（物理化学专业论文）牛磺酸席夫碱铜配合物的合成、晶体结构与性质研究.pdfVIP

首都师范大学硕士学位论文 摘要 超氧化物歧化酶( s o d ) 是体内专一清除超氧阴离子自由基的金属酶，具有抗衰老、抗 癌、抗炎等功效。由于天然s o d 在实际应用中的局限，其小分子模型配合物已经成为了 研究的热点。本课题从酶促机制的发展、酶的类别及结构研究包括酶结构的全序列同一性 研究等方面系统综述了超氧化物歧化酶的研究现状。其中包括比较成熟的c u ，z n s o d 酶 促机制和c u ，z n - s o d 、n i s o d 、m n s o d 和f e s o d 的结构及其过渡金属模型配合物的 研究情况。 本课题选用邻香草醛缩牛磺酸席夫碱和含氮小分子化合物毗啶、2 氨基吡啶分别合成 了具有变形四方锥构型的双核铜配合物( 1 ) 和近平面构型的单核铜配合物( 2 ) 。并经红外光 谱、紫外光谱、晶体结构测试对其进行了结构表征。采用n b t 一核黄素一蛋氨酸光照法测定 模型配化合物的s o d 活性，探讨了生物活性和结构之间的关系。实验结果表明配合物( 1 ) 和( 2 ) 均具有较强的清除超氧阴离子自由基韵能力，i c s o 分别为0 4 5 x 1 0 - 9 9 m l 和6 7 5 x 1 0 9 g m l 。这为进一步研究复杂生物活性分子结构与生物活性的关系提供了良好的模型配合 物。 关键词：超氧化物歧化酶铜席夫碱模型配合物晶体结构 首都师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) i sa n t i o x i d a u te n z y m et h a td e f e n dt h ec e l l sa g a i n s td a m a g eb y o x y g e nf r e er a d i c a l s i ta p p e a r st op l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nc o n t r o l l i n go x i d a t i v es t r e s s ，w h i c hi s t h o u g h tt oc o n t r i b u t et ot h ed e v e l o p m e n ta n dp r o g r e s s i o no fc o n s e n e s c e n s e ，c a r c i n o g e n e s i so r c a n c e r , i n f l a m m a t i o ne r e b e c a u s eo fi t sl i m i ti np r a c t i c a l i t y , t h ed e s i g na n da p p l i c a t i o no ft h e s y n t h e s i so f l o wm o l e c u l a rw e i g h tm e t a lc o m p l e x e sc o n t a i n i n gc u ，z n ，m ne t c s o dm i m i c sh a v er e c e i v e d c o n s i d e r a b l ea t t e n t i o n f r o mt h ep o i n to fd e v e l o p m e n t , s o r t ，s t r u c t u r er e s e a r c hi n c l u d i n gi d e n t i c a l s e q u e n c e ，t h ed e v e l o p e dh i s t o r ya n dr e s e a r c h i n gw o r ko fs u p e r o x i d ed i s m u t a s ea r ep r e s e n ti n t h ea r t i c l e t h er e l a t i v e l ym a t u r ec a b a l y t i cm e c h a n i s m ，t h es t r u c t u r er e s e a r c ho fc u ，z n - s o d ， n i - s o d ，m n - s o da n df e s o da n dt h e i r sm o d e lc o m p l e x e sa r ea l s or e p o r t e d p y r i d i n e ，2 - a m i n e p y r i d i n ea l es i n g l e do u ta st h e “r dl i t t l el i g a n d st os y n t h e s i z ec o m p l e x ( 1 ) a n dc o m p l e x ( 2 ) t h ec o o r d i n a t i o ng