（发酵工程专业论文）利用分枝杆菌降解植物甾醇生产雄甾烯酮的研究.pdf

摘要 本实验利用分枝杆菌m 1 与m 2 切除植物甾醇c t 7 位边链，制备a d d 与 a d ，主要研究内容包括以下几个方面： 1 分析测定方法的建立：薄层层析法，以乙酸乙酯：石油醚( 6 ：4 ) 作 为展层剂，以硅胶作为固定相，主要用于定性分析底物与产物；紫外吸光光 度法，采用双波长( 2 s 4 n m 与2 9 8 n m ) 检测，主要用于快速定量分析a d d 与 a d ；根据高效液相色谱与薄层层析相同的工作原理，采用硅胶柱，在薄层层 析分析法基础上建立了高效液相色谱法，同时建立了两种定量测定方法：标 准曲线法与内标法，高效液相色谱法主要用于准确定量测定产物a d d 与a d ； 气相色谱法，采用f i d 检测器和大口径毛细管柱，主要用于分析底物甾醇， 根据f i d 的工作原理，确定了各物质的相对校正因子，气相色谱法可用于定 量分析底物的四种成份和产物a d ( d ) 在发酵液中的相对含量。 2 生产菌种的性质：实验中发现菌体在培养过程中随着营养物质的消耗， 细胞形态发生有规律的变化，从长杆状逐渐变为短杆状，最后变为球形；这 种形态分化与菌体降解甾醇的活性有定相关性：当菌体为长杆状时转化活 性很高；当菌体变为短杆状时转化活性明显下降：菌体变为球形时转化活力 基本消失。两株实验菌m 1 与m 2 在菌体形态上没有区别，但在生产能力上 有较大差别，根据菌株对底物转化能力的大小，选择m 2 作为主要研究对象。 3 工艺参数的确定：详细研究了一级转化法与二级转化法两种工艺。一 级转化法中：斜面种子用m y c s 2 培养基2 9 ( 3 恒温培养6 0 h ，冷冻保藏不超 过2 0 d ，转接发酵培养基m y c 0 2 的接种量为7 ；二级转化法中：液体种子 的接种种龄为3 5 h 4 0 h ，以7 的接种量接种发酵培养基m y c 0 2 ，并优化了 发酵培养基的培养条件：p h = 7 0 、温度2 9 + c 、保证充足的溶氧。 4 投料的方式：通过对乙醇法、t w e e n 8 0 法、环糊精法及超声波法等的 试验，确定以t w e e n 8 0 乳化底物的投料方式，即用0 5 1 0 的t w e e n 9 0 悬 浮甾醇，在1 2 0 4 c 高温中乳化，然后用于配制发酵培养基m y c 0 2 。 5 5 l 发酵罐转化工艺优化：在摇瓶实验的基础上，进行了5 l 罐扩大培 养实验，在培养过程中保持转化温度为2 9 。c ，流加1 0 n a o h 与2 m 盐酸控 制d h 为7 0 ，通过调节空气流量与搅拌转速保持充足的供氧。5 l 罐转化结果 ( 挈 化1 6 8 h ) ：投料量为0 3 ，底物转化率为1 0 0 ，a d ( d ) 产率为9 0 以 上；投料量为o 5 ，底物转化率为9 5 左右，a d ( d ) 产率为8 5 左右； 投料量为1 o ，底物转化率为5 0 6 0 ，产物生成率在5 0 左右。 关键词：分枝杆菌，侧链降解，植物甾醇，雄甾一4 - 烯一3 ，1 7 一二酮，雄辔一1 ，4 - 二烯3 ，17 一二酮 a b s t r a c t i nt h i s e x p e r i m e n t ，p h y t o s t e r o l s w e r ec l e a v e ds u c c e s s f u l l yi n t oa d da n da d t h r o u g hc l e a v i n gt h ec 1 7s i d ec h a i no fs t e r o l sb ym y c o b a c t e r i u mm 1a n dm 2 t h e m a i n l yr e s e a r c h i n gc o n t e n t sa r c b l o w ： 1 t h em e t h o d so f a n a l y s i s a n dd e t e r m i n a t i o n ：t h em e t h o do f l a y e r c h r o m a t o g r a p h yw h i c he m p l o y e ds i l i c ag e la n de t h e r - e t h y la c e t a t e - p e t r o l e u m ( 6 ：4 ) w a s m a i n l y u s e dt oq u a l i t a t i v e l ya n a l y z et h es u b s t r a t e sa n dt h e p r o d u c t s t h eu l t r a v i o l e ta b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r yw h i c hw o r k e da tt w ok i n d so fw a v e l e n g t h ( 2 5 4 n m a n d2 9 8 u m ) w a s m a i n l yu s e d