（遗传学专业论文）抗生素产生菌191的分离鉴定及发酵产物的研究.pdf

浙江大学硕士毕业论文 抗生素产生菌1 9 1 的分离，鉴定及 发酵产物的研究 摘要 自从1 9 2 8 年f l e m i n g 发现青霉素以来，人们已经发现了大约一万 种抗生素，但真正具有临床价值的却不多其中只有1 0 0 多种投入了 工业生产。由于致病菌耐药性的广泛传播，目前正在使用的抗生素大部 分面临被淘汰的危险，因此寻找对耐药菌特别是耐甲氧西林金黄色葡萄 、一f 球菌( m r s a ) 有疗效的抗生素正成为新药研究的热点。夕7 我们实验室在研究大熊猫肠道微生物生态时，从其粪便中分离到一 株抗生素产生菌1 9 一l 。由该茵所产生的抗生素1 9 - 1 虽然对革兰氏阴性 菌及真菌不具抗性，但对革兰氏阳性菌包括耐甲氧西林葡萄球菌均有强 烈的抑制作用。该菌用5 0 0 m l 三角瓶装6 0 8 0 m l 下列培养基：淀粉3 、 黄豆饼粉2 o 、k h 2 p 0 40 0 5 、m g s 0 40 0 2 5 、( n h ) 2 s o , 0 4 、c a c 0 3 0 3 、 p h ：7 8 ，在2 5 。c 、1 8 0 2 2 0 r p m 的旋转式摇床中培养9 6 小时，抗菌 活性达到最大。经化学手段分离得到的抗生素粗提物通过纸层析、薄层 层析以及紫外可见吸收光谱等方法的测定，认为其可能是蒽环类抗生 素。通过1 6 sr d n a 序列的测定以及与g e n b a n k 中已知菌株序列的比较 分析，认定该菌属于链霉菌属。 关键j 司：链霉菌，新抗生素，耐药菌，1 6 sr d n a ? 三 浙江大学硕士毕业论文 s t u d i e so ni s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n d n e t a b o li t e so fs t r e p t o m y c e ss p 1 9 一l a b s t r a c t t h e r eh a v e b e e na b o u tt e nt h o u s a n da n t i b i o t i c ss i n c e f l e m i n g d i s c o v e r i e dp e n i c i l l i ni n19 2 8 ，o n l yo n eh u n d r e dk i n d so fa n t i b a c t e r i a ld r u g s h a v eb e e ni n t r o d u c e df o rc l i n i c a lu s e w i t ht h ei n c r e a s ei nb a c t e r i a lr e s i s t a n c e t oe x i s t i n ga n t i b a c t e r i a la g e n t s ，ar e n e w e de f f o r ts h o u l db em a d et os e e kn e w a n t i b i o t i c se f f e c t i v ea g a i n s tp a t h o g e n i cb a c t e r i ar e s i s t a n tt oc u r r e n ta n t i b i o t i c s i nt h i sp a p e r , a 1 1a c t i n o m y c e t es t r a i n ，1 9 1 ，w a si s o l a t e df r o mg i a n tp a n d a 7 s e x c r e m e mc o l l e c t e di n f u p i n gn a t u r er e s e r v ea n dw a sf o u n dt op r o d u c e a n t i b i o t i c s i t sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ss u i t a b l ef o rt h e p r o d u c t i o n o f a n t i b i o t i c sw e r es t u d i e da n dm e d i u mh a v i n gt h ef o l l o w i n gc o m p o s i t i o nw e r e f o u n du s e f u l ：3 ，0 s o l u b l es t a r c h ，2 o s o y b e a nc a k em e a l ，o 0 5 k h 2 p 0 4 0 0 2 5 m g s 0 40 4 ( n h 4 ) 2 s 0 4a n do 3 c a c 0 3f o rt h eg o o dp r o d u c t i o n o fa n t i b i o t i c s ，i tw a sc u l t u r e di n5 0 0 一m l e r l e n m e y e r f l a s k s c o n t a i n i n g 6 0 - 8 0 m lo ff e r m e n t a t i o nm e d i u mo nar o t a r ys h a k e r ( 18 0 - 2 2 0 r m ) a t2 5 。