e o m e t r ya r o u n dc u ( i i ) i nc o m p l e x ( 1 ) i sad i s t o r t e d t e t r a g o n a lp y r a m i d b u tc u ( i i ) i nc o m p l e x ( 2 ) e a r lb ed e s c r i b e da sas l i g h t l yd i s t o r t e ds q u a r e p l a n e t h ec o m p l e x e sa r ec o n s e q u e n t l ys y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e d t h ec h e m i c a ls y n t h e s i s ， i r ，u v ，x - r a yc r y s m ls t r u c t u r ed e t e r m i n a t i o n ，a n dc a t a l y s i sa c t i v i t yd e t e r m i n a f i o no f t h et w o n e wm o d e l c o m p l e x e sa r ea l s or e p o r t e dh e r e t h es o d l i k ea c t i v i t yo f t h et w oc o m p l e x e sh a v e b e e nm e a s u r eb yt h em e t h o db a s e dr e d u c t i o no f n i t r o b l u et e r r a z o l i u m 叫b 1 ) w i t l l l a c t o f l a v i n t h er e s u l t sd e m o n s t r a t ea l lt e s t e dc o m p l e x e sh a v eg o o ds o d - l i k ea c t i v i t i e s ， c o m p l e x ( i ) a n dc o m p l e x ( 2 ) w i t h i c 5 0 = 0 4 5 x l o - 9 9 m ea n d i c 5 0 = 6 7 5 x i o g m l r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ；c o p p e r ；s h i f t b a s e ；m i m i cc o m p l e x ；c r y s t a l s t r u c t u r a l ； j i 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本课题的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文储铭谚企若 日期：五咿j 月弓1 日 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文作：疹磊者 日期：“年s 月弓 日 第一章超氧化物歧化酶及其席夫碱金属模型配合物的研究 第一章超氧化物歧化酶及其席夫碱金属模型配合物的研究 生物体在进化过程中不但在体内建立了一套执行防御氧化性损伤的抗氧化机制，还利 用氧的氧化作用进行物质代谢和能量代谢以及利用活性氧消灭入侵的微生物，但生物体对 活性氧的防街系统还不完善有时活性氧的损伤会造成或大或小的病理变化。这种生物的 需氧性和氧对生物潜在的危害性就被称为氧对生命过程的“双重性，_ 这是生物界普遍存 在的一个重大的矛盾问题。随着放射生物学和自由基生物学的迅速发展，特别是1 9 6 9 年 m c c o r d 和f r i d o v i c h 1 1 发现超氧化物歧化酶( s o d ) 的生物活性之后，提出了氧毒性的超氧化 物自由基学说，并且揭示了超氧自由基的形成是氧毒性的主要因素，促进了对氧代谢和 s o d 深入而系统的研究。通过设计配体合成与s o d 活性中心结构相似的配合物，研究其 结构和功熊可以获得许多难以从结构复杂的天然酶的研究中得到的信息，对其活性中心的 研究意义重大。近年来，金属酶s o d 化学模拟迅速发展。已成为配位化学和生物无机化 学研究的一个重要领域。 第一节超氧化物歧化酶的研究 超氧化物歧化酶( s o d ) 广泛存在于各种好氧和耐氧生物体内。不仅如此，在专性厌氧 生物中也存有少量的s o d 。它是机体清除超氧阴离子自由基的一种重要酶，在维持机体的 氧化一抗氧化平衡中起着重要作用，是生物体预防氧毒性的重要防线。自1 9 3 8 年，m a r n 等首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶【2 】算起，人们对s o d 的研究已有近七十年的 历史。