t oq u a n t i t a t i v e l ya n a l y z ea d da n d a d a c c o r d i n g t ot h es i m i l a rw o r kt h e o r yo ft h el a y e rc h r o m a t o g r a p h ya n dt h e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , t h em e t h o do fh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t hs i l i c ag e lc o l u m nw a se s t a b l i s h e d t h r o u g ht h e m e t h o d so fc a l i b r a t i o nc o l - v ea n di n t e r n a ls t a n d a r d ，t h ep r o d u c t sa d da n da d c o u l db eq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e d u s i n gf i dd e t e c t o ra n d l a r g ec a l i b r ec a p i l l a r y c o h m m ，t h eg a sc h r o m a t o g r a p h yc o u l db eu s e dt oa n a l y z et h ef o u rk i n d so f p h y t o s t e r o l si nt h es u b s t r a t e a n da c c o r d i n gt ot h ew o r kt h e o r yo ff i dd e t e c t o r , t h er e l a t i v ee m e n d a t i o nf a c t o r sw e r ed e t e r m i n e d s ot h eg a sc h r o m a t o g r a p h y c o u l db eu s e dt oa n a l y z et h es t e r o l sa n d a d ( d ) i n t h ef e r m e n t a t i o ns a m p l e 2 t h eq u a l i t yo f s t r a i n su s e di n p r o d u c t i o n ：d u r i n gt h ec o n s u m i n go f n u t r i t i o n ，t h e c e l lm o r p hc h a n g e d r e g u l a r l yf r o ml o n gb a c i l l it os h o r tb a c i l l ia n dl a s tt oc o c c i t h es t r a i nc a p a c i t yo f c l e a v i n gs t e r o l sh a ds o m er e l a t i o n s h i pt ot h ec e l lm o r p h t h et r a n s f o r m a t i o nc a p a c i t yw a sh i g hw h e nt h ec e l lw a sl o n gb a c i l l i ，b u tt h e t r a n s f o r m a t i o n c a p a c i t yb e c a m el o ww h e n t h ec e l lb e c a m et os h o r tb a c i l l i ，a n dl a s t w h e nt h ec e l lm o r p ht u r nt oc o c c i ，t h et r a n s f o r m a t i o nd i s a p p e a r e d t h e r ew e r en o d i f f e r e n c ei nc e l lm o r p hb e t w e e n m y c o b a c t e r i u mm 1 a n dm 2 ，b u tt h e i rp r o d u c t i o n c a p a b i l i t yw a sd i f f e r e n t a c c o r d i n gt ot h e i rt r a n s f o r m a t i o nc a p a b i l i t y , s t r a i nm 2 w a ss e l e c t e da st h em a i n l y r e s e a r c h i n go b j e c t 3 t h ep a r a m e t e r s o f p r o c e s