（植物学专业论文）类血影蛋白在花粉管生长调节中的作用.pdf

摘要 花粉管的极性生长是高等植物生殖和发育过程中的一个重要方面，有关花粉管生 长机理的研究一直也是这方面的热点。在花粉管极性生长过程中，有许多因子如顶端 c a 2 + 梯度、顶端p o pg t p 觞e 、微丝和微管骨架等都在参与其过程。最近鉴定出膜骨架 蛋白的类似蛋白( 类血影蛋白) 存在于川百合花粉管胞质中，本文利用川i 百合花粉为材 料，进一步研究膜骨架蛋白类血影蛋白在花粉管生长过程中的作用。 。利用s d s - p a g e 和免疫印迹发现在川百合花粉管胞质中存在i o s k d 的类血影蛋 白。用二相法提取纯度较高的花粉管质膜并结合s d s p a g e 和免疫印迹，发现花粉管 质膜上存在约1 5 0 k d 的类血影蛋白。利用双向电泳发现存在于花粉管质中的类血影蛋 白的等电点为4 3 9 ：存在于川百合花粉管质膜上的1 5 0 k d 类血影蛋白的等电点为4 5 4 。 进一步利用活性电泳发现存在于川百合花粉管胞质中的类血影蛋白是以二聚体存在， 分子量为2 1 0 k d 左右。 利用显微注射人血影蛋白单克隆抗体于正在生长的川百合花粉管中，发现血影蛋 白单克隆抗体能明显抑制花粉管的生长。无论是注射牛血清白蛋白还是血影蛋白抗体， 被注射的花粉管在最初的3 0 m i n 恢复期内生长速度极其缓慢，最快也只有o 8 8 m h 。 恢复期过后，被注射血影蛋白抗体的花粉管的生长速度为7 7 9 m h ，而注射牛血清白蛋 白的花粉管恢复期后的生长速度达到1 9 6 p m h 。表明花粉管中类血影蛋白参与了川百 合花粉管的生长。 动物细胞中利用n e m 处理红细胞，发现血影蛋白四聚体降解为二聚体或单体。本 文利用巯基破坏性试剂n e m 处理川百合花粉，发现3 0 p , m o l l n e m 能完全抑制花粉的 萌发和花粉管的伸长。去掉n e m 后，3 0 ”m o l l n e m 处理的川百合花粉萌发率可恢复 至对照的9 8 ，花粉管的伸长可恢复至对照的6 0 。表明n e m 是一类不影响活细胞 代谢过程的药剂。被n e m 处理的花粉管，用a l e x a - p h a l l o i d i n 标记其中的微丝，发现 随着n e m 浓度的升高，花粉管中微丝的排列方式发生变化，并不是表现为正常的有规 则的微丝束状态，而是呈现弯曲现象。3 0 t u n o l ln e m 处理的花粉，只在其萌发孔处有 一个圆球突起，不表现为一个纵向的管状结构，且圆球中的微丝排列紊乱，不规则， 不表现为正常的花粉管极性生长。由于血影蛋白也是肌动蛋白的一种结合蛋白或交联 蛋白，n e m 处理花粉管后，类血影蛋白的活性受到抑制，或类血影蛋白的二聚体降解 为单体，导致与其结合的相关蛋白的活性降低，使花粉管内微丝束形态发生变化，从 而抑制了川百合花粉的萌发和花粉管的伸长。 n e m 处理过的川百合花粉管，川百合花粉管中c a 2 + 浓度升高。用c a 2 + 特异性螯合 剂或c a z + 通道特异性抑制剂发现，花粉管中新增加的c a 2 + 主要来源于胞外，即通过质 膜c a 2 + 内向型通道进入花粉管内。由于在动物细胞中血影蛋白可以直接与质膜中的蛋 白或通道相连，n e m 处理花粉管后，很可能造成花粉管质膜中类血影蛋白的活性降低， 打开了与之相关的c a 2 + 通道，c a z + 进入细胞内。从另一方面也说明，川i 百合花粉管中 的类血影蛋白也可能在主动调控c a 2 + 通道的活性。 以上结果表明，川百合花粉管中的类血影蛋白在调控花粉萌发和花粉管生长方面 有重要的作用。i ， 。i jl 关键词： 川百合花粉管，& 猢血影蛋白，花粉管生长，肌动蛋白段 a b s t r a c t p o l l e nt u b ep o l a rg r o w t hi sa ni m p o r t a n ta s p e c ti np l a n tp r o l i f e r a t i o na n dd e v e l o p m e n t t h e r e f o r e ，t h es t u d yo f m e c h a n i s mo f p o l l e nt u b et i pg r o w t hi sa l w a y si n t e r e s t i n gf o rr e s e a r c h e r s t h e r ea r em a n yf a c t o r s ，s u c ha sc a 2 + g r a d i e n t ，r o pg t p a s ea tt h et i po fp o l l e nt u b e s ，a c t i na n d m i c r o t u b u l ec y t o s k e l e t o nt h a th a v eb e e ns h o w nt ob ei n v o l v e di nt h e p r o c e s s o fp o l l e n g e r m i n a t i o na n dp o l l e nt u b eg r o w t h