（发酵工程专业论文）γ—亚麻酸生物合成工艺的研究.pdf

浙江工业大学硕士学位论文 丫一亚麻酸生物合成工艺的研究 摘要 y 亚麻酸是一种高级多不饱和脂肪酸，具有很高的医用价值，是 人体内的一种必需脂肪酸。微生物发酵生产y 一亚麻酸也成为国内外 研究的热点之一。本文以高大毛霉为出发菌种，发酵生产y 亚麻酸。 对高大毛霉液态发酵工艺条件进行优化。优化后的培养基成分 是：麦芽糖浆1 5 0 9 l ，硫酸氨3 9 l ，c n 为5 0 ，z n s 0 40 0 1 9 l 、 f e s 0 40 0 1 6 9 l 、m n s 0 40 0 0 1 9 l 、k h 2 p 0 42 9 l 、m g s 0 4 0 3 9 l 。优化后的培养条件：p h 值5 5 ，选用种龄2 4 h 的孢子悬液接 种，接种量1 0 ，摇瓶装液量3 0 ，纱布层数3 层，摇床转速2 0 0r p m 。 2 8 培养3 d ，然后2 6 。c 培养l d 。 菌体生物量在3 l 发酵罐罐培养至7 2 h 左右达到最大，此后菌体 生物量逐步减少；产g l a 水平在7 2 h 达到最大，此后呈下降趋势。 发酵结束后，菌体生物量达到2 1 9 9 l ，油脂量0 8 9 2g l ，g l a 量 o 3 1 1g l 。 对高大毛霉固态发酵工艺条件进行优化，优化后的培养基成分 是：以麸皮、豆饼粉、k h 2 p o 。为基本固态培养基，最佳比例为 8 ：1 ：0 0 1 5 ，2 淀粉、o 6 f n r t 4 ) 2 s 0 4 。基料与水分比例为1 ：1 5 。优化 后的培养条件：装量2 5 9 2 5 0 m l 瓶。p h 值在5 4 5 6 之间。孢子悬液 接种，接种量在2 5 m l 2 5 0 m l 到3 5 m l 2 5 0 m l 之间。2 8 。c 培养8 4 h ，然 浙江工业大学硕士学位论文 后2 6 。c 培养3 6 h 。优化后可得油脂3 6 8 9 k g 培养基，g l a l 3 2 9 k g 培 养基。 对油脂分离提取工艺条件进行优化。优化后的条件是：菌体破碎 方法为超声波破壁法。仪器功率8 0 0 w ，作用时间6 0 r a i n 。最终产物 量可达2 0 9 & g o c 左右。油脂萃取方法：乙醇一正己烷法。乙醇：正己 烷为1 ：1 ，混合液量为1 0 m l g 菌体生物量，处理时间6 0 m i n 。最终产 物量可达2 0 9 k g d c 以上。 关键词y 一亚麻酸，高大毛霉，油脂，发酵，优化，分离提取 浙江工业大学硕士学位论文 s t u d yo nb i o l o g i cs y n t h e s i so f g a m m a l i n o l e 】蛆ca c i d a b s t r a c t g a m m a - l i n o l e n i ca c i d ( g l a ) ，ap o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，i sa n u t r i t i o n a l l yi m p o r t a n t a n de s s e n t i a l f a t t ya c i d p r o d u c t i n gb y m i c r o o r g a n i s mw a sr a t h e rn o t i c e a b l e i n t h i s t h e s i s ，p r o d u c t i o n o f g a m m a - l i n o l e n i ca c i db ym u c o r m u c e d ow a ss t u d i e d i nt h el i q u i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ，t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u m w e r ec o m p o s e do f a sf o l l o w s ：m a l t o s e1 5 0 9 l 、( n h 4 ) s 0 43 e e l 、z n s 0 4 0 0 1 9 l 、f e s 0 40 0 1 6 9 l 、m n s 0 40 0 0 1 9 i 、k h 2 p 0 42 9 l 、m g s 0 4 o 3 9 m t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：p h5 5 ，s e e d c u l t u r et i m e 2 4 h ，i n o c u l a t i n g w i t h s u s p e n s i o ns p o r e s ，i n o c u l u m p e r c e n t a g e1 0 ，m e d i u ml o a d a g e7 5 m l 2 5 0 m