s e s ：i nt h i se x p e r i m e n to n es t e pp r o c e s sa n dt w os t e p s p r o c e s sw e r es t u d i e di nd e t a i l a n dt h ep a r a m e t e r so fp r o c e s s e sw e r ed e t e r m i n e d ， f o ri n s t a n c e ：i no n es t e pp r o c e s s ，t h es l a n tc u l t u r es h o u l db ec u l t u r e di nc u l t u r e m e d i u mm y c s 2u n d e r2 9 a n di t sp r e s e r v a t i v et i m es h o u l db en om o r e t h a n2 0 d a y s ，t h ei n o c u l a t i o nq u a n t u mt om y c 0 2s h o u l db e7 a n di nt h et w os t e p s p r o c e s s ，t h el i q u i dc u l t u r es h o u l db ea d d e dt ot h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mi nt h e p e r i o do f 3 5 h 4 0 hb y7 o fm y c 0 2 t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n so f m y c 0 2 w e r ea l s od e t e r m i n e d ，f o ri n s t a n c e ：p h = 7 0 ，c u l t u r et e m p e r a t u r ew a s 2 94 ca n d 2 t h ed i s s o l v e d o x y g e n s h o u l db e a m p l e 4 1 1 1 em e t h o d so fa d d i n gs u b s t r a t e ：a m o n gt h em e t h o d so fa d d i n ga l c o h 0 1 c y c l o d e x t r i n , t w e e n s 0a n du l t r a s o n i c 、e m p l o y i n go 3 l t w e e n 8 0t od i s p e r s e s u b s t r a t ei st h eb e s tm e t h o d i nt h i sm e t h o dp h y t o s t e r o l sw e r es u s p e n d e di n 0 5 - 1 o t w e e n 8 0 ，a n dt h es u s p e n d i n gl i q u i dw a se m u l s i f i e di n1 2 0 ，t h e ni t w a su s e dt op r e p a r ef e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u mm y c 0 2 5 t h eo p t i m i z a t i o no f t r a n s f o r m a t i o n p r o c e s si n5 lf e r m e n t a t i o nr e a c t o r ：b a s e d o nt h ee x p e r i m e n t so ff l a s k ，t h eo p e r a t i o np a r a m e t e r so f5 lf e r m e n t a t i o nr e a c t o r w e r ee s t a b l i s h e d d u r i n gt h ec o u r s eo f c u l t i v a t i o n ，t h et e m p e r a t u r ew a sc o n t r o l l e d i t l2 9 t h ep h = 7w a s a d j u s t e dt h r o u g ha d d i n g1 0 n a o h a n d2 m h y d r o c h l o r i c a c i d ，a n d t h ea b u n d a n to x y g e nc o u l db ea c q u i r e dt h r o u g h a d j u s t i n gt h ea i r f l u xa n d t h es t i rr o t a t es p e e d t h et r a n s f o r m a t i o ne