（材料物理与化学专业论文）新型萘酰亚胺类荧光探针与核酸及其前体相互作用的研究.pdf

摘要 摘要 本文合成一系列萘酰亚胺型荧光探针( n i 、n i a d u 、n d i ) ，应用稳态与 瞬态光谱法分别研究了它们与核酸及其前体的相互作用，主要研究结果如下： l 萘酰亚胺型畔i 、n d i ) 荧光探针具有较强的紫外吸收和荧光发射，其荧 光光谱具有明显的溶剂效应和p h 效应。随着溶剂极性的增强，n i 的荧光发射 强度增大，且最大荧光发射波长发生红移；在溶液p h 值到达1 1 时，n i 探针 荧光发射最强，而后迅速减弱。 2 核酸及其前体( 碱基、核苷) 对萘酰亚胺探针的荧光具有强烈的淬灭作 用，其规律符合s t e r n - v o i m e r 线性方程，所得双分子淬灭速率常数接近速率扩散 控制范围，证明其相互作用具有电子转移的性质。核酸对萘酰亚胺型荧光探针 的淬灭能力远强于核苷及碱基，四种核酸碱基中嘌呤碱基的淬灭能力强于嘧啶 类碱基。 3 应用纳秒激光光解技术研究了n i 荧光探针时间分辨瞬态吸收光谱特性， 证实了激发态和瞬态中间体的归属。探索了n i 与b 胡萝卜素的t t 能量转移 过程，系统研究了一系列电子给体淬灭剂( 1 1 ) a 、g u a 、2 - d g u a ) 与n i 相互作 用的瞬态动力学与电子转移机理，测定了其相应的淬灭速率常数。在无外加淬 灭剂的情况下，3 n i 与n i 发生自淬灭，研究了其自淬灭反应的动力学，提出其 自淬灭电子转移机理。 4 2 _ 氨基一2 脱氧尿苷( a d u ) 对n i 稳态荧光的淬灭具有明显的微环境效 应。在c t a b 和s d s 胶束体系中的双分子荧光淬灭速率常数( 1 ( a ) 值均大于水和 t r i s 中的k 0 ，达到或者接近扩散控制范围，证明a d u 对n i 探针的稳态荧光淬 灭具有电子转移的性质。 5 设计合成了三种萘二酰亚胺和2 一氨基一2 l 脱氧尿苷共价连接的超分子 ( n i - a d u ) ，研究了分子内a d u 对n i 基团淬灭反应的瞬态动力学，提出其分子 内电子转移机理。其次，设计合成具有特殊碱基序列的发夹式寡聚核苷酸( o d n ) ， 发现o d n 对n i - a d u 超分子具有明显的荧光淬灭作用，其熔炼温度随着n i a d u 中亚甲基连接体的碳原子数目增多而升高，且均高于未加n i 以d u 时o d n 的熔炼 温度。此结果证明n i - a d u 超分子能使o d n 发夹结构变得更加稳定。 摘要 6 设计了两类八种萘酰亚胺荧光探针( n i 、n d i ) ，对其合成进行了探索和改 进，得到较为满意的结果。同时对于2 一氨基一2 叫搅氧尿苷( a d u ) 的合成进行了 改进，找到了一条适宜大量制备a d u 的合成路线。 关键词：萘酰亚胺，激光闪光光解，电子转移，荧光探针，寡聚核苷酸 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，as e r i e so fn a p h t h a l i m i d ef l u o r e s c e n tp r o b e s ( n i ，n i a d u ，n d i ) w e r es y n t h e s i z e d t h ei n t e r a c t i o n so fn a p h t h a l i m i d ew i mn u c l e i ca c i da n di t s p r e c u r s o r sw e r es t u d i e db ys t a t i ca n dt r a n s i e n ts p e c t r o s c o p y t h er e s u l t sw e r e s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 n a p h t h a l i m i d ep r o b e s ( n i ，n o i ) e x h i b i t e ds t r o n gu va b s o r p t i o n a n d f l u o r e s c e n c ee m i s s i o n a p p a r e n ts o l v e n ta n dp he f f e c to nt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f n a p h t h a l i m i d ew e r eo b s e r v e d t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fn ii n c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s eo fs o l v e n tp o l a r i t y , m o r e o v e r , r e ds h i f to fm a x i m