lf l a s k ，i tw a sc u l t i v a t e da t 2 8 i nt h ef i r s t7 2 ha n dt h e na t2 6 i nt h en e x t2 4 h i na3 lf e r m e n t o r , t h em a x i m u mb i o m a s si n7 2h o u r sw a s21 9 9 e l ；t h ec o n t e n to fl i p i di nt h e b r o t hw a s0 8 9 2e l ；a n dt h ec o n t e n to fg l aw a s0 311g l i nt h es o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ，t h eo p t i m a lm e d i u mw e r ec o m p o s e d o f a sf o l l o w s ：w h e a lb r a n ：b e a nc a k e ：k h 2 p 0 4w a s8 ：1 ：0 0 1 5 ，2 s t a r c h ， o 6 ( n h 4 ) 2 s 0 4 t h er a t i oo fs u b s t r a t et ow a t e rw a s1 ：1 5 t h eo p t i m a l 1 i i 浙江工业大学硕士学位论文 c u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：m e d i u ml o a d a g e2 5 9 2 5 0 m lf l a s k ，p h 5 4 5 6 ，i n o c u l a t e dw i t hs u s p e n s i o ns p o r e s ，i n o c u l u mp e r c e n t a g ew a s b e t w e e n2 5 m lt o3 5 m 1 i tw a sc u l t i v a t e da t2 8 。c i nt h ef i r s t8 4 ha n di n t h en e x t3 6 ha t2 6 。c t h ec o n t e n to fl i p i dw a s3 6 8 9 k gc u l t u r e ，a n dt h e c o n t e n to fg l aw a s1 3 2 9 k gc u l t u r e t h ec e l lw a l lw a sd e s t r o y e df o r1hb ys u p e r s o n i ca t8 0 0w ：g l a w a se x t r a c t e df o rl hf r o mt h ec u l t u r eb y1 0m le t h a n o la n dn - h e x a n e ( 1 ：1 、 p e rg r a md r yb i o m a s s ，t h ey i e l do fg l a w a s2 0 9 k gd r yb i o m a s s k e yw o r d s ：g a m m a l i n o l e n i ca c i d ，m u c o rm u c e d o ，l i p i d ，o p t i m i z a t i o n ， e x t r a c t i o n 浙江工业大学硕士学位论文 浙江工业大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：木彩 日期：口# 年，月口扩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口以 作者签名：朱勘 导师签名： ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 日期：口年p 月口矿日 日期： 一辞6 月矿日 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1y 亚麻酸的理化性质和生理作用 丫- 亚麻酸( g a m m a - l i n o l e n i ca c i d ，简称g l a ) ，法定编号c a s 4 6 3 - 4 0 1 】，学 名6 ，9 ，1 2 十八碳三稀酸( 6 ，9 ，1 2 o c t a d e c a t r i e n o i ca c i d ) ，为全顺式，非共轭立 体构形，直链，分子式为c 1 8 h 3 0 0 2 【l 】，相对分子质量2 7 8 4 4 。y - 亚麻酸是a 一亚麻 酸的异构体，属n 6 系列不饱和脂肪酸。无色或淡黄色油状液体，不溶于水，溶于 许多有机溶剂。碘值2 7 3 5 。由于其高度的不饱和性使其在空气中不稳定，遇空气 后可自动氧化而形成坚硬膜层。尤其在高温条件下，易发生氧化反应。