f f e c t s ( t r a n s f o r m a t i o n1 6 8 h ) o f5 l f e r m e n t a t i o nl ：e a c t o rw e r eb e t o w ：w b 鲫t h ea d d i n gr a t ev q a s0 3 ，t h es u b s t r a t e t r a n s f o 衄a t i o nr a t ew a s1 0 0 a n da d ( d ) y i e l dr a t ew a sa b o v e9 0 w h e n t h e a d d i n gr a t ew a s0 5 ，t h es u b s t r a t et r a n s f o r m a t i o n r a t ew a sa b o u t9 5 ，a n da d ( d ) y i e l dr a t e w a sa b o u t8 5 w h e nt h ea d d i n gr a t ew a s1 0 ，t h es u b s t r a t e t r a i l s f o r m a t i o nr a t ew a s5 0 6 0 ，a n da d ( d ) y i e l dr a t ew a sa b o u t5 0 k e yw o r d s ：m y c o b c t e r i u ms p ，s i d e c h a i nc l e a v a g e d e g r a d a t i o n , p h y t o s t e r o l ， a n d r o s t a - 4 e n e 一3 ，1 7 d i o n e ，a n d r s t a - 1 ，4 - d i e n e 一3 ，1 7 - d i o n e 3 一鲞里型茎奎堂壁主兰垡丝塞 第一章前言 1 ，1 蟹俸化食物的结构、分类与嗡床应用h 6 】 甾俸他合物( s t e r o i d s ) x 称类蘑醇，怒一类含有筇戊烷多氢萋犊魏纯台戆， 缩构通式如图1 - 1 虚线框中所示。由三个六元环和一个五元环组成，分别称 为a 、b 、c 、d 环，在母核的第l o 弱1 3 位有角甲熬( ，c h 3 ) ，簇3 、1 1 、1 7 稼可能霄羟嫠( - o h ) 或酾鏊( 一c = 。) ，a 环或b 环存在灏分双键，第i7 位土畜 长短不同的侧链。由于甾体母核上取代熬、双键位嚣戚立体构型镰的不同， 形成了系歹g 蹙有独特生溅功能的化合物p , 2 1 。 1 - 1 甾体化合物的基本结构 器淬识台秘广泛存程予动、蘸秘筑缓蕺菜骜徽黛魏懿缓缝孛，魄较黪燕 的有：动物组织中的臌周醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 、胆酸( c h o l i ca e i d ) 、皮质醇 f c o r t i c o r t i s o n e ) 和皮质酮( c o r t i c o s t e r o n e ) 等肾上腺皮质激索，雄酮 ( a n d r o s t e r o n e ) 、孕黧( p r o g e s t e r o n e ) n 耱二醇( o e s t e r 0 1 ) 等蛙澈素；攘兹中麴薯 警皂素( d i o s g e n i n ) 、谷甾醇( s i t o e t e r 0 1 ) 、豆甾醇( s t i g e s t e r 0 1 ) 和菜油甾醇 ( c a m p e s t e r 0 1 ) 等 酵母细胞中的麦角固醇( a a g o s t e r 0 1 ) 祷。 甾嚣激素蘩携嚣瓠髂起簧 霉重鬟麓调节终臻，羧誉麓“叟愈戆锯匙叫”。 如肾上腺皮质激素能治疗戚缓解胶原悭疾病、过敏骸休克等疾瘸；同时也是 治疗阿狄森氏等内分泌疾瘸不可缺少妁药物。关于甾体激素的作用原理，人 髑警速接受“羞鏊表这攀谈”，该学嚣认受篷露激素分子蟹, l , ( 3 0 0 m r 左袁) ， 脂溶性大，因而易透过细胞壁膜进入细胞，激素首先与胞浆受体缩合，形成 第一章文献综述 复合物，该复合物经变构获得透过核膜的能力，然后与核内受体相结合，进 而启动或抑制d n a 的转录过程，最终诱导或抑制新蛋白的生成，引起各种生 理改变。 自二十世纪5 0 年代以来，随着甾体化学的迅速发展，甾体激素药物已逐 渐成为医药领域的重要门类，在临床上的应用日益广泛。在世界范围内其产 量仅次于抗生素，为第二大类药物，产值每年以1 5 的速度递增，2 0 0 0 年销 售额突破2 0 0 亿美元。 与甾体化合物有关的激素药物主要分为三大类： 1 肾上腺皮震激素( a d r e n n o c o r t i e o s t e r o i d s ) ：简称皮质激素，包括盐皮质 激素和糖皮质激素两类。盐皮质激素( m i n e r a l o e o r t i c o i d s ) 在体内主要影响水盐 代谢，主要药物有醛固酮( a l d o s t e r o n e ) ，临床上主要应用予治疗阿狄森氏内分 泌疾病。