u me m i s s i o nw a v e l e n g t h o c c u r e d t h ef l u o r e s c e n c ee m i s s i o ni n t e n s i t yr e a c h e dt h em a x i m u ma tp h = l1 ，a n d t h e nd e c r e a s e dr a p i d l y 2 t h ef l u o r e s c e n c eo fn a p h t h a l i m i d e sw a ss t r o n g l yq u e n c h e db yn u c l e i ca c i d s a n dt h e i rp r e c u r s o r s ，w h i c hi sg o v e m e db ys t e m v o l m e rl i n e a re q u a t i o n t h e b i m o l e c u l a rf l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gr a t e c o n s t a n t sw e r em e a s u r e dt ob et h e m a g n i t u d eo f10 1 0m 。1 s 1 w h i c ha r ec l o s et ot h ed i f f u s i o n c o n t r o l l e dr a t el i m i t t h i s i n d i c a t e dt h a tt h eq u e n c h i n gw a sac h a r a c t e r i s t i co fe l e c t r o nt r a n s f e r ( e t ) i n t e r a c t i o n t h eq u e n c h i n ga b i l i t yb yt h eq u e n c h e r ss h o w e dt h ef o l l o w i n gs e q u e n c e ： n u c l e i ca c i d p u r i n eb a s e p y r i m i d i n eb a s e 3 n a n o s e c o n dl a s e rf l a s hp h o t o l y s i st e c h n i q u ew a su t i l i z e dt oi n v e s t i g a t et h e t i m e - r e s o l v e dt r a n s i e n ta b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p yf e a t u r e so ft h en if l u o r e s c e n c e p r o b e s ，a n dt h et r a n s i e n ti n t e r m e d i a t e so fn 1w e r ei d e n t i f i e d t h et - te n e r g yt r a n s f e r p r o c e s sb e t w e e nn ia n d 3 - c a r o t e n ew a se x p l o r e d t r a n s i e n tk i n e t i c sa n de l e c t r o n t r a n s f e rm e c h a n i s mo fn 1w i t han u m b e ro fq u e n c h e r s ( t p a 、g u a 、2 - d g u a ) w e r e s t u d i e d t h ec o r r e s p o n d i n gq u e n c h i n gr a t ec o n s t a n t s ) w e r em e a s u r e d n ip r o b e s u n d e r w e n tt h es e l f - q u e n c h i n gp r o c e s sb e t w e e nt r i p l e ts t a t e sa n dg r o u n ds t a t e so fn l i nt h ea b s e n c eo fq u e n c h e r s t h es e l f - q u e n c h i n gk i n e t i c sw a si l l u s t r a t e d 4 s t a t i cf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fn ib y2 - a r n i n o - 2 - d e o x y u r i d i n e ( a d u ) s h o w e do b v i o u