c f o r9 6h o u r s t h ea n t i b i o t i c s a g a i n s tg r a m p o s i t i v eo n a n i s m s i n c l u d e p a t h o g e n i c b a c t e r i ar e s i s t a n tt om e t h i c i l l i nw e r ec h a r a c t e r i z e da s a n t h r o c y e l i n ea n t i b i o t i c s u s i n gs e q u e n c ea n a l y s i so ft h e 1 6 sr d n a ，t h e o r g a n i s mw a s i d e n t i f i e da ss t r e p t o m y c e s s p k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e t es p ，n e w a n t i b i o t i c , b a c t e r i a l r e s i s t a n tt oa n t i b i o t i c s ，1 6 sr d n a 2 浙江大学硕士毕业论文 刖雷 人类发展至今，一直未曾彻底摆脱过感染性疾病的困扰，据世界卫 生组织( w h o ) 估计，全球每年平均有1 7 0 0 多万人死于各类感染性疾病 。当今的感染性疾病有三个特点，一是致病菌耐药性问题日趋严重， 结核、霍乱、登革热和白喉等曾得到控制的疾病卷土重来，而且难以控 制；二是近二十年来出现了爱滋病、埃博拉出血热和军团病等三十多种 新的感染性疾病，缺乏相应有效的药物；三是机会致病菌的出现和传播， 给人类特别是那些体内自身免疫系统缺陷的以及进行器官移植和广泛使 用进攻性肿瘤化疗的病人的健康带来严重威胁。 与数年至数十年前人们主要关注革兰氏阴性杆菌感染症相反，近年 来，由于感染症病原菌发生变化，革兰氏阳性球菌，尤其是耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌( m e t h i c i l l i nr e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u sa p ，s m r s a ) ，耐万古霉素粪肠球菌( v r e ) 和耐青霉素肺炎球菌( p r s p ) 所致 的感染症对人类的健康造成极为严重的威胁。据统计，目前m r s a 己成 为院内感染的主要致病菌。万古霉素是治疗m r s a 感染的主要药物， 然而由于万古霉素在人类中以及其它糖肽类抗生素在动物中的广泛应 用，导致了v r e 的出现。体外试验已经证明，对万古霉素的高度耐药性 可由粪肠球菌迅速向金黄色葡萄球菌转移。因此人们担心v r e 的耐药基 因最终将自然地转移到m r s a 上。此外，曾经一度销声匿迹的结核分枝 杆菌，近年来在获得耐药能力后又开始卷土重来。据w h o 预测，在未来 l o 年内，全球将有3 0 0 0 多万人死于耐药性结核分枝杆菌引起的肺结核。 3 浙江大学硕士毕业论文 面对耐药菌的威胁，人们采取各种手段不断寻找更加新颖、有效的 抗生素。利用基因工程技术虽然可以获得些新抗生素，但是到目前为 止这类抗生素还没有一个可用于工业生产。对已知化合物的改造是获得 有价值新抗生素的重要途径，目前临床上广泛使用的1 3 一内酰胺类抗生 素主要都是通过这种途径获得的。可是当涉及到结构复杂或对反应条件 敏感的抗生素时，这种方法就受到严重的局限。而用经典方法从土壤微 生物中筛选新抗生素，虽然有其固有的局限性，但它仍然是目前获得新 抗生素的主要途径。况且微生物合成抗生素的能力还远未被人类充分利 用，不断增加的新抗生素数量可以说明这一点。1 9 4 6 1 9 5 0 年开发近2 0 0 种，1 9 5 6 - 1 9 6 0 年近5 0 0 种，1 9 6 6 1 9 7 0 年近1 0 0 0 种，1 9 7 6 7 9 8 0 近1 5 0 0 种，1 9 8 1 1 9 8 5 年超过2 0 0 0 种。因此从土壤微生物中继续寻找新抗生 素仍十分必要。但是由于已知抗生素的重复筛得率在不断增加，人们不 得不采取某些措施，以便能找到更多的新抗生素。研究以前没有注意过 的特殊环境如海洋、雪地、火山1 ：3 、盐碱地等中的微生物，便是其中的 一个有效方法。然而动物粪便作为环境特殊的微生物来源，却从未引起 过人们的注意，因而，对其进行研究具有重大的意义。 本实验室在研究大熊猫肠道微生物生态时，特意注重了对其中有用 放线菌的筛选。