i np r e s e n ts t u d y , w ei n v e s t i g a t et h er o l e so fs p e c t r i n l i k e p r o t e i n si nl i l yp o l l e ng e r m i n a t i o n a n dp o l l e nt u b eg r o w t h f i r s t l y , w eh a v ei d e n t i f i e dt w ok i n d so fs p e c t r i n l i k ep r o t e i n s ，o n ei nt h ec y t o p l a s mw i t h m o l e c u l a rw e i g h to f1 0 5 k di d e n t i f i e db ys d s p a g ea n dw e s t e r nb l o t t i n g ，a n da n o t h e rw i t h m o l e c u l a rw e i g h to f1 5 0 k di nt h ep l a s m am e m b r a n eo fp o l l e nt u b ep u r i f i e dw i t ht w o - p h a s e m e t h o da n di d e n t i f i e db ys d s p a g ea n dw e s t e r n b l o t t i n g a c c o r d i n g t ot w od i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ，t h ep io f1 0 5 k ds p e c t r i n - l i k ep r o t e i ni s4 3 9a n dt h ep io f1 5 0 k ds p e c t r i n - l i k e p r o t e i n i s4 5 4 n a t i v ep a g ea n dn a t i v ew e s t e r n b l o t t i n g i n d i c a t et h a t e x i s t i n g f o r mo f s p e c t r i n l i k ep r o t e i ni nt h ec y t o p l a s mi s a sad i m e rw i t h2 1 0 k do fm o l e c u l a rw e i g h ti n l i l y p o l l e nt u b e s w h e nm o n o e l o n a ls p e c t r i na n t i b o d y ( 1 m g m 1 ) i sm i c r o i n j e c t e di n t o g r o w i n gl i l yp o l l e n t u b e s ，t h eg r o w t ho fp o l l e nt u b e si si n h i b i t e d a f t e rm i c r o i n j e c t e dw i t hm o n o c l o n a ls p e c t r i n a n t i b o d yo rb s a ，t h eg r o w i n gr a t eo fp o l l e nt u b e si s s l o wd o w nd u r i n gt h ef i r s t3 0m i n u t e s ( n a m e dr e c o v e r ys t a g e ) ，t h e f a s t e s tg r o w i n gr a t ei s o n l yo 8 8 u m ，1 1 a tt h i s s t a g e a f t e rt h e r e c o v e r ys t a g e ，t h eg r o w i n g r a t eo f p o l l e nt u b e sm i c r o i n j c o t e dw i t hm o n o c l o n a ls p e c 打i na n t i b o d y r e a c h e s7 7 p m h ，b u tt h eg r o w i n gr a t eo f p o l l e nt u b em i c r o i n j e c t e dw i t hb s a ( 1 m g m 1 ) i su pt o 1 9 6 p m h i ts u g g e s t e d t h a ts p e c t r i n - l i k ep r o t e i ni si n v o l v e di nt h eg r o w t h o f p o l l e nt u b e s w h e nt r e a t e d l i l yp o l l e n sa n dp o l l e nt u b e sw i