（生物医学工程专业论文）胆固醇改性普鲁兰多糖自组装载药纳米粒子的研究.pdf

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a g g r e g a t e dn a n o p a r t i c l e so f c h o l e s t e r o l - b e a r i n gp u l l u l a n a b s t l a c t p o l y s a c c h a r i d e sa r eh i 曲1 ys t a b l e ，s a f e ，n o n t o x i c ，h y d r o p h i l i c ，b i o d e 伊a d a b l e ， a b u n d a n tr e s o u r c e si nn a t u r ea n dl o wc o s ti nt h e i rp r o c e s s i n g h y d r o p h o b i c a l l ym o d i f i e d p 0 1 y s a c c h a r i d e s ，a l s on a m e dh y d r o p h o b i z e dp o l y - s a c c h a r i d e s ，a r ea m p h i p h i l i ci nn a t u r e d u et ot h e j rh y d r o p h jj i cb a c k b o n e sa n dh y d r o p h o b i cp e n d a n t s d u et oa b o v eo u t s t a n d i n g m e r i t s ，m o d i f i e dp 0 1 y s a c c h 撕d e sh a v er e c e i v e dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o ni nt h ea r e ao f d r u gd e l i v e r ys y s t e m s w eu s es u c c i n i ca c i da n d1 ，6 一h e x y ld i i s o c y a n a t es y n t h e s i z i n g c h s pa n dc h d pb y d i r e c t l y 伊a r i n gp r o p e r c h o l e s t e r o lr e s i d u e so n t od i f 诧r e n t m o l e c u l a rw e i 曲tp u l l u l a n t h i sd i s s e r t a t i o na l s os t u d i e dt h e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e nl e n 醇h o ft h el i n ka n ns y s t e m ，c h o l e s t e r o l - b a s e dd e 伊e eo fs u b s t i t u t i o n ，m o l e c u l a rw e i 曲to f p u l l u l a na n dp r o p e r t i e so fn a n o p a r t i c l e s t h em a i nc o n t e n to ft h i sr e s e a r c ha r es h o w na s f o l l o w s v a o u sc h 0 1 e s t e r 0 1 - b e a r i n gp u l l u l a n s ( c h d pa n dc h s p ) w i t hd i f f 打e n tm 0 1 e c u l a r w e i 曲t so fp a r e n tp u l l u l a na n dd e 伊e e so fs u b s t i t l j t i o n ( d s ) o fc h o l e s t e 聊m o i e t yw e r e s ) ，n t h e s i z e da n dc h a r a c t 舐z e db yf o u n e rt r a n s f o m li n f r a r e d ( f t i r ) ，p r o t o nn u c l e a r m a 朗e t i cr e s o n a n c e ( hn m r ) ，a n dx r a yd i 绗a c t i o n ( x r d ) h ed e g r e eo fs u b s