现已从大熊猫粪便中分离到一株抗生素产生菌1 9 1 ， 由该菌所产生的抗生素对包括耐甲氧西林葡萄球菌在内的所有试验过的 革兰氏阳性细菌均有强烈的抑制作用，经初步鉴定认为其可能是葸环类 抗生素，具有潜在的应用价值。 4 浙江大学硕士毕业论文 1 菌株 材料与方法 1 1 链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p ) 1 9 1 分离自由陕西省佛坪县国家自然保护 区野外采集来的大熊猫粪便中。 1 2 检定细菌和白色念珠菌由浙江省药品检验所提供；耐甲氧西林药葡 萄球菌由杭州市中医院提供。 2 培养基l l i 2 1 高氏一号培养基 可溶性淀粉2 0 n a c l0 0 5 琼脂1 5 ， 2 2 营养肉汤培养基 营养肉汤2 2 ， 2 3y e p d 培养基 酵母膏1 0 琼脂1 5 2 4 霉菌培养基 蛋白胨o 5 ， m g s o 。0 0 5 ， 2 5 基础发酵培养基 k h 2 p 0 4 o 0 5 ， c a c o ，0 3 k n 0 3 0 1 f e s o 。0 0 0 1 p h 7 2 7 4 琼脂1 5 k 2 h p 0 4 o 0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 葡萄糖2 0 蛋白胨2 0 p h 自然 葡萄糖1 o ， 琼脂1 5 ， k i - 1 2 p 0 40 1 ， p h 自然 m g s 0 40 0 2 5 ，( n h 4 ) 2 s 0 40 4 p h 自然 5 浙江大学硕士毕业论文 2 6 初始发酵培养基 淀粉4 0 ，酵母膏2 6 ， k h 2 p 0 40 0 5 ，m g s 0 4 0 0 2 5 ， c a c 0 3o 3 ，p h 自然 2 7 葡萄糖一酵母膏培养基 葡萄糖1 o ，酵母膏1 o ， p h 7 2 糊精o 5 ， ( n h 4 ) 2 s 0 4o 4 ， 琼脂1 5 ， 2 8 察氏培养基 蔗糖3 o ，n a n 0 3o 2 ，k 2 h p 0 4 0 1 ， f e s 0 4o 0 0 1 ，m n s 0 4 h 2 00 0 0 0 1 ， 琼脂2 0 ，p h 7 2 2 9 葡萄糖天门冬素培养基 葡萄糖1 o ，天门冬素o 0 5 ，k 2 h p 0 4o 0 5 ， 牛肉膏0 2 ，琼脂2 0 ，p h 7 2 2 1 0 无机盐淀粉培养基 可溶性淀粉1 0 ，m g c 0 3 0 1 ，k 2 h p 0 40 0 3 ， n a c lo 0 5 ， n a n 0 30 1 ，琼脂1 8 ， p h 7 2 2 1 1 马铃薯培养基 马铃薯去皮和芽眼，切成斜箍状长方块，用水洗净，装入无菌试管( 试管 内先放入湿棉花球，使马铃薯块保持湿润) 2 1 2 酪氨酸培养基 l 一酪氨酸0 1 ，酵母膏0 1 ，n a c lo 8 5 ， 琼脂1 6 ，p h 7 2 2 1 3 伊莫松培养基 6 浙江大学硕士毕业论文 葡萄糖1 0 ， 蛋白胨o 4 ， p h 7 2 酵母膏1 o ， n a c l0 0 5 牛肉膏0 4 琼脂2 0 。 2 1 4 基础发酵培养基 k h 2 p 0 4o 0 5 ，m g s 0 4 o 0 2 5 ， ( n h 4 ) 2 s 0 4o 4 ， c a c 0 30 3 ， 3 抗生素产生菌的筛选 3 1 放线菌的分离纯化 采用琼脂平板稀释法p 1 从大熊猫粪便及其周围土壤中分离放线菌， 培养基采用高氏一号。为抑制细菌和霉菌的生长，用时在已融化的高氏 一号琼脂中加入重铬酸钾溶液。每3 0 0 m l 培养基中加入3 o ( w v ) 重 铬酸钾溶液l m l 6 1 。 涂布均匀的平板置于2 8 。c 恒温箱中培养，5 天左右即可挑菌。为 避免重复，尽量挑取菌落形态不同的放线菌。纯化后的菌株用高氏一号 斜面培养基保存。 3 2 抗生素产生菌的筛选 3 2 1 抗菌活性的测定 采用纸片法”1 。滤纸直径5 5 m m ，每片加5 9 l 药液。待纸片干燥后， 轻轻贴到涂有检定菌的平板上。检定菌若无特别说明，一般均指金黄色 葡萄球菌。 3 2 2 发酵培养 培养基采用较为丰富的初始发酵培养基。摇瓶发酵，每2 5 0 m 1 三角 7 浙江大学硕士毕业论文 瓶中装3 0 m l 发酵培养基。于2 8 c 旋转式摇床中培养3 - 4 天后检测活性， 转速为1 8 0 转分钟( r p m ) 3 2 - 3 初筛 采用营养琼脂平板扩散法( 纸片法) 1 8 从已纯化的放线菌中筛选抗 生素产生菌。 3 2 4 复筛 选出对金黄色葡萄球菌有拮抗作用的菌株。扩大抗菌范围，增加藤 黄微球菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌，沙门 氏菌、白色念珠菌以及从临床上分离出来的。3 株耐甲氧西林葡萄球菌 5 7 3 、5 9 5 、6 0 0 为检定菌，除白色念珠菌用霉菌培养基外，其它细菌均 用营养肉汤培养基培养。 