蛋白不 形成凝胶，但是对肌肉蛋白形成的凝胶的粘弹特性具有重要的影响。 早在1 9 4 8 年f e f r y 【1 7 】指出，蛋白质凝胶的形成机理分两步。第一步是蛋白质 2 浙江工商大学硕士研究生学位论文 受热而变性展开；第二步是展开的蛋白质基团因聚合( a g g r e g a t i o n ) 作用而形成较 大分子的凝胶体( g e lm a t r i x ) 。蛋白质分子的解聚和伸展，使反应基团暴露出来，特 别是球蛋白的疏水基团，有利于蛋白质之间的相互作用。因此分子量大且琉水氨 基酸含量高的蛋白质容易形成稳定的网络结构。凝胶结构及其物理化学性质取决 于变性和聚集的相对速率，蛋白质聚集速度相对展开的速率慢，这有利于形成更 细致的凝胶网络。当蛋白质聚集的速率高于展开的速率时，就形成粗糙、无序的 凝胶结构或凝结物【l 司。 对于鱼类肌肉来说，许多学者对其凝胶的形成过程及机理进行过更多的研 j 究。现在普遍认为鱼类肌原纤维蛋白形成凝胶过程主要经过3 个阶段，即凝胶化 ( s u w a r i ) 、凝胶劣化( m o d o r i ) 和鱼糕化( k o m b a k o ) 3 个阶段 1 9 1 。 凝胶化通常指在5 0 以前，肌球蛋白和肌动蛋白分子形成一个较松散的网状 结构，由溶胶变成凝胶，凝胶化程度主要取决于鱼的种类【刎。鱼类肌原纤维蛋白在 4 0 c 左右放置2 - 4 h ( 高温s e t t i n g ) ，低于4 0 c 下放置1 2 - 2 4 h ( 低温s e t t i n g ) 可发生 凝胶化而形成s u w a r i ，低温下凝胶化( 称为s e t t i n g ) 是由于鱼肉本身所含有的谷氨 酰胺转氨酶催化作用下使分子内产生极强的共价键的结果【2 ”。而高温s e t t i n g 则 与肌原纤维蛋白流变特性的转变有关阎。肌球蛋自在肌原纤维蛋白形成的三维网 状结构中起主导作用。学者z i e g l e r 【矧认为肌球蛋白凝胶形成机制：加热使肌球 蛋白失去非共价键稳定的昏螺旋，然后分子间相互结合，从而形成刚性的蛋白网 络结构，该结构由共价二硫键和其它非共价键相互作用稳定。s a n o 2 4 1 等发现肌球 蛋白形成的凝胶其强度比肌原纤维蛋白形成的凝胶强度高，他还认为凝胶的形成 应首先起自肌球蛋白i a m m 部分，也就是先由l m m 部分肽链解螺旋，然后不同 肌球蛋白中的l m m 部分发生链接形成m m m ( m e d i a t em y o s i nm o l e c u l e ) ，然后 m m m 再由不同肌球蛋白的h m m 凝集成大的蛋白质颗粒，并进一步形成网络结 构。其过程如下图所示。 浙江工商大学硕士研究生学位论文 跏m ，- 、一 s z n ，口，hm n k c k 鼽肄置办分子 nj - b b l i i ”- 4 ”y 0 1 1 5 d r t h rf 洲t b 口f h mws 2 t h * 童_ 2 胡始阶段柏联结) 艏l 包帆球辑妇热凝嗣承意黼 c p 州n d l 川4 ”lr 坤e d 0 rn l t 洲rl m l h m 联结成鞭台况琏 r t l 磁l _ 时如瑚p 雌粕缸蜘n 耐蠡口瑚嗽a i 露忡村f l j h 黼”虹 f o e g e d i n g 嘲等则将肌球蛋白的作用归于其超螺旋a - h e l i x 尾部的变性。