在碱性条 件下易发生双键位置及构型的异构化反应，形成共轭多烯酸。天然品多见于亚麻 油( - z 5 0 ) 、黑加仑籽油( 2 2 ) 、月见草油( 9 ) 、玻璃苣油( 1 5 2 5 ) 等中。母乳中亦含有少量。在人体内虽可由亚油酸转化而成，但往往不能满足人 体对y 一亚麻酸的需要，故常作为必需脂肪酸对待。 v 一亚麻酸作为人体必需脂肪酸，是组成人体各组织生物膜的结构材料，也是合 成人体系列前列腺素的前体。它在人体很多组织中存在，但存在时间很短，且 含量很少。正常人从事物中摄取的亚油酸经6 脱氢酶转化为y 一亚麻酸，进而代谢 为二高_ y 亚麻酸( d h 吖亚麻酸) ，转化成前列腺素e 1 ( p g e l ) ，或经5 脱氢酶转 化为花生四烯酸，生成其它前列腺素( p g s ) 【见图1 - 1 ，但当人体摄取过量的饱 和脂肪酸或出现其它代谢紊乱时，体内的a 6 脱氢酶受到抑制，从而影响亚油酸向 y 亚麻酸的转化，造成体内前列腺素缺乏，导致种种疾病产生。此时，如及时地补 充y 亚麻酸，便可以保证体内前列腺素的正常代谢，从而消减疾病。 代谢途径如图1 1 所示： 浙江工业大学硕士学位论文 扩扩 g 缎一测：一前列腺素附一 二十碳五烯酸 g 蟛售彩= 叭= 一、 ，= 忙、v t 一亚麻酸d f i t 一亚麻酸花生四烯酸 前列腺素p g i 前捌腺素p g 一 图1 - 1 亚油酸在人体内的代谢途径【1 1 27 - 亚麻酸的药理临床研究 1 2 1 降血脂作用研究 研究结果表明：y 亚麻酸具有明显的降低总胆固醇( t c ) 功效，活性是亚油 酸的1 6 0 倍。其机理为： ( 1 ) 作为p g e l 的前体而发挥降低t c 的作用； ( 2 ) t 亚麻酸为多不饱和脂肪酸，增大了t c 的极性，水溶性，使之容易被 酶分解； ( 3 ) 7 - 亚麻酸可以从血液中清除甘油三酯，减少内源性t c 的合成，从而减 少b 一脂蛋白的生成。 由于y 亚麻酸还具有明显提高高密度脂蛋白( h d l ) 的作用，因而能抑制细 胞摄取，分解和蓄积低密度脂蛋白胆固醇，还能排除已蓄积在细胞内的胆固醇。 临床结果f 2 1 表明对甘油三酯，胆固醇，6 脂蛋白下降的总有效率分别为8 1 5 ， 6 8 2 ，6 4 8 。 2 塑垩三些查堂堕主堂垡堡苎 1 2 2 抑制血小板聚集和血栓素a 2 形成 血栓素a 2 ( t x a 2 ) 是内源性最强烈的血小板聚集剂和血管收缩剂，而前列腺 环素( p g h ) 则为最强烈的血管扩张剂。正常人体内两者保持动态平衡，以维持 血小板的生理作用。一旦两者失去平衡，将使t x a 2 的合成增多，p g l 2 的生成减少， 而增加了血小板的聚集作用。v 亚麻酸作为p g e l 的前体，一方面通过其抑制了血 小板的聚集，同时它还通过二高吖亚麻酸抑制血小板t x a 2 的合成酶的活性，从而 改变t x a 2 p g l 2 的比值【i j 揭示了y 亚麻酸抗血栓性心血管疾病的机理。 1 2 3 抗酯质过氧化 对月见草研究表明，其具有明显的抗酯质过氧化作用，说明y 一亚麻酸在体内 首先被氧化而减轻了细胞酯质过氧化损害。c c l 4 在体内能产生自由基损害肝细胞 膜，月见草油具有拮抗c c h 致死作用 3 1 ，提示其氧化作用可能是通过对抗或清除 自由基来完成的。最近u n p a s 也报告了有关这方面的研究，并认为v 亚麻酸，花 生四烯酸等可以作为潜在的抗癌药物【3 】o 1 2 4 抑制溃疡及胃出血的作用 许多实验已经证实前列腺素可以缓解胃出血或胃溃疡，在对由阿司匹林引起 胃出血的大鼠进行喂养y 亚麻酸的实验表明，t 亚麻酸可有效的防止阿司匹林引起 6 去饱和抑制作用，保护胃粘膜免受损害，而且促进了花生四烯酸和前列腺素前 体物质的合成。令有研究表明，月见草中的y - 亚麻酸可明显抑制大鼠幽门结扎性 溃疡的形成，显著抑制大鼠应激性溃疡，对组织胺所致的大鼠胃溃疡有明显的抑 制作用，并明显抑制慢性醋酸型胃溃疡。抑制胃酸分泌，降低胃酸浓度【4 】。 1 2 s 增强胰岛素作用 a w a x d 认为，由t 亚麻酸组成的磷脂可以增强细胞膜上磷脂流动性，增强细 胞膜受体对激素( 包括胰岛素) 的敏感。由y 一亚麻酸而来的前列腺索等活性物质， 也可以增强腺苷酸化酶的活性，提高胰岛p - 细胞分泌胰岛素的功能。此外丫亚麻 酸作为多不饱和脂肪酸，还可以恢复糖尿病人细胞的脂肪酸去饱和酶的活性【5 】j 艋床 观察也同时表明了对高血糖者的降血糖作用，说明其对糖尿病及其综合症有较全 面的防止作用。 浙江工业大学硕士学位论文 1 2 6 减肥作用 由于y 亚麻酸对棕色脂肪组织有刺激作用，能促进棕色脂肪酸线粒体活性， 以消耗提内过多热量，而具有治疗肥胖症作用。临床应用在正常饮食下可以降低 体重2 - 8 k g 的患者达7 5 6 】。 1 2 7 改善女性月经前综合症 7 1 一般约有6 0o 6 以上妇女会发生乳房胀痛【扪、全身不适等所谓月经前综合症 ( p m s ) 。y 亚麻酸能明显改善p m s 的各种症状。