sm i c r o e n v i r o n m e n t a le f f e c t t h ev a l u e so fb i m o l e c u l a rf l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gr a t ec o n s t a n t s w e r eg r e a t e rt h a nt h a ti nw a t e ra n d i r i s t h ek qw e r e i l l a b s t r a c t c l o s et ot h ed i f f u s i o n c o n t r o l l e dr a t el i m i tw h i c hp r o v e dt h a tt h eq u e n c h i n gw a sa c h a r a c t e r i s t i co fe l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nn ia n da d u 5 t h r e et y p e so fc o v a l e n t l i n k e ds u p e r a m o l e c u l en i a d uw e r ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d t r a n s i e n tk i n e t i c so fi n t r a m o l e c u l a rq u e n c h i n gp r o c e s sw a ss t u d i e da n d i n t r a m o l e c u l a re tm e c h a n i s mw a ss u g g e s t e d o l i g o n u c l e o f i d e ( o d n ) 讯t hs p e c i a l b a s es e q u e n c ew a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h ef l u o r e s c e n c eo fn i - a d uw a s o b v i o u s l yq u e n c h e db yo d n t h em e l t i n gt e m p e r a t u r e ( t m ) r i s e sw i t ht h ei n c r e a s e d c a r b o na t o mn u m b e ro fl i n k e ri nn i a d u m o r e o v e r , t h ev a l u e so ft mw e r eh i g h e r t h a nt h a to fo d n t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h eh a i r p i ns t r u c t u r eo fo d ni sm o r e s t a b l ew i t ht h en i - a d up r o b e 6 e i g h tn a p h t h a l i m i d ep r o b e s ( n i l ，n 1 2 ，n 1 4 ，n 1 6 ，n d l l ，n d l 2 ，n d l 4 ，a n d n d l 6 ) w e r ed e s i g n e d s y n t h e t i c sr o u t e so fn ia n dn d lw e r ee x p l o r e da n d i m p r o v e d ，a n dt h es a t i s f i e dr e s u l t sw e r eo b t a i n e d i na d d i t i o n ，t h es y n t h e t i cr o u t e so f a d uw e r ei m p r o v e d ，w h i c hi sa l s os u i t a b l ep r e p a r a t i o ni nl a r g es c a l e k e yw o r d s ：n a p h t h a l i m i d e ，l a s e rf l a s hp h o t o l y s i s ，e l e c t r o nt r a n s f e r , f l u o r e s c e n c e p r o b e ，o l i g o n u c l e o f i d e i v 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：痞今辟7 - 2 0 0 6 年3 月15 。