t h3 0 p m o l ln e m ，ak i n do fs u l t h y d r y l a l k y l a t i n gr e a g e n tw h i c hd e p l o y m e r i z e ss p e c t r i nt e t r a m e r si n t od i m m e r so rm o n o m e r si nr e d c e l l s ，b o t hp o l l e n sg e r m i n a t i n gr a t ea n dp o l l e nt u b eg r o w t ha r ei n h i b i t e d w h e nn e m i sr e m o v e d b y2 0 1 l mn y l o nf i l t r a t i o n ，t h er e c o v e r yp e r c e n to fp o l l e ng e r m i n a t i n gr a t ea n dt h er e c o v e r y p e r c e n to f p o l l e nt u b eg r o w t ha p p r o a c h9 8 ，6 0 r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l s t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h a tn e md o e sn o ta f f e c tm e t a b o l i s mi nl i v i n gc e l l s ，i na d d i t i o n ，n e mm a y p l a ya r o l eo f d e p l o y m e r i z i n gs p e c t r i n l i k ep r o t e i nd i m e r si n t om o n o m e r si np o l l e nt u b ea n da f f e c tt h e i r a c t i v i t i e st ob i n dt h e i rr e l a t e d p r o t e i n s ，a n d r e s u l ti nai n h i b i t i o ne f f e c to l lb o t h p o l l e n g e r m i n a t i o na n dp o l l e nt u b eg r o w t h i no r d e rt o i n v e s t i g a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n s p e c t r i n l i k ep r o t e i n s a n dt h ea c t i n i i i c y t o s k e l e t o n ，p o l l e nt u b e sa r et r e a t e dw i t hn e m a tv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n sa n ds t a i n e dw i t h 1 0 n m o l la l e x a - p h a l l o i d i n t h ef o r mo fa c t i nf i l a m e n t a r r a yi s r e m a r k a b l yc h a n g e d ，f r o m l o g n i t u d i n a la r r a n g e db u n d l e sa st h a ti n c o n t r o lc e l l si n t oc u r v e ds h o r tb u n d l e sp o l l e n st r e a t e d w i t h3 0 9 m o l lh a v ear o u n db u l g ea tg e r m i n a t i o na p e r t u r e ，b mn on o r m a lp o l l e nt u b e sa r e o b s e r v e d i ti n d i c a t e dt h a ts p e c t r i n - l i k ep r o t e i n si np o l l e nt u b e sh a v es o m e h o waf u n c t i o ni nt h e a r r a n g e m e n to f a c t i nf i l a m e n t s b e s i d e st h e c h a n g eo fa c t i n f i l a m e n t a r r a y , c a 2 + c o n c e n t r a t i o ni np o l l e nt u b e i sa l s o i n c r e a s e dw h