3 3 抽提试验 把复筛选出的菌株1 9 一l 进行摇瓶发酵，发酵液经3 5 0 0 r p m 离心5 分钟，上清液分别用等体积的正丁醇、乙酸乙酯和苯抽提：菌体用7 5 的丙酮浸泡两次，浸泡液合并后蒸干，用水稀释至原发酵液体积；然后 用纸片法测定各部分的抗菌活性。 3 ，4 抗生素稳定性测定 取菌株1 9 1 的发酵上清液分别进行酸、碱、热等稳定性测定。 4 菌株1 9 1 发酵条件的研究 4 1 斜面培养基的选择 将菌株1 9 一l 接到高氏一号琼脂、察氏琼脂、葡萄糖天门冬素琼脂、 8 浙江大学硕士毕业论文 葡萄糖酵母膏琼脂和马铃薯块等五种斜面培养基上，于2 8 c 恒温培养 箱中培养5 7 天后，观察比较其生长及产孢情况。 4 2 发酵培养基碳氮源的选择 4 - 2 1 碳源的选择 固定1 o 的蛋白胨作为唯一的有机氨源，在基础培养基中分别加 入不同的碳源：淀粉2 o 、葡萄糖1 0 、糊精1 o 、蔗糖1 0 。发 酵培养9 6 小时后，用纸片法检测其效价。 4 2 2 氮源的选择 固定3 0 的淀粉作为唯一的碳源，在基础培养基中分别加入不同的 有机氮源：黄豆饼粉2 o 、玉米浆2 0 、蛋白胨1 0 、酵母膏1 o 。 发酵培养9 6 小时后，用纸片法检测其效价。 4 2 3 碳氮比的确定 把4 2 1 和4 2 2 所确定的碳氮源，按不同比例加入到基础培养基中， 发酵培养9 6 小时后，用纸片法检测其效价。确定最佳发酵培养基成分。 4 3 不同营养成分对效价的影响 用l ：，( 3 ”) 正交实验哪对上述筛选过的1 1 种培养基成分：蛋白胨、 酵母膏、淀粉、葡萄糖、玉米浆、糊精、k h 2 p o 。、( n h 4 ) 2 s o 。、m g s o 。、 c a c o ，、黄豆饼粉的3 个水平进行考察。分析不同成分对发酵单位的影 响。 4 4 金属离子对效价的影响 在最佳发酵培养基( 4 2 3 ) 的基础上，用l 。( 3 4 ) 正交实验，对硫 酸铜、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸锰的三个水平进行考察。分析金属离子 9 浙江大学硕士毕业论文 c u ”、z n ”、f e ”、m n 2 + 对效价的影响。 4 5 转速、装量和发酵时间对效价的影响 用l 9 ( 3 4 ) 正交实验对摇床转速、三角瓶装量、发酵时间的三个水平 进行考察，摇床温度控制在2 8 。 4 6 温度、p h 对效价的影响 4 6 1 温度对效价的影响 发酵培养基用5 0 0 m l 的三角瓶分装，每瓶8 0 m l ，p h 自然。分别置 于2 5 、2 8 c 、3 0 。c 、3 2 。c 、3 6 。c ，2 2 0 r p m 的摇床中培养9 6 小时，然 后用纸片法测效价。 4 6 2p h 对效价的影响 发酵培养基用5 0 0 m l 的三角瓶分装，每瓶8 0 m l ，用n a o h 和h c l 调成不同的p h ：5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 ，p h 用梅特勒一托利多p h 计 检测，在2 8 c 、2 2 0 r p m 的摇床中下发酵培养，9 6 小时后用纸片法测其 效价。 4 7 发酵代谢曲线的测定 4 7 1 发酵培养 5 0 0 m l 三角瓶中装8 0 m l 、p h7 0 的发酵培养基，在2 5 。c 、2 2 0 r p m 的旋转式摇床中培养，每隔1 2 小时取样测定相对菌丝浓度、p h 和效价， 并观察菌丝形态。 4 7 2 相对菌丝浓度的测定【”1 取发酵液1 0 m l ，于3 5 0 0 r p m 的转速下离心5 分钟，以沉淀体积百分 含量作为相对菌丝浓度。 l o 浙江大学硕士毕业论文 4 7 3 效价的测定 按3 2 1 的方法测定，以抑菌圈大小表示抗菌活性。 5 菌株1 9 1 所产生抗生素的早期鉴别 5 1 纸层析 5 1 1 样品制各 取1 0 m l 发酵上清液，用等体积乙酸乙酯抽提，蒸干后再用2 m l 乙 酸乙酯溶解。 5 1 2 溶剂系统 采用捷克8 种溶剂系统i ”1 ( 水饱和的正丁醇、水饱和的正丁醇内含 2 的对甲苯磺酸、丁醇：醋酸：水( 2 ：l ：1 ) 、水饱和的正丁醇内含2 的毗啶、正丁醇饱和的o 5m o l lp h7 0 的磷酸缓冲液、正丁醇饱和 的水内含2 的对甲苯磺酸、苯：甲醇( 4 ：1 ) ( 滤纸用0 5 m o l 1p h7 0 的磷酸缓冲液处理) 、甲醇：水( 3 ：1 ) ( 水中含3 n a c i ，滤纸用5 n a 2 s o 。处理) 和其它1 0 种溶剂：水饱和的苯、苯、水饱和的乙酸乙酯 ( p h2 1 0 ) 、水饱和的乙酸乙酯( p h7 ) 、氯仿：甲醇( 5 ：1 ) 、苯：乙 酸乙酯( 9 ：1 ) 、甲醇：水( 7 ：3 ) 、乙酸乙酯：石油醚( 1 ：1 ) 、乙醚、 石油醚。 5 1 3 扩展方法 取1 2 u , l 样品点至距新华滤纸条( o 5 3 0 c m ) 下端5 c m 处，在直 径1 0 c m 、高4 0 c m 的圆柱形层析缸中上行扩展，溶剂5 0 m l ，滤纸先用 展开剂饱和3 0 分钟。溶剂扩展1 6 c m 后停止层析。 