日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 年月日2 0 0 6 年3 月l5 日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 躲孝每青 g少1 矽形年月主日 第1 章引言 11 概述 第1 章引言 核酸是生命现象中不可缺少的生物大分子，它包括脱氧核糖核酸( d n a ) 和 核糖核酸( r n a ) 两大类。d n a 和州a 都是由若干核苷酸( n u c l e o t i d e ) 头尾相连 而形成，单个核苷酸是由吉氮有机碱( 称碱基) 、戊糖和磷酸三部分构成，碱基 构成核酸的侧链，戊糖和磷酸构成核酸的主链。构成核苷酸的碱基分为嘌砖 ( p u r i n e ) 和嘧啶( p y r i m i d i n e ) 二类。前者主要指腺嘌呤( a d e m i l e ，a ) 和 乌嘌岭( g u a n i n e ，g ) ，d n a 和r n a 中均含有这二种碱基。后者主要指胞嘧啶 ( c y t o s i n e 。c ) 胸腺嘧啶( t h y m i n e ，t ) 和屎嘧啶( u r a c i l ，u ) ，胞嘧啶存在 于d n a 和r n a 中。胸腺嘧啶只存在于d n a 中，屎嘧啶则只存在于r n a 中。自w a t s o n 和c r s c k 提出d n a 双螺旋结构以来，核酸尤其是d n a 的研究已有了巨大的进步。 d n a 双链依靠氢键和分子力结合在一起，呈右手和左手螺旋井因此形成了大沟 ( m a j o rg r o o v e ) 和小沟( m i n o rg r o o v e ) 1 1 1 1 2 1o 双链d n a 的外围是重复的磷酸 糖苷酯的长链，因此从核酸的表面根难获得这类大分子运动变化的信息，要获 得这些信息就必须进入d n a 的大沟或小沟中，只有这样，才能探测到碱基的存 在。 核酸也是生物遗怡信息的载体控带着蛋白质的台成和有机体细胞的机能。 其碱基的排列顺序存储并传递着相应的遗传信息，探索核酸的结构、变化，研 究核酸的损害、修复、杂交等过程对于了解人类以及各娄生物的衰老过程、遗 传和变异、寻找新的抗癌、抗衰老、抗病毒的途径以及改造生物等方面有着重 大而深远的意义。核酸的研究已有一百多年的历史。早在1 8 0 8 年，瑞士的一位 第1 章引言 青年科学家f m i e s c h e r 从外科绷带上脓细胞的细胞核中分离出了一种有机物质， 即为我们今天所知的脱氧核糖蛋白。核酸的生物学作用是在发现核酸以后7 0 多 年才被证明的，这就是1 9 4 4 年由a v e d ，等所完成的著名的肺炎球菌转化试验。 这一发现大大推动了对核酸结构和功能的研究。由于真核生物的遗传信息完全 来自于d n a ，因此对d n a 的研究也多于r n a t 引。核酸作为生物活性大分子具 有其脆弱性，很易受到损害，核酸的损害会造成非常严重的后果，人体虽然对 核酸的损害具有定的修复能力，但有很多不能修复的损害会造成核酸的变异， 如核酸碱基的缺损或者由于核酸的损伤造成核酸链的断裂都会产生癌变、衰老、 遗传疾病甚至细胞死亡等等。人体遗传物质被破坏会造成对人体健康的危害， 而对癌细胞、病毒、细菌的遗传物质进行破坏导致其死亡，则能产生杀菌消毒 及抗癌的作用，人们正在针对这一机理进行大量的抗病毒抗癌药物的研究。 近来研究表明，核酸易与许多内、外源光敏分子发生多种作用，从而引起 核酸链的断裂。这种核酸光断裂从严格意义上说分为两种，一种是光断裂剂以 激发态的形式直接与核酸反应，从而引起核酸主链的直接断裂，在反应过程中 这种光断裂剂只是起催化剂的作用，并不会被消耗掉。但是大多数光断裂剂受 激发后，会产生一些活性中间体，例如自由基，碳正离子等，随后引起一系列 光化学反应，但是并不会直接导致核酸的断裂，这些核酸需经过热的哌啶或苯 胺等的二次处理，才能完全揭示其受损伤的位置和程度。 尽管内源光敏分子即天然核酸光断裂剂在很多方面极为有用，但由于他们的 分子较大，其核酸序列识别的范围有限，限制了他们的广泛使用。这促使化学 家研究更为实用的人工合成的核酸光断裂剂。人工合成的光断裂剂具有较好的 光化学活性和选择性，其激发波长通常在3 0 0 嫩以上，在这种情况下，大多数 蛋白质都不会受到影响，在很大程度限制了副反应的发生。同时，人工合成的 光断裂剂也具有较理想的核酸序列识别性，他们与核酸特定位置的优先亲和力 及其在某位置上的活性优势，都会引起核酸的选择性断裂。因此，实现人工合 成的小分子与d n a 特定碱基序列的识别是化学、生物学和药学领域关注的焦点 之一。 1 2 核酸荧光探针的研究进展 核酸与外源作用物有多种复杂的相互作用，例如氢键形成、折叠、静电作 2 第1 章引言 用、范德华作用等。正是由于核酸的双螺旋结构，从核酸的表面很难获得这类 大分子运动变化的信息，要获得这些信息就必须进入d n a 的大沟或小沟中，而 荧光探针方法是研究这种相互作用的有效方法之- - 4 1 。荧光法具有极高的灵敏 度。在激光作激发光源时，所需样品溶液可小至l g l ，检出限可达1 0 叫6 1 0 1 4 9 【5 】a 核酸探针主要分为放射性同位素核酸探针和非放射性同位素核酸探针两大 类。