e nt r e a t e dw i t hn e mu s i n gs p e c i a lc 一+ c h a n n e l si n h i b i t o r si np l a s m am e m b r a n e o ri nc y t o p l a s ta n dc a ”c h e l a t o r se g t a i ti se v i d e n c e dt h a ti n c r e a s e dc a 2 + m a i n l yc o m e sf r o m e x t m c e l l u l a rm a t r i xt h r o u g hc 一+ c h a n n e l si np l a s m am e m b r a n eo f p o l l e nt u b e s i ti ss u g g e s t e d t h a tn e m p r o b a b l yd i s r u p t st h ec o n n e c t i o nb e t w e e ns p e c t r i n - l i k ep r o t e i na n dc 一+ c h a n n e l so r o t h e rp r o t e i n sr e l a t e dw i t hc a 2 + c h a n n e l s ，a n dd r o v ec a ”i n t ot h ec e l l o nt h eo t h e rh a n d s p e c t r i n - l i k ep r o t e i n i n p o l l e nt u b e sm a y a l s o p a r t i c i p a t e t h e r e g u l a t i o n o fc 一+ c h a n n e l s a c t i v i t i e s i nt h es u m m a r y , s p e c t r i n - l i k ep r o t e i n si nl i l y p o l l e nt u b e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei np o l l e n t u b eg r o w t h k e yw o r d s ：l i l yp o l l e n s ( t u b e ) ，s p e c t r i n ，p o l l e nt u b eg r o w t h ，a c t i n ( f i l a m e n 0 v 英文缩写 a r p 2 3 b c b s a c b d m s o d t t f - a c t i n e g t a 玎强 i p 3 p - m e m f i 慨 n e m n b t p a g e p b s p h p i p 2 p m s f s d s s h 3 t h s 1 ：a m 匝 p v p p e s n p - 4 0 英文缩写词表 英文名称 a c t i n - r e l a t e dp r o t e i n2 3 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 i n d o l y lp h o s p h a t e b o v i n es e r u mm b u m i n c y t o c h a l a s i nb d i - m e t h y l s u l f o x i d e d i t h i o e r y t h r i t o l f i l a m e n t o u sa c t i n e t h y l e n eg l y c o l - b i s ( b - a m i n o e t h y ie t h e r ) n , n n - t e t r a c e t i ca c i d i n t e r m i d a t ef i l a m e n b i n o s i t o l1 , 4 5 - t r i s p h o s p h a t e 2 - m e r c a p t o e t h a n o l m i c r o f i l a m e n t s m i c r o t u b u l e s n - e t h y l m a l e i m d e p - n i t r o b l u et e t r a z o l i u m p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e p l e c k s t r i nh o m o l o g y p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l4 5 b i s p h o s p h a t e p h e n y l - m e t h y l - s u l f o n y l - f l u o r i d