1 9 6 9 年，m c c o r d 【l j 等进一步发现了它们的生物活性，有关氧代谢的分子生物学等方 面的研究工作，可与d n a 双螺旋结构学说的成就相提并论1 3 l 。最近研究表明，超氧化物歧 化酶c u 伴护蛋白质( c c s ) 对s o d l 的功能完善至关重要1 4 。s o d l 的结构表明，除金属 中心的特性外，c y s 5 5 和c y s l 4 4 河的二硫键对于其发挥功能亦很重要。s o d 的插化极可 能由二分子的杂二聚体引起。它可以保护线粒体免受活性氧的损伤口i 。其基因变异会导致 肌肉萎缩等疾病p g 】。b a n c i 等研究认为其催化活性与离子强度相关，分子整体电性能影响 酶活性【9 j 。亦与外源性物质有关。并且不同来源的酶呈现不同的生物学特性b o 1 1 。 s + c e r e v i s i a e 的c u ，z n - s o d 可以同时表现出抗氧化剂和强氧化剂的特性i 埘；缨胞溶质的 s o d i 的保护效应与超氧阴离子自由基将出现在葡萄糖诱发的白内障形成过程中【1 3 】。s o d l 的缺失将使由氧决定的敏感性转化为d n a 损伤和复制受阻【】，也将引起幼儿早期听力的 丧失”副。s o d 2 转基因小鼠实验表明人类线粒体s o d 2 表达的控制增加同样也能提高酶活 首都师范大学硕士学位论文 性，降低超氧化物水平量【1 6 1 。e c s o d 活性的丧失会导致一系列包括与细胞外超氧化物歧 化酶表达有关的组织方面的疾病【1 7 1 ，活性的增强可以改善成年老鼠的记忆功能和认知损伤 i t s 。 酶的活性还受其外源性物质的调节。心脏线粒体比肝脏线粒体的m n s o d 显示了较强 的活性，在缺氧线粒体中活性降低。含氧量正常的线粒体中【c a l f 和 m 9 2 1 均可活化酶而 【m 9 1 f 稍弱，同时加入时具有加合作用，这在心脏线粒体中表现明显。 c a 2 + 】f 在调节需氧 代谢中的m n - s o d 的活性中发挥着作用n 9 1 。为了在不同物理环境中发挥作用，酶结构会发 生微小变化。室温下六配位n 缸( ) 在接近生理温度时变为五配位h 缸( m ) 【2 们。重组的 m n - s o d 会加速还原超氧化物阴离子，其活性受溶液的p h 和温度等影响1 2 n 。重组的c u , z n - s o d 在氮端氨基酸序列、亚单元分子量、热稳定性等方面与n c m - s o d 中的天然c u ， z n - s o d 相似【2 2 1 。在缺氧环境下，c u , z n - s o d 和m n - s o d 酶的异构化后活性变化各异【2 3 1 。 氨基酸类席夫碱配合物由于具有许多药理学和生理学活性而十分重要，多应用于抗癌 p 4 、抗菌口5 1 、消炎【2 6 2 7 1 、生物化学反应如氨基转移或脱羧反应中【2 耵，且其生物活性和金属 的配合有关，广泛应用于治疗、合成、生化反应( 如酰胺基转移、脱羧、缩合、b 消除及外 消旋反应) 、催化、生物调节剂、热敏或者压敏材料中的染料、聚合物改性、分析试剂、螯 合剂等方面。例如抗癌活性非常强的三丙氨酸席夫碱配合物。席夫碱基团通过碳氮双键 ( c 对4 - ) 上的氮原子及与之相邻的具有孤对电子的氧( o ) 、硫( s ) 、磷( p ) 原予作为给体( 供体) 与金属原子( 或离子) 配位，其金属配合物可以作为金属酶的模拟物嗍。研究金属离子和席 夫碱配体之间的合成、结构和相互作用，对于深入考察其生理、药理活性的作用机理、构 造、稳定性等方面有着十分重要的作用，并且还可以获得许多难以从结构复杂的天然酶的 研究中得到的信息，对其活性中心的研究意义重大【3 p 3 4 1 。因此对小分子能在生理条件下保 持稳定的小分子模型物的合成、表征及生物活性的研究成为热点1 3 5 1 。近年来研究其配合物， 不仅重视选择功能性原料，并对其形成机理、光谱性厨3 t 钾j 、氧化还原电势3 3 1 等方面有进 一步的研究，而且综合考虑形成配合物后的功能性、广谱性 3 9 , 4 0 。 1 酶促机制 氧自由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 或称活性氧，主要包括超氧阴离子自由基 ( oi ) 、羟自由基以及有机过氧化物自由基等。生命体在正常代谢中产生r o s ，而一些外 界环境因素能增加细胞中的r o s 浓度，若不能及时清除以恢复平衡，会引起生物膜的过氧 化损伤，甚至造成细胞器的损害和d n a 与蛋白质的降解与失活。生命有机体在进化过程 中形成并发展了清除活性氧的系统，例如抗氧化酶系统和非酶性小分子抗氧化系统。s o d 第一章超氧化物歧化酶盈其席夫碱金属模型配台物的研究 属于氧化还原酶，是催化oi 歧化反应，专一清除生物体内的超氧阴离子自由基平衡 机体氧自由基的金属酶，其催化作用是通过所含金属的氧化和还原过程电子得失实现的。 在生理条件下，s o d 可使oi 歧化产生0 2 的反应速度提高1 0 4 倍1 。 ( ) i + m ”l 手o 、+ m “ h o 、+ m ” h 、o 、+ m ”1 作为氧化还原酶，特别是那些参与电子传递的氧化还原酶，其结构与作用机制一般比 较复杂。