（材料物理与化学专业论文）高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究.pdf

东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究摘要 高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究 摘要 蜘蛛丝强度高、弹性好、初始模量大、断裂功大，是迄今为止人类所知道的 最强韧的材料之一，所以，模仿蜘蛛吐丝过程生产优良性能的纤维成为高分子材 料领域近年来研究的热点之一。由于蚕丝在组成、成丝机理、结晶及构象等方面 与蜘蛛丝相似，且在一定成丝条件下所得的机械性能可与蜘蛛丝媲美，因此，在 目前无法获得大量可供实验用的蜘蛛丝蛋白质的情况下，本论文以蚕丝蛋白质为 模型，对仿生纺丝技术尤其是合适的纺丝液即再生丝素蛋白水溶液的结构与性质 进行初步的探索性研究，以便为今后的仿生纺丝提供指导。 本论文以与蚕体内天然丝素蛋白质溶液相仿的高浓度再生丝素蛋白水溶液 为主要研究对象进行了相关研究。鉴于再生丝素蛋白水溶液进行仿生纺丝时，将 涉及到再生丝素蛋白水溶液的储存问题，为此，本论文首先研究了高浓度再生丝 素蛋白水溶液在不同温度和浓度下的存放稳定性，发现随着溶液浓度和存放温度 的升高，溶液的稳定性下降，最终将使体系发生凝胶化。发生凝胶化后，部分丝 素蛋白分子转变为p 折叠结构，形成了s i l ki 和s i l ki i 结晶。由本论文的研究表 明，在制备纺丝用再生丝素蛋白水溶液时，应先把稀的再生丝素蛋白水溶液存放 在低温下，然后在纺丝前进行浓缩，这样就可以得到稳定的纺丝用丝素蛋白水溶 液。 为了给今后的仿生纺丝提供指导，本论文对高浓度再生蚕丝蛋白水溶液即纺丝 原液的流变性能进行了研究。结果发现再生丝素蛋白水溶液的粘度非常小，溶液 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究 摘要 切力变稀现象随溶液浓度的增加而减弱。溶液的零切粘度先是随着浓度的升高增 加，并在浓度为3 5 时达到最大值；而当溶液浓度进一步升高到4 0 时，零切 粘度反而下降。 ， 为了制得真正仿生的再生丝素蛋白水溶液，本论文根据蚕体内丝素蛋白溶液 探讨研究了浓度、剪切作用、金属钙离子含量及p h 值等诸多因素对再生丝素蛋 白水溶液结构与性质的影响。结果发现：高浓度的再生丝素蛋白水溶液经过_ 定 的剪切作用后将呈现出光学各向异性的性质。相同浓度下，剪切作用越大，再生 丝素蛋白水溶液中丝素蛋白分子沿剪切作用方向的有序程度也随之增加；在相同 的剪切作用下，再生丝素蛋白水溶液的浓度越高，越容易发生由光学各向同性至 ， 各向异性的的结构转变；并且随着溶液中丝素蛋白浓度的增加，使溶液出现光学 各向异性所需的临界剪切作用力变小；当浓度小于2 9 时，临界剪切作用对浓度 很敏感，而当浓度大于2 9 时，随着浓度的增加，临界剪切作用下降不明显。由 此也说明，只要将溶液浓度增至2 9 左右，已足以使溶液在一定剪切作用下发生 向光学各向异性的转变。再生丝素蛋白水溶液在受剪切作用发生由光学各向同性7 至各向异性的转变过程中，部分丝素蛋白分子构象由无规卷曲或( 和) a 螺旋结 构转变成1 3 折叠结构的。此外，本论文工作还表明，在再生丝素蛋白水溶液中添 加适量的金属钙离子或将溶液p h 调整至呈一定的酸性值，均有利于丝素蛋白分 予向p 折叠结构转变。 ， ： 本论文的上述研究工作表明，再生丝素蛋白水溶液的结构与性质不仅与浓度 有关，还受温度。剪切作用、p h 等诸多因素的影响，因此，i 在制各真正仿生的 纺丝用的再生丝素蛋白水溶液时，不仅要使溶液中丝素蛋白分子的浓度达到与生 物体内相仿的高浓度，还要注意应力、金属离子、p h 值、温度等诸多因素的协 同作用。这也是本课题组下一步的研究重点。 。 关键词：再生丝素蛋白，稳定性，流变，仿生纺丝，剪切作用 东华大学硕士学位论文 高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究摘要 s t u d i e so ns t r u c t u r ea n d p r o p e r t i e so fc o n c e n t r a t e d r e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i na q u e o u ss o l u t i o n s a b s t r a c t s p i d e rs i l ki sk n o w n a so n eo ft h em o s tt o u g h e s tm a t e r i a l si nt h ew o r l df o ri t s r e m a r k a b l em e c h a n i c a lp r o p e r t i e s b i o m i m e t i cs p i n n i n gs t u d yo ns p i d e rs i l kh a s b e c o m eo n eo fl e a d i n ga r e ai np o l y m e rs c i e n c