t i m t i o n ( d s ) o fc h o l e s t e r o lm o i e t yd e t e 胁i n e db y 1hn m r b e t w e e n5 2a n d3 9c h o l e s t e r o l g m u p sp e rh u n d r e dg l u c o s eu n i t s c h s pa n dc h d ps e l f a g g r e g a t e dn a n o p a r t i c l e sw e r e p r 印a r e db ya n a l y z e di na q u e o u sm e d i aa n db yp r o t o nn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( 1h n m r ) ，d ”a m i cl a s e rl i 曲t s c a t t e r i n g ( d l s ) ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c 叩y ( t e m ) a n dt h en u o r e s c e n c ep r o b et e c h n o l o 百e s c r i t i c a la s s o c i a t i o nc o n c e n t r a t i o n ( c a c ) w a s s t l l d i e db yf l u o r e s c e n c ep r o b em e t h o d c h s pa n dc h d ps e l f a g g r e g a t e dn a n o p a n i c l e s h a da r o u 曲l ys p h e r i c a ls h a p e ，d i a m e t e ro fc h s pp a n i c l ei s4 5 2 0 5n ma n dd i 锄e t e ro f c h d pi sb e t w e e n4 0n ma n d10 5n m w i t ht h ed so fc h o l e s t e 州m o i e t yi n c r e a s e d ，t h e d i a m e t e r o ft h e n a n o p a r t i c l ei n c r e a s e d ，c r i t i c a lm i c e i l ec o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e d m o l e c u l a rw e i 曲to fp u l l u l a nh a sn o t h i n gt od ow i t ht h es i z ec h a n g e w i t ht h el e n 百ho f t h el i i l | ( a r md e c r e a s e d ，c r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e d ，t h ed i a m e t e ro ft h e n a n o p a r t i c l ei n c r e a s e da n dt h es t a b i l i t yo ft h en a n o p a r t i c l ee n h a n c e d d o x o m b i c i n ( d o x ) a n dm i t o 煳n t r o n e ( m t o ) w e r e1 0 a d e di n t ot h ec h s pa n d c h d p n a n o p a r t i c l e sb yd i a l y s i sm e t h o d d o x - l o a d e dc h s p s e l f - a g 皂歹e g a t e d 3 巾 父7 ：f ：卜7 | 玩北京协雨j 跃学院硕十学位论文 n a n o p a r t i c l e sw e r ea l m o s ts p h e r i c a li ns h a p ea i l dt h e i rs i z er a n g 矗o ml4 0 5t o3 0 8 3n m ， l o a d i n gc a p a c i t y ( l c ) o f t h en a n o p a r t i c l e sr a n gf r o m8 8t o18 6 d o x l o a d e dc h d p s e l f a g g r e g a t e dn a n o