5 1 4 显影方法 采用生物显影法3 j ：把金黄色葡萄球菌稀释到一定浓度，加到营养 浙江大学硕士毕业论文 琼脂培养基中，摇匀后倒入平板中铺平冷却，然后把晾干后的层析纸条 贴于平板上，在3 5 3 7 的恒温箱中培养1 8 2 0 小时，观察测定r f 值。 5 2 薄层层析 5 2 1 溶剂系统 采用a s z a l o s 溶剂系统f “】：甲醇、含1 0 甲醇的氯仿、氯仿、甲醇： 苯( 1 2 ：8 8 ) 、甲醇：苯( 6 ：9 4 ) 、甲醇：苯( 4 ：9 6 ) 5 2 2 扩展方法 取按5 1 1 法制备的样品l 2 p l 点到长2 0 c m 、宽1 0 e r a 的硅胶g 薄 板上，将薄板置于长2 0 e r a 、高2 0 c m 的玻璃层析缸中上行扩展，溶剂 用量1 0 0 m l 。 5 2 3 显影方法 将层析完的薄板晾干，置于紫外光下观察黄色斑点。 5 3 纸电泳”1 滤纸条裁成1 3 0 c m ，中间点上按5 1 1 法制备的样品2 p l ，分别置 于p h8 6 的巴比妥缓冲液和p h4 0 的0 1 m o l l 的醋酸缓冲液中，在电 压5 0 0 v 的电场中电泳2 个小时，然后用生物显影法检测。 5 4 紫外可见吸收光谱的测定 发酵上清液用等体积乙酸乙酯抽提，所得抽提液经蒸发浓缩后，溶 于色谱溶剂甲醇中，然后置于日立紫外分光光度计中扫描测定。 浙江大学硕士毕业论文 6 菌株1 9 1 部分1 6 sr d n a 序列的测定 6 1 模板d n a 的提取 菌株1 9 1 用葡萄糖酵母膏液体培养基培养，于生长稳定期离心收 集菌体。总d n a 提取参照c t a b 法0 6 1 。其中有一步稍稍作了改动，即 用0 3 3 9 m l 的商浓度溶菌酶代替蛋白酶k 。 6 2 引物合成 根据e d w a r d s ! ”1 的文献，p c r 两引物分别用p a 和p h 。 p a ：5 一a g a g t t r g a t c c t g g c t c a g 3 p h ：5 - a a g g a g g t t a t c c a g c c g c a 3 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。脱盐后溶于水 中，浓度为i o u m o l 1 。 6 3p c r 扩增方法 反应体系5 0 u l ，模板1 - 2 p 1 ，引物各加5 0 p m o l 。反应程序为9 5 。c 预 变性5 分钟，9 5 。c 变性1 分钟，5 2 5 8 退火4 0 秒，7 2 延伸2 分钟， 共进行3 0 个循环反应，最后在7 2 。c 延伸7 分钟。 6 4 序列测定和分析 p c r 扩增产物经凝胶电泳分析确认是所需的产物后，直接送交上海 生工生物工程技术服务有限公司测序。序列测得后将其输入g e n b a n k ，并 用b l a s t n 程序对库中的所有序列进行比较分析。 浙江大学硕士毕业论文 结果 1 抗生索产生菌的筛选结果 1 1 初筛结果 用琼脂平板稀释法，分离出放线菌共1 4 4 株。经初筛发现菌株5 6 、 1 6 4 、1 9 1 对金黄色葡萄球菌有较强的拮抗作用。 1 2 复筛结果 对选出有抑菌作用的3 株放线菌进一步复筛验证，并扩大检定菌的 范围。结果见表1 。经反复筛选最终确定1 株优良的抗生素产生菌株 1 9 1 。由该菌所产生的抗生素，即抗生素1 9 1 ，虽然只对革兰氏阳性菌 有抑制作用，但是它产抗生索稳定，抑菌作用强，并且对耐甲氧西林葡 萄球菌也有同样的抑制作用。结果见图l 、2 、3 、4 。a m p 为对照氨苄 西林，含药量o 5 p g 表1 抗菌谱测定结果 检定菌 放线菌 金黄色短小芽枯草芽藤黄徽大肠杆沙门氏绿脓杆白色念 葡萄球孢杆菌孢杆菌球菌苗菌菌珠茁 菌 1 9 - i + + +- h - h - 一 一 一 一 1 6 - 4 + 5 6 + + 一一 + “+ + ”表示有强抑菌作用，“+ ”表示有抑菌作用，“一”表示无抑菌作用 1 3 抽提实验结果 为确定菌株1 9 1 所产抗生素的分布情况及溶解特性，对其进行了 初步抽提实验。结果( 表2 ) 表明：该菌所产抗生素主要分布在发酵液 中；易溶于正丁醇、乙酸乙酯等极性较大的有机溶剂，不溶于苯等极性 1 4 浙江大学硕士毕业论文 较小的有机溶剂。 表2 抽提实验结果 编号 12345678 抑菌圈 1 5 88 31 5 51 2 01 5 01 2 301 5 6 ( m m ) 注：】发酵上清液、2 菌体浸泡液、3 丁醇萃取液、4 丁醇萃余液、5 乙酸乙酯萃取液、 6 乙酸乙酯萃余液、7 苯萃取液、8 苯萃余液 图l抗生素1 9 1 对金黄色葡萄球菌的抑制作用 1 5 浙江大学硕士毕业论文 图3 抗生素1 9 1 对耐甲氧阿林葡萄球菌5 9 5 的的抑制作_ l j 1 6 浙江大学硕士毕业论文 图4 抗生素1 9 1 对耐甲氧西林葡萄球菌6 0 0 的抑制作用 1 4 抗生素稳定性分析 对菌株1 9 1 所产抗生素进行酸、碱、热等稳定性检测。结果表明该 菌发酵上清液在6 0 c 水浴中加热2 个小时，其抑菌活性无明显变化； 在1 0 0 c 水浴中加热半小时，其抑菌活性明显降低。