e s i n c et h e r ei ss t i l ln o te n o f i g h m a n - m a d es p i d e rp r o t e i nt h a tc a l lb eo f f e r e dt os t u d ys 西n 1 1 i n g ，a n dt h es i l k w o r m f i b r o i ni sv e r ys i m i l a rt os p i d e rp r o t e i n , s i l kf i b r o i n ( s f ) i ss e l e c t e da sam o d e ls y s t e m i nt h i st h e s i s i nt h i sw o r kt h er e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n ( r s f ) a q u e o u ss o l u t i o n sw i m1 1 i g hs i l k f i b r o i nc o n t e n tw e r ef i r s tp r e p a r e da n dt h es t a b i l i t yo fr s fa q u e o u ss o l u t i o n s 、析m d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n su n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sw a ss t u d i e d i tw a sf o u n dt h a t t h es t a b i l i t yo fs o l u t i o nd e c r e a s e sq u i c k l y 谢t l lt h ei n c r e a s eo fs fc o n c e n t r a t i o na n d t e m p e r a t u r e t h es o l u t i o nt u r n st ob eg e l a t i o ng r a d u a l l yw h e nt h es fc o n c e n t r a t i o n a n dt e m p e r a t u r ek e e pi n c r e a s i n g s o m eo fs i l kf i b r o i ni st u r n e di n t o1 3 - s h e e t c o n f o r m a t i o na n db o t hs i l k ia n ds i l ki ia r ef o r m e da f t e rg e l a t i o n t h ea b o v er e s u l t s i m p l yt h a tt h er s fa q u e o u ss o l u t i o ni sa nu n s t a b l es y s t e ma n di ts h o u l db es t o r e d u n d e rl o wt e m p e r a t u r ea n dc o n c e n t r a t e dj n s tb e f o r es p i n n i n g t h er h e o l o g i c a lb e h a v i o r so fc o n c e n t r a t e dr s f a q u e o u ss o l u t i o n sw e r es t u d i e db y u s i n gah a a k e r s15 0r h e o m e t e r t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ev i s c o s i t yo fc o n c e n t r a t e d r s fa q u e o u ss o l u t i o ni sn o tv e r yh i g h t h e s h e a r - t h i n n i n g b e c o m e sn o t o b v i o u s w i 廿1t h ei n c r e a s eo ft h es fc o n c e n t r a t i o n ，w h i c hi sv e r yd i f f e r e n tf r o mo r d i n a r y p o l y m e rs o l u t i o n s t h ev a l u e o f1 1oi n c r e a s e sg r a d u a l l yw i 也t h e i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o na n dr e a c h e si t sm a x i m u mw h e nt h es fc o n c e n t r a t i o no fs o l u t