曾对4 7 名平均年龄2 1 9 岁( 1 9 - 2 1 岁2 5 名，2 2 - 2 4 岁1 7 名，2 5 3 5 岁5 名) 的妇女，每天给予y - 亚麻酸3 6 r a g ，经2 个月后，身体酸痛改善率为3 2 1 ，头痛改善率2 9 4 ，腰痛改善率3 4 8 ，乳 房肿痛改善率2 8 6 。 1 2 8 其他作用 近几年来国内外临床研究还表明y 亚麻酸对精神分裂症嘲，特应性湿疹或普通 鳞癣病【1 0 l 有缓解作用。曾试验1 6 0 岁患者( 成人3 1 1 名，女性1 6 7 名) 每天给予 4 8 8 0 m g ，结果均有定效果。对多种炎症1 ”。如：风湿性关节炎，溃疡节肠炎， 脉管炎，肾炎等均有疗效和改善作用。预示着y 一亚麻酸具有更广泛的药用前景。 1 3p 亚麻酸的各种生产方式 y 一亚麻酸的来源有化学合成、从动物中提取、从植物中提取以及从利用微生 物发酵法获得。 1 3 i 化学合成 1 9 5 9 年，o s b o n d 首先报道以全合成方法从简单有机物分子合成制备g l a ，以 及其他相似的多烯脂肪酸，合成路线主要包括炔类化合物和格林试剂反应，以及 l i n d l a r 催化加氢反应等过程。从原料、试剂和操作条件看，此法有一定难度，不 易推广，现在己基本被弃用。 浙江工业大学硕士学位论文 1 3 2 动物资源 e y w i n 等用人工方法培养某些纤毛纲原生动物( c i l l i a t e d p r o t o z a ) ，发现有四个 种中g l a 含量超过3 0 ：最近，日本o n a d ac e m e n t 公司生物工程研究所的m o r i o h i r a m o 和东京农业与技术大学生物工程系的y u n k im i u r a 等利用新鲜海水培养一 种蓝丝藻( s p i m l i n a p l a t e n s i s ) 和一种小球藻( c h l o r e l l as p 。n k g 4 2 4 0 ) 生产g l a ， 其含量可达总脂肪酸的1 0 。近来还发现人乳中也存在g l a 。 1 3 3 植物资源 y - 亚麻酸存在于某些孢子植物及种子植物的油中 1 3 3 1 月见草 g l a 首先从植物月见草种籽油中发现，月见草成为一种天然g l a 资源。月见 草( o n e o t h e r a b e n n i s l ) 又名夜来香( e v e n i n g p r i m r o s e ) 、山芝麻，属柳叶菜科多年 生草本植物，原野生于北美洲，1 7 世纪初移植到欧洲，我国东北、山东、江西有 种植，亩产籽达1 0 0 k g 。月见草籽又称山芝麻( w i l d s e s a m e s e e d s ) ，含油2 0 2 5 ， 含y 亚麻酸9 2 1 1 5 ，还含有7 0 8 0 的亚油酸。为了满足越来越大的国 内外市场的需求，我国近年来已进行了大面积的人工栽培。仅吉林省延边地区1 9 8 8 年的种植面积己达2 0 0 0 公顷，通过园艺所经过多年的研究分离出高产株系，可使 每亩产量达到1 5 0 k g ，其出油率较野生株高1 3 4 。 1 3 3 2 黑加仑。 黑加仑( r i b e sm i g r u ml ) 属虎耳草科茶蔗子属小灌木，是我国东北地区广泛 种植的一种浆果。黑加仑可加工成果汁、果酱等多种产品。t r a i f e r 等人发现黑加 仑籽中含油1 4 4 3 ，1 r 亚麻酸含量为1 1 7 1 ，此外含有1 4 7 5 的a 亚麻酸1 2 1 。 1 3 3 3 华山松籽油 华山松( p i n u s a r m a n d yf r a n c h ) 系我国特产，分布北自山西沁源，南至云南、 贵州，西至甘肃西部，年产量约2 0 0 0 t 。华山松子含粗脂肪5 1 2 ，含v 一亚麻酸 3 7 9 3 【1 3 1 。 浙江工业大学硕士学位论文 1 3 3 4 微孔草 微孔草( m i c r o u l as i k k i m e n s i sh e m s l i ) 紫草科微孔草属两年生草本植物，又 叫野菠菜。高有为等人经几十年研究，我国青藏高原及邻近的四川、陕西、甘肃、 云南、贵州等八省海拔2 5 0 0 到4 0 0 0 米的高寒地区发现了这种植物，微孔草全属 3 0 余种，其中2 6 种为我国所独有。微孔草含油4 0 到4 5 ，含y 亚麻酸8 1 ， 还含有1 3 6 的舡亚麻酸f 】4 】。微孔草亩产g l a 量是月见草两倍，仅四川省微孔草 有五十万亩，产籽1 5 万吨，是极有开发前景的g l a 天然资源。 1 3 3 5 螺旋藻 螺旋藻( s p i r u l i n a ) 又名蓝藻，属蓝藻门，是一种多细胞、微型、不分枝、无 异形细胞的螺旋状体，生长于热带的高温碱性湖水中，在地球上已有3 5 亿年的历 史，是现存最古老的生命之一，螺旋藻含有2 0 左右的y 亚麻酸。 1 3 3 6 玻璃苣 紫草科玻璃苣( b o r a g e ) 油中的y 一亚麻酸含量为1 8 - 2 6 。