（环境科学专业论文）海洋厌氧活性菌株资源库构建及一株活性海洋细菌的鉴定.pdf

大连交通大学1 = 学硕士学位论文 a b s t r a c t c o n s t r u c t i n gl i b r a r yo fa c t i v em a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i an o to n l yh e l p su st oe x p l o i tt h e r e s o u r c eo f0 m c i n a lm a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i aa n de n l a r g et h en e ws p e c i e sa n dn u m b e r b u t a l s op r o v i d e st h ep r e r e q u i s i t eo fm a r i n eb a c t e r i a la n t i b i o t i c ss t u d i e s m a r i n eo h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aa n ds u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i aa r et w om a j o rc l a s s e si n m a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i a t h e i rm o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r ea n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o nh a v e m a n yc h a r a c t e r i s t i c s t h e i rm e t a b o l i z i n ge n z y m e sa n ds e c o n d a r ym e t a b o l i t e sa r es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n tf r o mt h em a r i n ea e r o b i cb a c t e r i a t h e r e f o r e c o n s t r u c t i n gl i b r a r yo fm a r i n e p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a la n ds u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i aw i t ha c t i v i t y i sv e r yi m p o r t a n tf o r s c r e e n i n gn e w a n t i b i o t i c sa n d e x p l o i t i n gn e wd r u g s n e p u r p o s eo ft h i ss t u d yi st oc o n s t r u c tt h el i b r a r yo fm a r n ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aa n d s u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i aw i t ha c t i v i t y t h es a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o mt h ey e l l o ws e a , b o s e aa n de a s ts e ao fc h i n a m a r i n ep h o t o s y n t h e r i cb a c t e r i aa n ds u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i aw e r e e n r i c h e da n di s o l a t e d m a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i aw i t ha n t i b a c t e r i a la c t i v i t ys c r e e n e df r o mt h e i s o l a t e db a c t e r i a t h et a x o n o m i cc h a r a c t e r i s t i c so f3s t r a i n so fm a r i n ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a w e r es t u d i e d f u r t h e r m o r e ，o n es t r a i