i o nc o m e s i i i 东华大学硕士学位论文 高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究 摘要 t o35 b u tt h ev a l u eo fr lod e c r e a s e sw h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni sf u r t h e ri n c r e a s i n g t h eo p t i c a lp r o p e r t i e so fc o n c e n t r a t e dr s fa q u e o u ss o l u t i o n sw e r ea l s os t u d i e d i t w a sf o u n dt h a tt h ec o n c e n t r a t e dr s fa q u e o u ss o l u t i o n sa r eo p t i c a l l ya n i s o t r o p i ci f s u f f i c i e n ts h e a r 话a p p l i e da n dt h ec r i t i c a ls h e a rf o r c ea tw h i c ht h es o l u t i o nb e c o m e s o p t i c a l l ya n i s o t r o p i ci sd e c r e a s e d 、耐mt h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no ft h es o l u t i o n w h e nt h ec o n t e n to fs i l kf i b r o i ni nt h es o l u t i o ni sl o w e rt h a n2 9 ，t h ec r i t i c a ls h e a r f o r c ei ss e n s i t i v et ot h ec o n c e n t r a t i o n r a m a ns p e c t r aa n a l y s i ss h o w st h a ts t r u c t u r e c h a n g e sf r o mc o i la n d ( o r ) ah e l i xc o n f o r m a t i o nt o1 3 - s h e e tc o n f o r m a t i o ni nt h e s o l u t i o ni f a na p p r o p r i a t es h e a rf o r c ei sa p p l i e d i tw a sa l s of o u n dt h a ta p p r o p r i a t e a c c r e t i o no fc a 寸i nt h es o l u t i o no rc h a n g i n gt h ev a l u eo fp ho fs o l u t i o nt o a l l a p p r o p r i a t ea c i d i t y v a l u ec a na c c e l e r a t es i l kf i b r o i nt of o r mp - s h e e tc o n f o r m a t i o n t h ea b o v ei n v e s t i g a t i o n si n d i c a t et h a tt h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so ft h e r e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i ns o l u t i o n sa r ea f f e c t e dn o to n l yb yt h es fc o n c e n t r a t i o n ，b u t a l s ob yo t h e rf a c t o r ss u c ha st h et e m p e r a t u r e ，s h e a rf o r c e ，m e t a li o n ，t h ev a l u eo fp h a n ds oo n i no r d e rt op r e p a r eb i o m i m e t i ca n ds p i n n a b l er e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n a q u e o u ss o l u t i o n s ，t h ec o o r d i n a t i v ee f f e c to fv a r i o u sf a c t o r so ns o l u t i o ns h o u l db e s t u d i e d k e yw o r d s ：b i o m i m e t i cs p i n n i n g ，r e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n ，r h e o l o g i c a lb e h a v i o r , s t a b i l i t y , s h e a rf o r c e i v 附件一： 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期：年 趴哪 月白 附件二： 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存和汇编本学位论文。 