糖皮质激素( g l u c o e o r t i c o i d s ) ，主要生理作用是影响糖、蛋白质、脂 肪和水盐代谢，主要有可的松( c o r s t i s o n e ) 、泼泥松( p r e d n i s o n e ) 、地塞米松 ( d e x a m e t h a s o n e ) 、倍他米松( b e t a m e t h a s o n e ) 等，其主要功效为抗炎、抗毒、 抗过敏、免疫抑制、对风湿性、类风湿性关节炎、红斑狼疮等胶原性疾病有 明显的治疗作用。 2 性激素( s e xh o r m o n e ) ，包括雌激素、孕激素和雄激素。雌激素( e s t r o g e n s ) 主要有雌酮( o e s t r o n e ) 、雌三醇( e s t r i 0 1 ) 等，孕激素( p r o g e s t o e n s ) 主e 要有孕酮 ( p r o g e s t e r o n e ) ，临床上常用于治疗妇科疾病，骨质疏松等。雄激素( a n d r o g e n s ) ， 主要有睾酮( t e s t o s t e r o n e ) ，临床上主要用于两性性机能不全所致的疾病，还可 用于治疗贫血、消耗性疾病以及促进骨折和伤口的愈合等。 3 蛋白同化激素( a n a b o l i cs t e r o i d s ) ：主要有1 7a 一甲基去氢睾丸素( 1 7 q m e t h y l d e h y d r o - t e s t o s t e r o n e ) 、苯丙酸诺龙( n a n d r o l o n e p h y l p r o p i o n a t e ) 等，主要 用于蛋白质合成不足和分解增加的治疗，如营养不良、严重烧伤、恶性肿瘤、 手术后恢复期过长、慢性消耗性疾病以及长期大剂量使用糖皮质激素引起的 负氮平衡等。 1 2 甾体医药工业发展筒史 1 2 1 甾体药物研究发展史 甾体化合物所具有的特殊生理活性早在1 0 0 多年前已经引起人们的关注， 天津科技大学硕士学位论文 二十世纪二十年代，某些天然甾醇被发现具有雌激素和雄激素的活性。到了 3 0 年代人们已经成功地从肾上腺、性腺或尿中，提取和分离到多种天然甾体 激素结晶，并确定了其化学结构，陆续开始人工合成的工作。如3 0 年化早期， m a y o 基金会的e d w a r dc k e n d a l l 分离到了可的松；1 9 3 7 年巴塞尔大学的 t a d e u s r e i c h s t e i n 成功合成了第一副肾皮质激素一去氧皮质酮 ( d e s o x y c o r t i c o s t e r o n e ) ；1 9 4 9 年美国m e r c k 公司在工业规模上研究成功了甾 体化合物的化学合成法嘲。这些工作只是探索性的，未受到应有的重视。直 到1 9 4 9 年m a y o 基金会的p h i l i ps h e n c h 宣布可的松对风湿性关节炎和急性 风湿热有显著效果，震动了医药界，可的松抗炎效果的发现对医学领域具有 极其深远的影响。k e n d a l l ，r e i e h s t e i n 和h e n c h 因此于1 9 5 0 年共同荣获诺贝 尔奖 9 】。甾体激素类药物在临床上获得的成功，促进了甾体化学的快速发展， 科学家们开始加大力量研究探索甾体药物的合成。 最初化学家们将希望寄予化学合成法。甾体化合物结构十分复杂，含有 几个不对称中心，尤其是它的活性高低多取决于取代基，而且往往是特定位 点的取代基，如c l i 。位上的羟基( o h ) ，c l , 2 位的双键等，这就给化学合成 法带来了极大的困难。美国m e r c k 公司s a r e t t 等人用两年时间从5 7 6 公斤的 脱氧胆酸中经过3 2 步化学反应，合成了9 3 8 毫克的醋酸可的松( c o r t i s o n e a c e t a t e ) ，收率仅为0 1 6 。制备成的可的松每克价值高达2 0 0 美元，根本谈 不上经济效益，也无法进行工业化生产。 化学合成法应用于甾体化合物最大的局限性在于它的选择性较差，尤其 是在甾体母核的c 位引入甾体活性所必须的氧原子极其困难。从脱氧胆酸 到可的松的合成中，仅将氧原子从c 1 2 位转移至c 1 i 位就需1 0 步反应。这时 人们的目光开始转向微生物领域。生物酶催化的酶反应所具有的高度专一性， 恰能弥补化学合成在此方面的不足，将生物酶引入甾体化合物的转化成了一 种理想的经济模式。1 9 5 2 年美国u p j o h n 公司p e t e r s o n 和m u r r a y 首先发现少 根根霉僻h i z o p u sa r r h i z u s ) ，以后又发现黑根霉( r h i z o p u s n i g r i c a n s ) 能使黄体酮 一步转化成1 1a 羟基黄体酮，收率达8 5 以上，解决了生产可的松等皮质激 素药物的最大难题。化学合成难以完成的反应，利用微生物轻易而举得到了 实现，开创了微生物转化甾体化合物的先河。