no fa c t i v em a r i n eb a c t e r i u m a 01w a si d e n t i f i e d f i n a l l y 13 2s t r a i n sw e r ei s o l a t e d ，a n da m o n gt h e s es t r a i n s8 0s t r a i n sw e r em a r i n e p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a , 5 2s t r a i n sw e r em a r i n es u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i a ah u n d r e da n df o u r s t r a i n sw i t ha n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw e r es c r e e n e df r o ml16s t r a i n s t h et a x o n o m i cs t u d i e s i n d i c a t e dt h a tt h em o r p h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c so f3s t r a i n so fm a r i n ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a w e r ed i s t i n c t ，a n do n es t r a i nw a sa e r o b i o t i ci nd a r k t h es t r a i na 01w i t hi n t r a s p e c i e s r e s i s t a n c eb e l o n g e dt om a r i n eb a c t e r i ab a c i l l u ss u b t i l i s k e yw o r d s ：m a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i a ；p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ；s u l f a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ；i n t r a s p e c i e sr e s i s t a n c e i l 大连交通大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解太蓬銮通太堂有关保护知识产权及保 留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的 知识产权单位属太整塞通太堂，本人保证毕业离校后，发表或使用 论文工作成果时署名单位仍然为太蓬銮通太堂。学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件及其电子文档，允许论文被查 阅和借阅。 本人授权太鎏銮通太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入 中国科学技术信息研究所中国学位论文全文数据库等相关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 、 又。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名：聿晷寸 日期：渺莎年月乡日 导师签名： 勿鸟净 日期：洲年月6 日 学位论文作者毕业后去向：辽宁省铁岭市 工作单位：铁岭市委组织部电话：0 4 1 0 6 6 3 5 5 0 5 通讯地址：铁岭市第五中学( 尚敬东收) 邮编：1 1 2 0 0 0 电子信箱： y a n g d a n t l 1 6 3 t o m 大连交通大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢及参考 文献的地方外，论文中不包含他人或集体已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得太董塞通太堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 本人完全意识到本声明的法律效力，申请学位论文与资料若有不 实之处，由本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名： 书好 日期：加影年f 月衫日 绪论 绪论 半个世纪以来陆生微生物发酵产物一直是制药工业的重要资源之一，然而近年来由 于在该领域研究历史久远，以及研究方法的落后和筛选模型的陈旧，寻找新的种属的微 生物或筛选新的活性代谢产物的难度越来越大，因而使新药的开发面临挑战【1 1 。为了寻 找新的资源，人们将目光投向巨大的天然宝库一海洋。海洋是生命之源，人类物质资源 的天然宝库。海洋其生物量约占地球生物总量的8 0 ，生物种类2 0 万种以上，蕴藏着 丰富的药用资源i z j 。