将肌 球蛋自按一定速度由3 0 加热到7 0 c ，肌球蛋白中的超螺旋a h e l i x 中尾部肽链 解离发生变性，这种解螺旋是持续进行的。解螺旋后的肌球蛋白按一定顺序排列， 并连接在一起，逐渐扩大成大的三维立体风络结构，随着尾部螺旋解开的程度逐 渐增大，凝胶的弹性也越来越大。如5 5 c 时，肌球蛋白分子中有3 2 的a - h e l i x 存在，而在7 0 时仅有4 的a - h e l i x , 所以后者形成的凝胶要比前者强的多。但 如果采用恒定的高温如7 0 c ( 不是由低温到高温的持续加热) ，则大量解开螺旋的 肌球蛋白会无序结合成大小不等的“蛋白核”，使网络的形成不均匀，从而使凝胶 弹性增大变得困难。在凝胶开始阶段，首先发生球蛋白的变性，这种变性包括蛋 白质构型或构相的改变以及肽链的解离，第二个阶段是发生变性的蛋白质发生相 互连接加这种连接是随意的，则只能形成蛋白质颗粒，只有按一定方式排列并连 接起来的变性蛋白质才能形成有弹性的凝胶体。 n i w a 口唰研究表明肌动球蛋白和肌球蛋白在4 0 的凝胶过程中，肌球蛋白头 部的二硫键起了重要的作用。s u z u k i 等研究认为在冷冻过程中鱼肉的肌球蛋白、 原肌球蛋白、肌动蛋白和肌原蛋白发生凝集变性，这种变性与热变性不同，主要 是由于氧化作用而形成了疏水基团、亲水基团和离子基团，并在蛋白分子、游离 氨基酸、脂肪酸之间形成共价键，特别是活性疏基被氧化成二硫键。台湾学者对 在鱼糜中加入还原剂、氧化剂的作用进行了研究。他们认为疏基有序地氧化成二 硫键对鱼糜胶凝作用巨大，随后他们对经冷冻储藏后鳍鱼( c o d ) 和鲐鱼( m a c k e r e l ) 的蛋白进行了研究，发现二硫键对经冷冻储藏鱼糜凝胶的形成及其强度起着非常 4 浙江工商大学硬士研究生学位论文 重要的作用 2 7 1 。 在鱼糜中存在的肌原纤维蛋白与白蛋白对凝胶也起着一定的作用。但肌原纤 维蛋白、白蛋白与肌球蛋白相比，凝胶温度高，凝胶强度低。肌球蛋白在4 5 就已发生凝胶化，肌原纤维蛋白必须加热到5 0 。c ，最大凝胶化发生在7 0 以上。 白蛋白初始凝胶的温度要达到8 5 ，到9 5 以上达到最大它们达到最大时，凝 胶强度分别达到肌球蛋白的i 5 i $ 。如果人为加大肌原纤维蛋白与白蛋白的浓 度，使其与肌球蛋白发生连接，则得到凝胶的强度要大得多网。 总之，肌球蛋白在鱼糜的凝胶化过程中起着关键的作用，此夕i - - - 硫键、肌球 蛋白与自蛋白、肌球蛋白与纤维蛋白原及其它蛋白的连接也对鱼糜的凝胶化起到 了一定的作用例。 当鱼肉蛋白质凝胶化后，升高温度至u 6 0 c 左右，在5 0 - 7 0 c 温度带时，凝胶分 裂形成断裂的网状结构，出现凝胶劣化现象口0 1 。凝胶劣化一般是由于内源性组织 蛋白酶类引起肌球蛋白的分解洲。因此，对肌原纤维蛋白凝胶或鱼糜制品进行加 热时应该使其缓慢通过5 0 以下温度区以促进凝胶化，并迅速通过5 0 - 7 0 。c 凝胶 劣化区，以尽量避免凝胶劣化，同时还应当加入酶抑制剂抑制蛋白酶的活性，从 而赋予产品有良好的弹性。 鱼类蛋白酶存在于鱼肉的肌纤维、细胞质及细胞外结缔组织的胞外基质中。 