早期的d n a 研究方法多是用放射性同位素核酸探针，常采用q3 2 p ，”s 和3 3 p 来标记【6 j 。放射性同位素核酸探针具有很高的灵敏度，且对生物体系微扰很小， 但同时也存在很多难以克服的弊端，如由于衰变，放射性物质的有效期很短； 元素的放射性对环境不敏感，对d n a 构象变化无能为力；同时，放射性对生物 体也存在潜在的损害等，这些都很大程度上限制了放射性同位素核酸探针在生 物研究中的应用。而在非放射性同位素核酸探针中，荧光探针以其信号强、寿 命长等优点愈来愈引起人们的关注。荧光法通常是非破坏性的，甚至可以对单 个活细胞进行研究。如果荧光光谱仪与电子计算机连用，则可准确测量快速的 荧光变化( p s 至f s ) ，从而实现对化学反应的实时监测。荧光光谱提供的信息 量也比较大，例如激发光谱，发射光谱，荧光光谱，荧光强度( i ) ，量子产率 ( ) ，荧光寿命( c ) ，荧光共振，淬灭速率常数( k q ) 等。其次，荧光对环 境十分敏感，这对研究核酸这类具有复杂微环境的大分子来讲十分有利。核酸 具有很弱的内源荧光，激发波长是2 6 0n m ，而荧光团的激发波长一般要远大于 这一波长，故直接用荧光光谱很难研究核酸的变化，这为荧光探针的使用提供 了有利条件v j 。 核酸探针根据荧光团是否与核酸链相连，可分为共价探针和非共价探针两 类。其二者的作用原理相似，都是由于与不同的环境作用而产生不同的荧光信 息。非共价探针的使用方法较共价探针简单得多，只须向一定的核酸溶液中加 入特定的荧光物质，并研究各种荧光参数的变化，就可以得到所需要的信息。 但是由于这种方法所能提供的信息较少，而使其应用主要限制于探针性质的初 步研究和筛选上。共价探针是目前应用最广泛的核酸荧光探针使用方法。这种 方法大致也可以分三类：一类是在磷酸糖苷链上接入一个外来的生色团；第二 类是在糖基上接入一个生色团；第三类是对碱基进行修饰，接上一个荧光团或 接入取代基使其自身荧光得以加强。l ep e c q 等人最早应用共价探针的方法心j 。 他们将一个乙锭( g t h i d i u m ) 分子( 图1 1 ) 接到一条寡聚核苷酸链上，并用它 第1 章引言 作为探针研究去研究d n a 。乙锭本身荧光较弱，在与核酸结合后，与核酸的长链 发生了荧光共振能量转移( f r e t ) 使乙锭荧光得以大大加强，这一加强了的荧 光还会被核酸碱基所淬灭，淬灭程度随乙锭与碱基之间的距离以及碱基的种类 的不同而变化。这一对环境的高度敏感的性质，使它可以提供相对较多的信息， 从而使它得到了广泛的应用。直至近期仍有一些研究者在用这一探针在探索d n a 中电子转移及d n a 的损害 9 , 1 0 】。 在乙锭之后，其它的一些荧光团组装的探针也被广泛地加以研究，其中有 芘( p y r e n e ) i n 】，吖啶( a c r i d i n e ) 及其衍生物【1 2 1 ，藏红t ( s a f r i n d i n et ) ， 吡啶及噻唑类，噫唑类等芳环或杂环化合物【1 3 1 8 1 。另外还有许多过渡金属如r u ， 尤其是镧系金属的配合物【1 9 ，2 们。这些荧光体均被尝试用于核酸的研究分析中。 但因为研究核酸的损害，核酸中的电子转移等需要，原位杂化( i ns i t u h y b r i d y z a t i o n ) 应用的更为广泛。 n h 2 e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) h 3 h 2 r u 图1 1 几种常见核酸荧光探针 4 二g r ut r i b i p r y d i n a t e 第l 章引言 糖基修饰的核酸探针也曾被广泛研究过，并曾在核酸与蛋白质相互作用的 研究中起过重要作用f 圳，这种修饰被认为比较接近于其母体核苷酸和核酸的行 为，并得到了证明当与这种蛋白质酶作用时，2 ，3 一羟基是伸出在碱基部位 之外的。p 2 1 h - r a s 与不可被水解的一个核苷酸衍生物一一邻甲氨基苯甲酰 ( m a n t ) 取代的g d p ( 二磷酸鸟苷) 相作用的催化部位晶体结构的研究表明m a n t 位于蛋白质的表面。 h i r a t s u k a 和u c h i d 最早使用了核糖修饰的荧光核苷酸，他们合成了2 ，3 一 0 - ( 2 ，4 ，6 - t r i n i t r o c y c l o h e x a d i e n y li d e n e ) a d e n o s i n a 一5 一t r i p h o s p h a t a ( t n p a t p ) ( 图1 2 ) ，这是一对互变异构体的混合物。h i r a t s u k a 随后又使用了腺 苷酸和鸟苷酸的2 。( 3 ) 一o - a n t h r a n il o y l ( m a n t ) 和m e t h r a n il o y l ( m a n t ) 衍生物 【2 l 】。选择这类荧光团的一个重要因素是它们相对较小的体积( 使得核苷酸与蛋 白质成键时受到的微扰要小) ，和它们对于环境的极高的敏感性。