由于海洋环境的特殊性，海洋微生物具有独特的代谢方式，其代谢 产物化学结构具有极大的复杂性和多样性，因此，从海洋微生物的次级代谢产物中寻找 开发有别于陆栖微生物产生的生理活性物质，已成为当前微生物资源和天然药物研究的 一个重要方向。 海洋药理活性细菌资源的研究进展 海洋细菌是海洋微生物中的优势类群，同时具有产生生物活性物质的巨大潜力，无 疑成为药物筛选的重要来源。最早关于海洋细菌拮抗特性的研究是在1 8 8 9 年，d eg i a x a 首次报道了海水中存在有潜在的抑制炭疽、霍乱病原茵的细菌【3 】。过了近6 0 年后， r o s e n f e l d 等在1 9 4 7 年，对5 8 株海洋细菌进行研究，发现其中7 株对一般非海洋型细菌有 强大的抗菌作用，并指出这7 株多属于球菌及芽孢杆菌【4 】。后来，k r a s s i ln i k o v a 和b u c k 的工作进一步确证了海洋细菌的抗菌作用，其中b u c k 的研究表明海洋细菌对酵母有抑制 作用。这一时期，研究者对海洋药理活性细菌资源的研究刚处于萌芽阶段。直至u 1 9 6 6 年， b u r k h o l d e r l 5 从海洋假单胞菌分离到抗生素硝吡咯茵素( p y r o l n j t r i l l ) ，掀开了海洋细菌活 性物质研究的序幕，随后不断有新的拮抗海洋细菌被发现。到2 0 世纪七八十年代，海洋 药理活性细菌资源的研究进入了加速发展期，日本明显注意到这方面的巨大应用前景， 东京大学微生物研究所的o k a m i 研究小组率先开展海洋细菌药理活性的系统研究，并卓 有成效，从而奠定了海洋细菌药理活性研究的基础【6 j 。近几年来，对海洋细菌药理活性 资源的研究又有新的进展。一方面，2 0 0 1 年，l u e s c hh 掣7 】证实了从海兔中分离到的抗 肿瘤活性物质d o l a s t a t i n1 0 实际来源于海兔提取液中的藻青菌s y m p l o c a 。此后，共附生 于海洋生物体内的海洋细菌药理活性的研究引起广泛关注。目前，发现的活性物质主要 是在海绵、海鞘、海参等动物中分离得到的，据估计，2 0 5 0 的海鞘、海参和海绵体 内的微生物可产生具有细胞毒性和抑菌活性的化合物，研究者已经从共附生海洋细菌中 分离到多种具有较强生物活性的物质，包括毒素、抗生素、抗肿瘤活性物质、酶类、色 素等，其中许多已经进行工业化生产侈j 。另一方面，对海洋细菌抗肿瘤活性的研究也有 一定进展。研究者对海洋细菌抗肿瘤药理活性的研究开始于7 0 年代，到目前，已从海洋 大连交通大学工学硕士学位论文 细菌中分离得到多种有价值的抗肿瘤活性物质。2 0 0 3 至2 0 0 6 年，从海洋细菌中分离得到 化合物的主要类型及抗肿瘤活性如表1 所示【9 】。随着研究技术及条件的成熟，研究者们已 经将目光投向海洋药理活性微生物资源库的构建。目前，s c r i p p s r 研究所 1 0 1 。已收集至t 3 8 0 0 多种微生物，从中得至t j 3 5 0 0 0 多种提取物，高效率的培养出一批微生物活性成分。国内 在这方面的研究也颇见成效，研究者从中国海域分离到超过7 2 0 0 株的海洋细菌，其中有 近1 9 0 0 株海洋细菌具有不同程度的药理活性。王书锦等【l l 】从辽宁近海海域分离到海洋细 菌5 6 0 8 株，其中约有2 5 的海洋细菌具有抗病原真菌、病原细菌的活性。，骆祝华等【1 2 】 从不同海区的海洋底质、生物样、水样中分离至r j 4 8 0 株海洋细菌，经筛选1 1 7 株海洋细菌 具有抑菌活性。詹萍等【1 3 】从中国北部湾海域采集的海蜇样品中分离至1 j 5 7 7 株海洋细菌， 其中1 1 9 株具有抗白色念珠菌活性。 表12 0 0 3 2 0 0 6 年从海洋细菌中获得的抗肿瘤天然产物【9 】 t a b l e1a n t i t u m o rm e t a b o l i t e sp r o d u c e db ym a r i n eb a c t e r i ad u r i n gt h ep e r i o d2 0 0 3 2 0 0 6 化合物i c 5 0化学结构类型抗肿瘤细胞株i c s o ( g g m l ) b 1 多糖 u 9 3 76 3 2 u l o n g a p e p t i n鳍醛酸多肤 h uo 6 3 t a s i p e p t i n sa &b 鳍醛酸多肤 h uo 8 2 0 9 3 t a s i a m i d eb 缩氨酸 h uo 8 0 a n t h r a e y c l i n e醌类 m u0 0 0 6 s a l i n o s p o r a m i d ea 生物碱 n c i6 00 0 0 2 5 p a l a u a m i d e 缩氨酸 h u o 0 1 3 m i x i r i na ，b ，c 缩氨酸 h u0 6 8 m i c r o m i d e 生物碱 h u0 2 6 b e l a m i d ea 甲基化线性四肽 h c t 1 1 6o 7 1 海洋厌氧活性菌株的研究 目前，研究者关于海洋药理活性细菌资源研究几乎都是基于海洋好氧微生物，而 对于微生物的另一大类群一厌氧微生物的报道很少。