p a r t i c l e sw e r ea h n o s ts p h 甜c a li ns h a p ea n dt h e i rs i z er a n g6 7 0 ml0 4 t o3 6 8 1 啪，l o a d i n gc a p a c i t y ( l c ) o ft h en a n o p a n 池sr a n g 行o m9 3t o1 6 7 x r d p o w d e rp a t t e m ss h o w e dt h a tc r y s t a lp e a k so fd o xd i s a p p e a r e dw h e nd o xw a s e n t r a p p e d i n t oc h s pa n dc h d pn a n o p a r t i c l e s l o a d i n gc a p a c i t y( l c ) o ft h e m t o l o a d e dn a n o p a n i c l e sw a sh i 曲e rt h a nt h ed o x l o a d e dn a n o p a n i c l e si nm es a m e f e e dr a t i o l o a d i n gc a p a c i t y ( l c ) o ft h en a n o p a r t i c l e sd e c r e a s e da n dt h es i z eo fl o a d e d - n a n o p a n i c l e sc h a n g e dg r e a t l yw i t ht h el i n ka m ll e n 百hi n c r e a s e di nt h es a m ef e e dr a t i o ， d e g r e eo fs u b s t i t u t i o na n dm 0 1 e c u l a rw e i 曲tp o l y s a c c h 撕d e s t h ei n v i t r or e l e a s eo f d o xa n dm t 0 一l o d a e dc h s pa n dc h d pn a n p a r t i c l e sd e m o n s t r a t e dt h a tt h er e l e a s e b e h a v i o ro fd o xa n dm t oe x h i b i t e dat w o - p h a s ep a t t e mc h a r a c t e r i z e db yaf a s ti n i t i a l r e l e a s e ，t h e nas l o w e ra n dc o n t i n o u sr e l e a s e m o r e 邵 p a r e n ts l o wr e l e a s eo fd o x t h e f a s ti n i t ia lr e l e a s ed e c r e a s e da n dt h es l o wr e l e a s ep a t t e mi n c r e a s e dw i t ht h el i n ka m 1 e n 蛋hd e c r e a s e d d o xa n dm t or e l e a s er a t e d e c r e a s e dw i t ht h ep hi n c r e a s eo ft h e r e l e a s em e d j a k e y w o r d s ： c h o l e s t e r 0 1 - b e a r i n gp u l l u l a n ；l i m 【a n n ；s e l f - a g g r e g a t e dn a n o p a r t i c l e s ； d m gd e l i v e r ys y s t e m 4 第一章绪论弟一早三百下匕 药物缓控释载体能够有效改善难溶药物的口服吸收，延长药物的作用时间，提 高药物的稳定性，降低其毒副作用，增加药物的生物利用度和在靶向部位的浓度等， 因而受到国内外的广泛关注。目前，研究较多的药物缓控释载体主要有微球、微胶 囊、囊泡、脂质体和胶束等。 1 1 药物缓控释载体 1 1 1 微胶囊微球 微球和微胶囊是一种有擘膜的微型容器，是将活性物质等包覆在其中所形成半 透或密封的微囊，因此它有许多独特的性能【l 】：能改善物质的物理状念，如将液态 物质转变为固态物质；改善物质的表面性质【2 3 】；隔离易起变化的物质以便长期保 存；调节控制释放速度，控制挥发、溶解、发色时f u j ；将有毒、有味等物质与环境 隔离；用于特殊目的的不相容物质的分离。