几乎同时又发现银样链霉菌 f s 神幻聊y c p sd 馏口触 o ，淞) 能将孕酮氧化成1 6o 羟基孕酮，该反应对合成抗炎 第一章文献综述 活性更强的1 6n 羟基一9n - 氟氢化泼泥松( 1 6q h y d r o x y 一9 n f l u o r o p r e d n i s o l o n e ) 有重要作用。1 9 5 5 年s k u l l 和k i t a 用新月弯孢霉( c u r v u l a r i a l u n a t a ) 由脱氧皮质醇经1 1b 羟基化作用制成了皮质醇。随后人们又相继发现 细菌、放线菌、酵母、霉菌的某些菌种可以使甾体化合物的一定部位发生有 价值的转化反应，微生物在甾体激素转化中的应用日益扩大。将化学合成与 微生物转化相结合的生产工艺推动了甾体药物的工业化大生产。从此诞生了 - - f j 新的工业，微生物的应用也拓宽了一个新的领域一甾体微生物转化1 1 0 - 1 3 1 。 1 2 2 甾体激素生产原料的发展 在理论上甾体药物可通过化学全合成法和半合成法合成 1 4 ，由于上面提 及的一些原因，当今甾体药物的制备主要依赖于半合成，即利用天然甾体骨 架进行结构改造。自从发现人体中肾上腺皮质激素的生理效应以来，科学工 作者开始致力于肾上腺皮质甾体激素合成的研究。早期，合成甾体激素的起 始原料大多是来自动物的胆固醇、胆酸等，由于这些原料的来源少，含量低， 合成路线长，成本高，不能满足生产的需要，因此科学工作者开始努力从植 物中寻找起始原料，薯芋皂素的发现和应用，为甾体药物工业化生产提供了 资源丰富而又经济的天然甾体原料。本世纪3 0 年代中期，日本人藤井胜也， 冢本赳夫等从山蓖藓( d i o s c o r e a t o k o r om a k i n o ) q 6 分离出薯芋皂素，5 0 年代初， m a r k e r 发明了霉菌氧化，在甾体1 1 位引入了羟基，同时薯芋皂素又具有5 位双键和3 位羟基的特点，这些工作为生产甾体药物奠定了基础。薯芋皂素 作为合成甾体药物的良好原料，在相当长的一段时期内，占据着主导地位， 当前世纪各国用来制取甾体药物的天然资源仍大多是薯芋皂素( 约占7 0 】，我 国基本上全部以薯芋皂素为原料。 1 5 - 1 8 墨西哥是薯芋皂素的主产国，由于甾体药物工业对薯芋皂素的需求日增， 薯芋资源日渐枯竭，1 9 7 0 年以后，墨西哥一再强制提高薯芋原料的价格，从 1 9 7 3 年每吨6 0 0 美元猛涨至1 9 7 6 年的5 ，6 0 0 美元。原料价格的大副上升，迫 使一些大公司努力开拓新的资源。其问出现了许多薯芋皂素的替代产品如澳 州茄碱( s o l a s o d i o n e ) 、海柯皂素( h e c o g e n i n ) 、替告皂素( t i g o g e n i n ) 等。但其中 成就最突出的是日本东京大学名誉教授a r i m a 和威斯康辛药学系教授s i h 发 现微生物可降解甾体化合物的c 1 7 位侧链，这一发现使得原来自薯芋皂素制备 甾体药物的工业生产结构发生了重大的变革，人们可以直接利用微生物切除 天然甾醇的侧链生产a d d 与a d ，a d d 与a d 再经化学方法进行结构改造可 4 天津科技大学硕士学位论文 得到一系列有价值的甾体激素化合物。这从根本上改变了薯芋皂素法生产某 些甾体药物步骤多，得率低，价格贵等不足之处i 2 j ) 。其实早在1 9 1 3 年就已发 现微生物能利用胆固醇和植物甾醇作为碳源和能源”4 】，1 9 4 2 年t u r f i t t t 2 2 1 报 道了胆固醇及植物甾酵可作为分枝杆菌生长的唯一碳源，但该菌除了降解这 两种甾醇的侧链外，还会进一步降解甾体的骨架，因此不能用于甾体激素的 生产菌种，直到1 9 6 9 年日本甜h 护，2 4 等人才用添加抑制剂的方法成功抑制 了微生物降解甾核的反应，这就使得甾醇降解产物中仅有a d d 和a d 。另外 m a r s c h e c k 2 5 i 等用诱变的方法筛选到分枝杆菌m y c o b a c t e r i u m n r r lb 3 6 8 3 ， 无需加入抑制剂便能有效降解胆固醇、胆甾酮、植物甾醇等的侧链产生a d d ， 该菌的进一步诱变得到了丧失c i , 2 脱氢酶活力的m y c o b a c t e r i u m n r r l b 一3 8 0 5 的突变株，该菌能有效产生a d 。由于胆固醇、植物甾醇等来源丰富，价格便 宜，许多大的制药公司如日本三菱化成、德国先令( s o b e r i n g a g ) ，荷兰g i s t ， 美国u p j o h n 等己先后开发成功，并已应用于生产f 2 6 湖。 1 3 甾体化合物的微生物转化 甾体化合物广泛存在于动、植物体内，但从自然界获取的这些天然结构 的化合物，往往活性极低，必须对其进行结构改造，以增强其治疗活性，并 克服毒副作用。常用的方法是利用化学合成与微生物转化相结合的工艺路线， 其中微生物转化在整个生产工艺中占有重要地位。微生物转化是指利用微生 物细胞对有机化合物某一特定部位( 基团) 的作用，使它转变为结构上相类 似的另一种化合物。