（矿物加工工程专业论文）球红假单胞菌降解褐煤的研究.pdf

安徽理工大学硕士论文摘要 摘要 煤炭是我国最主要的能源及化工原料，然后煤炭的使用带来了严重的生态环 境问题。如何在煤炭开发利用过程中减少对环境的危害，如何从煤炭这一传统的 “不清洁”能源获得“清洁”的能源或化工产品，利用低成本且环境友好的微生 物转化技术成了煤炭综合加工利用的新领域和新途径，具有十分重大的深远意义。 本论文主要以煤炭的微生物转化技术作为研究方向，以煤炭的微生物降解作 为突破口，采用球红假单胞菌作为煤炭降解的微生物，研究了球红假单胞菌的生 长特性及最佳培养生长条件。 在褐煤的微生物降解实验中，比较系统地研究了褐煤降解的各种因素对煤炭 降解的影响，实验结果表明煤样粒度对煤的微生物降解有很大的影响，菌液用量、 煤浆浓度和降解作用时间对煤的降解有一定的影响。 褐煤的微生物降解实验研究结果表明，煤样粒度、煤的预处理方式对煤炭具 有很大的影响。细粒煤样粒度比粗粒煤样粒度在相同的降解条件下更容易被降解， 用硝酸预处理过的褐煤比原褐煤更容易被微生物降解。 为探索提高煤的降解率，研究中尝试对现有菌种进行了驯化育种与紫外诱变 育种，并应用于煤的微生物降解实验中，实验结果表明，驯化育种比自然菌在相 同条件下降解率提高约9 ，诱变菌比驯化菌又高出6 左右，说明菌种改良有利 于提高降解率。 为了了解降解产物的特性，在研究中采用了f t i r 、x r d 和t g d t a 等多种 现代分析测试技术，对原煤、硝酸处理煤、煤降解后残渣及煤降解产物进行了比 较和研究。结果表明，褐煤的分子结构在降解前后发生了较大程度的变化，结构 发生了降解，热性质发生了变化。降解产物是加酸沉淀物，固态时是一种似煤的 黑亮色物质，加碱易溶解，不溶于乙醇。 图4 2 表2 0 参6 9 关键词：球红假单胞菌；褐煤；降解 分类号：( t d 9 2 5 5 )； 室堂堡三查堂堡主堡塞型墨! ! 生 a b s 仃a c t c o a li st h em a i ne n e r g yr e s 叫r c e sa 1 1 df e e d s t o c ko f c h e m i c a li n d u s t r yi nc h i n a ，b u t t h ea p p l y i n go fc o a lc a nb 血gal o to f e n v i r o n m e n tp r o b l e m h o wt od e c r e a s et h e h a n nt om ee n v i r o m e n tw h e ne x p l o i t i n ga n du t i 王i z i n gc o a l ，h o wt og e tc l e a n r e s o u r c e o rc h e m i c a ld r o d u c t sf r o ms u c hat r a d m o n a lu n c k a nr e s o u r c e ，u t i l i z i n gl o w c o s ta n d 衔e n d l y e n v i r o m e n tm i c r o b i 0 1 0 9 i c a l t e c h n 0 1 0 9 yb e c o m e s an e w 印p r o a c ha n df l e l di n c o m 口r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no fc o a l ，a 1 1 dh a sg r e a ts i g n m c a n c e u s i n gm i c r o b i 0 1 0 9 i c a lt e c l l n 0 1 0 9 y o fc o a lc o n v e r s i o n a st h e s u b j e c ta n d m i c r o b i o l o g yd e g r a d a t i o no fc o a l a st h eb r c m ，t 1 1 r o u g h ， u s i n gr h o d o p s e u d o m o n a s s p h e m i d e sa sa k i n do fm i c r o b i o l o g yt od e g r a d ec o a l ，t l l i sp 印e r h a ss t u d i e dt h eg r o w m f e a t i l r e sa 1 1 dt h eb e s tc u l t u r i n gc o n d i t i o n so f 刚d o p s e u d o m o n a ss p h e r o i d e s i nt h ee x p e r i m e n to fl i g i l i t eo fm i c r o b i o l o g yd e g r a d a t i o n ，w eh a v es t i l d i e dt h e e f 艳c t so fv a r i o u sk i n d so ff a c t so nc o a ld e g r a d a t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es i z eo f c o a ls 锄p i e h a s g r e a t e f f b c to n d e g r a d a t i o n o f c o a l ，t h e v 0 1 u m e o f b a c t e r i u m ，c o n c e m r a t i o no fc o a ls l u r r ya i l dt i m eo fd e g f a d a t i o nh a v ea l i t t l eo fe 艉c t o nd e g r a d a t i o no f c o a l t h er e s u l t so f1 i g n i t ed e g r a d a t i o ns h o wt h a t ，t h es i z eo fc o a ls a m p l ea n dn 1 劬o d s o fc o a ls a m p l ep r e t r c a t m e mh a v ef e a te 丘e c to nc o a ld e 掣a d a t i o n ，s m a l lg r 锄u l a r i t yo f c o a lc a i lb ed e g r a d e dm o r ee a s i l yt h a l lb i gg r a n u l a r i t yo fc o a lo nt h es 锄ec o n d i t i o n ， t h el i g n i t ew h i c hw a sp r e 吮a t e d 诚心n i t r i ca c i dc a nb ed e g r a d e dm o r ee a s i l yt h a n o r i g i m l l i g l l i t e i no r d e rt oi m p r o v em ee m c i e n c yo fc o a ld e g r a d a t i o n ，i nt h et e s e a r c h ，w e 乜yt o u s ee x i s t i n gs t r a i n st oc u l t l l r en