1 9 9 2 年s c r i p 报道 英国最著名的y 一亚麻酸生产商s c o t i a 制药公司正在研究利用玻璃苣生产高含量的 y - 亚麻酸油。他们利用杂交技术培育的高产品种正在进行种植技术的评价。并且已 经开发了种去除杂质的方法，有望得到纯的y 一亚麻酸。 1 - 3 4y 亚麻酸的微生物发酵 目前，微生物发酵法生产y 亚麻酸已成为研究热点，与上述三种生产方法相 比，具有许多优点。首先微生物繁殖能力强、生长快，菌丝体易于收集和提取； 其次，生产不受原料和产地限制，不受季节和气候的影响，不占用大量土地，可 长年工业化生产，周期短，过程可人为控制；微生物发酵法产生的产物含量较高； 发酵后所得的菌体还含有大量的蛋白质、灰分和纤维素，脂肪抽提后可进行再利 用；可通过先进的生物技术手段大幅度提高y 一亚麻酸的产量和降低生产成本。可 见，微生物发酵法具有非常重大的意义。 因此，各国科学家开始探索新的卜亚麻酸来源。1 9 4 8 年b e r n h a r d 和a l b e r c h t 【l 纠 首先从布拉克须霉( p h y c o m y c e s b l a k e s l e e a n u s ) 的菌体脂肪中鉴定出7 一亚麻酸，其含 量高达菌体脂肪酸的1 6 。随后人们又发现了一系列产y 一亚麻酸油脂的菌类，包 6 浙江工业大学硕士学位论文 括被孢霉属、根霉属、小克银汉霉属等。由此，低等丝状真菌成了y 亚麻酸的又 一新来源。 真菌发酵法进行y 亚麻酸生产要综合考虑菌体生物量、菌体油脂含量以及油 脂中p 亚麻酸含量三个因素，这三个指标都较高的菌株才是进行发酵生产的理想 菌株。日本首先进行了这方面的研究。1 9 8 5 年，铃木修等f 1 6 】对被孢霉属的深黄被 孢霉( m o r t i e r e l l a i s b e l l a n a ) ，拉曼被孢霉( m r a m a n n i a n a ) ，葡酒色被孢霉( m v i n a c e a ) 和矮被孢霉( m n a n a ) 进行了高浓度碳源发酵培养，结果干燥菌体量为4 0 - - 8 0 9 l ， 油脂含量为3 5 - - 7 0 ，脂肪酸中y 亚麻酸含量为3 一1 1 。1 9 8 6 年开始，日本 出光石油化工公司和英斯特奇公司已经采用微生物发酵法制取、生产7 亚麻酸油 脂，年产量约5 万吨，英国s f s b 厂采用二千升发酵罐进行发酵，年产量1 0 0 吨。 两国已推出含微生物y 一亚麻酸油脂的功能性食品和系列化妆品，使微生物油脂的 综合利用迈出了实用化的第一步 i7 j 。目前，国内也有许多科研单位和高校从事这 发面的研究。邢来君等 1 8 , 1 9 , 2 0 以一株深黄被孢霉a s 3 3 4 1 0 为出发菌株进行诱变育 种，先后得到了5 株高产菌，其菌体干重、油脂含量、y 亚麻酸含量都有大幅度提 高1 9 9 1 年赵振英等【2 l 】从毛霉目6 个属的菌株中筛选出c 6 7 6 1 和t 8 7 6 5 ，其v 亚麻 酸含量分别为1 2 1 4 和2 2 - 2 4 。1 9 9 8 年黄建忠【丑】等对深黄被孢霉a s 3 3 4 1 0 进行了紫外线，硫酸二乙酯和亚硝基胍复合诱变得到高产脂m 0 1 8 变株，菌体平均 油脂含量达7 9 2 ，y 亚麻酸平均含量为7 2 。2 0 0 0 年张玲等田j 报道对雅致枝霉 a s 3 3 4 5 6 进行5 氟尿嘧啶、紫外线、氯化锂复合诱变得到变异株t e 7 - 1 5 ，其菌体 生物量达到1 9 0 4 e j l ，y 亚麻酸产量达到9 5 m g l ，满足工业化生产的要求。2 0 0 1 年，咸漠【2 4 】等用硫酸二乙酯对深黄被孢霉进行化学诱变获得变异株x m - 1 ，其菌体 生物量为1 5 1 9 t , ，油脂量为7 5 9 ，l 。表1 - 1 列出了现有国内外y - 亚麻酸高产菌株， 这些研究工作极大地推进了真菌发酵生产p 亚麻酸的研究进程。 浙江工业大学硕士学位论文 表1 - 1高产油脂菌株的油脂含量及油脂中y 亚麻酸含量口5 1 实验室发酵时发酵液一般以葡萄糖、麦芽汁或糖蜜为基础，添加有机氮源和 无机氮源以及少量无机盐。但在工业发酵中要尽量降低微生物发酵的成本，最好 是菌种能在低成本的培养液中生长良好。国内外已有许多学者进行了这方面的研 究，如1 9 9 1 年l i n d b e r g 等【2 6 】研究以淀粉为碳源对鲁氏毛霉( m u c o r r o u x i a n u s ) c b s 4 1 6 7 7 进行发酵，结果产量与以葡萄糖为碳源时相近。1 9 9 5 年p r e z z 2 7 1 用乙酸作为 碳底物对鲁氏毛霉和卷枝毛霉进行发酵培养，其g l a 含量为中性脂的1 5 6 。2 0 0 0 年日本上田隆史等【2 2 9 1 研究了高山被孢霉发酵过程中所需要的关键矿物元素，同 时发现了培养被孢霉属的新氮源。国内，陈艺虹等1 3 0 】以毛霉s p - 1 6 为发酵菌株对5 种碳源和6 种氮源进行了考察，认为饴糖和酶解淀粉可作为该菌株的良好碳源， 花生饼粉、脱酚棉籽饼粉和酵母粉是该菌株发酵生产v 亚麻酸的良好氮源。