转化的最终产物不是由营养物质经微生物细胞的一系列 代谢过程后产生的，而是利用微生物细胞的酶系对底物的某一特定部位进行 催化反应形成的。 1 3 1 甾体化合物微生物转化反应类型 微生物对甾体化合物的转化反应是多种多样的，它们对甾体每一位置 ( 包括甾体母核和侧链) 上的原子或基团都有可能进行生物转化垆1 ( 见图1 - 2 ) 。 这些反应至今已经发现的主要有氧化、还原、水解、酯化、酰化、异构化、 卤化、a 环开环、边链降解等。以上反应不一定都是单一的转化，有时一种 微生物还可以对某种甾体化合物同时产生数种不同的转化反应。目前在甾体 激素药物的生产中，比较重要的微生物转化反应主要有羟基化、脱氢、边链 第一章文献综述 降解等 2 1 ( 列于表1 - 1 ) 。 十十 | i 图1 - 2 甾体化合物的微生物转化反应位点 表1 - 1 工业上重要的甾体药物微生物转化反应 反应类型反应底物和产物微生物 1 1q o h 1 1 1 3 o h 1 6a o h 1 9 o h 黄体酮一1 1q 黄体酮 化合物s 一氢化可的松 9d 氟氢可的松一9a 一氟1 6 羟基氢可的松 化合物s 一1 9 羟甲基化合物s 黑根霉( r h i z o p u sn i g r i c a n s ) 新月弯孢霉( c u r v u l a r i al u n a t a ) 蓝色犁头霉似b s i d i ac o e r u l e a ) 玫瑰产色链霉菌 ( s t r e t o m y c e s r o s e o c h r o m o g e n u s ) 球墨孢霉( n i g r a s p o r as p h e r i c a ) 芝麻丝核菌( c o r t i c c u ms a s a k i 0 c 1 1 2 _ 脱氢氢化可的松一氢化泼泥松 口，0 鬟2 焉 a 环芳构化反应1 9 去甲基睾丸素一雌二醇 嚣飘即d 查竺竺竺竺三翌二三三兰竺墅竺! 墨翌翌璺塑型 分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u ms p p 1 边链降解 胆甾醇一a d d 、a d 植物甾醇- - - - a d d 、a d 珊瑚红球菌( r h o d o c o c c u s c o r a l l i n e ) 在这些反应中边链降解的重要性仅次于羟基化反应，由于甾体边链降解 的成功开发，使得自然界丰富的甾体资源得到有效的利用，解决了甾体医药 工业中所需原料的问题，促进了甾体医药工业的迅速发展。 1 3 2 甾体微生物转化反应的共性难题 1 3 2 1 底物的溶解性与投料方式 6 一 拍 打 歪里整茎奎堂篓圭皇叁笙壅 甾体化合物在水中的溶解度很低，一般的溶解魔范围在1 0 。5 1 0 m 0 1 l 之翔，属难溶憔或微溶性能合耪1 2 7 1 。籀瓣在水中的溶解度低于2 m g l 1 3 s ，这 往褥甾体底物与生物酶静稳效接触十分困难1 2 。甾俸底妨魏这种戆溶经严重 影响着甾体转化反应的遮翠和产率，也是微生物转化工业中最主要的问题 i e 9 - 3 ”。髫裁常采用添热露枫溶裁的方法来提高整体熊豹在发酵滚中的浓度 l 礁3 砧4 1 。铡如在氢证可酾松筋生产中，常将底耨r s a 露谵溶解程8 0 左右 的乙醇溶液中，再以3 8 的添加量投入到发酵液内进行转化；在1 1a 羟基 缘反应中通鬻将沃氏底貔与涎酮混台聪投双。不鼹的反虚体系积不弼的底物， 选择使餍酶礴税溶帮不裰褥。依据“既要对底甥露较大的溶解程又要对菌 种产生较小潞性”的原则，人们对于有机溶剂的选择开展了大量工作。甲醇、 二甲甄砜、二甲基甲酰胺、乙醇是研究院较多豹四种溶翔，它们均易溶于水 并较容易溶解躐体忧合彩。髫兹在_ i 驶中应用鲍大多楚乙醇，辩麓纯可静稔 的生产和醋酸泼泥松的生产。然而，觅论选择哪种适用的有机溶剂，它对 缎生物细胞的毒害作用都楚不可避免熬，这在很大稷度上制约了底物投料量 的增船。 据文献报道利用环糊精尤其是b 环糊精的包域作用可有效提高甾体底 糖豹溶麓蚀黼。8 】。选择台遮的叠，环糊糖与包埋底物之间的分子比率，可提高 产物懿收率。h e s s c l i n k 3 霹等通过实簸证臻环糨糟髓显著增热分棱轷萤 n r r l b 3 6 8 3 降解胆固醇、谷甾醇及4 - 胆甾烯酮边链生成a d ( 蛳的产率，当 环糨精与底物的摩尔比率为2 ：l 时微生物降解边链的活性可增加1 7 0 倍， a d 静收率扶3 5 4 0 斑麓舞8 0 娃。t ，发酵周期帮由1 7 5 h 减夺弱1 2 0 h e 反应的加快是由于底物磁发酵液中溶解度增大，从而加快了底物分子向细胞 麴接递速度。环糊精在生物转化中仅仪作为甾体增溶剂和反应载体”，并不 影响绍髓瀚生长皖速率帮缁耱密度。 改善底物的投入方斌，将底物磨成细粉状进行“微粒化”处理，或与吐 滠黝混合剃成“平涝颗粒”，或直接趣发醇液中添加表面活性剂如吐温8 0 、 聚乙烯乙醇犟硅酸酯、畦溢2 0 、洗衣糟等方法，都可或多或少_ 琏毂璎蠢蠢甾俸在 发酵液中的溶解度，提高产物的转化鼯和收率p l 。以固体方式投料可实现离 浓度基质转化，使发酵工艺更经济，遐警体微生物转化的新趋势。