保密蹦在l 年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口。 学位论文作者签名： 参1 砜耷 i、i 日期：年月 日 燧名：印织 日期：年月日 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究第一章 第一章前言 1 1 蜘蛛丝的性能及其应用前景 自然界中许多生物包括蚕、蜘蛛、蝎子等可以分泌液状纤维状蛋白质进而纺 成天然纤维。其中蜘蛛分泌产生的丝纤维尤其是牵引丝( d r a g l i n es i l k ) 在力学性 能上具有蚕丝以及一般合成纤维无法比拟的突出优点，如表1 - 1 所示【”】，蜘蛛 牵引丝的强度明显高于蚕丝、橡胶、合成纤维，与钢筋束的强度相近，仅次于凯 夫拉；其伸长与蚕丝及合成纤维相似，远高于钢筋、棉和凯夫拉；尤其是其断裂 功最大，是凯夫拉的三倍多，且远高于钢，因而其韧性很好。综合起来看，蜘蛛 牵引丝是迄今为止人类所知道的最强韧的材料之二。据称，利用一根直径为5 毫米的蜘蛛牵引丝缆绳可以强制停住一架全速飞行的波音7 4 7 客机【4 】。因此，此 种材料在国外被誉为“生物钢 ( b i o s t e e l ) 【5 j 。 表卜1 蜘蛛牵引丝和其它纤维的力学性能比较【1 - 3 】 初始模量，强度 材料伸长率( ) 断裂功( j k g ) ( n 时)( n m 2 ) 蜘蛛牵引丝 9 8 - 3 2 1( 卜3 0 ) x 1 0 91x1 0 91 x 1 0 5 家蚕丝 1 5 - 3 55 1 0 96 1 0 87 1 0 4 尼龙 1 8 2 63 1 0 95x1 0 88 x t 0 4 棉 5 6 - 7 1 ( 6 1 1 ) 1 0 9( 3 - 7 ) 1 0 8( 5 1 5 ) 1 0 3 ， 钢 8 o2 x 1 0 1 x 1 0 95 x 1 0 3 凯夫拉 4 o1 1 0 1 14 1 0 93 1 0 4 橡胶 1 1 0 68 1 0 4 由于蜘蛛丝不仅具有高强、高韧至优异的力学性能，还具有轻质、生物相容、 可降解等其他一些特性，因此，其潜在的应用领域将十分广泛 6 1 。比如：利用蜘 蛛丝的生物相容性可以使其做良好的敷料，由其制成的人工关节、韧带、手术缝 合线等具有可降解、韧性好等特点；由蜘蛛丝制成的衣服轻盈、柔软、舒适、耐 磨而且弹性好；在军事领域中，将其与其它材料复合制成的防弹衣轻如羽毛且透 东华大学硕士学位论文 高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究第一章 湿防水，可以更好地保护人体免受侵害；此外，在航天、航海、建筑与汽车等众 多领域也有着巨大的潜在用途i 蚓。蜘蛛丝或人造蜘蛛丝应用领域预测见表卜2 。 表1 - 2 ( 人造) 蜘蛛丝的应用领域预测 纤维特性应用领域 透湿防水与柔软度衣着纺织品、织物 复合材料、结构材料、耐高冲击力材料( 建筑用、航天用) 高韧性、轻量、高强度防弹衣、坦克和飞机装甲、降落伞绸、宇航服装 绳索、钓鱼线、捕捞网具 超细、高强、化学稳定 性 天文望远镜内准线、纳米尺寸纤维、磁性和导电材料 一 耐水性帆船、滑翔翼之风帆 能量吸收转换复合材料、耐高冲击力材料 生物相容性人工筋健、人工韧带、人工眼角膜、人工皮肤等外科植入材 抗菌性，料 + 可降解性组织修复、伤口处理、缝合线 甩于眼外科和神经外科手术的超细生物可降解外科手术缝 合线 遇水超收缩性高敏感度湿气侦测器 由于蜘蛛丝优异的性能和广泛的应用领域使其逐渐成为各国科学家关注研 究的焦点之一。然而蜘蛛是肉食动物，不喜欢群居，相互之间残杀，难于大规模 饲养【1 0 】，而且，蜘蛛通常只吐出适用于自己结网的丝量，无法像蚕一样大量的 吐丝。因此，人类无法通过人工繁殖蜘蛛来获取蜘蛛丝。在这种情况下，各国科 学家纷纷将研究重点放在人类如何来人i n 造蜘蛛丝即蜘蛛丝的仿生纺丝研究 上，以期能模仿蜘蛛成丝过程人工生产强度高、韧性好的高性能蜘蛛丝纤维。 1 2 国内外在蜘蛛丝仿生纺丝领域的研究现状 对蜘蛛丝仿生纺丝技术的研究，作为分子生物学、基因工程与高分子材料加 工等多学科的交叉点，正成为众多领域尤其是高分子材料领域近年来研究的热点 之一。而在模仿蜘蛛成丝的整个“仿生 技术中有两个技术难点：一个难点是如 何利用转基因技术，将蜘蛛丝蛋白质的相关基因转移到细菌、植物体或哺乳动物 的乳腺上皮或肾细胞中，进行表达，生成组成、序列与蜘蛛丝蛋白质完全一致的 蛋白质，并提纯出此蛋白质【l l - 1 6 】；另一个难点是如何以蜘蛛丝蛋白质为原料，制 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究第一章 得真正仿生的纺丝液，并采用合适的纺丝技术进行纺丝，这也是把蜘蛛丝蛋白质 最终转变成优良性能纤维的一个关键点。 