但是作为微生物的一大类群，厌氧 微生物总类繁多、形态各异，并且具有好氧微生物所不具备的生理代谢途径，因此其作 为海洋活性物质研究来源的潜力巨大。根据掌握的文献表明，从海洋厌氧菌药理活性的 研究仅限于海洋光合细菌，几乎没有其他海洋厌氧类群的研究。 对海洋光合细菌药理活性的研究开始于1 9 9 1 年，东京农业技术大学的j g r a n tb u r g e s s 等【1 4 j 从海洋中分离到2 0 0 株光合细菌，其中有两株细菌对啤酒酵母具有抗性，并且 其代谢产物的有机溶剂粗提物具有光谱抗菌活性，最高活性表现在细胞色素体内。利用 2 绪论 色层析法对其中一株细菌的代谢产物进行分离，得到两个具有抗菌活性的色素化合物。 此研究首次发现海洋光合细菌具有光谱抗菌的活性，并且海洋细菌的细胞内部也可产生 抗生素活性。2 0 0 0 年，m e l o 等l l 纠从光合细菌c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u m 中得到代谢 产物的粗提物。通过观察，因染色质浓缩和细胞核酸容量的减少而导致v 7 9 纤维原细胞 在形态上的变化，进行药理活性检测，结果显示该粗提物对v 7 9 纤维原细胞具有较高的 毒性( c c 5 0 = 7 p 1 ) ，且对白血病和淋巴瘤细胞细胞株具有有效的抑制作用( i c s o = 1 0 。8 m ) 。2 0 0 1 年b r o m b e r g 和d u r a n ，将此物质定名为紫色杆菌素。同年，l e o n 等【1 引，从热 带和亚热带的海洋中分离到一株光合细菌c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u m ，利用工业乙醇对 此菌株产生的紫色杆菌素进行抽提，再利用过滤、有机溶剂萃取、结晶和高效液相色谱 的方法进行纯化，通过核磁共振、质谱分析、紫外和红外光谱手段对其结构进行解析， 最终确定其分子结构为3 - 1 ，2 一d i h y d r o 一5 一( 5 - h y d r o x y 一1 h i n d o l 3y 1 ) 2 一o x o 一3 h - p y r r o l 一3 y l i d e n e l ，3 - d i h y d r o 一2 h i n d 0 1 2 1 ) 。l e o n 等进一步研究了紫色杆菌素对利什曼虫l e i s h m a n i a a m a z o n e n s i s 的抑制效果。原生动物l e i s h m a n i aa m a z o n e n s i s 可引起不同类型的疾病，如 皮肤传染病、黏膜与皮肤的传染病和内脏利什曼病等。据统计全世界有1 2 0 0 多万人患 有此疾病。但现在用于治愈此疾病的药物都具有潜在的毒性。研究者通过测定紫色杆菌 素的e c 5 d 2 4h 值来考察其对利什曼虫病的抑制效果，同时与另一种治愈此疾病的药物 p e n t a m i d i n e 进行比较。虽然结果显示该菌素的e c 5 0 2 4h 是治疗利什曼虫病药物p e n t a m i d i n e 的1 0 倍，但它无毒，且不会引起肾、肝和心脏的不良反应，这个发现对治疗该病 有重大意义。随后，研究者们利用细胞形态观察、t r y p a nb l u e 染色和m t t 等方法测试 了紫色杆菌素的抗肿瘤活性，结果发现，此化合物对v e r o 、m a l 0 4 、h e p 2 、f r h k 4 细胞株、黑素瘤、m o l t - 4 白血病、n c i h 4 6 0 肺癌和k m l 2 结肠癌细胞株均有抑制作 用【1 7 。1 9 】。近几年，研究者发现光合细菌产生的生理活性物质具有很大的应用价值。s a s a l 【ik 等【2 0 】概述了光合细菌在医学领域的应用，此菌群能产生大量的生理活性物质，包 括v b l 2 辅酶q l o 、5 氨基乙酰丙酸( a l a ) 、卟啉和r n a 。其中a l a 已经被应用于癌 症、痤疮、髂骨损伤等疾病的诊断和治疗当中1 2 1 j 。此外，研究者从海洋光合细菌提取的 r n a 能作为提高免疫力和防止传染的辅助药物，也可以用于癌症治疗药物的输送体系。 而辅酶q l o 应用于心脏病的治疗已经有3 0 多年的历史瞄】，其商业化生产开始于2 5 年前。 近几年发现辅酶q l o 具有增强心肌功能、抗休克、提高免疫力、改善细胞内呼吸等多种 生理功能，能够促进动物的生长，提高抗病能力，而且其商业产品已经在中国和日本出现。 辅酶q l o 的产量与氧化还原电位( o r p ) 和光照有关，在厌氧光照下是好氧无光时的两倍， 所以光合细菌的应用能大大提高辅酶q l o 的产量。揭晶等1 2 3 】概述了光合细菌在农牧业、 保健品、食物、医药等许多领域的应用。尤其指出，近年来，利用光合细菌的代谢作用对 大连交通大学工学硕士学 7 = 论文 中药进行生物技术处理，又开辟一新的研究领域，为现代新药的研究开发，提供了一种全 新的思路和方法，具有极大的研究价值【2 4 1 。 关于海洋硫酸盐还原细菌药理活性的研究很少。2 0 0 5 年，大连交通大学的海洋微生 物研究小组穆军等1 2 5 】对海洋硫酸盐还原细菌的药理活性进行了研究。