特别是在p h2 和 p i l l 0 的条件下变化更加明显，如图5 、6 所示。 2 菌株1 9 1 发酵条件的研究 2 】斜面培养基的确定 由于放线菌1 9 1 在合成培养基高氏号琼脂上生长得不是很好 影响产孢的质量和数量，所以又试用了其它几种培养基，结果见表3 。 1 7 浙江大学硕士毕业论文 1 4 一 1 2 重1 0 臣8 煽 6 霉 t 5 匝 4 随 曩 o 一一。一一一一 01 53 04 56 07 5 9 0 1 0 51 2 0 时间( h ) 图5 温度对抗生素活性的影响 0】234567891 0l l1 2 p h 图6p h 对抗生素活性的影响 i + 6 0 水浴 i + 1 0 0 水浴 1 + 6 0 水浴 + l o o 水浴 从结果可看出菌株1 9 1 在合成培养基上生长得较差，产孢较少： 而在天然或半合成培养基上生长则都很好，且产孢也多。为提高孢子质 量和数量我们采用了成分简单、配制方便的葡萄糖酵母膏琼脂做为斜 面培养基。 1 8 浙江大学硕士毕业论文 表3 不同培养基对产孢的影响 培养基 菌丝孢于 高氏一号琼脂 很薄一层贴于斜面表面稀少 察氏琼脂 同上稀少 葡萄糖天门冬素琼脂 生长茂盛丰富 葡萄糖- 酵母膏琼脂 生长茂盛丰富 马铃薯块 生长非常茂盛丰富 2 2 培养基中碳氮源的确定 在基础培养基中加入1 蛋白胨作为唯一的有机氮源，分别加入淀 粉、糊精、葡萄糖、蔗糖等4 种碳源，考察不同碳源对发酵单位的影响； 同理，在基础培养基的基础上以3 的淀粉为唯一的碳源，分别加入蛋 白胨、酵母膏、黄豆饼粉、玉米粉等4 种氮源，考察不同氮源对发酵单 位的影响，结果见表4 。在碳源方面，利用得最好的是淀粉，其次是糊 精，最差的是蔗糖；而在氮源方面，利用得最好的是黄豆饼粉，其次是 蛋白胨和酵母膏。 以淀粉、黄豆饼粉为碳氮源，分别作不同用量试验，结果见表5 。 其中编号2 的发酵单位最两，即在基础培养基中加入3 o 的淀粉和2 0 的黄豆饼粉，构成了最佳发酵培养基。 表4 不同碳氮源对效价的影响 碳源菌体浓度效价氮源菌体浓度效价 ( )( )( m m )( )( )( m m ) 淀粉2 71 42 黄豆饼粉2 1 21 83 糊精 1 283 玉米粉2 l l1 45 葡萄糖1 26 1 蛋白胨i 1 41 4s 蔗糖l 20 酵母膏l 71 02 1 9 浙江大学硕士毕业论文 表5 不同碳氮比对效价的影响 编号淀粉( ) 黄豆饼粉( )效价( m m ) l2 151 32 23 2 01 86 33 251 79 442o 1 44 5 4301 46 2 3 不同营养成分对效价的影响 用l 2 7 ( 3 ”) 正交表对1 1 种曾筛选过的营养成分的3 个水平进行考察。 实验方案见表6 。经正交实验后，各成分对效价的影响结果从大到小分 别为酵母膏、硫酸铵、磷酸二氢钾、淀粉、玉米浆、硫酸镁、糊精、碳 酸钙、葡萄糖、黄豆饼粉、蛋白胨( 见表7 ) 。 表6l ：，( 3 ”) 正交实验因素水平表 因素 l234567891 0 1 1 水平1 00000000000 ( ) 水平2 03l515201520050 0 504 o0 2 5 2 ( ) 水平3 0 63 0303030 301001080235 ( ) 注：1 蛋白胨、2 酵母膏、3 淀粉、4 葡萄糖、5 玉米浆、6 糊精、7 磷酸二氢钾、8 硫酸 铵、9 硫酸镁、1 0 碳酸钙、1 1 黄豆饼粉。 2 0 浙江大学硕j 。毕业论文 表7 l ：，( 3 ”) 正交设计和结果 l2345678901 1效价 1il32 1223 l210 221l1ll332110 33123l3 i333 1l0 4122 1l2223 l30 52233 l132 l330 632 l21312223 0 7l3 13l22 l2320 823221l3 13220 9333 j i3 j j】20 1 0l 111233 l32363 1 12 i23221 l1l3 18 5 1 23i32212 l2331 0 1 3123323332 120 1 422122213 3320 1 5322l2123 1220 1 6l3222332 13 10 l7233i221222 10 1833i321223 1l0 1 911233li22 22 15l 2 021323322 3 l2 0 2 l31113232 132 8 2 2 2l2123lil1 111 3 6 2 32221332 l2317 4 2 43233323132l 0 2 513313113333 0 2 623i33323 1230 2 73322323 32l30 l3 5 6 8i2 8 i2 191 03 875 72 5 5 84 0 33 2l3 l 2 592j5j2 363 482 671 7 42 333 252j42 33 i i l l 2 8201 03 364 432 371 451 0 1 633 563 4 8 极 9 16 8i4 l1 l73 43i54 27 4 582 41 421 1 5 差 塑翌盔兰堡! ：兰些堡三 一 2 4 培养基中外加金属离子对效价的影响 按照2 2 确定的培养基，外加硫酸铜、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸锰， 用l ，( 3 一) 正交实验，考察金属离子c u “、z n ”、f e ”、m n 2 + 的三个水平 对效价的影响。