对于第一个技术难点，国内外许多研究者近年来已做了许多工作，取得了较 大的突破。例如，1 9 9 7 年，d u p o n t 公司已在大肠杆菌和酵母菌中分别表达了蜘 蛛丝蛋白质基因。1 9 9 9 年，n e x i ab i o t e c h n o l o g i e s 公司开始与美国陆军生化指挥 中心( 简称s b c c o m ) 合作开发基因转移技术来制备蜘蛛丝蛋白质，并于2 0 0 2 年通过 s c i e n c e ) ) 杂志向外界宣布，他们己成功地将来自一种叫做n e p h i l a c l a v i p e s 蜘蛛的牵引丝蛋白质基因转移至天竺鼠的肾细胞及擅长分泌蛋白质到 细胞外的母牛乳腺细胞上，并希望由此来生产大量可溶性蜘蛛丝基因重组蛋白。 同年，n e x i ab i o t e c h n o l o g i e s 公司又开始进一步研究将蜘蛛丝基因转移到山羊的 乳腺细胞上，期望能靠此步骤直接从羊乳中获取丝蛋白质。德国植物遗传与栽培 研究所的研究者也在2 0 0 1 年宣称已成功地利用转基因技术将n e p h i l ac l a v i p e s 蜘 蛛的蜘蛛丝蛋白质基因转移至马铃薯及烟草这两种可大面积种植的植物上【1 7 】， 由此可望大大降低蜘蛛丝蛋白质的制备成本。国内最近几年也开始了对上述领域 的研究，其中，中国农业大学的李宁教授己于2 0 0 2 年成功地将我国特有的一种 蜘蛛的丝蛋白质基因转移到小白鼠的体内，并计划于3 年内转移到牛的乳腺上从 而得到含蜘蛛丝蛋白质的牛奶。此外，上海生化研究所的研究人员近几年利用转 基因技术中“电穿孔 的方法，探索将蜘蛛牵引丝部分的基因注入只有半粒芝麻 大的蚕卵中，使培育出来的家蚕能分泌出含有牵引丝蛋白的蜘蛛丝。此研究被列 为国家“8 6 3 计划重点项目，目前正在进行中。 综上所述可知，国内外一些研究者通过转基因技术等合适的方法已制备出了 蜘蛛丝蛋白质，基本解决了模仿蜘蛛成丝仿生技术中的第一个技术难点。但要获 得真正的高性能材料，除了需获得与蜘蛛丝同样组成、同样分子序列的蛋白质外， 还必须在弄清楚蜘蛛制丝过程的基础上，制得合适的纺丝液，并研究蜘蛛丝的超 分子结构及获得这种结构的纺丝技术。目前国内外对蜘蛛丝的人工纺丝技术的研 究，大致可分为以下几个方向： ( 1 ) 以蜘蛛丝蛋白质为纺丝对象：美国康奈尔大学等机构的研究人员前几 年已从蜘蛛的丝腺内提取蜘蛛丝蛋白质，用六氟异丙醇或甲酸等作为溶剂采用普 通的湿法纺丝方法进行了纺丝研究，但由于使用了有毒有害的极性溶剂，成丝与 蜘蛛吐丝过程并不一样，因此效果不是很理想，得到的纤维强度很低； 2 0 0 2 年，美国陆军生化指挥中心首次用水作溶剂对少量的蜘蛛丝蛋白质进行了 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究第一章 纺丝探索。但他们在实验中采用的纺丝方法仍为湿法纺( 蜘蛛吐丝属干法纺) ， 并用了甲醇作为凝固剂，所以制得的人造蜘蛛丝强度还是偏低，只有2 2 9 d ，仅 为天然蜘蛛丝强度的2 0 4 0 【l 引。2 0 0 3 年，复旦大学的邵正中教授和英国牛津大 学等机构也合作发表了对蜘蛛丝蛋白质水溶液进行成丝探索的研究成果，由于实 验中纺丝液量极少( 一滴溶液) ，研究人员只能采用针从纺丝液中挑拉出丝，这 种成丝过程仿生效果仍不够理想，因此，所形成的人造蜘蛛丝强度仍然较低【19 】。 目前，人类虽然已能通过生物技术得到少量的蜘蛛丝蛋白质，但由于代价过 于昂贵，大量的蜘蛛丝蛋白质纺丝液的获取尚无法实现，因而，在一定程度上也 阻碍了以蜘蛛丝蛋白质为对象的仿生纺丝研究的进展。 ( 2 ) 以蚕丝蛋白质为替代物模拟纺丝：由于目前蜘蛛丝蛋白无法大量获取， 要进行较完整系统得仿生纺丝技术的研究，必须先寻找出一种合适的蛋白质作为 模型物质，在解决其提纯及浓缩问题的基础上，进步表征其溶解行为和纺丝液 性能以及在不同的凝固条件下的纺丝凝固行为。由于蚕丝蛋白质的主要氨基酸组 份与蜘蛛丝接近( 见表1 3 所示) ，蚕的成丝过程与蜘蛛的成丝过程也十分相似， 均是以水为溶剂进行液晶纺丝、相分离沉淀的，在成丝过程中蛋白质均发生由无 规卷曲和( 或) a 螺旋结构至1 3 折叠结构的转变，而且在一定的成丝条件下，蚕 丝的机械性能甚至可能与蜘蛛丝的机械性能媲美，再加上蚕丝来源丰富，便于提 纯，因此以蚕丝蛋白质为模型来进行仿生纺丝研究也越来越引起相关领域研究者 的重视。 一 二 表i - 3蜘蛛丝和蚕丝的氨基酸组成【2 1 】 、 氨基酸 ， 蚕丝蜘蛛丝 甘氨酸、 4 2 93 7 1 丙氨酸 3 0 o2 1 1 丝氨酸 1 2 24 5 酪氨酸 4 8 天门冬氨酸天冬酰氨 1 92 5 酸 精氨酸o 。5 7 。6 组氨酸 o 2 o 5 谷氨酸谷氨酸盐 1 49 2 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究。