e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s r c - h o m o i o g yr e g i o n 3 t r i h y d r o x y m e t b y i a m i n om e t h a n e n a - p t o s y l l - a r g i n i n e - m e t h y l - e s t e r p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e p i p e r a z i n e - n , n - b i s 佗m o r p h o l i n oa c i d ) n o n i d e tp - 4 0 张学琴：类血影蛋白在花粉管生长调节中的作用 第一部分文献综述 胞质骨架( c y t o s k e l e t o n ) 是细胞内蛋白组成的网络结构，由由微管( m i c r o t u b u l e s ， m t s ) 、微丝( m i c r o f i l a m e n t s ，m f s ) 、中间纤维( i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t s ，i f ) 构成；膜 骨架( m e m b r a n es k e l e t o n ) 是由血影蛋白( s p e c l r i n ) 、锚蛋白( a n k y r i n ) 、肌动蛋白 ( a c t i n ) 、带3 蛋白( b a n d3 ，存在于质膜上的一种阴离子通道) 等在质膜内侧、胞质 表面构成的一层网络结构，这两种骨架系统在细胞内形成一个相互联系、动态的三维 网络体系，它们在维持细胞的形态、参与胞内囊泡运输、细胞有丝分裂和控制细胞极 性生长等许多重要的植物细胞生理活动中发挥重要的功能。 细胞的极性生长是生物生殖和发育中一个重要方面，极性生长现象是一个非常复 杂的信号调控过程。其调控机制多种多样，互相关联。但目前研究较为明确的是细胞 骨架( m t s m f s ) 系统在细胞极性生长中的发挥重要作用。高等植物的花粉管是研究极性 生长的一个典型材料。在传输精细胞到胚珠的过程中，花粉粒首先落在柱头( s t i g m a ) 表面，然后花粉管由萌发孔突出，经过一系列的蛋白识别过程，花粉管穿过柱头细胞 壁，以l c m h 的速度快速生长，最后到达胚珠完成受精过程。事实上，花粉萌发前细 胞内就已开始进行一系列有关花粉管生长的调控过程。前人多年的研究结果表明。无 机离子，如c a 2 + ；蛋白激酶，如蛋白激酶c ( p k c ) ：细胞骨架蛋白，如m t s 、m f s 等都 参与花粉管的生长。最近在百合花粉中鉴定出膜骨架的一种主要蛋白一血影蛋白的类 似蛋白，即类血影蛋白( s p e c t r i n 1 i k ep r o t e i n ) ，但其在花粉中的存在形式、功能以及是 否参与或调控花粉管的生长还不太清楚，本论文针对此方面的相关问题进行综述和研究。 第一章细胞膜骨架研究进展 一、概述 动物红细胞在血液循环中往往要穿过直径比自己还窄的毛细血管，但其并没有被 挤碎而是能在毛细血管中顺利畅通，是否红细胞内存在一种韧性的结构帮助红细胞抵 抗外力压迫呢? m a r c h e s i 等用非离子去污剂处理人的红细胞膜时发现除去质膜上磷脂 类等物质后，还留下一张与红细胞原初形状相同的网络结构，推测很可能是此结构在 保护红细胞膜结构方面起中起作用( m a r c h e s i 等，1 9 6 8 ) 。由于是在红细胞中发现的， 所以将此结构称为“血影( g h o s t ) ”，又由于是在细胞膜上发现的，所以称为“膜骨架”。 l 中国农业大学博士学位论文 通过s d s - - p a g e ，发现膜骨架有多种蛋白组成。1 9 7 3 年y u 等，利用电子显微镜第一次 观察到膜骨架真实地分布于红细胞膜上( y u 等，1 9 7 3 ) ，且发现此结构分布有序、排列 精致，网络中的两个节点间的一段是血影蛋白四聚体分子，节点是短肌动蛋白丝( s h o r t a c t i n f i l a m e n t s ) ，再由短f - a c t i n 将血影蛋白四聚体构成多边形的网络结构( l i u 等1 9 8 7 ； s h e n 等，1 9 8 6 ) 。锚蛋白( a n k y r i n ) 结合在血影蛋白四聚体上。锚蛋白又与质膜中的带 3 蛋白( a n i o ne x c h a n g e r b a n d3 ) 胞质端结合( b e n n e a ，1 9 7 8 ，1 9 7 9 ；b e n n e a 等，1 9 8 2 ； l u n a 等，1 9 7 9 ) 。由于血影蛋白、锚蛋白及带3 蛋白分子结构上的特异性，各膜骨架蛋 白间、各膜骨架蛋白与相关蛋白间、膜骨架蛋白直接或间接与质膜蛋白间都会相互作 用；它们也可通过与胞质骨架蛋i ! i ( m t s 、m f s 及其相关蛋白1 相连，因此可以在细胞内 形成一个非常有序、互为动态的结构，共同完成细胞内各项重要生理活动。