大多数电子传递链包藏在线粒体内膜，难以可溶形式提纯。当电子经线粒体呼吸 链传递到分子氧及在各种羟化和氧化过程中会形成毒性的氧的部分还原产物，作为中间产 物出现在酶的活性部位上。随着人们对于各种c u , z n s o d 结构的深入了解以及各种现代手 段的运用，对于s o d 酶催化机理的研究也有很大的进展。 7 0 年代中期，f e e 和l i p p a r d 等分别通过研究c u ，z n s o d 酶催化oj 歧化的动力学，发 现速率限制过程是oi 与活性中心的键会过程。在p h = 5 2 9 6 2 阅结合速率与p h 无关， 并且酶在水中歧化的反应速率与在重水溶剂中是相同的，说明质子转移不是结合过程的一 部分，质子传递并非催化反应的决定步骤，由此提出了铜锌咪唑桥质子化并断开和重新循 环作用机理【4 2 】。 o - + 同时h i s - 6 1 咪唑桥重新形成 据此机理，在歧化过程中伴随着c u 氧化态的变化与铜锌桥的断裂和重新形成，且咪唑 桥为过氧根的质子源。1 9 8 6 年f e e v 用停留法对s o d 酶催化歧化反应动力学重新进行了研究 4 3 】，总酸质子转移过程为速率限制过程，催化歧化形成h 2 0 2 所需要的质子来自于溶剂水而 非昧唑桥。 b e r t i n i 等研究结构表明】在催化过程中与c u ( i i ) 相距o 6 啪的舢争1 4 1 具有重要作用。 他认为机理如下： 首都师箍大学硕士学位论文 c u ( i i ) a r g 1 4 1 传 递质子 h o 0 2 2 。+ c u ( i d c u ( 1 ) ( 不考虑a r g - 1 4 1 作用时) c n 2 h 4 + 一一o i - 一- c u ( i i ) ( 决速度) 这种以氢键形式存在的稳定中间体( 还原型配合物) 增加了呸对质予的亲合力并诱 导质子从船1 4 1 传递给0 2 2 。形成h 0 2 2 。，同时电荷重新分布，还原酶又重被氧化为c u ( i i ) 酶， 完成一个循环催化过程。o - 被还原为h 2 0 2 所需要的质子直接来源于活性中心附近的 a r g - 1 4 1 。b e r t i n i 测定了含有不同氨基酸残基酶盼催化歧化活性【4 5 】。结果表明a r g - 1 4 1 有加 速何与c u ( i i ) 配位的作用，是活性中心的一部分，在催化过程中发挥着重要作用。 1 9 8 9 年张静怡等根据p h = 7 下备自不同的氧化还原电势探讨了超氧化物歧化酶催化超 氧阴离子自由基歧化作用的机制m 】。推测可以发生歧化反应2 0 3 0 2 + 0 2 2 ，由于两个 相同电荷的锈难于靠近，影响了歧化反应速度。但与s o d 配位后获得活化，消除了呸- 间 的静电斥力，加速了歧化，h p c u + s o d + 0 i + 2 旷c = 令c u 2 + - s o d + 0 2 可自发进行。对于与 多价金属配位，配合物的空间构型效应不容忽视，c u + 的构型为d 1 0 。对称性高，形成的s o d 配合物的立体构型为四面体，位阻效应较小，比较稳定；而c u 2 + 为扭曲的平面正方形，位 阻效应较大，不稳定，故可发c k c u , + s o d 催化锈- 的歧化反应。 人们普遍接受c u , z n s o d 机理是1 9 8 3 年由t a i n e r 基于0 2h i l l 的牛- - c u ，z n - s o d 氧化型 晶体结构和广大的光谱数据所提出的，推测机理是通过连续的0 i 对活性位置的c u 2 + 离子 交替氧化及还原 4 7 】。采用的s o d 结构是重修过的0 2n n l 牛s o d ，大面积序列的残基拓扑结 构是通过基本的紧密堆积与氢键的维系而趋于稳定的，并为o - 提供一个唯一的、有效且 充足的超氧位置( 超氧阴离子所在的位置) ；同时呸与c u “、与活性有重要作用的a r g 1 4 1 以适宜的几何构型相连，其旁边有两个水分子，是超氧位置的灵魂( 水分子位置) 。这一几 何结构、分子活性表面，以及生化数据为酶机理的研究提供了一个特殊模型。由于z n 的存 在及c u ( i i ) 的扭曲平面四边形，增加了其电势。因此，三配位的c u 结构是建议机理关键的 4 第一章超氧化物歧化酶及其席夫碱金属模型配合物的研究 一步。 o 三+ c u ( i i ) 卜o ：+ c u ( i ) 查圭望竺查 - 三配位铜还原酶郴】 l 一。 并与h i s - 6 1 分离 c u ( i ) 与c u ( i i ) 之间通 过h i s 6 1 与溶剂水进行 质子传递 1 9 8 4 ，b l a c k b 啪1 研究还原型的牛一s o d 是三配位，c u 为平面三角结构，为此机理 提供了第一个直接的结构证明。但是1 9 9 5 年r y p n i e w s k i 等得到了分辩率为0 1 9 n l n 的一个牛 还原酶结构是五配位与氧化态牛s o d 五配位结构相刚钏。