它们被广泛的 应用于众多研究系统中5 一三磷酸核苷酸及酯酶的研究。 图1 2t n p - a t p 的互变异构 n n 0 2 此后，带有其它荧光团的核菅酸也陆续被合成并得到广泛应用。o n u r 等利 用咪唑化的羧酸来酰化核苷酸2 ( 3 ) 一羟基的方法引入了荧光团田l ， g r e m o 等 第1 章引言 利用氨基甲酰基链，将荧光团接在糖基上】，h i l e m a m 等合成了用荧光素和罗丹 明来标记戊糖的核苷酸【2 4 】； 2 一氨基一2 一脱氧和3 - 氨基一3 f _ j 搅氧核苷酸的合成也 提供了一类新型荧光核苷酸。 l e o n a r d 等人最早对核酸碱基进行了修饰。他们合成了“e t h e n o 系列。其 中最常用的是l - n 6 一e t h e n o a d e n o s i n e 【2 5 ，2 6 】( 图1 3 ) 。利用这一方法，l e o n a r d 与其合作者进行了大量的研究工作。此后，一些对碱基进行的更为保守的改造 工作也有了一些进展，例如以间型霉素( f o r m y c i n e ) 代替正常的核苷( 鸟苷) 与磷酸相结合，形成的间型霉素磷酸酯( f o r m a yc i n ep h o s p h a t e ) ，和2 l 氨基 嘌呤核苷酸( 图1 3 ) h 1 一n 6 - - e t h e n o a d e n o s i n e o 一o p i o 1 - - n 6 - - e t h e n o a d e n o s i n e 6 o _ 卞 d 第1 章引言 n 2 一氨基嘌呤核苷酸 图1 3 具有荧光的修饰核苷酸 n h 2 都被作为荧光探针研究核酸同蛋白质的相互作用【”1 。s k a l s k i 等人合成了一种修 饰碱基的核苷 2 8 , 2 9 】，并用作为荧光探针，研究了一些具有特定顺序的单链 o “ 一c 卜p i o 妙 i 图i 4r u 的联吡啶类配合物修饰的核苷酸 ( s i n g l es t r a n d ) 、双链( d o u b l es t r a n d ) 核酸。这种方法虽然直接，但是由 于碱基的修饰，直接破坏了核酸形成二、三、四级结构所需的氢键，从而影响 所获得的核酸信息的真实性。由于碱基修饰将破坏d s d n a 赖以稳定的氢键， 因此，一些改进方法便应运而生。 9 0 第1 章引言 r = n 丫n h r ( a ) h n n h r 。( b ) h 八n h r ( c ) 图1 5n l - - c a r b o x y m e t h y l 一4 一t h i o t h y m i n e g r i n s t a f f 等合成了一系列的以r u 的联吡啶类配合物修饰的核苷酸( 图 1 4 ) 3 0 , 3 1 1 ，而c a r o l es a i n t o m e 等人则利用长链将一个 n - l - c a r b o x y m e t h y l - 4 - t h i o t h y m i n e ( 荧光团) 接到碱基上【3 2 】( 图1 5 ) 。这种 修饰在d n a 双链上，荧光团伸入到大沟中而不影响碱基间氢键，因而，其所形 成的微扰在上述的各类修饰中微扰最小，但仍造成一些重要信息的丢失。 除了有机小分子核酸荧光探针，金属离子及金属络合物核酸荧光探针也是 一类比较重要的荧光探针。金属离子主要涉及到稀土金属，如t b ( i i i ) ，e u ( i i i ) 3 3 - 3 5 】等，是基于稀土离子本身的发光特性，由此可提供有关d n a 及其组成的信 息。当核酸的三线态与稀土离子激发态能量相匹配时，可发生从核酸到金属离 子的能量转移。金属络合物荧光试剂大多是过度金属元素配合物。反应是基于 络合物结构的发光性质探测d n a 的二级结构，其中配体多与n - n 原子进行络合， 主要由菲罗啉、联吡啶及其衍生物与钌( i i i ) 、钻( i i i ) 、锌( i i i ) 等金属离子形 成的络合物。另种金属络合物( 荧光试剂是稀土的胺羧化合物) ，可作为核酸 的扩散控制无辐射能量转移荧光探针，如l a ( i i i ) ，y ( i i i ) ，a i ( i i i ) ，s c ( i i i ) 等 8 一羟基喹啉形成络合物，二乙三胺五乙酸( d t p a ) 、4 ，7 一而氯磺基苯一1 ，l o 一菲罗 第1 章引言 啉一2 ，9 一二羧酸( b c p d a ) 、n 一( 2 一羟乙基) 乙二胺三乙酸( h e d 3 a ) 等与铕( i i i ) 、 铽( i i i ) 等稀土离子形成的络合物可用与探查核酸的左右手螺旋及核酸的含量。 1 3 分子间相互作用及其研究方法 随着现代分子生物学和生物分子技术的发展，科学已经证实核酸与外源作 用物之间存在有多种复杂的相互作用，如氢键作用、折叠、静电作用、范德华 作用等，这些基本上属物理性质作用。荧光探针与核酸的相互作用除物理性质 作用外主要可归结为能量转移作用( e n e r g yt r a n s f e r ) 和电子转移作用 ( e l e c t r o nt r a n s f e r ) 。