研究者从中国的黄 渤海域的水样和泥样中分离到7 0 多株，利用有机溶剂对菌株的次生代谢产物进行抽提， 再利用枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、大肠杆菌f ，e s c h e r i c hi a c o l i ) 、白色念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n s ) 和大豆疫霉根腐病菌f ，p 坳o p h t h o r as o j a e ) 作为活性指示菌株，采用纸片 法对分离到的海洋硫酸盐还原细菌进行抗菌活性的测定。结果显示，7 0 株海洋硫酸盐还 原细菌中，具有抗菌活性的菌株占到1 4 ，可见海洋硫酸盐还原细菌的抗菌作用明确，且 抗菌谱具有选择性。在严格厌氧的硫酸盐还原菌中，集中分离出如此多的活性菌株，在国 内外尚未见有报道。该研究小组进一步对其中一株具有抗枯草芽孢杆菌活性的海洋硫酸 盐还原菌s r b l 8 ，进行了分类学研究。通过对菌株s r b l 8 进行形态学观察、生理生化 测试以及1 6 sr d n a 全序列测定，序列测定结果在g e n b a n k 数据库的同源性比对及系统 发育进化树的构建，最终将其鉴定为脱硫弧菌( d e s u l f o v i b r i od e s u l f u r i c a n s ) t 2 6 1 。 海洋厌氧活性菌株资源库构建的意义 海洋厌氧菌具有产生生理活性物质的巨大潜力，但目前研究者对其药理活性的研究 要远落后于海洋好氧菌的研究，仍处于研究初期。因此海洋厌氧活性菌株资源库的构建 将加速这一进程。 海洋厌氧菌包括两大类群一海洋光合细菌和海洋硫酸盐还原细菌。这两类菌群的生 理功能具有许多特性。光合细菌的生理类型可随着生长环境的改变而改变，所以其生理 功能具有多样性，在不同的自然环境下表现出不同生理功能。硫酸盐还原细菌的生理功 能具有特殊性，它们的呼吸作用需要硫酸盐作为电子受体。尽管许多微生物代谢过程中 都产生h 2 s ，但硫酸盐还原细菌是产生h 2 s 主要来源。它们的特殊生理功能决定了它们参 与新陈代谢的酶系和产生的次生代谢产物与好氧微生物相比差异显著。依据光合细菌的 特殊生理功能及代谢产物的特殊活性，研究者们关于光合细菌活性物质应用方面的研究 初见成效。研究发现光合细菌菌体无毒，富含营养物质，蛋白质含量高达6 0 6 5 ，还 含有多种b 族维生素及泛酸、叶酸、辅酶q 等生理活性物质，能参与有机体神经组织的 代谢并促进血液的形成；促使动物生长发育。同时光合细菌氨基酸种类齐全，含有丰富 的氨基酸，从而具有与动物蛋白相似的性质【2 7 】。在水产养殖方面，某些光合细菌还可以 对水产养殖中的病害细菌产生拮抗作用，因而受到水产养殖专家们的高度重视【2 引。在保 健方面，光合细菌能够增强动物的抗氧化能力，经动物实验表明其具有延缓衰老、免疫调 节的作用【2 9 1 。在医药方面，光合细菌本身能够完全或部分对抗免疫抑制剂的作用，对小 4 绪论 鼠的免疫器官与免疫功能有一定的保护作用1 3 0 】。近年来，利用光合细菌的代谢作用对中 药进行生物技术处理，又开辟一新的研究领域。硫酸盐还原细菌的特殊生理功能使其不仅 能在厌氧的条件下生存，其中一些还能耐受许多如热、冷、高盐度及高压的极端环境。 此类菌群在世界的许多地方普遍存在，它们产生了大量的h 2 s ，对工业、经济和生态都 产生着不同的影响【3 。由此可见这两类菌群具有重要的研究价值。 综上所述，构建海洋光合细菌和硫酸盐还原细菌活性菌株资源库，不仅有助于我们 深入探索海洋环境中药用光合细菌和硫酸盐还原细菌的资源，扩大这两类新物种的种类 和数量。更重要的是它将为先导化合物的研究提供基础，成为海洋细菌抗生素研究的前 提和必要条件。这将对新抗生素的筛选和新药的开发具有重要的意义。 海洋厌氧活性菌株资源库构建的研究方法 海洋厌氧活性菌株资源库构建的研究目的是从不同海域的水样和泥样中，富集和分 离到一定数量的海洋光合细菌和硫酸盐还原细菌，利用药理筛选模型从中筛选出活性菌 株，进而构建成海洋厌氧活性菌株资源库。海洋厌氧活性菌株资源库构建所涉及到的研 究方法：1 样品的采集方法。2 厌氧菌的分离方法。3 活性菌株的筛选方法。4 海洋光合 细菌和硫酸盐还原细菌的分类学研究方法。下面将详细概述这些研究方法。 1 样品的采集i 砚j ( 1 ) 水样的采集方法 水样采集的主要原则是水样必须具有足够的代表性，且必须不受任何意外的污染。 采样前根据监测内容和监测项目的具体要求，选择适合的采样器和盛水器，要求采样器 具的材质化学性质稳定、容易清洗、瓶口容易密封。其次，确定采样总量( 分析用量和 备份用量) 。在运输过程中要注意盛水器应当妥善包装，以免它们的外部受到污染，特 别是水样瓶颈部和瓶塞，在运送过程中不应破损或丢失。为避免水样容器在运输过程中 因震动、碰撞而破损，最好将样品瓶装箱，并采用泡沫塑料减震或碰撞。需要冷藏、冷 冻的样品，须配备专用的冷藏、冷冻箱或车运送：条件不具备时，可采用隔热容器，并 加入足量的制冷剂达到冷藏、冷冻的要求。冷藏或冷冻能抑制微生物的活动，减缓物理 作用和化学反应速度。如将水样保存在1 8 - - 2 2 的冷冻条件下，会显著提高水样中磷、 氮、硅化合物以及生化需氧量等监测项目的稳定性，并对后续分析测定无影响。 ( 2 ) 泥样的采集方法 底泥指水体沉积物。为了研究排入水体的污染物在底泥中的积累、分布、转化和迁 移的规律，需要采集底泥样品。水的流量和流速直接影响沉积物沉积的速度、厚度和颗 粒级配及其变化规律。