此结构又为1 9 8 4 年i 扫o s m a na n d b u s h 提出的另一种机理提供了证据剐。他们认为通过催化循环c u 仍保持五配位，机理的 关键是c u 与嘎- 之间形成稳定的配合物，然后再与第二个分子的o i 进行外部电子转移。这 些激发了m 呐e ta l 的兴趣【锄，他们对不同p h 缓冲液中获得的还原型牛s o d 晶体结构进 行了深入的研究，均证实了早期b l a c k b u r n 的研究，显然在水溶液及晶状半流体中还原型的 c u 与三个组基酸配位形成平面三角构型。1 9 9 6 年f h o g i h a r a 从酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s a e ) 中获得的0 1 7n n lc u ，z n - s o d 5 3 1 清楚地说l t j j h i s 6 l 远离e l l 2 + ，距离大于o 0 3n n l 2 并且咪唑环偏离c u - z n 轴1 5 0 。 2 超氧化物歧化酶的类别及结构研究 2 1 超氧化物歧化酶的结构研究 目前，在人体中仅发现三种s o d ，根据金属辅基的不同可分为c u , z n - s o d 、m n s o d 和n i s o d 。植物中还有一种f e s o d 。m n s o d 主要分布在线粒体中，而c u ，z n s o d 主 要分布在细胞浆，尤其是在红细胞中，它们在防止o i 对细胞的损害方面起着重要的作用。 同时，由于金属辅基的多样性，生命体内一旦某类s o d 的合成由于金属辅基的缺乏而受阻 时，就可以由另一类s o d 来补充。 2 1 i c u ，z n - s o d 和n i - s o d 的结构研究 1 9 7 2 年，r i c h a r d s o n 实验室首先获得单晶，并提供了结构数据 5 4 1 。随着分析技术的进 步和分析仪器静密度的提高，电子密度图的分辨率不断提高，超氧化物歧化酶的结构研究 获得较大的发展。 首都师范大学硕士学位论文 1 9 7 4 ：0 5 5 呦分辨 率的电子密度 i 1 9 7 5 ：0 3n l t l 分辨率 的电子密度图 酶的两个亚基结构相同，每一个亚基包括己知的序 列1 5 1 个氨基酸和一个c u 、z n 的s o d 骨架结构及外 部一对环u 0 0 p 埔成了活性通道峰5 1 。 可以分辨肽链骨架的走向和金属配体的组成。两个 相同的亚基通过非共价键的疏水作用而缔合，其中 的二硫键对亚基缔合起着重要的作用【5 6 1 。 i 1 9 8 2 ：0 2n l n 分辨率比较清楚的看到了c u ，z n - s o d 活性中心位置的排 的电子密度图列5 7 1 。c u 、z n 分别与多个组氨酸咪唑基的n 原子配 位，并通过组氨酸咪唑环进行桥连，在每一个二聚 分子之间呈非晶体学二次轴的对称性【跚。 c u ，z n s o d 的活性中心部位，c u ( i i ) 与四个h i s 残基( t i p h i s - 4 4 ，h i s - 4 6 ，h i s - 6 1 ，h i s 1 1 8 ) 的咪唑基n 原子配位形成畸变的平面四方形( 其中，h i s - 6 11 - 的咪唑基作为c u ( i i ) 和z n ( i i ) 的桥联配体) ，与轴向配位水分子形成畸变的四方锥构型。z n ( i i ) 与三个h i s ( h i s - 6 1 ，h i s 6 9 ， h i s 7 8 ) 残基n 原子和一个门冬氨酸残基( a s p 8 1 ) 的羧基氧原子配位形成三角双锥畸变的 四面体构型。z n f i i ) 的主要功能是稳定蛋白质结构。n i s o d 的活性中心结构尚未知，基于 s o d 的进化保守性，推测在n i s o d 的活性中心部位，n i 仍与三个组氨酸残基、一个a s p 残 基及一个h 2 0 配位 5 9 1 。 2 1 2m n s o d 和f e s o d 的结构研究 m _ n - s o d 活性部位基本上有一个是底物或其它内源性配体接近m n l l 离子的通道，该通 道由疏水残基构成的疏水穴、两个亚基链共同形成，终止于金属离子附近的t y r - 3 6 和h i s 3 2 残基。e d w a r d s 研究了e s c h e r i c h i ac o l i ( 大肠杆菌) m n s o d 的晶体结构。其结构与其它 m n - s o d 和f e s o d 高度一致，以不对称单元均二聚形式存在删。m n 以h i s - 2 6 、溶剂分子( 可 能是o h 3 为轴向配体，h i s 8 1 、a s p 1 6 7 和h i s 1 7 2 为赤道位配体的五配位三角双锥构型。配 位溶剂分子和a s p 1 6 7 未配位的羧酸氧及谷氨酸残基g i n - 1 4 6 以氢键网状结构存在。 m n - s o d 二聚体的活性中心通过由一个单体的h i s 1 7 1 和另一个单体的g l u 1 7 0 桥联接。为了 在不同物理环境中发挥作用，酶会发生微小的结构变化。