图l ，图2 为发现红细胞膜骨架的电镜照片及其模型。 图1 快速冷冻置换法得到的红细胞膜骨架电镜负染照片( u r s i t t i w a d e ，1 9 9 3 ) 大箭头：血影蛋白四聚体；小箭头：肌动蛋白节点 f i g 1 t h en e g a t i v e l ys t a i n e dp h o t oo fu n f i x dm e m b r a n es k e l e t o no fr e dc e l lu n d e r e l e c t r o n i cm i c r o s c o p yb yq f d e r r ( q u i c k - f r e e z e ，d e e p - e t c h ，r o t a r yr e p l i c a t i o n ) ( u r s i t t i w a d e 1 9 9 3 ) l a r g ea l t o w ：t e t r a m e rs p e e t r i n ；s m a l la i t o w m e s h w o r kj u n c t i o n si nm e m b r a n e s k e l e t o nm a d eu po f s h o r ta c t i nf i l a m e n t 2 张学琴：类血影蛋白在花粉管生长调节中的作用 图2 红细胞膜骨架模型( h e n o n 等，1 9 9 9 ) f i g 2m o d e lo f m e m b r a n es k e l e t o no f r e dc e l l ( h e n o n 。e ta 1 1 9 9 9 ) t h er e db l o o dc e l lm e m b r a n ei sc o m p o s e do fal i p i db i l a y e rr e i n f o r c e do ni t si n n e r f a c eb yat w o - d i m e n s i o n a ls p e c t r i nm e s h w o r k ：t h em e m b r a n es k e l e t o n t h es p c c t r i n f i l a m e n t sf o r mat r i a n g u l a ri a t t i c e w i t hal o to fd e f e c t s t h e f i l a m e n t sa r eb o u n dt o t r a n s m e m b r a n ep r o t e i n sb ya n k y r i nt ob a n d3a n db yal i n k i n gc o m p l e xt og l y c o p h o r i na n d b a n d3 红细胞膜骨架的成分有：血影蛋白、带3 蛋白、锚蛋白、t r o p o m o d u l i n ( 原肌球调 节蛋白) 、p r o t e i n4 1 、p r o t e i n 4 2 等。t r o p o m y o s i n ( 原肌球蛋白) 在电子显微镜下与网络 结构中的肌动蛋白丝一样长，分布于节点中，主要是调节微丝的形态和长度，而 t r o p o m o d u l i n 也存在于节点中，主要是与t r o p o m y o s i n 协同对微丝生长速度较慢的一 端加帽( f o w l e r , 1 9 9 0 ，1 9 9 6 ，1 9 9 7 ) 。其它蛋白的功能也是在节点处，是促进血影蛋 白与锚蛋白、血影蛋白与肌动蛋白、肌动蛋白与其它蛋白等之间的亲和性。红细胞膜 骨架的最基本的功能是对膜双分子层提供一个刚性支持，在外界机械压力作用下，维 持红细胞膜的稳定性，保护红细胞的完整性。同时它也是细胞内某些信号通路中的一 个链接点，在信号转导中起纽带作用或直接执行某种具体功能。通过膜骨架蛋白的突 变体的研究发现如果缺少某一膜骨架蛋白或蛋白中的某些特殊区段，红细胞的形状及 内部结构发生改变，导致相应的血液病的产生或生物机体、机能表现异常( g i l l i g a n 等， 1 9 9 9 1 。 中国农业大学博士学位论文 二、膜骨架蛋白组成成分及其相互问作用 膜骨架蛋白首先在红细胞中被发现的，但随后在动物的其它组织和细胞如动物的 脑神经细胞( d i a k o w s k e 等，1 9 9 9 ) 、果蝇( t h o m a s 等，1 9 9 9 ) 、线虫( m c k e o w n 等1 9 9 8 ) 、 藻类( h o l z i n g e r 等，1 9 9 9 ) 中都鉴定出膜骨架蛋白中的类血影蛋白，甚至在细胞中的高 尔基体中也鉴定出膜骨架蛋白，包括血影蛋白、锚蛋白( b e c k 等，1 9 9 8 ) 。最近十年来， 在高等植物细胞中也相继发现膜骨架蛋白中的类血影蛋白的存在。在动物细胞中还发 现各膜骨架蛋白在不同的细胞和不同的物种间存在多种异型体，如血影蛋白、锚蛋白 和带3 蛋白等蛋白的异型体，因其只在分子量存在差异，而结构上却非常相似，推测 这些异型体在其它组织和细胞中所起的功能相似。