第一章 赖氨酸 o 40 5 缬氨酸 2 51 - 8 亮氨酸 o 63 8 异亮氨酸 0 6 0 9 。苯丙氨酸o 7o 7 脯氨酸 o 54 3 苏氨酸 0 91 7 蛋氨酸。 o 10 4 半光氨酸 恒量o 3 色氨酸 2 9 近几年，美国华盛顿大学、康奈尔大学的研究人员分别以家蚕的丝素蛋白作 为替代物，用六氟异丙醇或浓甲酸溶液等作为溶剂采用普通的湿法纺丝方法进行 了纺丝初探 2 2 - 2 3 】，但由于使用了有毒有害的极性溶剂，成丝与蜘蛛吐丝及蚕吐丝 过程也并不一样，放效果不是很理想。因此，第二个技术难点即制备仿生纺丝液 并采用合理的纺丝技术进行纺丝仍是目前人类需要解决的问题。本论文的研究工 作也将对第二个技术难点开展初步的探讨。在目前国内尚无法获得大量的可供试 验用的蜘蛛丝蛋白质的情况下，将主要以蚕丝蛋白质为模型来开展相关的研究。 1 3 蚕丝的化学组成及成丝过程 为了以蚕丝蛋白质代替蜘蛛丝蛋白质来进行仿生纺丝研究，有必要了解蚕丝 的一些基本性质与结构，并进一步了解蚕丝形成过程中结构、构象等的变化，便 于为仿生纺丝技术的研究提供指导。 1 3 1 蚕丝的化学组成 2 4 之5 】 蚕丝的主要成分是丝素蛋白和丝胶蛋白。丝素蛋白是蚕丝的主要部分，决定 蚕丝的主要性质，约占总量的7 0 。蚕丝中的丝素蛋白分子以反平行折叠 ( 1 3 一s h e e t ) 构象为基础，形成微纤维，不溶于水，而丝胶为小分子物质，约占蚕 丝总重的2 5 ，作为蚕吐丝过程中的保护物及胶黏剂包在丝素蛋白纤维的外面， 能溶解在水中，因而可以用沸水洗去丝素蛋白外的丝胶来实现两者的分离。蚕丝 中除丝素蛋白、丝胶以外，还有一些其它物质，如蜡、碳水化合物、色素和无机 成分等。但这些物质的含量很少，是蚕丝的次要成分。此外，蚕丝中还有k 、 自m 腰* i g 自m 溶踱镕目；性质 r* 一 c a 、s l 等多种元素，它们和蚕丝的性能及蚕的吐丝机理等有着直接关系。 在以蚕丝蛋白质为模型进行的仿生纺娃研究中，主要都是将蚕赴脱胶后以丝 素蛋白质为原料进行的。丝素蛋白质中包含1 8 种氨基酸( 参见前述表卜3 ) ，其 中甘氨酸、丙氢酸、丝氨酸占总组成的8 5 。丝素蛋白质的分子量约为3 6 万左 右，分子包括一条人分子量的肽链【2 6 1 ( 称为h 链，分子量约为3 0 万) 及1 3 条小分子量的肽链( 称为l 链，分子量在2 万左右) 。 132 蚕丝的成丝过程 要实现真正意义上的仿生纺丝，首先必须在了解了解蜘蛛过程的基础上进 一步了解蚕的成丝过程。据文献报道口】，蜘蛛丝的纺丝液由位于蜘蛛腹部的腺体 分泌形成。图1 - 1 为n e p h i ac l a v i p e s 蜘蛛体内分泌牵引丝的成丝装置示意图。 国1 i蜘蛛的纺丝管示意图 图中的上部为蜘蛛纺丝装置各部分所对麻的组织细胞图( 标为a g ) ，下 部为成丝体系的构造示意图( 分为四部分，分别标为v 、x 、y 、z ) 。由v o l l r a t h 等人的研究表明 2 ”，分泌牵引丝的大囊状腺包含一个长长的尾部和一个较大的 液囊，尾部是分泌纺丝液即蜘蛛丝蛋白水溶液的土要部分；而液囊主要是贮藏这 种纺丝液的仓库，并引导纺丝液通过一个“漏斗”( 图1 】v 所示) 进八圆锥形的 导管( 图中1 、1 x 所示) ，纤维成形的人部分工作都在这一导管巾形成。在导管的 一 匪 东$ 大学+ 学位女商镕度煮蛋自m 培聩镕# # 质的究 第一章 外壳有三个环圈末端为调节阀( 图li y 所示) 。从大囊状腺尾部分泌的蜘蛛 丝蛋白水溶液在流经体内狭长且逐渐细化的纺丝导管过程中不断浓缩并形成液 晶，在各种条件作用下( 如剪切作用、金属离子、p h 值影响等) 液体蛋白晟后 转化为固体纤维1 由喷丝口( 见图中1 1 中z ) 喷出。在上述过程中，蛋白质分 子也发生了由无规卷曲和( 或) n 螺旋结构到o 折叠结构的转变。 蚕的成丝过程与蜘蛛有许多相似之处。蚤伴内有一对分泌液状丝蛋白质的腺 体，即绢丝腺。熟蚕( 五龄蚕食桑叶6 8 天成为熟蚕) 的绢丝腺如图1 2 所示。 图1 熟蚕丝腺图 蚕绢丝腺与蜘蛛类似也分为前、中、后三部分，在蚕丝的形成过程中，先由 蚕后部丝腺合成分泌出大量的丝素蚩白水溶液印液状丝素蛋白，在经中部丝腺流 动的过程中浓度缓慢增加。相对比较宽大一点的中部丝腺起储存丝素蛋白的作 用，并分泌出蚕丝蛋白的另一组分一丝胶。在中部丝腺，丝素蛋白被液状丝胶所 包覆，这种丝蛋白起流经逐渐细化的中部灶腺前区井进入继续变细的前部丝 腺。蚕体内成一对的绢丝腺在前部丝腺的顶端合为一，并与吐丝管相接。在从 中部她腺流经前部丝腺直至吐丝管的过程中二种丝蛋白并不混合，但丝素蛋白 溶液的浓度不断增大，加之溶液在不断受到剪切力的作用及其他因素( 如金属离 子的含量、p h 值等) 的影响，丝素蛋白水溶液呈现出光学各向异性的性质。有 末华 碰学位t 女高浓度m # 蛋自水溶液# 目；性质目f 究第一章 研究者经研究认为，此过程中溶液逐渐形成液晶，尤其当溶液流经吐丝管中部直 径较小的压丝部时，溶液受到矗一步的剪切作用使大量的丝素蛋白分子由无规卷 曲合( 或) n 螺旋结构快速向0 折叠结构改变，d 折叠片层相互叠在一起构成结 晶区，疏水性增强，从而导致相分离使水分从固化丝表面析出，最终实现了丝素 的纤维化1 3 0 - 3 2 i 。