大多数蛋白酶为溶酶体酶和细胞质酶，另有一些存在于肌浆中并与肌纤维或巨噬 细胞外层相连。蛋白水解酶可降解蛋白质，破坏凝胶结构。组织分解后，酶主要 分布在肌浆蛋白中。它们的活性受特定的内源抑制剂、激活剂、p h 及环境温度 的影响。酶活性在鱼种之间差异极大，而且随捕获季节、性成熟、产卵及其他因 素的变化而变化嘲。内源性组织蛋白酶类通常分为两类：组织蛋白酶类( c a t h c p s i n s ) 和热稳定碱性蛋白酶。 组织蛋白酶为溶酶体蛋白酶，溶酶体中约有1 3 种组织蛋白酶在蛋白质的体 内转化和死后流变特性变化中起主要作用。其中组织蛋白酶b 、d 、h 、l 、l - l i k e 、 x 已从鱼贝类中纯化并鉴定出来1 3 3 1 。鱼糜加工过程中，内源组织蛋白酶b 、l 、 l - l i k e 活性的变化与鱼种有关。鳕鱼肌肉中蛋白酶活性在鱼糜加工过程中逐渐下 降，而在鲭鱼鱼糜中，经漂洗处理，还有8 7 的组织蛋白酶b 、h 和l - l i k e 活性 刚。在水解肌原纤维蛋白时，组织蛋白酶l 的活性高于组织蛋白酶b 。组织蛋 白酶l 被认为是大马哈鱼肌肉软化或太平洋鳕鱼鱼糜降解的主要蛋白酶。由于组 浙江工商大学硕士研究生学位论文 织蛋白酶b 、l 、l - l i k e 是溶酶体蛋白酶，溶酶体周围的p h 、温度及离子强度会 影响这些蛋白酶向肌浆的释放。因此，鱼死后的状况和鱼糜加工工艺会影响鱼糜 中这些蛋白酶的存留，也会影响到鱼糜制品的凝胶强度。 虽然不同的鱼体内酶的种类、来源及含量差异极大，但大多数鱼中都含有热 稳定蛋白酶。这类酶使肌原纤维蛋白形成的凝胶网络结构解体，形成浆状而非质 地坚实的凝胶。这些酶在5 0 7 0 c 时最活跃。尽管大多热稳定蛋白酶是水溶性蛋 白酶，但是漂洗工艺不能完全消除鱼糜中热稳定蛋白酶活性。这表明酶可能与肌 原纤维蛋白相结合，有时甚至是紧密连接在肌原纤维蛋白上，不易通过漂洗除去。 碱性蛋白酶位于肌肉组织的肥大细胞中，易与骨骼蛋白如肌动蛋白和肌球蛋白相 互作用。而且许多碱性蛋白酶对热稳定且在鱼肉的p n 范围内活跃，因而对鱼糜 品质影响更大 3 5 】t 3 6 1 。碱性蛋白酶有一些相似特性：最适p h 范围窄( 7 5 8 5 ) ，最适 温度6 0 ，5 0 以下7 0 以上观察不到活性，分子量较高( 5 6 0 - 9 2 0 k d a ) 等。 若再升高温度凝胶变成有序和非透明状，肌球蛋白和肌动蛋白形成的网络结 构被固定住，把加入的辅料及水分包裹在里面，鱼糜制品的凝胶强度则明显加大， 从而最后完成鱼糕化形成鱼糕。 第三节谷氨酰胺转氨酶的应用研究 一、谷氨酰胺转氨酶概况 谷氨酰胺转氨酶( t r a m g l u t a m i n a s e ，简i 5 玎ge c 2 3 2 1 3 ) 又称转谷氨酰胺酶， 是一种催化蛋白质或多肽链中赖氨酸上的氨基和谷氨酰胺残基上的卜酰胺基之 间的结合反应，通过转酰基作用而形成s - v - 谷氨酰基) - 赖氨酸共价结合键d t j 。从 而改交蛋白质的结构和功能性质，所以在食品、纺织和医药工业显示出广泛的应 用前景，特别是在食品工业中，在改良食品物性和粘合力上有惊人的效果，赋予 食品蛋白质以特有的质构和口感，并可以提高其营养价值。