正交实验方案见表8 ，实验设计和结果见表9 。金属离 子对效价的影响从大到小依次为：c u ”、z n ”、f e ”、m n “。 表8l 。( 3 4 ) 正交实验因素水平表 因素 12 34 水平l ( ) o000 水平2 ( ) o 0 1o 0 1o 0 5o 0 3 水平3 ( ) 01 o 1o 10 1 注：1 硫酸铜、2 硫酸锌、3 硫酸亚铁、4 硫酸锰 表9 l 9 ( 3 4 ) 正交实验设计和结果表 效价 1234 ( m m ) 11】111 5 0 212221 1 8 313330 42 l231 33 522311 1 、0 623 l29 4 731320 832130 9332】0 i 2 6 82 832 442 6 i i 3 372 282 512 1 2 i i i 09 41 1 01 3 3 极差 3 3 71891 4 11 2 7 2 2 浙江大学硕士毕业论文 2 5 转速、装量、发酵时间对效价的影响 在用5 0 0 m l 的三角瓶代替2 5 0 m l 的三角瓶发酵时，经常遇到发酵不 稳定的情况，经分析认为与通气有关，所以用l ，( 3 4 ) 正交表对摇床转速、 装量、发酵时间的3 个水平进行考察，培养温度为2 8 。正交实验方 案见表1 0 。实验设计和结果见表1 1 。结果显示，菌株1 9 1 所产抗生素 的效价与通气量有密切关系。当转速为1 4 0 r p m 时，无论是6 0 m l 还是 l o o m l 摇瓶中，其效价均为0 ：当转速为1 8 0 r p m 时，只有装6 0 m l 的摇 瓶中有抗生素合成：当转速为2 2 0 r p m 时，摇瓶中无论装6 0 m l 、8 0 m l 还是l o o m l 均有抗生素产生。为进一步考察通气量对效价的影响，又试 验了5 0 0 m l 摇瓶中分别装2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、l o o m l ，在1 8 0 r p m 和2 2 0 r p m 的转速下培养9 6 小时。结果表明( 图7 ) ，当转速为1 8 0 r p m 时，装量 为6 0 m l 的摇瓶中效价最高；当转速为2 2 0 r p m 时，装量为6 0 8 0 m l 的 摇瓶中效价最高。这说明菌株1 9 1 在进行液体发酵时，需要一定的溶 氧量，但过高也不利于抗生素的合成。 t 占 匿 | 蓝 曩 4 06 08 01 0 01 2 0 裂量( m 1 ) 图7 通气量对效价的 ! ；响 一i 8 0 r 鲫 2 2 0 r p m 浙江大学坝一l 毕业论文 表1 0l 。( 3 4 ) 正交因素水平表 因素 时间( h ) 转速( r p m ) 装量( m 1 ) 水平i 6 0 1 4 06 0 水平2 8 4 18 08 0 水平3 1 182 2 01 0 0 表11 l 9 ( 3 4 ) 正交实验设计和结果 时间转速装量效价 l23(mm) 12 13o 2 l11o 33 i2o 4 122o 5323o 62 2l176 733 l1 65 82321 6 ，6 9 l33l38 i o3 411 38 】i i 76 1 663 42 i i i 4 691 381 65 极差 4 692 031 77 2 6 不同温度和p h 对效价的影响分析 通过不同温度和p h 试验，结果表明，菌株1 9 一l 在p h 中性偏碱， 温度2 5 2 8 之间，对抗生素的合成较为合适。 2 7 代谢变化曲线分析 分别用最佳发酵培养基( m 2 ) 和仞始发酵培养基( m 1 ) ，按最佳 发酵条件( 8 0 5 0 0 m l 、2 5 。c 、2 2 0 r p m ) 进行发酵培养，其代谢变化曲线 浙江大学硕士毕业论文 如图8 、9 、1 0 。由实验结果可知，抗生素1 9 1 主要在菌体生长稳定期、 p h 5 5 左右时合成。由于用m 2 发酵培养，抗生素合成期较长、p h 变化 小，因此效价明显比用m 1 发酵培养高。然而无论用m 2 还是m 1 ，菌株1 9 一l 的发酵代谢都具有以下特征：在0 4 8 小时期间菌体生长迅速，p h 急 速下降，此时抗生素几乎不合成或合成很少；在4 8 7 2 小时期间菌体生 长与死亡基本保持平衡，口h 变化缓慢，此时抗生素大量合成；在7 2 9 6 小时期间菌体开始衰亡，p h 缓慢上升，此时抗生素合成几乎停止；在 9 6 1 2 0 小时期间菌体大量死亡，p h 迅速上升，抗生素合成完全停止。 表1 2 温度、p h 对效价的影响 8 ，、 量7 臣 鋈e 5 一一一一一1 一。