在不同自然条件下受控制水体或受污染水域的沉积不同。底泥采 样要考虑自然因素，也要考虑人为因素。海洋底泥采样一般与海洋地质调查或海洋综合 大连交通大学t 学硕士学位论文 调查结合进行。采样点的布设随海洋调查的方式( 路线采样，面积采样) 而异。采样方 法有表层采样、拖网采样和柱状采样。小比例尺基础调查主要用表层采样和柱状采样。 海洋底泥采样器可分为拖曳式采样器、表层采样器和柱状采样器三类。拖曳式采样器在 调查船低速航行时以拖曳方式取表层样品。采集表层底质和底栖生物样品。柱状采样器 用于采集海底以下一定深度的柱状样品。 2 厌氧菌株的分离 厌氧微生物在生长过程中，不需要分子氧。由于它们体内不存在过氧化氢歧化酶和 过氧化氢酶，所以氧气的存在对它们的生长产生毒害作用，不是抑制就是杀死微生物【3 3 】。 在厌氧微生物的分离过程中，最重要的一点就是要尽可能控制氧气对微生物的影响。厌 氧菌分离的常规方法有亨盖特厌氧滚管技术和琼脂稀释振荡分离法。 ( 1 ) 亨盖特厌氧滚管技术【3 4 】 将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于5 0 。c 左右的恒温水浴中，用l m l 无 菌注射器分别吸取1 0 一、1 0 击、1 0 刁三个稀释度的稀释液各o 1 m l 于融化了的琼脂培养基 试管中，而后将其平放于盛有冰块的盘中或特制的滚管机上迅速滚动，这样带菌的融化 培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。每个稀释度重复3 次，而后置于3 7 ( 酸奶样品 4 2 ) 恒温培养箱中培养。一段时间后，即可在厌氧管的琼脂层内或表面长出肉眼可见 的菌落。 ( 2 ) 琼脂稀释振荡分离法【3 5 】 按照3 3 ( w v ) 的浓度配制琼脂溶液，并根据培养基中盐的浓度，向溶液中加入 一定量的n a c l 和镁盐。将盛有3 m l 此无菌无氧的琼脂溶液的试管放置于5 5 左右的恒 温水浴中，用移液管取o 5 m l 不同稀释度的富集菌液于融化的琼脂管中，同时倒入6 m l 温度为4 0 左右的特定培养基于试管中，充分振荡，待培养基凝固后，倒入固体与液体 比为1 ：3 的无菌石蜡混合物于试管中。而后置于恒温培养箱中培养一段时间后，即可 在蜡管的内部或内壁的表面长出肉眼可见的菌落。 3 活性菌株的筛选 活性菌株是指菌株的代谢产物中存在生物活性物质。对菌株的筛选即通过一些有效 的筛选模型来检测菌株的代谢产物中是否具有活性物质。微生物的代谢产物具有众多的 生物活性，如何更好地建立高效、灵敏的筛选系统，从有合成潜力的产生菌中发现有效 的先导化合物，继而开发为临床药物，成为现在研究的热点问题之一。活性菌株的筛选 一般经过的步骤为：1 必须分离各种不同生态环境下的微生物。2 应用发酵技术建立起 每个微生物的纯培养物。3 使用生物学或其他系统检测发酵液的生物活性( 初筛) 。4 在初 筛发现阳性菌株后，经复筛确定其生物活性。 6 绪论 传统的活性物质的筛选方法【3 6 】主要为检测体外的抑菌活性( 与疾病相关或不相关的) ， 随着生命科学中各分支学科的快速发展及相互渗透，特别是分子生化药理学和病因学的 发展，使人们能够在分子水平上认识疾病发生的生化过程，了解参与反应的各种分子， 从而能够选择这些分子( 如酶蛋白分子) 作为药物作用的靶位，建立起定靶筛选方法。加 之，分子遗传学特别是基因工程技术的发展和应用，以及生物大分子的分离和纯化技术， 使筛选模型中的靶酶或受体分子能够分离出或化学合成，两者的结合使定靶筛选方法能 够在实际筛选中应用。筛选模型的另一个发展方向为：根据现有药物的作用机制，建立 基于作用机制的筛选模型。随着研究的深人，人们发明一些新的筛选方法，创造更接近 药物作用环境的筛选系统，即应用特殊菌株或细胞筛选靶酶抑制剂。 ( 1 ) 稻瘟霉9 6 孔板筛选模型了7 】 人们发现一些天然的和合成的具有抗有丝分裂、抗真菌或免疫抑制活性的化合物能 引起特定真菌的分生袍子或菌丝在生长过程中形态发生改变，并通过观察特定真菌菌丝 在生长过程中形态的变化来筛选具有生物活性的微生物次级代谢产物。日本岩崎成夫以 稻瘟霉的分生袍子或菌丝形态生长异常( 卷曲、膨胀、菌丝分枝过多或念珠状等) 或生长 抑制为指标，成功地筛选出了多个有抗肿瘤、抗真菌活性的化合物。 将接种在土豆培养基上的稻瘟霉，在2 7 下培养12 d 左右，收集分生孢子，混悬在 l o m l 无菌水中，过滤除去菌丝体得孢子悬液，孢子悬液中加入3 0 0 i _ t l 沙氏液体培养基后， 以每孔5 0 p l 的量加入到9 6 孔培养板的各孔中。将各菌株的发酵液分别过滤除去菌丝体， 取5 0 p l 滤液分别加到9 6 孔板的第1 行各孔中( 从第3 列开始，第l 、2 y l j 作空白对照) ，每1 列 从第1 行开始依次稀释到最后一孔( 即第8 行) ，然后2 7 培养1 6 h ，在倒置显微镜下观察孢 子及菌丝体生长形态变化情况，根据上述活性指标，判断活性，计算最小活性浓度。 ( 2 ) 斑马鱼模型删 斑马鱼模型测定菌株的抗肿瘤活性。脉管基因可以促进肿瘤的生长，因此抑制脉 管的形成能很好的治疗癌症。现存一些用于药物筛选的方法太过复杂，经研究发现斑马 鱼作为动物模型用于筛选影响脉管形成的小分子物质很有效。在斑马鱼发育过程中，其 血管的形式有显著的特征，尤其是它们的肠下血管( s s ) 可以被染色并可在显微镜下 观察，因此斑马鱼模型可作为筛选影响脉管基因化合物的重要模型。