纤维化后的丝素蛋白质由于疏水基团的外露而难溶于水了。 l33 蚕丝的纤维化机理 尽管迄今为止人们都认为蜘蛛和蚕的纺丝是经历液晶态的，但在丝索蛋白水 溶液的构象转变、液晶的形成和纤维成型机理方面还没有完全达成共识，存在多 种不同的说法。其中，代表性的有c h r i s t o p h e r v i n e y 9 3 。3 73 、j u a m a g o s h i 0 8 】及我国 的于同隐 3 9 4 0 1 等人提出的不同观点。 b 曲，谤p g 蠢：雾嚣器翌嚣i ： 。谚j 尊句。审纂。螽森，磊呙磊， 孚参一谤昏莎氆：i 詈? 嚣詈：对剪切 在纺丝管中流动的过程 中，蛋白质大分子形成各 向异性球状聚集体，开始 出现双折射现象，对剪切 高度敏感，粘度降低 在喷丝口处，在剪切应 力作用下蛋白质向b 一 折叠结构转变 开始纤维化，疏水基团 外露形成，b 折叠片 疏水基团 段。 爨一 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究第一章 1 3 3 1 v i n e y 的液晶形成机理 一 v i n e y 首先于1 9 9 1 年在“n a t l l r e 上发表文章宣称，他用偏光显微镜观察到了 天然丝素蛋白溶液的光学各向异性现象，随后作者又根据f l o r y 的液晶理论，进 一步提出了丝素蛋白溶液在一定的浓度范围内会形成向列型液晶的观点。他认 为，平衡条件下，丝素蛋白分子在腺体中采取无规卷曲构象，没有任何可分辨的 二级结构。在一定的浓度范围和环境条件下，球状丝素蛋白分子通过自组装形成 线形聚集体，产生各向异性，然后形成超分子液晶。这是一种超分子取向的棒状 结构，丝素蛋白之间只存在非共价键( 盐桥) 作用。此时，蛋白分子对剪切敏感， 在足够的剪切作用下可形成p 一折叠结构并进一步形成d 一折叠片，最后形成三维 的p 一折叠结构( p 层晶) 并完全纤维化。这一过程的示意图如图1 - 3 所示a 1 3 3 2m a g o s h i 等人的观点 m a g o s h i 等人解剖了正在吐丝的蚕的前部丝腺，发现随即流出的丝素蛋白溶 液在偏光显微镜下呈双折射现象，由此他们认为前部丝腺中的丝素蛋白溶液形成 了液晶，并认为此时丝素蛋白分子为1 3 一折叠结构。然后，他们又用针刺丝腺的 方法估计了丝腺中丝素溶液的粘度，认为由中部丝腺到前部丝腺，丝素溶液的粘 度是逐渐降低的，由此他们进一步认为前部丝腺中的丝素蛋白溶液形成了向列型 液晶。 虽然他们没有解释形成液晶的原因，但他们认为形成液晶时丝素蛋白分子是 p 一折叠结构。而呈p 一折叠结构的丝素蛋白分子是不可能为球状的，显然，m a g o s h i 等人提出的观点和前述v i n e y 的“由球状分子自组装聚集而形成液晶”的理论是 不一致的。 1 3 3 3 于同隐等人的观点 我国的于同隐教授等人在蚕丝素蛋白方面的研究也很有造诣。他们将熟蚕中 部丝腺中的液状丝素冻胶取出，除去表面膜体组织且除去丝胶制成样品，放在偏 光显微镜下观察，发现中部丝腺尤其是中部丝腺的中、前段部位的丝素具有双折 射现象，且中部前段丝素的双折射值比中段的双折射值高，由此认为沿着吐丝方 向丝素蛋白大分子的有序程度在逐渐增加，并认为可能形成了液晶。由于在垂直 吐丝方向的试样截面上未发现有双折射现象，且小角x 光衍射( s a x s ) 分析结 果也未发现试样有长周期，所以于教授等人认为蚕腹中丝素蛋白分子具有向列型 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究第一章 液晶态。同时，r a m a n 光谱、c d 谱结果显示，中部丝腺中部的丝素蛋白分子中 存在无规卷曲和a 螺旋二种结构，因此，于教授等人又提出了中部丝腺中丝素 蛋白分子的a 组合螺旋结构模型( 如图1 4 所示) 。他们认为液状丝素中丝素蛋 i 白分子由无规卷曲和旷螺旋二部分组成，分子链呈连续折叠组成似棒状的结构。 折叠弯曲部分为无规卷曲，g t 螺旋包含在伸直部分中。他认为分子链连续折叠组 成的这种似棒状结构是形成向列型液晶的重要因素。后来，于教授等人还用扫描 隧道显微镜和激光拉曼光谱进一步证明，蚕体内丝素蛋白溶液随着浓度的升高， 构象逐渐变成静组合螺旋，然后形成单个稳定的螺旋体，最后在水份流失和剪切 力的作用下解体伸直为p 折叠结构。 图1 4 中部丝腺丝蛋白大分子折叠的q 组合结构模型， ， 于同隐等的这一“由多个丝素分子形成q 组合螺旋从而形成液晶”的观点和 ， v i n e y 的观点更是截然不同。 1 3 4 蚕体内丝素蛋白水溶液结构与性质的变化及其影响因素 在以蚕丝蛋白质为模型进行相关的仿生纺丝研究中，很关键的一点是制备合 适的纺丝液，为此，人类首先必须了解蚕体内天然丝素蛋白水溶液在成丝过程中 的结构与性质的变化及其影响因素，由此可为真正仿生的再生丝素蛋白水溶液的 制备提供有效的指导。 1 3 4 1 蚕体内丝素蛋白水溶液结构与性质的变化【4 1 4 3 】 如前所述，丝素蛋白在蚕体内后部丝腺合成，有研究表明，此时丝素蛋白分 子为无规卷曲结构及旺螺旋结构，可以与水形成丝素蛋白水溶液，蛋白质浓度为 1 2 1 5 左右，溶液呈现出光学各向同性。