19 9 5 年赵人俊等f 3 1 】研究了影响被孢霉产y 亚麻酸油脂的因素，其中包括氮源种类，c n 比率，p h ，种龄和接种量。关洁雯等【3 2 】还对被孢霉产y 一亚麻酸的补料工艺进行了 研究。这些研究降低了微生物发酵的成本，提高了y - 亚麻酸的产量。 现在，真菌发酵生产y 亚麻酸已成为国际趋势，真菌发酵法与传统的从月见 8 浙江工业大学硕士学位论文 草籽油中提取y 亚麻酸相比，具有许多优点( 表1 2 ) 。菌体能适应高浓度培养基中 的发酵培养，可达到菌体产量大，发酵罐利用率高的要求；此外，真菌发酵在产 生7 亚麻酸的同时还可以生成其它多不饱和脂肪酸琊4 】，如双高吖亚麻酸 ( d h 吖一l i n o l e n i c ，d g l a ) 和花生四烯酸( a r a c h i d o n i c a c i d ，a a ) 。1 9 9 7 年我国黄慧琴 等【3 5 】用被孢霉c 如，f 把陀肋m 埘o ) 发酵生产花生四烯酸。2 0 0 0 年刘吉华等。叼用轮枝 霉( d i a s p o r a n g i u m s p ) 研究了发酵生产双高吖- 亚麻酸( d h 吖- l i n o l e n i e ) 和花生四烯酸 ( a r a c h i d o n i c a c i d ，a a ) 的条件。2 0 0 0 年h i r o s h i 和k e n g o 等【3 铂也报道了高山被孢霉 ( m o r t i e r e l l a a l p i n a ) l s - 4 经a 5 。工脂肪酸脱饱和作用进行双高十亚麻酸的工业生产。 可见，真菌发酵生产是有广阔发展前景的技术，真菌油脂是月见草油的良好替代 品。 表1 - 2 月见草提取与真菌发酵生产t 一亚麻酸的比较项目 油脂存在于菌体细胞内，发酵后要对菌体进行细胞破碎，然后再进行油脂的 提取。油脂的提取，目前国内主要采用有机溶剂抽提法。1 9 9 9 年张玲等口8 】提出了 真菌油脂快速提取法。但由于多不饱和脂肪酸化学活性大，对氧气敏感，所以这 些传统方法易造成不饱和脂肪酸的氧化变质。9 0 年代，国外开始使用c 0 2 超临界 萃取法从月见草油中提取油脂，效果较好，得率在2 0 2 3 以上。在我国，山东 轻工业学院食品工程系的尹卓容等 3 9 1 也进行了c 0 2 超临界萃取方面的研究，分析 浙江工业大学硕士学位论文 了物料水分，粉碎粒度以及萃取条件( 压力，温度) 对萃取过程的影响。但这种分离 技术对设备装置的压力耐受性要求甚高，设备投资费用高。近年国外又有人m 提 出了y 亚麻酸的大规模的工业纯化工艺，应用酶催化反应和蒸馏相结合的方法进 行油脂提取。油脂抽提后7 - 亚麻酸含量的测定通常采用气相色谱法【4 1 ，4 2 1 。 1 3 5 丫- 亚麻酸产量的提高 目前对真菌生产y 亚麻酸的调控机理研究的还不详尽，处于摸索阶段。所以 往往都采用盲目的诱变育种和随机筛选来提高菌体的十亚麻酸产量。在国外从8 0 年代就开始了这方面的研究。1 9 9 2 年a n d r e w t 4 3 1 发现从亚油酸到多不饱和脂肪酸的 脱饱和作用是由一系列不同的脱饱和酶起作用，经6 脂肪酸脱饱和酶的作用亚油 酸在体内转化为y 亚麻酸，而在3 脂肪酸脱饱和酶的作用下，亚油酸在体内转化 为a 亚麻酸。1 9 9 2 年c o h e n 4 4 1 发现几种吡啶族的除草剂可抑制c 0 3 脱饱和作用。 根据t 亚麻酸在体内的转化途径，如果3 脱饱和受到抑制就会提高y 亚麻酸的产 量，因此如果能筛选出某种菌株，它的c 0 3 脱饱和受到这种吡啶族除草剂的抑制， 那么这种菌株就有可能是y 亚麻酸高产菌株。我国的吕飒音等m 】以此为基础，用 紫外线和甘草酸进行诱变，获得了被孢霉的y 亚麻酸高产菌株a 2 0 变株。随着生 物化学和基因工程技术的进一步发展，各国学者已开始转向各种脂肪酸脱氢酶基 因的研究 4 6 1 ，他们希望构建出基因工程菌株或将这些基因转入大豆、花生等油料 作物中，使得这些新型的基因工程菌株和油料作物品系有更高的出油率( 见图1 2 1 。 1 0 浙江工业大学硕士学位论文 j 诱变处理 i 筛选高产菌株( 作稳定性实验) i i 高g l a 含量油脂 图i - 2g l a 高产菌株的筛选和构建 如，h y e k y u n g 和m a n a b u 【4 7 】等克隆和表达了哺乳动物的6 脂肪酸脱饱和酶 基因。1 9 9 9 年a i d 和s h i m a d a 等【4 8 】克隆了鼠中6 一脂肪酸脱饱和酶基因，同年h u a n g 等【4 9 】对高山被孢霉( m o r t i e r e l l a a l p i n a ) 的, 5 1 2 脂肪酸脱饱和酶进行了克隆。2 0 0 0 年， 日本铃木修、秋庸裕等【5 0 】对哺乳动物的6 脂肪酸脱饱和酶基因进行了分子克隆， 研究了其生理学意义。我国张羽航等【5 1 1 构建了被霉( m o r t i e r e l l a s p ) c d n a 文库 并对9 脂肪酸脱饱和酶的c d n a 序列进行了筛选。