当小分子物质添加 到鱼的培养液中，就会扩散到胚胎体内，经染色后可在显微镜下观察，如出现s i v s 的 缺失或没有则说明该物质具有抗肿瘤活性。剂量大小对结果有决定作用。 ( 3 )双层琼脂扩散法筛选模型【3 9 】 于高氏一号固体培养基上点接种待测菌株，每平板5 株，2 6 培养7 d 。后倒入水琼 脂1 2 1 5 m l 覆盖于菌落上，同时于每一菌落中央的上层水琼脂上套上抗生素测定用的 7 大连交通大学工学硕士学位论文 小钢管。2 6 恒温置放1 2 h ，于小管内加入0 1 m l 卤虫液( 2 0 0 4 0 0 只m 1 ) ，2 6 培养，分 别于4 、8 、1 2 h 用双目解剖镜观察并统计卤虫死亡率。 ( 4 ) 纸片法筛选模型【4 0 j 活性菌株采用液体发酵方式进行摇瓶培养，培养液体积3 0 5 0 m l ，一周左右发酵结 束。将发酵液减压蒸干，依次用少量乙酸乙脂、正丁醇、甲醇抽提，得乙酸乙脂相、正 丁醇相、甲醇相，每相取5 0 1 t i l l 至u 纸片上，晾干，逐片移入涂有指示菌的琼脂平板上， 恒温培养。1 2 h 后观察是否产生抑菌圈及直径的大小。 ( 5 ) m t t 法筛选模型【4 卜4 2 】 细胞培养至9 0 铺底( 处于对数生长期) ，用胰酶消化液( o 2 5 胰酶d h a n k 8 液) 消 化收集细胞，吹打制成单细胞悬液，苔芬蓝染色计算活细胞数，接种细胞于9 6 孔板中， 每孑l j j i 2 0 0 m m 3 悬浮细胞液，在3 7 以培养箱培养过夜第二天加入各稀释度的菌株发 酵液2 0 n u 一，继续培养3 d ，倒去培养液，p b s 洗1 遍， j i ) m t t ( 0 2 m g c m 3 ) 1 0 0 m m 3 ，在3 7 培养4 h ，然后去除m t t ，i i i d m s o 与甘氦酸、n a o h 缓冲液( 9 ：1 ) 2 0 0 m m 3 ，摇床摇0 5 1 h ，酶标仪测定5 7 0 n m 吸光值。其中四孔做全培液空白对照，四孔做细胞悬浮液对照， 每样平行测试3 孔，以阿霉素为标准参照。抑制率计算式为： 抑制率= 10 0 x ( o d 对照o d 实t ) o d 对照 发酵液活性以i d 5 0 衡量，i d 5 0 为抑制率为5 0 时，发酵液所稀释的倍数；抗癌药物 的活性以i c 5 0 衡量，i c 5 0 为抑制率为5 0 时样品的浓度 ( 6 ) d d r t 法筛选模型【4 1 4 3 】 将菌株( 通常一个菌落) 分别接种于含5 c m 3 蛋白胨肉汤培养基中，在3 7 振荡培养 1 6 h ，在1 0 0 c m 3 中性红琼脂培养基中加入l c m 3 菌液后倒人平皿中静置1 h ，将所要测定的 放线菌发酵液和受试物滴加在覆盖于琼脂培养基上直径为8 m m 的滤纸片上，3 7 培养 2 4 h ，以丝裂霉素为标准药物对照，根据发酵液产生的抑菌圈大小的差异来判定其对d n a 造成损伤的大小及是否有抗肿瘤活性。 4 海洋光合细菌和硫酸盐还原细菌的分类学研究 对海洋光合细菌和硫酸盐还原细菌进行分类学研究，首先要了解光合细菌和硫酸盐 还原细菌的主要类群特征，及其之间的差异。以它们的特征为依据，对菌株进行形态学、 生理学和遗传学上的研究，最终确定其分类学地位。 ( 1 ) 光合细菌的类群及其特征【3 8 m 4 5 1 紫色非硫细菌的光合作用色素分为在细胞质膜和胞质内膜系统上，为细菌叶绿素a 或b ，还含有各种类型的类胡萝卜素；细胞悬浮液为绿色、黄绿色、棕黄色、棕色、红 棕色、红色和深紫色；厌氧条件下光合异养，也可以利用氢气( 大多数) 、硫化物、硫 8 绪论 代硫酸盐和硫元素( 个别) 作为电子供体而进行光合无机营养，形成的硫粒在细胞外， c 0 2 为碳源；此外，在有氧或微氧并且无光条件下，有些种可进行化能自养或化能异养； 氨或有机氮化合物可作为氮源；在细胞内发现多糖，多磷酸等贮存物；生活在淡水、海 洋等高盐环境中，湿润的泥土，田野都有它的存在，基本上不形成有颜色的菌绒，这点 很容易和其他厌氧细菌加以区分。根据细胞形状、光合系统膜形状等不同，可分为六个 属。 红螺菌属( r h o d o s p i r i l l u m ) 螺旋状的细菌；以二分分裂繁殖；以极毛运动；革兰氏阴性；含有菌绿素a 和群l 的类胡萝卜素；不含有气泡。厌氧的光能异养菌，此外，大多数种在黑暗的微好氧和好 氧地情况下，能够进行氧化代谢；在有简单有机碳化合物时具有光合能力，分子氢可作 为电子的供体，在光合作用中不产生分子氧；细胞悬液常因光合色素而呈显红到棕色。 ( 室) r h o d o p i l a 茵属 此菌属细胞形状从螺旋形到卵形，细胞直径为1 6 1 8 微米；能运动，具有极生鞭 毛；色素为叶绿素和类胡萝卜素。此菌为光能异氧菌，光照下厌氧生长，黑暗中可好氧 生长；喜欢酸性条件；此菌属的代表菌种为r h o d o p i l ag l o b i f o r m i s ( p f e n n i g1 9 7 4 ) 。 ( 9 r h o d o b a c t e r 菌属 细胞为卵形或杆状，直径为o 5 1 2 微米；部分菌株可以运动，且具有极性鞭毛； 细胞以二分分裂方式繁殖；可产生荚膜，并能形成细胞链；革兰氏阴性：光合内膜为多 囊状的；光合色素有叶绿素a 和s p h e r o i d e n e 系列的类胡萝卜素。