室温下六配位的m n ( 1 l i ) 核在接近 生理温度变为五配位的n i i ) 【引1 。 6 第一章超氧化物歧化酶及其席夫碱金属模型配合物的研究 最近对t e l o n g a t u s ( d 腔毛滴虫) f e s o d 结构研究表明f e l l l 为变形的三角双锥，与 h i s - 2 7 、h i s - 7 9 、h i s 1 6 5 、a s p 1 6 l 残基和一个溶剂分子( h 2 0 或o h - ) 配位，且在较宽p h 范围内( 5 1 1 0 0 ) 构型保持；均二聚体交界处产生了溶剂分子填充的漏斗状孔道可将底物 传输到活性部位6 2 j 。 2 2 超氧化物歧化酶的结构全序列同一性研究 至1 9 8 5 年，在完成了全部氨基酸序列分析工作的六个超氧化物歧化酶中，四个是c u z n - s o d 分别来源于牛、人的红细胞、马肝和酵母，另外两个是m n s o d 6 3 1 来源于大肠杆 菌和一种嗜热细菌。这两m n - s o d 的全序列同一性为6 0 。而对多种来源的m n s o d 和 f e s o d 进行的n 一末端序列分析揭示，这两类s o d 在氨基酸序列上具有高度一致性，从 而判断进化上可能来源于同一祖先。1 9 9 8 ，j a c k s o n 等系统研究和分析了这两种s o d 之间 结构的相似性唧】。m n - s o d 和f e s o d 是以同一亚单元单位组成的二聚体或四聚体存在， 各自的氨基酸排列的相同性高，在部分细菌中即使m n 和f e 相互交替也能保持活性，配位 环境相似【6 5 】。从p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ( 丙酸杆菌) 中获得的s o d 的f e 和m n 一级结 构具有相似活性，以不对称单元的均二聚体结晶。三级结构同其他s o d s 相似，与三个h i s ， 一个a s p 和一个h 2 0 成键以五配位形式存在。残基第二层由憎水的氨基酸，h i s 和两个 h 2 0 构成，与催化活性和结构稳定性有关，还可能是其具有c 蜊6 f 口凰r f c ( 倾向分生组织的) 行为的原因。s c h m i d t 研究认为金属特性并非无足轻重，金属环境的微小变化也可能是造 成这种c 册6 缸协如( 倾向分生组织的) 行为的原因i 匍。 c u , z n - s o d 与上两类s o d 没有这种进化上的相关性，但不同来源的c u ，z n s o d 之间 却呈现出明显的进化的保守性和高度的序列同一性【6 7 1 。人和牛的红细胞中提纯的c l l z n - s o d 之间全序列同一性高达8 0 。通常人们认为细胞色素c 是进化上高度保守的典型 蛋白质，因为不同来源的细胞色素c 序列同一性为5 5 7 ，而不同来源的c u ，z n s o d 全 序列同一性高达8 0 ，可以肯定c u ，z n - s o d 也是一类进化上高度保守的酶。 7 首都师范大学硬士学位论文 第二节席夫碱金属s o d 模型配合物的研究 s o d 作为配位化学金属蛋白的模型，各配体间通过氢键相互作用，相互联系。s o d 中金属离子的存在强烈影响着其它原子的表现，而且通过重新构建取代c u 或z n 离子，可 获取s o d 的一系列衍生物。国际上，自7 0 年代对s o d 的研究全面展开，从种类、来源、 结构、功效直到s o d 的模拟化学，使对s o d 的研究达到了一个高潮。8 0 年代末，国内对 s o d 的研究相继展开，主要集中在应用以及与应用直接相关的基础理论等方面，并取得了 很大的进步。 研究表明s o d 活力的高低与机体衰老、肿瘤、炎症等疾病有关。由于天然s o d 在稳 定性、膜穿透性、生物利用度和免疫原性等方面存在著一些限制。因此，对具有s o d 活 性且能在生理条件下保持稳定的小分子模型物的研究成为热点。咪唑基是组氨酸残基很好 的模型。因此对s o d 结构的模型主要表现在以咪唑基为桥、以含氮小分子为配体的单核， 同、异双核及多核( 铜、锌、钴、镍、锰、铁) 配合物的合成与表征。苯并咪唑基由于其易 于制取、拥有较涨唑基更大的化学惰性及能够提供较为合适的空间位阻，也成为组氨酸残 基较为理想的模型物。当前报道的s o d 模型物多为苯井咪唑类，氨羧类。氨基酸以及席 夫碱等金属配合物等。相对于天然s o d 这些小分子模型物具有分子量小、脂溶性好、膜 渗透性强、性质稳定等优点，最有望用于药物筛选。s o d 模型配合物的活性优劣，取决于 中心金属原子的配位结构与天然s o d 活性部位微环境的相似程度，配位结构越相似活性 越强而与核的多寡无关。含有n 、0 、s 给体的席夫碱配体被广泛应用于生物模型配合物 的研究中陆6 9 】。比较以席夫碱为配体和以非席夫碱为配体的单、双核模型配合物对呸清 除表现出的活性，则前者明显高于后者【4 ”。为此，以席夫碱为配体的金属s o d 模型配合 物的合成、表征及构效关系的研究等工作倍受关注并已取得显著成果。同时，在应用方面， s o d 已进入食品、化妆品、医药等领域，无可置疑s o d 的研究和应用有不可估量的前景。 