目自订，微囊微球的应用研究主要涉及生 物医学工程、药物控制释放、农、世、化工等领域。 蛋白质和多肽类大分子物质( 如生长激素、胰岛素、干扰素等) 以及其它药物 ( 如抗生素、抗癌药以及诊断药剂等) 由于在治疗多种难以治愈疾病的过程中表现 出药理作用强、副作用少等特点而备受关注。然而由于此类药物的稳定性差，采用 传统的口服方法在人体胃肠道内易被酶分解，所以目前多限于注射给药，而且需要 多次注射以维持疗效。将其微囊化能最大程度地保持药物的生物活性，并且可通过 调节壁厚度和孔径以达到控释或缓释的目的。近年来利用可生物降解且生物相容性 良好的聚合物材料作为药物载体束制备微囊取得了很大的进展1 4 j 。例如y i y 0 u h u a n g 等【5 】采用凝聚法制备载有利多卡因的p l p e g 微囊微球。亲水性的p e g 嵌 于p l a 中，可提高p l a 的降解速率，降低降解产物的酸性，增强聚合物载体的亲 水性。另外，在共聚物中引入亲水性的p e g 连段，可以增加药物在聚合物载体中 的分散效果，不仅可改善载体制备工艺条件，而且可增强p l a 对药物的包裹作用。 用此载体制备的微囊微球具有多孔性，其药物释放速率高于p l a 均聚物微球。 n b a d r iv i s w a n a t h a n 等【6 】以乳酸和羟基乙酸的共聚物( p l g a ) 为壁材，以牛血清 白蛋白( b s a ) 为芯材，采用w o o 乳液蒸发技术制备p l g a 微球。由于使用有 机溶剂( 液体石蜡) 作为连续分散介质，牛血清白蛋白在连续相中的损失很少，所 制备微球的包封率超过9 0 。并且制备的微球表面光滑无孔，在进行体外释放实验 中，可以明显地降低药物微囊释放初期的突释效应，使其能长期保持疗效。b ib o t t i c y o u a n 等【7 】分别以乳酸与乙交酯的共聚物( p l g ) 和聚( 己内酯) ( p c l ) 为 壁材，采用( o o 例) 溶剂蒸发技术制备了包含b s a 油性芯材的微囊。其制备过 5 中陕学科院北京协雨i 跃学院硕十学位论文 程是将b s a 分散于角鲨烯中形成有机相，然后加入聚合物的溶液中进行乳化，形成 o o 乳液，再将o 0 乳液加入浓度为0 7 5 的聚乙烯醇( p v a ) 溶液中，形成o o 八 型乳液，在常温常压下蒸发除去有机溶剂，形成微囊。由于p l g 和p c l 的降解速率 缓慢，可以进行蛋白质长期控释的研究。在4 下，包囊内的蛋白质能够在6 个月 内保持稳定，均匀释放。 蕾彝物质 绁鹁 他溺产物 图1 1 微胶囊示意图 f i g u r el - ls c h e m a t i cd i a 黟a mo f m i c r o c a p s u l e s 1 1 2 囊泡 囊泡( v e s i c l e ) 是两亲分子有序组合体的一种形式，是由闭合的双分子层所形成 的球型或者椭球型的缔合结构，有单层囊泡( s u v ) 和多层囊泡( l m v ) 。在生命科学 界，囊泡作为细胞膜的最好的模拟体系受到人们极大的关注【8 】。 囊泡所具有的双层膜结构使其成为潜在的理想体内药物载体，既可以携带水溶 性药物( 如氨基酸、多肽、蛋白类药物) ，将药物包封在微水相内，也可以携带油溶 性药物，将药物增溶在双层膜中。与胶束、微乳液相比，囊泡体系作为药物载体有 如下特点：增溶量更大；双层膜具有更强的牢固性和稳定性；比表面大，可通过组 成、p h 、盐来调节粒径的大小和药物分子的渗透率。 箩，07 “、孑7 謦，_ ，碜 卜一700 誓誓，够囊 一，玉叠么 6 巾队，譬科0 j 院北京协和陕学院硕 ：学f t 论文 f i g u r e1 2t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r 0 黟a p ho fp a l m i t o y lg l y c o lc h i t o s a nv e s i c l e s 吲 两亲性高分子也可自发形成囊泡，以其良好的稳定性、流动性和渗透性正逐渐 引起药物载体研究者的兴趣。u c h e g b u 等【引合成了棕榈酰乙二醇壳聚糖并制成了两 亲性的囊泡( 图1 2 ) ，用于抗癌药物阿霉素的传输而不影响药物的生物活性，此 实验己在小白鼠身上取得成功。后来研究表明可以通过调节棕榈酰乙二醇壳聚糖的 分子量柬控制囊泡的大小【1 0 】。在棕1 1 ；l 酰二醇壳聚糖与胆同醇质量比为2 ：1 时用超 声法可以形成囊泡，而聚合物囊泡包封于卵磷脂和月h 固醇( 质量比为2 ：1 ) 形成的 脂质体中可以形成囊泡巾囊泡。将羧基荧光素( c f ) 包埋在其中可以起到缓释的作 用，在普通的囊泡中4h 释放6 2 而在双重囊泡中仅释放2 8 1 。 1 1 3 脂质体 脂质体药物控制释放体系是磷脂、胆固醇等类脂质为膜材形成的双分子薄层中 i 白j 所制成的超微球状体，体积大小一般在几百纳米到几微米问。