下面简单介绍各膜骨架蛋白的分子 和结构特点。 ( 一) 、膜骨架蛋白 1 血影蛋白 血影蛋白是一个超家族，只要在其基因的n 端含有c h 结构域和在c 端含有钙调素 结合区的蛋白，并且中间插入有三螺旋重复序列的蛋白都属于血影蛋白超家族成员， 如n 一辅肌动蛋白( a a c t i n i n ) 和d y s t r o p h i n ( 肌营养不良蛋白) 和p l a k i n 家族成员，它 们都含有上述结构，而且p l a k i n 结构域能与肌动蛋白丝、整合素( i n t e g r i n ) 和m t s 直接结合。从血影蛋白重复序列进化程度来看，a 一辅肌动蛋白可能是血影蛋白进化中 的祖先( p a s c u a l 等，1 9 9 7 a ) 1 1 血影蛋白的分子结构 血影蛋白是一种伸展的弹性分子，约长2 0 0 - 2 6 0 n m ，有o 、b 两种亚基，叭b 两 种亚基侧向头对尾的方式形成异二聚体，异二聚体再以头与头相接形成异四聚体( 图 3 ) 。 血影蛋白分子上有多种结构域。n 亚基有2 2 个结构域，1 9 和1 1 - 2 2 是三螺旋 重复区，第1 0 是s h 。( s r ch o m o l o g yd o m a i n3 ) 结构域，c 一端的第2 2 个结构域为钙 调素( c a l m o d u l i n ) 结合区( t r a v e ，1 9 9 5 ) ，c - 端有2 个手象结构。b 一亚基有1 9 个 结构域，n 一端是高度保守的肌动蛋白结合区，此结合区有两个相邻的c h 结构域 ( c a l p o n i nh o m o l o g y ) 组成。紧接着便是1 7 个连续的重复区。靠近c 端的几个重复 序列是锚蛋白的结合区。最后的一个结构域在c 一端为p h 结构域，仉、0 还分别有c a l p a i n 的结合区。不同的结构域在细胞信号转导中执行不同的生理功能。 4 张学琴：类血影蛋白在花粉管生长调节中的作用 图3 血影蛋白二聚体模型( m a t t e i s 等，2 0 0 0 ) 血影蛋白a 、b 亚基以头对尾的形式平行排列形成二聚体，并展示0 【、b 亚基分子上的特异结合区域：0 【亚基上有e f 手象结构域、钙调素、c a l p a i n 和s h 3 结构域；b 亚基分子上有p h 、c a l p a i n 、锚蛋白和n 端c h 、肌动蛋白、 蛋白4 1 的结构域。( i t 、b 亚基上分别有2 2 个、1 9 个重复序列。 f i g 3t h em o d e lo fs p e c t r i n0 【。bh e t e r o d i m e r ( m a t t e i s 等，2 0 0 0 ) s p e c t r i na b s u b u n i t sa n t i p a r a l l e lt of o r mh e t e r o d i m m e r ，a n d s o m es p e c i a lm o l e c u l a rb i n d i n gd o m a i n s0 nb o t hs u b u n i t s ：一s u b u n i t h a se fh a n d c a l m o d u l i n c a l p a i na n ds h 3d o m a i l 3 s ：b s u b u n i th a sp h ， c a l p a i n ，a n k y r i na n dc h ，a c t i n ，p r o t e i n4 1a tct e r m i n a l 中国农业大学博士学位论文 1 1 1 三螺旋重复序列 通过x 一射线晶体衍射和核磁共振( n m r ) 方法发现血影蛋白所有重复序列单元都 是由三螺旋结构( d j i n o v i c c a r u g o ，1 9 9 9 1g r u m ，1 9 9 9 ：p a s c u a l 等，1 9 9 7 b ) 。三螺 旋是由2 个平行的和1 个反平行的a 螺旋组成。但a 一辅肌动蛋白中连续的三螺旋重复序 列则由一个较长的0 【螺旋连接一个反平行a 螺旋。 用原子力显微镜已证实血影蛋白的重复序列还可以折叠和去折叠，这种折叠力的 大小最大为3 5 p n ( r i e f f ，1 9 9 9 ) 。因此可以推测血影蛋白及其相关蛋白构成的膜骨架在 细胞内有一个潜在的功能，也就是这些骨架蛋白很可能作为分子弹簧来贮存能量和缓 解因外界机械压力对细胞造成的伤害。 1 1 2 肌动蛋白结合区 血影蛋白b 一亚基n 一端的肌动蛋白结合区由2 个c h 结构域组成，非常保守，具有 结合肌动蛋白丝的功能。其中c h 结构域类似于平滑肌中肌动蛋白的结合蛋白 c a l p o n i n 。这种成对出现的c h 结构域都具有侧向结合肌动蛋白丝的功能。这种类似的 蛋白还有：d y s t r o p h i n ( 肌营养不良蛋白) ，u t r o p h i n ，a 一辅肌动蛋白和f i m b r i n 。