l 席夫碱c u ，z n s o d 与n i s o d 模型配合物 席夫碱s o d 模型配合物的合成、表征与生物活性研究已成为对s o d 模型物研究的一 个重要领域。n i s o d 具有与c u ，z n - s o d 相类似的抑制类型和与其相当的生物活性。呈四 方锥构型且轴向配位被水或碱( 羧酸根) 的氧占据的铜配合物和天然s o d 结构非常接近因而 具有极其相似的活性。但具有近似平面结构的铜配合物多见报道。席夫碱铜配合物 ( c u ( b p p n ) ( c 1 0 4 ) 2 2 h 2 0 的e p r 谱测定gu a 值恰在1 3 5c m 一，具有可逆的构象转变， 配位方式从c u ( i i ) 平面四方构型转化为可能的c u ( i ) 四面体构型，极佳的满足了还原氧 8 第一章超氧化物歧化酶及其席夫碱金属模型配合物的研究 化循环过程，具有较高s o d 活性1 7 0 l 。而类似四方锥构型的如 c u ( a p y ) l ( c 1 0 4 ) 2 、 c u p u p h e p y ( c 1 0 4 ) 2 和 c u ( b p p n ) ( c 1 0 4 ) 2 2 由于轴向配位原子不是氢氧化物分子而阻碍了构 象转变，导致活性较低【n 1 。 为进一步获得c u 2 z n 2 s 0 d 的c u ( 1 i ) 和c u ( i ) 两种氧化态下结构的相关信息，研究 了6 一甲基毗啶- 2 - 甲醛双缩1 ，4 - 丁二胺铜配合物的【c u 2 1 - ( p u - 6 - m e p y ) 2 ( c l o , 0 2 m e o h 及 c u l l ( p u _ 6 _ m e p y ) ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 ) 2 晶体结构和s o d 活性吲( 见表1 ) 。c u l 。为平面四方构型而 二聚的c u l 为三角双锥构型。热力学稳定的二聚c u ls o d 模型物可应用于类胞液需氧环 境，为获得与更加稳定、有效的一类c u d i s c h i f f 的c u l 模型物的相关信息提供了可能【7 2 1 。 近年来相继发现大量以席夫碱为配体的单核c u “、z n ”、c o ”、n i l 的新型结构配合物具 有一定的s o d 样活性( 见表2 ) 。 目前，对s o d 活性的测试主要采取黄嘌呤黄嘌呤氧化酶l u m i n o l 化学发光体系法、邻 苯三酚自氧化法、核黄素蛋氨酸光照法、荧光和吸收光谱法等。半数抑制率i c 5 0 可以进行 定性比较，其值越小活性越强，但由于一些配合物未达到半数抑制率或溶解性方面的原因， 这一指标的使用受到限制。乔艳红等嘞得一系列邻香兰素氨基酸席夫碱及其配合物i c 5 0 j 邻香兰素- 半胱氨酸席夫碱i c 5 02 9 0 4l _ t g m l ，其锌配合物i c s o6 2 8p g m l ，钴配合物i c 5 05 3 3 l _ l g m l ，镍配合物i c s o1 8 4 1i t g m l ；铜配合物及其它邻香兰素氨基酸席夫碱金属配合物的 最大抑制率未达到5 0 而未得到其i c 5 0 值。席夫碱及其金属配合物的s o d 活性测试为进 一步研究提供了重要信息。 表1 黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶介质n b t 还原测定的铜配合物的抑制率 t a b 1 i n h i b i t o r ye f f e c to f c o p p e rc o m p l e x e so nt h ex a n t h i n e - x o dm e d i a t e dr e d u c t i o no f n b t p 6 铜配合物1 c 5 0 ( 州) c u ( i i ) ( p u - 6 - m e p y ) 0 t z o ) 2 + c u 2 ( i - 6 - m e p y h 2 + c u ( i i ) ( p u p y ) 2 + c u ( i i ) ( p u p h e p y ) 2 + c u 2 ( i i ) z n 2 s o d 2 2 5 2 。0 6 o 6 0 o 2 7 0 0 0 8 4 表2 c u ( i i ) 、z n ( i i ) 、c o ( i i ) 、n i ( i i ) 等席夫碱s o d 模型配合物 t a b 2 s o d m i m i c s o f s c h i f f b a s e s o f c u ( i i ) ，z n ( i i ) ，c o ( i i ) 。n i ( i i ) a n do t h e r s s o d 模型配合物配体模型配否砀丽i 面瓣 c u ( h l ) ( o a c h h 2 0 5 - 氯水杨醛缩硫配体有一定的生物活性，配合物抑制作用显著增强。 