光合自养菌株可以硫 酸盐作为电子供体，一些菌株可以以硫代硫酸盐和分子氢作为电子供体；光合异氧菌在 光照厌氧条件下以许多有机化合物作为碳源和电子供体；大多数菌株作为化能异养菌在 好氧黑暗条件下可以进行氧化代谢。 红假单胞菌属( r h o d o p s e u d o m o n a s ) 细胞形状为杆状和卵形到球形；以二分分裂或不对称分裂；以极生鞭毛运动；革兰 氏阴性；含有菌绿素a 或b 和类胡萝卜素；不含有气泡。厌氧的光能异养菌，此外，某 些种在黑暗中，微好氧或好氧地情况下，能够进行氧化代谢；在有简单有机碳化合物时 具有光合能力，分子氢可作为电子的供体，不能利用硫作为光合作用的电子供体，在光 合作用中不产生分子氧。细胞悬液常因光合色素而呈显绿色到棕色和红色的不同颜色。 红微菌属( r h o d o m i c r o b i u m ) 卵形到长卵形的细菌；以出芽繁殖：以周生鞭毛运动；革兰氏阴性；含有菌绿素a 和类胡萝卜素；不含有气泡。厌氧的光能异养菌，此外，大多数的菌株在黑暗中，微好 氧或好氧地情况下，能够进行氧化代谢；在有简单有机碳化合物时具有光合能力，分子 9 大连交通大学下学硕+ 学位论文 氢可作为电子的供体，在光合作用中不产生分子氧。细胞悬液常因光合色素而呈显粉红 色到红棕色的各种颜色。 ( 9 r h h o d o c y c l u s 属 细胞为细弧形或直的细杆状，直径为o 3 o 7 微米；部分菌株可以运动；且具有极 性鞭毛；细胞以二分分裂方式繁殖；革兰氏阴性；光合色素有叶绿素a 和类胡萝卜素。 光合自养菌株可以以分子氢作为电子供体；光合异氧菌在光照厌氧条件下以许多有机化 合物作为碳源和电子供体；菌株可在微好氧或好氧黑暗条件下生长；还原的硫化合物不 作为光合的电子供体。 紫色细菌的细胞为球形、卵形、螺旋形、杆状或弧形；有的菌株有液泡，有的菌株 没有；部分菌株具有运动性，运动的菌株具有单生极生鞭毛或多生极生鞭毛；光合作用 膜系统和细胞质膜相连，呈泡状，含细菌液绿素a 和类胡卜素1 、3 、4 ( 通常，含类胡 萝卜素1 的菌株呈棕黄、红棕或粉色，含3 的为紫红色，含4 的为深紫色) 。厌氧，所 有种都能利用硫化物或硫元素作为电子供体而进行无机光能营养作用，形成硫在细胞 内，硫酸盐为最终产物。有些种类还可以在黑暗有氧条件下进行化能无机营养和化能有 机营养。生活环境为厌氧，含有硫化物的水生环境，如池塘、湖泊和海洋。紫色细菌根 据特征的差异可分为1 0 个属。 着色菌属( c h r o m a t i u m ) 卵形、豆或杆状的细菌；以二分分裂繁殖；极生鞭毛运动；在某些不利情况和许多 自然环境中，细胞可不运动并长成有粘液包住的近乎规则的聚合体；革兰氏阴性：含有 菌绿素a 和类胡萝卜素，不含有气泡。厌氧的，在有硫化氢时能进行光合作用，同时他 们在细胞内产生并贮藏球状元素硫作为氧化作用的中间产物；分子氢可作为电子的供 体，在光合作用中不产生分子氧。细胞悬液常因光合色素而呈显多样色调的橙棕和粉 红到紫罗兰色和紫红色。生境为厌氧，含有硫化物的水生环境，如池塘、湖泊和海洋。 囊硫菌属( t h i o c y s t i s ) 在分裂为典型双球型菌之前，细胞呈球形到卵形；繁殖以二分分裂的方式；以极生 鞭毛运动；在某些不利和许多自然环境中，细胞不运动，并长成有粘液包着的近乎规则 的聚合体；革兰氏阴性；有菌叶绿素a 和类胡萝卜素，这二种色素都位于囊型的内膜上。 没有气泡。厌氧，在有硫化氢时能进行光合作用，同时产生硫元素( 作为中间代谢氧化 产物) 并呈球形贮藏于细胞内；分子氢可作为电子供体，光合作用时不放出分子氧。细 胞悬液呈棕色到紫红色和紫罗兰色的不同色调。有接触酶和氢化酶。 八球硫菌属( t h i o s a r c i n a ) 1 0 绪论 单个细胞呈球状，形成规则的立方堆，这是由于三个垂直平面分裂的结果，每堆常 含有8 6 4 个细胞；以极毛运动；不形成芽孢；革兰氏阴性；含有菌叶绿素a 和类胡萝卜 素，不含有气泡。厌氧，在有硫化氢时能进行光合作用，同时产生硫元素( 作为中间代 谢氧化产物) 并呈球形贮藏于细胞内；分子氢可作为电子供体，光合作用时不放出分子 氧。细胞悬液呈紫到红色的不同色调。 硫螺旋菌属( t h i o s p i r i l l u m ) 螺旋状细菌；繁殖以二分分裂的方式；以极生鞭毛运动；在某些不利情况下，细胞 可能不运动并成为有粘液包着的近乎规则的聚合体；革兰氏阴性；有菌叶绿素a 和类胡 萝卜素，这二种色素都位于囊型的内膜上，没有气泡。厌氧，在有硫化氢时能进行光合 作用，同时产生硫元素( 作为中间代谢氧化产物) 并呈球形贮藏于细胞内；分子氢可作 为电子供体，光合作用时不放出分子氧。细胞悬液呈桔棕到紫红不同色调。 荚硫菌属( t h i o c a p s a ) 球形到稍卵圆形：繁殖以二分分裂的方式；不动；由于在两个垂直面连续分裂照成 四联体；在某些不利情况和许多自然环境中，细胞可被粘液包着的近乎规则的聚合体； 革兰氏阴性；有菌叶绿素a 和类胡萝卜素，这二种色素都位于囊或管型的内膜上，没有 气泡。厌氧的光能自养菌，此外一种桃红荚硫菌( t h i o c a p s ar o s e p e r s i c i n a ) 在黑暗微好 氧到好养条件下能进行氧化代谢，在有硫化氢时能进行光合作用，这时他们产生作为中 间氧