被认为是用于生产新 型蛋白食品的最重要的酶种之一，引起了国t 为# l - 研究者的高度重视和兴趣 3 8 1 近年来无论在发达国家还是发展中国家对于新型食品的研究开发都非常重 视。人们不但要吃饱，而且更加注重食品的口感、风味和营养。传统食品越来越 难以满足人们的口味和营养需求。新型食品的研制与开发是目前急前言需解决的 6 浙江工商大学硕士研究生学位论文 问题，利用先进的加工手段，开发出优质的新型食品，是加速我国食品行业发展 的有效途径。谷氨酰胺转氨酶作为一种新型的食品添加剂，在食品加工中的作用 日益显著。 二、谷氨酰胺转氨酶的来源和性质 谷氨酰胺转氨酶广泛存在于于哺乳动物的各种组织器官( 如肝脏、毛囊、表 皮、前列腺、血液) 以及鱼、植物和微生物中。在机体多种生化反应及生命代谢 过程中发挥着重婺作用嘲【删。 1 9 6 6 年，b 0 l k 等人首次在动植物组织中发现t g a s e 并通过离子交换、过滤、 层析等分离纯化过程得到了酶活提高了2 3 0 倍的样品，但动物肝来源稀有，分离 纯化工艺复杂，价格昂贵，热稳定性差，未能在实际生产中广泛应用【4 1 】。8 0 年代 末。a n d o 等人利用微生物发酵法生产t g a s e 获得成功，并生产出纯化了1 7 4 倍的 t c , a s e ( 4 2 。与动物来源的谷氨酰胺转氨酶相比，微生物法生产的酶其作用p h 、温 度、底物专一性具有较广的范围( 表1 1 ) ，且生产成本低，产酶周期短，发酵产物 单纯，制得的酶制剂亦价格低廉，从而大大促进了其在食品工业上的应用，可以 说微生物来源的谷氨酰胺转氨酶的发现为其应用打开了一条更为广阔的可行之 路。 到目前为止，m t g 以其廉价的成本及独特优势引起了国内研究人员的高度 重视，而且有一些m t g 在菌种筛选m ( 吴介文等) 、发酵条件优化删嘲阐( 郑 美英等) 及酶的应用m ( 江波等) 方面的报道，但基本上是处于实验室水平 的研究阶段。江苏泰兴新鑫医药辅料有限公司与无锡轻工大学合作，利用微生物 发酵生产t g a s e ，产酶水平达到4 ，2 5u m l ，最高达到7 u m l ，达到国际最高酶活 水平，所生产的t g a s e 己经在国内广泛使用 4 9 1 。 不同来源的谷氨酰胺转氨酶的性质也有所不同( 表1 - 1 ) 。微生物发酵产生的 微生物谷氨酰胺转氨酶0 v i t g ) 较动物来源的谷氨酰胺转氨酶有许多优点，主要 为；p i - - l 适应范围广、不依赖c a 2 + 、稳定性强、催化交联程度高，另外微生物谷氨 酰胺转氨酶属于胞外酶，提取时不需要破壁，易于分离纯化。 7 浙江工商大学硕士研究生学位论文 最适p h 值 最适反应温度( ) v l i 值稳定范围 、温度4 0 残存活( ) 温度5 0 ( 2 残存活力( ) 分子量 等电点 0 r a m c a 残存活力( ) l m m = a 残存活力( ) 5 m m c a 残存活力( ) 谷氨酰胺转氨酶的催化机理 谷氨酰胺转氨酶是一种催化酰基转移反应的转移酶，根据酰基受体不同，可 以催化以下三种类型的反应，催化反应如图l 2 所示( 5 ”； ( 1 ) 催化蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的7 羧酰胺基和伯胺之间的酰氨基转移 反应( 图l z a ) ，利用该反应可以将一些限制性氨基酸引入蛋白质以提高其营养价 值，以弥补加工过程中流失或损坏的必需氨基酸。 ( 2 ) 当蛋白质中赖氨酸残基的氨基作为酰基受体时，形成蛋白质分子内或分子间 的奸谷氨酰基) 赖氨酸共价键( 图1 - 2 b ) ，使蛋白质分子发生交联，从而改变食品 的质构，改善蛋白质的溶解性、起泡性、乳化性等许多物理性质。利用该反应还 可以将不同蛋白质通l 立t g a s e 结合成大分子，从而开发新蛋白食品如模拟蟹螯、 模拟虾等。加工中碎肉的处理即是利用此原理。 ( 3 ) 当不存在伯胺时，水会成为酰基受体，其结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成 谷氨酸残基( 图i - 2 c ) ，该反应可用于改变蛋白质的等电点及溶解度。 8 6 一 一 一 帖 。 ” 椭 吖 删矧嬲 蛐 啪 啪 啪 删糯糯| 霎 蛐 椭 硼 啪 q 奶 q 舄 舢 蟠 啪 蚴 g ： 奶 舄 删 蟠 姗 蚴 g ： 7 8 x ， ， 钙 2 弱 蝴 9 2 姗 瑚 7 9 x ， ， 髟 勰 w 羹薹 蛐 修 啪 啪 浙扛工商大学硕士研究生学位论文 a b c 9一眦琏n一驯一nit-r4-c4-rn i tr 4 - 隅一n 玛_ k n 一托一n 强 i i g l t l 一一g l u o0 邑一 +一lyslqih一墅芷一n h l y s + n 地 e 一+ 一 一哆一n h n 强 一c a u n 珏 一g l u oo 皂一妣+ 聃堂o o h+ 隅 ii g l u ，一g l l l 一 图1 - 2t g 酶催化的反应机理 f i g u r e1 - 2m e c h a n i s mo f r e a c t i o n w h i c ht g a s ec a t a l y z e d 四、谷氨酰胺转氨酶在食品中的应用 1 9 9 3 年- 4 月日本味之素公司开发了以谷氨酰胺转氨酶为主体的食品用酶制剂 t g - s 。t g - k 和1 g b 三个品种f 5 2 1 ，产品投放市场后1 9 9 5 年在日本销售额即达2 0 亿 日元，位于淀粉酶之后，排名第二。目前，谷氨酰胺转氨酶己应用到肉制品、鱼 肉制品、乳制品、植物蛋白制品等多种食品中【5 3 】跚。 1 在畜肉制品中的应用 肌球蛋白和肌动蛋白是肌肉的重要组成成分，是谷氨酰胺转氨酶作用的良好 底物。经t g 鹤e 的催化，肌肉蛋白分子间形成致密的三维网状结构，显著提高了 产品的质构，改善了肉制品的品质，增加了产品的附加值。 s a k a m o t o e 5 5 等人在1 9 8 6 年就开始使用谷氨酰胺转氨酶生产重组肉制品，他们 将碎牛肉、碎猪肉和其它原料包括谷氨酰胺转氨酶、面粉、奶粉、品质改良剂等， 混合，成型，放入耐压容器内杀菌。可用此方法生产汉堡包、肉丸、烧卖等。 江波 5 6 1 等曾就谷氨酰胺转氨酶对火腿肠凝胶性质的影响进行过研究。通过实 验发现添加谷氨酰胺转氨酶后火腿肠组织的凝胶破坏力比对照组提高了6 0 n ，凝 胶强度比对照组提高了3 0 。经扫描电子显微镜观察，发现形成了致密的三维网 9 浙江工商大学硬士研究生学位论文 状结构。 