z n ( h l ) c 1 2脲( h l ) f 3 】 z n ( 1 i ) 配合物活性高于c u ( i i ) b e 合 。 9 z n l 2 n i ( h l ) s 0 4 。2 h 2 0 n i k 2 h 2 0 z n ( h l ) ( o a c ) 2 z n l n i 2 l ( s 0 0 2 h 2 0 z 啦l c a c h n i l 2 h 2 0 c o t a c u k z n t a c u l 2 h 2 0 z n k l h 归 c o l 2 1 1 5 h 2 0 c u uz n u c o u c u l z n l c o l c u ( i i ) 配合物p t c c u l 讲2 0 ) c u l ( o a c h z n l ( o a c h c o l ( o a t ) n i l ( o a 如 2 a c u 、2 - c a z n 、 2 c a c o 、2 - c an i 3 c a c u 3 一c a c o 3 c a z n 3 c a n i 5 氯水杨醛缩盐同浓度时，配合物催化歧化的活性比配体高，与浓度正相 酸氨基脲( h l ) 1 7 4 1关。双配体配合物活性高于单配体配台物， z n k 催化歧 化的活性最强。 5 氯水杨醛缩乙5 - c i s a l e n 具有清除作用，与n i ( i i ) 、z n ( 1 i ) 配位后活性增 二胺强。双核配合物平均抑制率远大于单核配合物但活性低子 ( il l ) t 7 q 天然s o d 。 5 溴水杨醛缩 o o - 一- - 乙基硫代 磷酰肼席夫碱 ( h l ) i 6 1 2 氨基5 巯基 1 , 3 a - 噻二唑缩 2 , 4 二羟基苯甲 醛( h l l ) f 7 埘、缩水 杨醛( h 2 l 2 ) ! 9 】 水杨醛缩2 一氨基 5 巯基1 , 3 。4 - 嚷 二唑的氯乙酸衍 生物m 1 l ) l 蛐】 原儿茶醛氨基硫 脲【| l 】 3 , 5 二硝基水杨 醛缩甘氨酸钾 ( k h l ) t ”l 邻氯苯甲醛缩 o 。昏二甲基磷酰 亚胺l ( l ) ，7 】 2 氯代苯甲醛缩 丙氨酸钾 f 2 c a k ) i s 。l 3 氨苯甲醛缩丙 t t 酸0 - c a k ) 9 针 配体在整个浓度范围内基本上表现为对s o d 的抑制作用， 配合物在高浓度时对s o d 有抑制作用。浓度为i l f f 5 i x l 0 6 时对s o d 有一定的激活作用，c u l , 2 的激活作用最强 配合物抑制率与浓度正相关，低浓度区随浓度增加快速递 增，高浓度区增速变缓。配体在1 , 6 3 2m g l 左右浓度段， 抑制率随浓度的增加而递减，后随浓度的增加逐渐增加。 c u ( i i ) 配合物活性最佳，配体与z n ( ) 配位后活性降低( 见 图1 ) 。 活性递增率随浓度增加而逐渐变缓。c u ( i i ) 配合物有较好 的抑制作用。c o ( i d l e 合物次之，较配体有更大的活性。 z a ( i i ) e 合物浓度 l ， m g i l 活性较配体高( 见图2 ) 。 p t c 是一种很强盼清除剂，保护超氧阴离子自由基介导的 组织细胞的氧化损伤。 有较强的清除作用。显示了较强的s o d 样话性，在一定 程度上具有模型s o d 酶的作用。 均有一定的抑制作用且抑制率高于配体与浓度成正比，具 有一定的s o d 酶活性，z n ( i i ) 配台物抑制率最高。 c u ( i i ) 、n i ( ) 配合物有较强的抑制作用，与s o d ( 0 0 6 g m o l l 1 ) 相比桓羞较远，其余配合物几乎没有作用。 c u ( i i ) 、n i ( i i ) f f a 合物有较强的抑制作用，与s o d ( o 0 6 $ j m o l - l 1 ) 相比相差较远，其余配合物几乎没有作用。 第一章超氧化物歧化酵及其席夫碱金属模型配合物的研究 c u l ( h 2 0 ) 2 c o l ( h 2 0 h n i l ( h 2 0 ) 2 z n l r h 2 0 ) 2 n a 【c u l a c 1 5 h 2 0 n a z n l a c 1 5 h 2 0 n a c o l a c 1 5 h z o c u v gc o v g z n v g 邻香草醛缩丝氨 酸( l i ) 、苏氨酸 r l 2 ) 、半胱氨酸 f l 3 ) 、蛋氨酸 ( l 4 ) 、谷氨酸 f l 5 ) l ”，驯 邻香草醛缩甲硫 氨酸州a h l ) 【”，8 7 1 n 邻香草醛缩氨 基葡萄糖( v g ) 有一定的清除作用。与配体相比铜、钴配合物的活性降低 而锌、镍配合物的活性明显增强，其中锌配合物的活性最 强；配体抑制作用随配合物浓度增加而增大，以邻香草醛 一半胱氨酸席夫碱为配体的锌配合物的活性最强。配体活 性表较l3 l 1 l 2 l 4 l 5 。 配体和配合物均有一定的清除作用，过渡金属离子对席夫 碱性能起一定的促进作用使配合物明显强于配体。活性比 较铜配合物 钴配合物 锌配合物