核酸前体包括核酸碱基、核苷及核苷酸是核酸的基本结 构单元，它们与核酸的结构和功能密切相关，近来核酸与核酸前体参与的电子 转移作用成为新的研究热点，这种化学作用最终可导致核酸主链和碱基侧链的 断裂【3 6 , 3 7 】，因而受到广泛重视p 8 枷】。 近年来电子转移反应( e l e c t r o nt r a n s f e r ，e t ) 的研究十分引人注目，它目 前已成为现代化学的重要领域之一。许多重要的生命过程( 包括绿色植物的光合 作用，生物体内的2 0 0 多种氧化还原酶参与的新陈代谢等) ，太阳能的储存和利 用，分子器件( m e d ) 研制等都涉及到e t 过程。 e t 过程包括初级电子转移和次级电子转移。激发单重态( 1 s e n s * ) 或激发三重 态( 3 s e n s * ) 从反应底物分子( d ) 中夺取一个电子后形成电荷转移络合物 c t c ( c h a r g et r a n s f e rc o m p l e x ) 的过程是初级e t 过程；初级e t 过程中形成的 自由基离子非常活泼，能与其它物种( 如0 ：) 等进一步发生电子转移，这一过程 是次级e t 过程。现已证实芳香氰化合物( 如9 ，1 0 一二氰葸d c a ) 和带正电荷的芳 杂环化合物( 如1 ，3 ，5 一三苯基吡喃硼氟酸盐t p p + ) 是两类较好的e t 吸电子型敏化 剂，借助现代研究方法，可提供电子转移过程的直接或间接证据，使电子转移 理论有了较大的发展，图1 6 表示了一种常见的光诱导电子转移过程。 初级e t 能否顺利进行与溶剂的极性和光敏剂的性能有很大的关系。极性溶 剂能有效分离电荷，利于发生初级e t 过程：而非极性溶剂中电荷不易分离，而 易发生电子回传( 逆e t 过程) ，重新回到反应物，这是一个耗能的过程，因此如 何阻止或减少这类电子回传，促进离子对中正、负离子自由基的分离，从而提 高电子转移过程的效率已成为近期光诱导电子转移研究的中心课题之一【4 1 1 。 第1 章引言 s + d s + d 图1 6 光诱导电子转移作用 产物 分析方法的发展与仪器的应用与发展是密切相关的。近几十年来，在物理 等基础学科的迅速发展和影响下，随着激光、微处理机和电子学的新成就等一 批新的科学技术的引入，都极大的促进了分析方法在理论研究方面的迅猛进展 及其研究手段的多样化发展。稳态荧光分析法、瞬态激光闪光光解法、紫外可 见光普法以及电化学方法都是近代发展起来的研究分子间相互作用的重要方 法。 1 3 1 稳态荧光法 荧光光谱法在生物研究中有广泛的应用。由于核酸内源荧光很弱，无法将 荧光技术直接应用于核酸结构和性质的研究中，而必须引入荧光探针。荧光衍 生法为研究核酸提供了灵敏探针，但方法繁琐、操作费时。基于核酸对小分子 探针的荧光增强或减弱作用进行核酸研究和分析的方法，因操作方便、。快速， 在众多的核酸分析方法中，其发展之快、涉及范围之广是其它方法无可比拟的。 荧光淬灭方法常用于研究分子间电子转移过程【4 2 j 。利用这种方法可以深入 了解生物大分子内许多的光化学和光物理过程。荧光淬灭方法分为稳态和动态 荧光淬灭两种。前者是测定荧光强度随淬灭剂浓度 q 的变化情况；后者测定荧 光寿命( t ) 受淬灭剂浓度 q 的影响。通过s t e r n v o l m e r 关系式求出的淬灭速 率常数k 来判断分子之间的相互作用途径。 荧光淬灭的途径有两类：能量转移和电子转移。早期的荧光淬灭研究主要 着重能量转移，这与所用的三线态敏化剂有关。八十年代，由于时间分辨闪光 光解技术、荧光淬灭及化学诱导核极化( c i d n p ) 技术的广泛应用，电子转移理论 有了很大的发展1 4 引，特别是m a r c u s 由于提出电子转移动力学理论并为后来实验 1 0 第1 章引言 所证实 4 4 1 ，因此获得1 9 9 3 年诺贝尔化学奖。 通过荧光淬灭技术可以帮助我们进一步了解电子给体与电子受体之间或能 量给体与受体之间的相互作用过程和机理。电子转移淬灭是指电子从给体的占 用轨道跃迁到受体的未占用轨道后引起其荧光强度和荧光寿命的降低。判断淬 灭过程是能量转移还是电子转移过程，大致可以从一下几个方面来判断：( 1 ) 如 果能量受体比能量给体的能量大3k c a l m o l 以上，即敏化剂的激发波长与淬灭剂 的吸收曲线没有重叠，并且其荧光发射曲线不与淬灭剂的吸收曲线发生交盖， 则不可能发生能量转移； ( 2 ) 根据r e h m w e l l e r 公式中电子给、受体间e t 的自 由能变化( z x g ) 值来判断e t 是否是热力学上有利的过程；( 3 ) 电子转移要求给、 受体间的有效距离小于或等于1 0 a o ，其淬灭速率常数接近扩散控制( 1 0 1 0 m o s o ) ； 而能量转移淬灭发生在1o 1 0 0 ，淬灭速率常数般小于扩散控制速率常数。 1 3 2 激光闪光光解方法 激光闪光光解是定性或者定量的研究光化学过程中的激发态和中间体的强 有力的工具，它是利用一定强度的激发光入射到所研究的样品体系中，然后用 动力学检测系统记录下被激发的样品体系随时间的演变过程。