吕心泉 5 7 1 等曾用谷氨酰胺转氨酶对重组牛肉生产牛肉干进行了研究，他采用 碎牛肉为主要原料，配以各种辅料，添加谷氨酰胺转氨酶，经过多次试验，优化 工艺配方，研制出了一种色泽、口感、风味均被人们接受的重组牛肉干 用谷氨酰胺转氨酶交联的蛋白质还可以用作脂肪替代物，生产低脂肉制品。 n o v o 公司使用交联酪蛋白凝胶作为脂肪替代物，应用到色拉米肠中代替了5 0 的脂肪。用谷氨酰胺转氨酶处理可提高肉制品的颜色。将血红蛋白交联后，可作 为抗氧化剂在肉制品中应用嘲。 ， ! 2 在乳制品中的应用 谷氨酰胺转氨酶在乳品工业中也有较为广泛的应用。乳制品中的酪蛋白、乳 清蛋白、乳球蛋白等是谷氨酰胺转氨酶作用的良好底物。经过谷氨酰胺转氨酶改 性后的酪蛋白，在功能性质方面得到显著增强，是优良的食品添加剂 5 9 1 。 经过谷氨酰胺转氨酶处理后，使乳清蛋白与酪蛋白交联在一起，可以提高奶 酪的产量。乳清蛋白经过谷氨酰胺转氨酶处理后，可作为可食性涂膜、包装材料， 提高产品外观及保质期【5 2 】。 在奶粉生产中，加入谷氨酰胺转氨酶可提高酪蛋白的玻璃化温度，有效防止 奶粉的结块。经过谷氨酰胺转氨酶处理过的脱脂乳粉，由于乳蛋白分子间形成了 性质稳定的共价键，在水溶液中形成的凝胶强度比未经处理的乳粉形成的凝胶强 度大，凝胶的持水性、耐热性、耐酸性增强。用这种脱脂乳粉生产酸奶，乳清析 出显著减少，酸奶的稳定性更好【4 9 】。 3 在植物蛋白制品中的应用 g o t t m a n n r 6 0 等人在1 9 9 2 年首先使用谷氨酰胺转氨酶处理焙烤食品，他们发现 在和面过程中添加谷氨酰胺转氨酶可以提高面团稳定性和面块的体积。用谷氨酰 胺转氨酶处理弱筋小麦面粉同样可以带4 得体积大、组织结构好的面包。 谷氨酰胺转氨酶可以减少方便面的吸油率，从而减少了方便面的热量，同时 减少了油的消耗量。在面条的生产中加入谷氨酰胺转氨酶，可明显提高面条的口 感及质地，使其表面粘度下降，蒸煮时不易粘连【6 l 】 在大豆制品加工中，k a 的嘲等研制了一种耐保存的麻婆豆腐。将豆浆与葡萄 糖酸内酷、谷氨酰胺转氨酶混合，5 0 保温一个小时，1 1 0 杀菌，从而制成产 浙江工商大学硖士研究生学位论文 品。这种麻婆豆腐在2 5 保存六个月后仍保持良好的口感、质地与风味。 4 在鱼制品中的应用 在国外，谷氨酰胺转氨酶已广泛应用于鱼糜生产中，能显著提高鱼糜制品的 凝胶强度，增加低值鱼的附加值。 学者s e g u r o 嘲报道了对阿拉斯加鳕鱼鱼糜凝胶弹性的影响，发现添加 t c f a s e 的效果明显优于不添加t g a s e 的鱼糜。 c ) u o - j a n et s a i 酬等曾将从，印硼泖p ，比f f 缸m 肠如忌舢抛中提取的谷氨酰胺转 、氨酶用于碎鱼肉的重组，结果表明谷氨酰胺转氨酶可催化肌球蛋白重链的交联， 并增加鲭鱼糜的凝胶强度。 h i r o k os a k a m o t o t 6 5 1 等在鱼糜生产中添加谷氨酰胺转氨酶以研究其提高凝胶 强度的状况。结果表明在鱼糜生产中加入谷氨酰胺转氨酶，由于形成了6 - ( 丫- 谷氨 酰基) 赖氨酸的交联结构，使鱼糜的凝胶强度提高。 j i 眦g 嘲等曾对谷氨酰胺转氨酶、还原剂和蛋白酶抑制剂对带鱼鱼糜品质的 综合