当丝素蛋白水溶液流入中部丝腺后， 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究 第章 被中部丝腺分泌出的丝胶包覆住，同时水分进一步减少，因此蛋白质浓度增加至 2 5 左右。在此阶段，溶液中丝素蛋白分子的构象仍为无规卷曲及n 螺旋结构， 溶液逐渐呈现光学各向异性的性质。丝素蛋白水溶液继续流入前部丝腺时，由于 水分的进一步减少，丝素蛋白浓度增加至3 0 左右，此时分子中出现少量的b 折叠结构，溶液出现光学各向异性，并形成了液晶1 4 4 。在丝素蛋白水溶液由后 部丝腺流入前部丝腺的整个过程中，丝素蛋白水溶液的浓度不断增加，丝素蛋白 分子由无规卷曲及0 【螺旋结构转变为d 折叠结构，m a g o s h i 等人的研究表明 4 5 】， 这一过程中溶液的p h 值也逐渐变小，在前部丝腺呈现出酸性。最后丝素蛋白水 溶液在剪切作用、金属离子、p h 值等各种条件的协同作用下固化成丝。丝腺各 部分的长度、液状丝素的浓度及构象变化见图1 5 。 长：3 0 0 m m 直径 ； 0 4 0 8 m m 覃：0 i 0 8 s 长：6 0 8 0 m m 直径：2 0 2 5 1 2 m m 重：0 0 0 6 0 0 0 3 0 0 3 s p h - 5 6 - 5 2 5 0 ( 4 9 ) 长：3 5 ( 4 0 ) m i l l 直径：0 0 5 0 3 m m 誓：2 - 4 0 0 ( 4 0 0 2 0 0 0 ) s p h ：4 0 ( 4 8 ) 蠢缮鳇骤 曜猹歪自】 、- 了一 卜短一雌呻觚 ； ，、 b 一一 埠 功能：合成丝素 弯弯曲曲的细管 无规卷曲、a - 螺旋 结构 溶液状态：凝胶 蛋白质浓度：1 2 1 5 粘度：中 光学各向异性 高水含量 功能：合成丝胶，水分 流失 无规卷曲、伽螺旋结构 溶液状态：凝胶一凝胶 一溶胶 蛋白质浓度：2 5 左 右 粘度：高一高一中 前区呈现微弱光学各 向异性 i _ - ； i i i l ， 纛弼缝臻 耀鳓 兰：! ：! ! 竺k i 蒜 五忑 霾r雌霸羡l 功能：水分流失，离子交换， p h 下降，糙度减小 逐渐变细。象一个长圆锥形的 喷丝头( 成圆锥形细管) 无规卷曲、洳螺旋及少量 b 折叠结构 木溶液状态：溶胶一向列形液晶 蛋白质浓度：逐渐增至3 0 粘度：低 * 3 t 生伸长应力下的流动 + 呈现光学各向异性 l 瓞琴 * 6 0 水 分流失 以反向p 折叠结构 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与性质的研究第一章 图1 5 蚕体丝腺各部分的长度、截面积及液状丝素的性质f 4 1 4 5 l 1 3 4 2 丝素蛋白水溶液结构与性质的影响因素 上述分析可见，蚕体内丝素蛋白水溶液在体内流动过程中，其浓度、p h 、 所受剪切作用是在不断变化的。一般认为：蚕吐丝的过程，其实是丝素蛋白构象 转变的过程，因此，要想真正实现丝素蛋白水溶液的人工纺丝，还必须研究影响 丝素蛋白水溶液结构与性质的各种因素。 1 3 4 2 1 丝素浓度的影响 v i n e y 等人【3 3 1 通过用偏光显微镜研究家蚕丝腺中和蜘蛛大壶腹腺中的分泌 物，发现因水份的蒸发使分泌物浓度增加，这样，向列液态结晶微结构就形成。 m a g o s h i 等人【4 5 】发现当蚕体内液态丝素干燥时，前部丝腺出现了p 结晶，因此推 断，在前部丝腺内必然存在一个无规卷曲和( 或) 0 【螺旋向8 折叠结构转变的临 界浓度。由前人这些研究表明，浓度对丝素蛋白水溶液的结构和性质有着重要的 。影响。 2 1 3 4 2 2 应力的影响 m a g o s h i 等人在蚕吐丝过程中的构象转变及液晶现象方面较有研究【3 8 】。他们 以活蚕为研究对象详细研究了蚕的腺体、纺丝过程及纺丝器的形状尺寸、腺体流 道中丝素蛋白分子的构象及溶液性质，并研究了影响丝素溶液纤维成型的许多因 素，其中包括丝素溶液中的金属离子浓度、p h 值、温度以及丝素的拉伸速率等。 此外他们在研究丝素蛋白分子的三种结构即无规卷曲( r a n d o mc o i l ) 、旷螺旋 ( a - h e l i x ) 和p 一折叠( b - s h e e t ) 相互转变的条件时发现，在一定的拉伸速率 1 0 1 0 0 0 m m m i n 下丝素溶液表现为非牛顿流体。在拉伸速率高于5 0 0 m m m i n 时， 、丝素蛋白分子才发生向b 折叠结构的构象变化。由于高拉伸速率下丝素蛋白溶液 受到的应力较大，故可推断，较大的应力作用有利于p 折叠结构的形成。 1 3 4 2 3p h 值的影响 前人在研究已发现，蚕和蜘蛛生物体内呈现出一定的酸碱度，且不同的p h 值环境在一定程度上对蛋白分子的结构及其转变有影响。例如，c h e n 等人研究 发现，p h 值对n c l a v i p e s 蜘蛛丝蛋白溶液的流变性能有一定的影响，并且发现 在p h 值6 2 左右时溶液的流变性质会发生突变，而且蜘蛛腺体内的丝蛋白分子 也有较明显地发生由a 螺旋到p 折叠的转变1 4 6 。m a g o s h i 等人在研究蚕体内丝腺 东华大学硕士学位论文高浓度再生丝素蛋白水溶液结构与往质的研究第一章 时，也发现丝腺不同部位处的溶液对应着不同的的p