一一 01 22 43 64 86 07 28 49 6 1 0 8 1 2 0 时间( h ) 图8p h 变化【l 【| 线 = - o - = m l - - - i i - - m 2 t 浙江大学坝 一毕业论文 i ： 誊2 0 瓢 罂： 星 一 匿 璃 暴 1 5 1 0 5 o 01 22 43 64 8 6 07 2 8 49 61 0 81 2 0 时间( h ) 图9 茵体生长曲线 01 22 4 3 64 86 0 7 28 49 61 0 81 2 0 时间( h ) 图1 0 抗生素合成i i l j 线 _ 卜m 1 f - _ m 2 3 抗生素1 9 - 1 的早期鉴别 31 纸层析和薄层层析结果 为初步判定抗生素1 9 1 是否为新抗生素，我们采用综合层析法列 其抽提物进行了纸层析和薄层层析分析。结果见图1 1 和1 2 。通过结果 与已知抗生素的比较，发现抗生素1 9 1 的纸层析图谱与大环内脂类抗 浙江大学坝士毕业论文 生素中的柱晶白霉素( l e u c o m y c i n ) 1 2 1 较为相似；而其薄层层析结果则与 a s z a l o s 分类系统中的第三群第二族中的许多抗生素如友菌素( a m i c e t i n ) 、色环素a 3 ( c h r o m o m y c i na 3 ) 、紫红霉素( r h o d o m y c i n ) 、诺加霉 素( n o g a l a m y c i n ) ”1 等较为相似。 3 2 纸电泳结果 为确定抗生素1 9 1 的酸碱性，进行了纸电泳试验。结果见示意图 1 3 。 根据强碱性物质在酸性和碱性条件下都向正极移动的原理可判断抗 生素1 9 1 为碱性化合物。 + r _ _ 矿 + + _ - 坐幽一 05 c m 图1 3 抗生索1 9 - 1 的纸电泳笛 3 3 紫外、可见吸收光谱的测定 为得到与抗生素1 9 1 早期鉴别有关的更多信息，用分光光度计对 其甲醇溶液的紫外可见吸收光谱进行扫描测定，结果见图1 4 。由图可 知抗生素1 9 1 具有特征吸收光谱，其最高吸收峰的位置分别为：2 2 3 n m 2 8 0 n m ，4 1 4 n m 。 2 7 t 堑坚查堂堕主兰些笙苎 一一 12 1 0 8 星06- 。厂 04 o 2 r 0 ：一一1 一一。 012 345678 溶媒系统 图1 1 纸层析图谱 注：i 搭刑水饱丰l | 耵止j 醪、2 水饱利阴止j 酊冈笛2 明盯甲举填敝、3j 醉：醚酸：水( 2 ： l ：1 ) 、4 水饱和的正丁醇内含2 的毗啶、5 正丁醇饱和的0 5 m o l lp h70 的磷酸缓冲液、6 正丁醇饱和的水内含2 的对甲苯磺酸、7 苯：甲醇( 4 ：1 ) ，滤纸用05 m o l lp h70 的磷酸缓 冲液处理、8 甲醇：水( 3 ：1 ) ，水中含3 n a c i ，滤纸用5 n a 2 s o 。处理 12 5 o4 0 2 0 23456 溶媒系统 幽1 2 河层层析幽谱 注：1 甲醇、2 含1 0 e p 醇的氯仿、3 氯仿、4q l 附：苯( 1 2 ：8 8 ) 、5 甲酣：苯( 6 ：9 4 ) 6 甲酣：苯( 4 ：9 6 ) 2 8 浙江火学坝十毕业论文 暑鲁日 譬矗蓉 薹萋 昂 ii ；至 9 害 婶 o 量耸s 鲁 图1 4 抗生素1 9 1 的紫外可见吸收光谱 3 4 其它纸层析结果 抗生素1 9 1 在其它溶剂中的纸层析结果见表1 3 。根据r f 值越大 其在溶剂中的溶解性越大的原理8 l ，抗生素1 9 1 易溶与正丁醇、乙酸 2 9 ooo旷* r r i 一e ： nz，叫o-1。一n厶。一j，tni； 口z甘p_一 n oo兽已删rvo ，2窖 浙江大学f ! i 毕业论文 乙酯、甲醇等极性较大的有机溶剂，可溶于水、不溶于苯、乙醚、石油 醚。从表1 3 还可看出，在某些溶剂中抗生素1 9 1 经纸层析后出现两个 抑菌圈，由此判断该抗生素应含有两种成分。 表1 3 抗生素1 9 - 1 在其它溶剂中的r f 值 溶剂 r f 溶剂 r f 水饱和的苯 0 ( 主要)乙腋乙酯：石油醚( 1 ：1 )0 3 ( 主要) 09 90 若0 甲醇：水( 7 ：3 ) 0 9 8 乙酸乙酯 09 8 水饱和乙酸乙酯o9 8 ( 主要) ( 滤纸用p h 7 的缓冲液处理) o7 8 苯：乙酸乙酯 0 乙醚 0 ( 9 ：1 ) 水04 6 ( 拖尾严重)扛油醚 o 4 菌株1 9 。1 部分1 6 sr d n a 序列的测定 4 1p c r 扩增结果 为达到特异性扩增的目的，我们对p c r 反应条件进行了优化。其中 主要试验了m 9 2 + 浓度、模板浓度以及退火温度对扩增产物的影响。最 后确定最佳反应条件为：m 9 2 + ：1 5 2 0 m m ；模板：2 5 u l ；退火温度： 5 8 ( 图1 5 ) 。 3 0 浙江大学硕士毕业论文 图1 5p c r 扩增结果 1 3 ：m g ! + 浓度分别为1 5 、j8 、2 0 m m ，模板量为2 5 p i 4 ： m 9 2 + 浓度为1 5 m m ，模板量为】0 u j 5 ： m a r k e r 分子量从上往下依次为2 0 0 0 、1 0 0 0 、