最 近在p l a k i n 家族成员蛋白中也发现有这种结构，并且已证实参与肌动蛋白丝与i f s 和 m t s 的连接( y a n g 等，1 9 9 9 ；f a l x 等，1 9 9 6 ) 。 1 1 3p h 结构域 血影蛋白b 一亚基的c 端有一个p h 结构域，大约有1 0 0 个氨基酸。首次在 p l e c k s t r i n ( 普列克底物蛋白，一种血小板与白小板c 激酶的底物) 中发现，是蛋白激 酶c 的底物，存在于多种蛋白中( r e b e c c h i s s c a r l a t a ，1 9 9 8 ) 。具有p h 结构域的 蛋白在信号转导中具有重要作用，因为p i p z 和ip 3 是其作用的配体。p h 也能与脂类结 合，因此血影蛋白中的p h 结构域可以将血影蛋白直接锚定在质膜上( d a v i s 等，1 9 9 4 ) ， 同时对局部区域的质膜具有定向作用( h a r l a n 等。1 9 9 5 ) 。 1 1 4 钙调素结合区 血影蛋白一亚基在c 一端有e f 手象结构，在血影蛋白四聚体中它与肌动蛋白结合 区并列。e f 手象结构能与细胞中的c a ”结合( t r a v e 等，1 9 9 5 a ；1 9 9 5 ) 。血影蛋白和钙 调素的区别在于血影蛋白c - 端只有两个e f 结构，而钙调素n 端和c 端都含有两个e f 结构。血影蛋白结合c a ”数量取决于e f 结构数的多少，但是这种结合即使达到几百毫 摩尔水、f 也不会影响细胞原有的生理活性( l u n d b e r g 等，1 9 9 7 ) 。f o w l e r 和t a y l o r ( 1 9 8 0 ) 6 张学琴：类血影蛋白在花粉管生长调节中的作用 也发现低浓度c a + 却会影响血影蛋白与肌动蛋白间的相互作用。众多的研究表明c a 2 + 的存在对于膜骨架的稳定性具有重要作用。 1 1 5s l l 3 结构域 s i h 结构域首次发现于s r c 蛋白酪氨酸激酶，多种蛋白存在此结构域。s h 。结构域存 在血影蛋白0 一亚基和非脊椎动物的1 3 - i t 血影蛋白中( m c k e o w n ，1 9 9 8 ) 。通过突变分析 发现s h 。参与多种细胞功能，主要参与细胞内复合物形成以及酶活性的调控。通过s h 3 的介导，血影蛋白a 一亚基可以和n a 通道蛋白c 一端富含脯氨酸区结合( p a r s o n s c o t t ， 1 9 9 7 ) ，因此血影蛋白o 【一亚基可以在n a + 通道的极性分布上起作用：又因为有很多离子 通道有富脯氨酸区，所以可以推测这一作用机制在离子通道的极性分布中普遍存在。 1 2 血影蛋白异型体 迄今为止，已发现在不同物种中存在多种血影蛋白不同的异型体。在线虫( c e l e g a n s ) 和果蝇( d m e l a n o g a s t e r ) 基因组中发现含有一种a 一亚基( d u b r e u i l 等， 1 9 8 9 ) 、一种b 一亚基( h a m m a x l u n d 等，2 0 0 0 ) 和另外一种1 3 - l t 亚基( m c k e o w n ，1 9 9 8 ) 。 而且在人的细胞中鉴定出2 个a 亚基( a 。、o 【：) ( s a h r 等，1 9 9 0 ) 、4 个b 一亚基( b ，、 b2 、8a 、b 。) ( s t a n k e w i c h 等，1 9 9 8 ：b e r g h s 等，2 0 0 0 ) 和另一种t 3 一h 亚基( s t a b a c h m o r r o w ，2 0 0 0 ) 。在高尔基体中发现的b $ t * 一亚基与红细胞中b 一亚基有相似的序列 ( b e c k 等，1 9 9 4 ：s t a n k e w i c h 等，1 9 9 8 ) 。这些异型体的存在除了拥有红细胞膜骨架 最基本的功能外，还因可能其所在特定的细胞或细胞内某一特定区域执行特定的功能。 2 锚蛋白 2 1 锚蛋白的分子结构 红细胞中的锚蛋白与质膜中的带3 蛋白、与血影蛋白一肌动蛋白网络都有很高的 亲和性。锚蛋白也是一个蛋白家族，有多种异型体，这些异型体的功能较为专一，就 是作为各种膜蛋白与血影蛋白一肌动蛋白膜骨架的接头，连接质膜和胞内环境，传递 胞内外信号。 2 1 1 结构域 锚蛋白有三个结构域：n 端8 9 k d ，是膜结合区域，该区域有2 4 个由连续3 3 个氨 基酸组成的a n k 重复序列，2 4 个重复区内也有带3 蛋白和微管蛋白( t u b u l i n ) 的结合 活性：中间是6 2 k d 处是8 一血影蛋白和v i m e n t i n ( 波形蛋白) 结合区域；c 端是5 5 k d 的调节区，主要调节前两个结构域的结合活性( b i r k c n m c t e r 等，1 9 9 3 ) 。多种蛋白具a n k 中国农业大学博士学位论文 重复序列，这类蛋白有多种不同的生物学功能。它们在生长发育、细胞内蛋白的运输 ( t r i c k k l i n g ) 、细胞极性的建立和维持、信号转导以及m r n a 转录起重要作用 ( s e d g w i c k & s m e r d o n 1 9 9 9 ) 。 2 2 锚蛋白