在激发光的作用 下，生物分子、有机分子能产生很大数量的电子激发态分子及其它短寿命中间 体，如果浓度足够大，就可以用光谱来检测，并通过适时跟踪浓度随时间的衰 变过程来研究反应的动力学过程。 闪光光解技术最早是由n o r r i s h 和p o r t e r 于1 9 4 8 年发展创立的【4 5 ，46 1 。当时 由于激光尚未出现，激光一般采用大功率氙灯作为闪光光源，其脉宽为微秒量 级，因而仅适用于研究大于微秒量级的动力学过程。不过在当时，这种开创性 的快速的光激发手段可以产生高浓度的瞬态中间体，从而参加不同的快反应过 程。因而这种技术为研究快反应提供了极大地便利【4 7 ，4 羽。而n o r r i s h 和p o r t e r 二人因为对于人类更深刻地理解动力学和化学变化作出了巨大的贡献，从而于 1 9 6 7 年获得了诺贝尔化学奖。 通常情况下，对光化学反应期间产生的中间体的检测，所用的方法很大程 度上取决于被研究物质的寿命，寿命较长的物质( 1 0 1s 一1 0 2s ) 可以通过直接照 射放在光谱仪样品池中的样品来观察，不稳定的中间体，在低温下进行光解后， 检测生成物的光谱或化学特征是可能的，但是这种技术的实用性受到中间体次 第1 章引言 级反应速度对温度的依赖关系的限制，且温度过低，实验操作和观察也会有很 大困难。而常温下，分子被激发后，从基态s o 激发到电子激发态s 。以后，分子 内或分子间所发生的一系列动力学过程属于快速过程，观测这些过程的实验光 谱方法包括：瞬态吸收，瞬态荧光和瞬态拉曼光谱等，本文所着重强调的以激 光作为激发光源的闪光光解技术是在室温下研究短寿命中间体( 1 0 。6s i o 以2s ) 的最强有力的工具之一。 1 3 3 紫外可见光谱法 紫外可见吸收光谱是研究小分子与核酸相互作用的一种最方便、最常用的 技术。小分子与核酸的相互作用会引起吸收带的红移( 蓝移) 现象或增色( 减色) 效 应。根据l o n g 理论，吸光度减小、吸收带红移、等吸收点的形成是小分子与 d n a 发生嵌插作用的标志。传统的核酸分析方法是建立在碱基共扼双键在2 6 6 n l n 处的最大紫外吸收基础上的分光光度法，这种分析方法简单、准确，但是一 般适用于纯样品( 无显著的干扰) 的分析测定。也有利用d n a 与吲哚或二苯胺试 剂进行一系列的衍生化反应后再进行分光光度法的测定，但是这些方法存在操 作繁琐或灵敏度低、条件苛刻等缺点。l i n g 等人研究了钌与邻菲咯啉以及联吡 啶形成的一系列配合物与d n a 作用后的紫外可见吸收光谱，发现它们在不同峰 值发生不同程度的减色效应，并且有明显的红移现象，表明这些配合物的证明 与d n a 作用的模式是嵌入式。 1 3 4 电化学方法 采用电化学方法研究其它分子与d n a 的相互作用，可以用于研究一些由于吸 收光谱比较弱或电子跃迁谱带与d n a 发生重叠而无法用紫外或可见等方法研究 的分子，用直接或间接伏安法方便的研究【4 弘”j 。 电化学方法作为一种直接检测电信号的方法成为d n a 的电子传递特性的重 要方法之一。b a r t o n 小组采用循环伏安法研究了以道诺霉素作为电子受体而以 固定双链d n a 的金电极作为电子给体研究d n a 的电子传递特性。发现没有距离 的依赖性而受碱基堆积的影响，h a r t i c h 等也采用循环伏安法研究在金电极上 d n a 薄层的电子传递性质，认为有序的d n a 可以传递电子或空穴，而随机无序 的d n a 则不能。计亮年等采用循环伏安法( c v ) 研究比较了一系列钴( 1 1 1 ) 多 1 2 第1 章引言 吡啶配合物与d n a 之间的相互作用【5 2 】。 1 4 本课题的设想 大量研究已经证实核酸光化学损害的主要部位之一是核酸碱基，特别是鸟 嘌呤由于其氧化电位值在四个碱基中最低而最容易受到损害。核酸碱基的变化 可能是导致基因突变和物种变异的一个重要原因，因此对核酸碱基的光动态损 害机理的深入研究具有重要的理论和实际意义。为了能够正确地解释核酸光化 学损害的原因，进而将其运用到医疗事业解决医学难题，推动着我们努力探索 核酸光断裂反应的机理。光断裂剂究竟在什么位置上进攻核酸，又是通过什么 途径促使核酸发生光断裂反应，很多情况下仅仅是由分析核酸断裂产物而得的， 因此，进一步研究核酸的光断裂途径，毫无疑问在设计、合成新型的核酸光断 裂剂，以用于改善现有的抗生素等化学药剂方面具有广泛而深远的意义。萘酰 亚胺类化合物具有良好的抗癌性能及抗免疫缺陷( h i v - i ) 性能【5 3 。5 6 1 ，并且具 有独特的荧光及瞬态吸收特征，是典型外源核酸荧光探针之一，在生 物化学和医学的领域内的应用近来引起注意 5 7 , 5 8 。 同时，鉴于这类化合物的三重态量子产率接近1 ，及其良好的荧光特性，因 此，研究这类探针的瞬态与稳态光化学特性对核酸化学研究具有重要的学术意 义。因为这个系列的衍生物不仅是目前发现的较有发展前途的抗病毒前体，而 且有可能用于核酸损害机理的研究。然而对于萘酰亚胺类荧光探针与核酸之间 的相互作用研究则少见