综合提取简介.doc

_多孔磁性硅胶微球的制备及其在基因组脱氧核糖核酸提取中的应用首席医学网 2006年07月12日 17:07:58 Wednesday 【关键词】 磁性微球,硅胶,核酸,酵母摘 要 采用模板法制备了多孔磁性硅胶微球，用于生物样品中基因组脱氧核糖核酸（DNA）的分离纯化。以球形和无定型硅胶为对照，考察了吸附液组成和洗脱时间等实验参数对小牛胸腺基因组DNA在磁性硅胶固相载体上的提取回收率的影响。实验结果表明：20（/）聚乙二醇和2 mol/L 氯化钠，洗脱10 min，DNA的回收率可达80；采用简单的细胞裂解体系和合适的吸附液组成，磁性微球应用于酿酒酵母中基因组DNA的提取，得到了平均长度约为5 kb、A260/A280大于1.77的高纯度DNA片段。关键词 磁性微球，硅胶，核酸，酵母Preparation of Porous Magnetic Silica Microspheres and TheirApplication for Genomic Deoxyribonucleic Acid ExtractionZhang Liming, Zhang Zhichao, Wan Qianhong*(College of Pharmaceuticals and Biotechnology ,Tianjin University, Tianjin 300072)Abstract Porous magnetic silica microspheres with high magnetization, uniform particle size distribution and large surface area were prepared by a polymer templated method. The microspheres were used as solidphase adsorbents for extraction of genomic deoxyribonucleic acid (DNA) from biological samples. Effects of experimental parameters including composition of capturing buffer and elution time on the yields of DNA isolated using the magnetic microspheres were examined and compared with those obtained with spherical and irregular silica particles. Results show that recovery yields of DNA up to 80% can be obtained on solidphase adsorbents with a capturing buffer composed of 20% polyethylene glycol (PEG) and 2 mol/L NaCl and elution time of 10 min. The magnetic microspheres and silica particles were applied for isolation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae after the cells were lysed and the genomic DNA fragments of about 5 kb were obtained with the A260/A280 values in the range of 1.771.82. The magnetic microspheres are comparable with the silica particles in terms of yield and purity of DNA isolated. Keywords Magnetic microspheres, silica, nucleic acid, yeast 1 引 言核酸分离纯化是许多分子生物学和现代医学研究中的重要内容。从生物样品中提取脱氧核糖核酸（DNA）的常规方法涉及有机溶剂抽提、醇沉淀和离心等步骤。这个过程耗时费力，不易实现自动化。Vogelstein等1报道在高浓度碘化钠存在下玻璃粉末作为吸附剂用于从琼脂糖凝胶中提取DNA片段以来，基于硅胶和其他具有亲水性表面的载体的固相核酸纯化技术被广泛采用25。基于磁性微粒的核酸纯化方法就是其中的一种。利用磁分离技术进行核酸纯化通常要经历吸附、洗涤和脱附等3个步骤。核酸在高浓度变性剂或聚乙二醇(PEG)溶液中被吸附到磁性微粒的表面。然后利用外磁场将负载核酸的磁性微粒从样品溶液中分离出来，经适当清洗后，在水中脱附即得到纯化核酸。 磁性微粒是磁性固相核酸提取技术中的关键成分。