它可以将药物粉术 或溶液包埋在微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统 吞噬，从而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要 在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治 疗剂量和降低药物的毒性。脂质体由双分子层组成，主要由磷脂为膜材及附加剂构 成。 脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种剂型。它具有类细胞结 构，进入人体后主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并通过改变 被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，从而 提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性【1 2 ，b 】。因此，脂质体 在许多疾病特别是癌症治疗中显示了明显的优越性。 脂质体药物释放体系的局限性表现在：脂质体的酯键易水解，化学稳定性差。 虽然通过脱水后，得到干燥的脂质体，稳定性可以大大提高，然而由于体内的凝聚 造成药物的泄漏，使药物在到达患病部位自订就被释放，造成疗效的下降。此种化学 及物理的不稳定性成为限制脂质体广泛应用的主要原因【 。6 】。对于脂质体药物释放 系统而言，合适的消毒方法也是一个主要的挑战。因为磷脂分子会被热分解，因此 对于通常的消毒方法中的热、辐射或化学消毒剂都非常敏感。同时，这种体系还存 在着载药量低、药物释放太快及可储存性差等缺点。因此，要使脂质体成为一种理 想的药物载体得以广泛的应用，还需进一步的研究。 1 1 4 胶束 胶束足由一种同时具有亲水链和疏水链的两亲性聚合物分子有序排列而形成 的，当聚合物在水中的浓度超过一定值时，其疏水端就自动聚集在一起，形成一个 7 r f t i l j 跃f 科。院北片! 饥承l 医0 j 院硕 = 学位论文 近似球形的结构，这个浓度就是临界胶束浓度( c m c ) 【1 。7 1 。胶束的一个重要性质就 是它的增溶作用，它能增加油溶性药物在水中的溶解能力，因而成为输送油溶性药 物的一个重要载体。同其它的载体相比，它具有自身的许多优点：可以增加药物的 生物利用度，降低毒副作用；延长了药物在体内血液中的循环时间，在更长的时间 范围内维持了血液所需的药物浓度【8 ，1 9 】；由于胶束的尺寸大多在5 1 0 0n m 左右， 大大降低了被网状内皮组织( r e s ) 吞噬的机会【2 0 】。 但是，胶束的载药量低，而且胶束的c m c 都在m m 0 1 l 范围内，在人体血液 环境体系中，很容易造成胶束解离，导致药物泄漏，从而失去了原有的作用，甚至 产生毒性反应。 虽然，胶束存在着一定的不足，但它们可以使疏水性药物增溶并且增加其生物 利用率；它们在体内( 血液中) 有较长的循环时f 日j ，并逐渐在目标位置形成累积； 它们的体积较小，可以透过病灶部位的血管壁从而产生富集；在胶束外表面修饰特 异性配基，可以实现靶向释药；此外，它们还易于大量制备和再生。胶束化的药物 可以受到良好的保护，避免了其在生物环境中失活，也避免了毒副作用，提高了生 物利用度。而且胶束可以通过合理的分子设计、制备条件选择及各种物理化学方法， 精确控制胶束大小、聚集数、结构和形状等目的，其到达到纳米范围，提高胶束的 生物利用率。胶束自身的优点和制备可控性的增加，使胶束成为药物缓释体系中的 研究热点。 下面就胶束的分类和材料进行简单的介绍。 1 2 胶束的应用及分类 1 2 1 胶束的应用 胶束作为药用载体可使难溶药物增溶，且具有靶向作用，能降低药物对正常组 织和器官的毒副作用【2 。早期的研究主要集中于嵌段聚合物，一般是通过透析法将 疏水难溶药物包裹进入胶束内核而使溶解度提高。载药能力受疏水链段影响较大， 疏水链段越长含量越高则载药能力越强。而包封率受到药物与两亲性高分子的比例 的影响，一般载药后胶束粒径会比载药前增大，且载药越多粒径增大越多。 爹o ，。? ：| 。一，? i 爰 t 一t；。 獬 缓。 。 ，易 擎一。 ii 乞* 凋 8 旗；。孳y 獭瞬帮”酽”铲”警溉 。女。，：褫 ”，“墨 缸 4 礴 9俨 蕴 _ 碜舞 * 。，秀 碜 # 7。荔 讳 。镛 一稚聱。秀 二 。 。锯蟛 韶 # ” 一 ； ” t 0 _ 8 t 1 川队 ：h o 院北京f 办和沃7 院硕十学f t 论文 图1 3p e c l l11 纳米胶束载药前后的透射电镜照片 2 2 】 f i g u r e1 3t e mi m a g e so fp e c l l l ln a n o m i c e l l e sb e f o r ea n da r e rl o a d i n gd r u g 【2 2 】 近年来对难溶性天然抗癌药物胶束增溶研究较多，如紫杉醇，研究人员应用胶 束柬增溶和包裹难溶性药物以达到增溶和缓释的目的，取得了较好的结果。