国内目前 第一奄文献综述 采用离浓发基质转化的照醋酸可的松的脱氢工艺，投料浓度为4 。由于甾体 化合裙的疏永性，在鏊旗浓度较高时产物在发酵液中呈结晶耩国，属于“j 薹l 结晶发酵” 4 0 l 。 8 0 年代中期诞生的双液耀发酵技零农9 0 年代必起的有极相酶技术弓l 入洼 强，搭俸糕物与生物酶的“两厢葙娩”、使人们脊希望从难戳有效接齄的豳境 中走出来【4 1 州。在非水溶性溶液中，酶获得了一些新的特性，如稳定性提高， 底甥专一憔改变及催化新的反应等1 3 叭。目前这方瑟的工作尚处予磷究初裳， 在有机溶黼的选择规律、有机溶裁辩细胞毒惶枫獠研究、两穰培养体系流变 特性和混合特性等方面裔待深入研究和完善，需鼷发酵工程、化学工程、细 胞工程、懿工程、蛋自葳工程和溶裁工程等多学科瓣相互交叉、渗透帮联合 攻关。 1 3 2 。2 纲胞壁膜的阻碍作用 甾体微生物降解是一个缓慢斡过毽，其原因不仅在于底物秘产物溶熊度 低，还在予它们进出微艇物细魏的遮壤也很低。s e d l a c z e k t 4 5 1 认为加入细胞熬 抑制剂或用生物酶处理菌丝体细胞壁进行甾体生物转化是一种陡好的方法。 本实验室的王敏博士f 4 6 】嶷对氢化可的松生产用蘩毅月弯胞霉磷突时发现，在 菌体的生长过程中添加真菌细胞壁撺制荆多氧菌豢能有效加恢1 1 羟基化 反应速率。n i k a i d o 及j a r t i e r l 4 7 1 认为分枝杆菌细胞朕的脂质双层的外层由一臻 可提取的滕质缀成，稻攥蔻酸与阿披彳巍糖缝合生成内层的主要成傍。一些改 变分技轷藏细腱壁署珏缬胞膜完整性的因素如突变、表面活性剂及细胞膜组成 成份生物合成抑制剂等能影晌疏水性投亲水性物质的渗透性，影响细胞对药 物的敏感馁。实验证鼹社5 l 馋炎脂质双鼷多 层蓦厦傀会穆生物合成簿铡潮的1 1 2 - 氯苯丙氨蔽及d l 亮氨酸，作为默聚糖台成的抑制剂如甘氨酸和万古霉素能 显著提高转化效率。 近来鸯人采用聚嚣二醇( p p 囝及穗氧烷 乍势溶裁镬投辩浓度及转键率大 大提高。文献【4 8 】表硝猩p p g 作为溶剂的条件下，m y c o b a c t e r i u ms p m b 3 6 8 3 能成功的将植物甾醇降解为a d ，底物浓度从5 9 几到3 0 9 l ，为了促进植物搿 醇与微生物缨藏的接触，棱兹甾醇溶解在一定量涎p p g 中，转化率最高可达 9 0 。另外硅氧烷也可达到类似结粜。 至型苎查兰堡主堂竺堡奎 1 3 3 反应的转化工艺 微生物对甾体的转化反应是利用微生物细胞的酶催化甾体底物转化为产 物，转化过程通常可分为两个阶段。第一阶段是微生物菌体的培养，提供丰 富的营养，最适的生长温度、p h 、溶解氧等培养条件，使菌体充分繁殖和生 长。第二阶段是加入甾体底物进行转化。根据转化时微生物菌体的状态，将 转化方式分为五种。 ( 1 ) 一步转化法 在培养菌体的适当时间，添加底物，一边继续培养，一边进行甾体的转 化。目前绝大多数甾体药物的生产采用这种方式。 ( 2 ) 静息细胞转化法 在适当的培养基中，使菌体充分生长后，用离心或过滤法分离菌体，将 收集到的菌体悬浮于水或适当缓冲液中，投入底物进行转化。其核心在于易 于控制反应体系中底物与菌体量的比例( 可以自由改变) ，以缩短反应时间， 减少反应的杂质并利于产物的分离纯化【3 9 】。收获的静息细胞在低温下保持活 性，菌体可以重复利用，省却了多次培养菌体的工序。 ( 3 ) 协同转化法 采用两种不同的微生物进行连续的或混合的转化，对甾体化合物进行多 步反应，称为协同转化或混合转化。典型的例子是新月弯孢霉和分枝杆菌或 简单节杆菌协同转化r s a 合成氢化泼泥松。首先利用新月弯孢霉的1 1p 一羟 基化能力转化可的松龙生成皮质醇；再以此为底物，利用分枝杆菌 ( m y c o b a c t e r i u ms m e g 研d 缩) 或简单节杆菌( a r t h r o b a c t e rs i m p l e x ) 的c 1 ，2 脱氢作 用生成氢化泼泥松 4 9 , 5 0 l 。此法可减少中间产物的分离提取工序，简化工艺， 降低生产成本，有时还可以抑制不需要的副反应发生，促进所需产物的形成。 发酵方式一般采用将两种微生物分别培养后按顺序转化f 5 0 , 5 3 - 5 5 】：或将两种微 生物分别培养后混合转化【5 6 】；或将两种微生物混合培养与转化【5 7 1 。 ( 4 ) 固定化菌体或固相酶转化法 随着固定化技术的曰益成熟和发展，在甾体中的应用越来越广泛。甾体 的c 1 2 位脱氢、l lb 羟基化、1 6q 羟基化、1 5 羟基化等反应均有采用固 定化技术进行转化的研究报道 5 8 - 6 3 。采用固定化技术可省去游离细胞培养的 9 第一章文献综述 时间，缩短转化周期，利于产物与菌体的分离。 ( 5 ) 无细胞体系的转化法 利用无细胞体系进行甾体转化研究开始于9 0 年代，1 9 9 3 年s u z u k i l 6 4 1 等 将新月弯孢霉的羟化酶主要组成一细胞色素p 4 5 0 和p 4 5 0 还原酶、n a d p h 等 提取出来( 或加入来自于酵母或猪睾丸微粒体p 4 5 0 还原酶、n a d p h 和二月 桂基卵磷脂d l p c ，其酶的纯度较低)