由于核酸吸附剂含有高浓度盐或表面活性剂，加入核酸样品后使得溶液的粘度增大。因此，利用外磁场从样品溶液中分离磁性微粒，就要求磁性微粒具有较高的磁化强度。本研究报道了利用自主研发的专利技术制备磁响应性高、粒径分布均匀和比表面积大的多孔磁性硅胶微球，用于生物样品中核酸的分离纯化。以球形硅胶和无定型硅胶为对照，考察了吸附剂组成和洗脱时间等实验参数对小牛胸腺基因组DNA在磁性硅胶固相载体上的提取回收率的影响。并将其应用于酿酒酵母基因组DNA的分离纯化。2 实验部分2.1 仪器、试剂和材料UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；磁分离架（美国Promega生物技术公司）；DYY7型转移电泳仪（北京六一仪器厂）；BioDocItTM紫外成像系统（英国UVP公司）。小牛胸腺（天津市北辰区红光农场）；无定型层析硅胶（5075 m，青岛海洋化工有限公司）；BaseLine球形硅胶（天津市倍思乐色谱技术开发中心）, 1 kb DNA ladder (北京鼎国生物技术有限责任公司）。PEG8000（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；NaCl为分析纯。其他试剂均为分析纯，实验用水为过0.45 m膜的二次蒸馏水。2.2 溶液配制PBS 缓冲液: 在800mL蒸馏水中溶解8 g NaCl、0.2 g KCl。1.44 g Na2HPO4 和0.24 g KH2PO4，用HCl调溶液pH 值至7.4，加水定容至1 L，在1 bf/in2(1.034105 Pa)高压蒸汽灭菌20 min，保存于室温；细胞裂解液：100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/L EDTA2Na, 1% Triton X100, 2% SDS；核酸吸附液：20%PEG8000，2.0 mol/L NaCl；TE缓冲液: 10 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/L EDTA2Na, pH 7.8；TAE缓冲液: 242 g Tris, 57.1 mL 冰乙酸，100 mL EDTA2Na, 定容至1000 mL，pH 8。2.3 实验方法 2.3 磁性硅胶微球的制备 磁性硅胶微球按文献6合成。. 标准小牛胸腺DNA的制备 用作标准参照物的小牛胸腺基因组DNA按文献7方法(浓盐法)制备。用紫外光谱测定DNA标准物的A260/A280为1.8。将制备得到的50 mg小牛胸腺DNA溶于10 mL 10NaCl溶液中得到浓度为5 g/L的DNA标准溶液备用。 2.3.3 小牛胸腺DNA在固相介质上的吸附和洗脱 称取磁性微球、球形硅胶和层析硅胶各0.06g于7 mL离心管中，用PBS悬液洗涤两次后，加入悬液6.0 mL，摇匀。然后各取1.0 mL于6个1.5 mL 微离心管中，磁性微球在磁分离架上分离并用吸管除去悬液，硅胶则通过1000 r/min离心5min分离，弃去悬液。在上述微离心管中各加入不同组成的核酸吸附液1.0 mL，再分别加入不同体积的DNA标准溶液（浓度为5 g/L），涡旋混匀。室温下振摇10 min。磁性微球在磁场下分离并弃去上清液，硅胶则通过离心分离除去上清液。用70%乙醇洗涤磁性微球和硅胶各两次。室温常压风干乙醇。再向洗涤后的磁性微球或硅胶中加入TE缓冲液1.0 mL，涡旋混匀，脱附10 min。磁场下分离磁性微球，或离心分离硅胶，吸取洗脱液用于紫外检测。 2.3.4 酿酒酵母DNA的提取 量取酿酒酵母菌液（A600=1.7）40 mL于50 mL离心管中，以2000 r/min 离心5 min，倾去上层清液，得湿菌体0.6 g，加入细胞裂解液6.0 mL，于4裂解30 min，得裂解粗液。称取磁性微球、球形硅胶和层析硅胶各0.01 g于7 mL 离心管中，用PBS悬液洗涤后，分别于磁场下或1000 r/min离心5 min分离，洗液弃去。分别加入裂解粗液各1.0 mL，再加入吸附液4.0 mL。室温孵化10 min。分别于磁场下和离心分离，吸弃清液。用70乙醇洗涤磁性微球和硅胶两次，弃去洗涤液。室温常压风干。最后加入TE缓冲液200 L, 混匀，脱附10 min, 于磁场下和离心分离，吸取清液作凝胶电泳和紫外检测。2.5 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 将样品溶液与0.1倍体积的溴酚蓝水溶液40（）蔗糖、025（/）溴酚蓝和1/6体积的50TAE缓冲液上样，在用0.001（）溴化乙啶染色的1琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为80 V。并用紫外成像系统进行检测。3 结果与讨论3.1 实验条件对DNA回收率的影响固相核酸提取技术的要点是选择合适的固相吸附剂与相应的吸附液组成，使得目标核酸选择性地吸附到固相载体的表面而样品中的杂质成分如蛋白质则仍滞留在溶液中。