在脂肪酸代谢途径中，y 一亚麻 酸是以亚油酸为底物，在c 6 位脱氢形成的，所以6 一脂肪酸脱饱和酶是y - 亚麻酸 生产过程中的关键酶，这就引起了各国学者的广泛关注。1 9 9 9 年h u a n g 和 c h a u d h a r y 等克隆了高山被孢霉( m o r t i e r e l l a l p i n a ) 的6 - 月旨肪酸脱饱和酶基因。我国 南开大学李春明和邢来君等【5 2 】也进行了有关研究，2 0 0 1 年他, f l i t 5 3 1 报道了深黄被孢 霉6 脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和序列分析方法，并在酿酒酵母中表达了高山被 孢霉4 形c ，卯砸6 一脂肪酸脱氢酶，在适合的条件下，加入外源底物亚油酸后其 y 亚麻酸产量达到了3 1 6 ，这就为基因工程菌株的构建开辟了广阔的前景。 浙江工业大学硕士学位论文 1 3 6 真菌发酵法提取工艺的研究 1 3 6 1 制取富含y 一亚麻酸的真菌油脂的前处理方法 含有y 一亚麻酸的真菌油脂多包含在菌体细胞内，部分与细胞蛋白质或糖类物 质结合而形成脂蛋白或脂多糖。因此在制取油脂时存在一定的难度，只有对产油 真菌细胞进行必要的前处理，才有利于油脂的制取。 前处理方法的实质就是对发酵结束后所得到的菌体进行破壁。目前，菌体破 壁工艺大致有四种：干菌体磨碎法、干菌体稀盐酸共煮法、菌体自溶法及菌体蛋 白变性法。 1 3 6 1 1 干茵体磨碎法 所谓干菌体磨碎法就是将干燥好的菌体于研钵中与细砂一起研磨至粉状。目 前国内研究者们多采用干菌体磨碎法进行菌体细胞的前处理。中德联合研究院和 江西赣江制药厂采用干菌体磨碎法对1 2 种酵母的产油脂量进行了探讨研究，结果 表明效果较为理想。吕飒音【4 5 】等人于2 0 0 1 年利用该法对被孢霉进行前处理，油脂 含量可达到4 0 左右。然而，李魁【5 4 】等人经过多次的实验证明：干菌体在磨碎过 程中细胞物质有一定损失，由此而造成油脂产油率的降低。徐玉刚5 4 】等研究者采 用湿菌体( 过滤后) 细砂磨碎后再经烘干制取油脂新工艺，发现可以弥补菌体于 磨法的不足，提高了真菌油脂的得率。 1 3 6 1 2 干菌体稀盐酸共煮法 干菌体稀盐酸共煮法又称为酸热法。2 0 0 3 年，章银良利用干菌体稀盐酸共煮 法对发酵结束后的高大毛霉进行破壁，菌体沉淀按每克菌体加5 m l 浓度为4 m o l l 的h c l 混匀，室温下放置1 小时，到达破壁效果后，沸水煮沸3 分钟，将h c l 除去。利用此法，油脂得率最高可到达1 0 9 3 。李植峰5 5 噜人于2 0 0 0 年利用共 煮法对拉曼被孢霉丹进行前处理，油脂得率均可达到2 0 以上。同年他们还用此 法对雅致枝霉t e 7 1 5 进行前处理研究，结果表明油脂得率最高也可达到2 0 左右。 用此法的缺点是菌体破壁后，剩下的h c l 如不除去将影响后面的萃取工艺，所以 必须利用沸水浴将h c l 除去，将但如果煮的时间过长又有可能破坏油脂中的y 一 亚麻酸。 1 2 浙江工业大学硕士学位论文 1 3 6 13 菌体自溶法 发酵结束后，离心收集菌体，让菌体在5 0 。c 下保温2 3 天，菌体自溶，细胞 壁破碎，油脂被释放出来。利用此法的优点在于只需要控制好温度，不需要别的 设备或试剂，操作简单。缺点在于时间过长。 1 3 6 1 4 菌体蛋白变性法 考虑到菌体自溶法耗时过长，有人提出了菌体蛋白变性法，即用乙醇或丙酮 使结合蛋白质变性，缩短菌体自溶时间，并且提高了油脂得率。吴平格等人 5 4 1 采 用改进后的菌体自溶法制取油脂，即菌体蛋白变性法，实验结果表明：把酵母菌 菌体细胞与水以1 ：1 混合后，定温9 5 c 处理1 5 分钟，再降温至4 8 。c ，保温自溶 3 2 h 制取油脂，其得率较高。 1 3 6 1 5 其他前处理方法 除了以上四种常用方法外，还有利用高压匀浆、球磨、膨化、高渗透压、超 声波等处理使菌体破碎的办法。 毕红卫【5 6 】经过多次实验对匀浆破壁法和超声波破壁法进行对比研究，结果表 明，超声波法得到的油含量更多，比匀浆破壁法增加了1 2 8 ，并节省人力。自 动化程度高。 应该指出的是，无论采用哪种方法制取真菌油脂，其理论产率和实际产率都 存在一定的差距，这主要是由于培养基中部分糖被产油真菌用于细胞的呼吸和构 成菌体细胞物质所致，故真菌油脂的实际产率均低于理论值。 1 3 6 2 油脂提取方法 对菌体的前处理结束后，菌体中的油脂被释放出来，此时要采用合适的方法 对油脂进行提取。目前主要有有机溶剂法和超临界c 0 2 萃取法。 1 3 6 2 1 有机溶剂法 有机溶剂法包括氯仿一甲醇提取法【s 7 】、氯仿甲醇正丁醇水e d t a 提取法【5 7 1 、 乙醇正己烷提取法【5 7 1 、石油醚索氏抽提法【5 8 1 、乙醇乙醚法【5 9 1 。 氯仿一甲醇提取法是目前较为普遍的一种方法，将氯仿和甲醇按体积比2 ：1 浙江工业大学硕士学位论文 充分混合，对真菌油脂进行萃取。