董岸杰 等【2 2 】采用固相分散法制备的负载紫杉醇的聚乙二醇- b 一聚( d ，l 乳酸) 两亲性嵌段 共聚物( p e d l l a ) 核壳型纳米囊( p m t ) 呈核壳结构球形，粒径为纳米级，p m t 随着p e d l l a 中疏水连段相对分子质量或载药量的增大而增大。 另外其它一些疏水难溶药物或是本身溶解较好但毒副作用较大的药物如阿霉 素等也可以选用聚合物胶束来作载体，一方面降低药物的毒副作用，另一方面可以 起到控释缓释的作用。陈爱民等【2 3 】利用壳多糖缓慢降解的特性，把它与阿霉素制 成壳多糖阿霉素缓释药粒，植入家兔胫骨上端进行体内释放试验，并与静注相同剂 量阿霉素的家兔进行比较。结果表明，该缓释药可使阿霉素在局部骨组织中维持较 高浓度达8 周以上，且骨组织中最高浓度是静注相同剂量阿霉素时骨含量的2 9 倍， 但血浆峰值浓度仅为静注组血浆峰值的1 1 3 。因此，壳多糖与阿霉素制成的缓释药 粒具有良好的缓释功能，该缓释药粒阿霉素的一次局部用量可超过静注一次用量的 1 0 余倍，能较好地满足骨肿瘤局部化疗用药量大、维持时i 、u j 长、血液浓度低、全身 反应小的用药要求。 1 2 2 胶束的分类 按照聚合物自组装原理分类，胶束可分为两亲性嵌段共聚物胶束、聚电解质胶 束和非共价键胶束。 1 2 2 1 两亲性嵌段共聚物 两亲性嵌段共聚物的亲水、疏水嵌段的溶解性存在极大差异，在水性环境中能 自组装形成亚观范围的聚合物胶束。这种胶束具有相对较窄的粒径分柿及独特的核 壳结构( 见图1 4 a ) 。这类胶束的内核载药量高、体内分布独特，可透过血脑屏 障，适用于口服给药系统及疾病诊断等领域【2 4 2 5 ，2 6 1 。泊洛沙姆是其中应用广泛的高 分子药用载体，可增加药物的溶解度、代谢稳定性和循环时间，还能提高转基因表 达的水平和持续时间【2 7 1 。两亲性嵌段共聚物最为常见的足聚乙二醇一聚谷氨酸苄酯 ( p e g p b l g ) ，它具有优良的血液相容性和生物降解性等特点，用纳米胶束载药 后显示出一定的缓释特性、低毒和更好的抗肿瘤作用。张跃庭等将聚乙二醇一聚己 内酯一聚乙二醇采用三嵌段共聚物为载体包载紫杉醇形成纳米胶束，有效地改善了 紫杉醇的水溶性。 1 2 2 2 聚电解质胶束 聚电解质胶束是可溶性嵌段在极性溶剂中电离出部分反离子，聚电解质的带电 9 巾i q 瞬。? 科。院北片i 协川阪7 ：院硕f 学位论文 强度和反离子的价态决定胶束的结构和尺寸的一种胶束。内核由共聚物的部分嵌段 凝聚形成凝聚成核的过程是分子间力( 包括疏水作用、静电作用、金属络合作用及 嵌段共聚物问氢键作用) 作用的结果【2 引。例如，聚电解质复合物胶束对于荷电化合 物( 如蛋白质、核酸等) 的传递有很大的优判2 9 1 。d n a 聚阳离子复合物作为基因 的非病毒传递载体引起了广泛关注，但这类复合物的共同缺点是水溶性差，以致较 难控制体内的生物分布和转基因表达。l e m i e u x 等【2 9 】合成了线形、分枝形、星形、 嵌段等结构的聚阳离子与非离子水溶性聚合物( 泊洛沙姆1 2 3 ) 的嵌段或接枝共聚 物，均能与短链d n a 自发结合形成聚离子复合物胶束。所得胶束在溶液中稳定，能 与靶细胞结合，可明显提高小鼠肝脏的转基因表达水平。周芬等用聚阳离子( p l l ) 和亲水片段( p e g ) 合成了三嵌段共聚物p l l p e g p l l ，作为非病毒基因载体与d n a 形成聚离子复合物胶束，可用于基因的传递和治疗【3 0 1 。 1 2 2 3 非共价键胶束 嵌段共聚物本身可以作为亚单元结构通过非共价键的连接形成新的大分子复 合单元，然后这种新的大分子复合单元作为一个整体同样可以进行自组装。这种自 组装方式又叫做超分子自组装，组合成的胶束又叫做超分子聚合物【3 l 】。这种方式是 将具有互补性的相互作用端基的小分子或低聚物等单体通过非共价键作用连接成 的“聚合物大分子”，准确地说它是组装成的大分子( 1 4 c ) 。那么与亚单元自身的 自组装相比，它们可能会既保留了亚单元各自的性质又会产生亚单元本身并不具备 的性质。 a b c 图l - 4 聚合物胶束的自组装示意图( a ) 两亲性嵌段共聚物胶束，( b ) 聚电解质复 合物胶束，( c ) 非共价键胶束 f i g u r el - 4s c h e m a t i cd i a 伊a mo fs e l f - a s s e m b l yo f p o l y m e rm i c e l l e s l o 巾陕z 科学院北京1 办承1 陕学院硕