因此，实验考察了核酸吸附剂中聚乙二醇和NaCl的浓度、脱附时间及共存蛋白质对磁性微球纯化DNA的回收率的影响。同时，以硅胶为参照，对比了核酸在不同固相载体上的提取回收率。所用固相载体的物理参数列于表1。表1 核酸固相吸附剂的物理特性（略）3.1.1 聚乙二醇含量对DNA提取回收率的影响 聚乙二醇（PEG）是核酸的有效沉淀剂。通过初步实验确定PEG8000为核酸吸附液的主成分。通过改变核酸吸附液中PEG的含量考察其对DNA在固相吸附剂上吸附和脱附的影响，结果见图1。当NaCl浓度为2.0 mol/L 时，DNA的回收率随吸附液中PEG百分含量的增加而上升，在20时，DNA的回收率达到80的最高值。此后，DNA的回收率随着PEG用量增加而降低。这可能是由于吸附液粘度随着PEG用量的增加而加大，影响了固相载体从溶液中的完全分离，而导致回收率的降低。DNA在3种不同固相载体上的回收率数据略有差别，但是，随PEG用量变化而变化的趋势大致相同。3.1.2 NaCl浓度对DNA回收率的影响 由于NaCl对于含有SDS的DNA样品的沉淀效果较好，因此在细胞裂解液中含有SDS时，首选NaCl。考察了NaCl浓度对DNA在固相介质吸附的影响，结果见图2。在PEG8000的浓度固定为20%的条件下，DNA的回收率随着吸附液中NaCl浓度的增大而略有增加。在2.0 mol/L时，DNA的回收率可达80。当浓度继续增大时，溶液粘度将会增大，妨碍固相载体的分离，从而影响DNA的回收率。 3.1.3 洗脱时间和溶液对DNA回收率的影响 TE缓冲液可在10 min内，将DNA从磁性微球上完全洗脱下来，DNA在整个吸附、洗涤和洗脱过程中，损失很小。也可用去离子水洗脱。在水或TE缓冲液中，离子强度极低，静电排斥增强，将大大削弱DNA在极性表面如硅胶表面的吸附10。洗脱液中水分子和DNA分子竞争硅醇基，使DNA分子脱附而溶解。3.2 利用磁性微球和硅胶从酿酒酵母中提取基因组DNA作为一种模式生物，酵母已成为基因工程中具有良好发展前景的受菌体而受到广泛的关注。Danilevich等1报道了用盐酸胍和硫氰酸胍等变性盐，使蛋白质变性，部分损伤酵母菌细胞壁，获得小片段DNA分子的研究。本实验采用了一种更为简单的细胞裂解液体系得到了约5 kb大小的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳检测见图3,紫外吸收光谱测定DNA的产率及纯度数据列于表2。以磁性微球和硅胶作固相载体，提取的DNA和用氯仿异戊醇抽提所得效果基本相同。根据A260/A280均大于1.77可知，纯化得到的DNA模板中基本上不存在蛋白质。去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）可溶解细胞壁上的蛋白质，形成了细胞壁空穴，胞膜也会被从细胞壁孔结构进入的裂解液破碎，细胞核里的基因组DNA被释放入受损细胞壁中，从细胞核中释放出的DNA呈长链状，易断裂。断裂的小片段基因组DNA可以透过细胞壁上的孔穴而被提取出来。这可能是只观测到5 kb左右DNA片段的主要原因。 表2 固相吸附法提取酵母基因组DNA的产率及纯度（略） 结论用模板法制备得到的多孔磁性硅胶微球，具有磁响应性强、粒径分布均匀和比表面积大的特点，可方便地应用于生物样品中基因组核酸的分离纯化。与传统核酸提取技术相比，基于磁性微球的方法不仅简化了提取条件与步骤，减少了溶剂污染和消耗，而且缩短了提取时间，使PCR扩增，核酸杂交等分子生物学技术的前期样品处理更趋于简便快速。References1 Vogelstein B, Gillespiet D. Proc Natl. Acad. Sci. USA， 1979, 76 (2): 6156192 Tian H J, Hhmer A F R, Landers J P Anal. Biochem., 2000, 283: 1751913 Dederich D A, Okwuonu G, Garner T, Denn A, Sutton A, Escotto M, Martindale A, Delgado O, Muzny D M, Gibbs R A, Metzker M L Nucleic Acids Res., 2002, 30 (7): e324 Levison P R, Badger S E, Dennis J, Hathi P, Davies M J, Bruce I J, Schimkat D. Chromatogr. A, 1998, 816： 1071115 Wolfe K A， Breadmore M C，Ferrance J P , Power M E, Conroy J F, Norris P M, Landers J P Electrophoresis， 2002, 23: 7277336 Wan Qianhong（万谦宏），Chen Lei（陈 磊），Zhang Zhichao（张志超）