d s o m a s h e k a r t 6 0 l 等人利用该法对破壁后的真菌 进行油脂萃取，油脂得率可达到2 0 以上。北京军医学院生化教研室的张玲【6 1 】等 人将氯仿和甲醇的体积比以1 ：1 混合，然后对破壁真菌菌体进行油脂萃取，油脂得 率也可达到2 0 以上。 根据禹明慧【6 2 1 等人的研究，氯仿甲醇正丁醇水- e d t a 以2 ：l ：1 ：1 ：o 1 的比例混合，达到的提取效果最好。 石油醚索氏抽提法也是一种较为常用的提取法，辽宁省分析测试研究中心的 王兰【6 3 1 等人于2 0 0 3 年对此法进行了一定的研究。由于操作简单，无需多种试剂混 合，因此国内外大多都采用此法。 禹慧明等人对以上几种常用的有机溶剂法做了较为详细的研究。实验结果表 明氯仿一甲醇正丁醇水- e d t a ( 2 ：1 ：1 ：1 ：0 ，1 ) 和乙醇一正己烷两步提取法效果 较好，但因氯仿、甲醇的毒性，不利于食品生产和环境保护，因此，工业生产中 采用乙醇正己烷法为宜。 1 3 6 2 2 超临界c 0 2 萃取法 采用超临界c 0 2 从菌体中提取油脂的过程可分为三个阶段：首先菌体中的油 脂成分需溶解在超临界c 0 2 中，然后溶解了油脂的超临界c 0 2 扩散，流动，进入 分离器，最后油脂与超临界c 0 2 分离，收集产品。禹慧明等人采用超临界c 0 2 对 被孢霉菌体中y 亚麻酸油脂进行提取研究，超临界萃取仪型号为h p 7 6 8 0 t s f e 2 ， 萃取温度为4 0 c ，样品量1 9 ，夹带剂含量1 0 ，c 0 2 密度0 5 o 9 5 9 c m 3 ( 压力 9 1 3 8 3 m p a ) 。结果表明，用高纯度c 0 2 的提取效果很好，并且可大大提高油脂 中v 亚麻酸含量。 g l a 油脂的提取宜用较低极性的溶剂，所用夹带剂极性增加时，虽可降低萃 取所需c 0 2 密度和操作压力，也可能使油脂产量提高，但油脂中g l a 含量大幅降 低，导致g l a 产量降低。根据禹慧明等人的实验，最佳提取条件用高纯度c 0 2 和较干燥菌体材料，在4 0 。c 、c 0 2 密度o 9 5g c m 3 提取，可提高油脂得率，同时使 油脂中g l a 含量高达8 2 ， 1 1 3 7 真菌发酵生产十亚麻酸的发展前景 y 一亚麻酸是多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，p u f a s ) 的一种。多不饱 1 4 浙江工业大学硕士学位论文 和脂肪酸及代谢产物在生物体内具有独特的生物活性，发挥着重要的生理作用。 p u f a s 经过一系列的酶促反应和生物转化后可应用于食品、医药和香料等领域刚， 在日常生活中起着不可低估的的作用，亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸更是人体的 必需脂肪酸。用真菌发酵进行y 一亚麻酸生产比从月见草中提取具有更多优点，发 酵后所得的菌体还含有大量的蛋白质、灰分和纤维素，脂肪抽提后可进行再利用。 并且，随着现代分子生物学技术的发展，人们对不饱和脂肪酸生物合成过程中各 种关键酶在分子水平上的作用与调节机制有了进一步的了解，这就使人们有希望 用基因工程手段改造t 亚麻酸生产菌，大幅度提高菌种的7 亚麻酸合成能力。目 前各国学者已经对不饱和脂肪酸代谢途径中的脱饱和酶有了相当深的了解，在此 基础上，可以通过抑制或提高某些脱饱和酶的活性来积累y 亚麻酸，从而达到高 产的目的。我们相信，随着生化技术和分子技术的不断进步和完善，真菌发酵生 产y 亚麻酸技术也将不断地完善起来，在今后会得到更广泛、更全面的应用。 1 4 本课题的创新点及主要任务 本课题所研究的是利用高大毛霉发酵产生y 亚麻酸，其中利用高大毛霉固态 发酵是一种新型的生产方式，目前在国内外文献中还未见确切的报道。 本文的主要任务是对发酵工艺条件进行优化。并进一步对在3 l 发酵罐培养过 程中，发酵液各物理化学参数与目的产物浓度的变化规律作了初步的研究。然后 运用现代分离纯化技术将含有y 亚麻酸的微生物油脂从菌体中提取出来，并采用 气相色谱法进行检测。 浙江工业大学硕士学位论文 第二章液态发酵培养基及培养条件的初步优化 本章主要对摇瓶发酵的各项工艺条件包括发酵培养基组分、培养时间、接种 量、种龄、培养温度、培养基初始p h 、摇瓶装液量、摇瓶纱布层数、转速等培养 条件，以及在3 l 发酵罐培养过程中发酵液各物理化学参数与目的产物浓度的变化 规律作了初步的研究。 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 菌种 高大毛霉( m u c o rm u c e d o ) 3 3 4 3 8 购于中国科学院微生物研究所菌种室。 2 1 1 2 培养基 2 1 121 斜面培养基( g l ) 马铃薯2 0 0 ，琼脂1 5 2 0 ，葡萄糖2 0 ，1 2 1 。c 下灭菌3 0 分钟； 培养方法：2 8 ，恒温培养7 2 h 。 2 1 1 2 2