e wb a c t e r i mb ym e a n so fd o m e s t i c a t i o na n di n d u c i n g c h a n g ew i t hu l t r a “0 1 e tr a d i a t i o na n da l s ou s em e mt od e g r a d ec o a l ，t h er e s u h ss h o w t h a to nt h es 锄ec o n d i t i o nt h ee f f i c i e n c yo fc o a ld e g r a d a t i o nb yt h ed o m e s t i c a t i o n b a c t e r i u mc a ni n c r e a s ea b o u t9 c o m p a r c dw i mo r d i n a r ys t r a i n s ，a i l dt h ee m c i e n c yo f c o a ld e g r a d a t i o nb yi n d u c i n gc h a n g ei sa b o m6 h i g h e rt h a nb yt l l ed o m e s t i c a t i o n b a c t e r i u m i no r d e rt o 啪d e r s t a n dm ef e a t u r c so ft h cd e g r a d e dp r o d u c t sa n dt l l em l e so f d e g r a d a t i o n ，w eu s es o m ek i n d so fm o d e mt e s t i n gt e c h n i q u e ss u c ha sf t i r 、x i 江) a n d t g d t at oc o m p a f ea n ds m d yo r i g i 砌c o a l 、龇c o a lp r e t r e a t e d w i t hn i t r i c i i 安徽理工大学硕士论文 a b s t r a c t a c i d ，c i n d e ra f c e rd e g r a d a t i o na n dd e g r a d a t i o np r o d u c t t h er e s u l t ss h o wt h a tb i g m o l e c u l a rs t i u c t i 】r e sh a v eb e e ng r e a t l yc h a n g e d ，a i l dt h ec h a r a c t e ro fc a l o r i ch a sb e e n c h a n g e d t h ed e g r a d a t i o np r o d u c t si sd 印o s i t e da 舭ra d d i n ga c i d t h ed e g m d a t i o n p r o d u c ti n l es t a t eo fs o l i di sl i k ec o a l ，b r i g h ta n db l a c k i tc a nb ed i s s o l v e db ya l k a l i a n dc a nn o tb ed i s s o v e db ye t l l a n 0 1 f i g u r e4 2t 曲l e2 0r e f j r e n c e6 9 k e y w o r d s ：r h o d o p s e u d o m o n a ss p h e m i d e s ，1 噜n i t e ，d e g r a d a t i o n c h i n e s eb o o k sc a t a l o g ：t d 9 2 5 5 i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方以外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得塞邀堡王盔堂或其他教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： ；灿闽寤签字日期：。f 年占月口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塞徵理王态堂有保留、使用学 位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单 位属于安徽理工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽理工 盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保 密的学位论文在解密后适用本授权书) 。同时本人保证，毕业后结合 学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为安徽理工大学。 学位论文作者签名：抽胡暗 签字日期：一，年月o 日 也 日 潲铂 彳多鳓伟采 师 日 导 字签 安徽理工大学硕士论文引言 引言 我国有丰富的褐煤资源，但褐煤的水分和灰分含量高、热值低、直接燃烧经 济效益较差，且长期堆放会造成环境污染。因此，寻找一条简便易行而经济效益 又较好的途径来加工处理褐煤，使其转变为清洁的燃料、化工原料以及一些有特 殊价值的化学品是有待解决的问题。 利用微生物加工处理褐煤是煤炭综合加工利用的一种新的尝试和努力。利用 微生物把褐煤转变成其他类燃料或从中提取附加值高的化工品这一技术，国外从 2 0 世纪2 0 年代初，就开始了这方面的研究。但直到2 0 世纪8 0 年代褐煤及其他 劣质煤的生物降解才受到了人们的广泛关注。但这方面的研究还存在不少问题， 如高效合适降解菌种的寻找和筛选、降解产物特性的确定都有待于更深入的研究。 本课题研究的目的是利用球红假单胞菌实现褐煤的降解。采用液体降解方 式，设计正交实验，对菌种采用了驯化育种和诱变育种并设计了对比试验，并用 现代分析测试技术红外光谱技术、x 射线衍射技术及热分析技术对褐煤与褐煤降解 后降解产物进行特性分析，以发现降解过程中褐煤结构与组成的变化。 煤炭的微生物降解技术在当前能源、资源危机和环境保护问题日益紧迫的全 球形势下，对维护全球的健康发展和人类生存有着重要的贡献和深远的意义。 安徽理工人学硕士论文l 绪论 1 绪论 1 1 选题背景 中国有丰富的煤炭资源，已探明的煤炭储量超过8 1 1 0 “t ，在我国能源构成 中占7 0 以上，7 5 的发电燃料、7 5 的工业燃料、8 0 的居民生活燃料和6 0 的化工原料，都是来自煤炭【l 】o 特别是褐煤、风化煤等低阶煤资源 2 1 ，在我国 已探明的褐煤保有储量达1 3 0 3 亿吨，占全国煤炭储量的1 3 弱【3 i 。褐煤是一种 变质程度低、易风化自燃、发热量低、含水量、含氧量及挥发分较高的年轻煤种， 芳香族碳含量较低 3 l ，并含有少量的氮和硫等元素。这些低价煤资源直接燃烧热 效率低，工业应用价值低，长期露天堆放，不仅造成能源的浪费，而且容易造成 环境污染。因此，如何合理开发和充分利用褐煤及低阶煤资源1 4 】将是一个值得深 入研究的课题。 煤炭作为资源，具有广泛的用途，既可以作为能源，又可以提取有用的化工 产品，6 0 以上的化工原料就来自煤炭，对经济的发展起着重要的作用。作为能 源，煤炭必须清洁高效利用，采用高温、高压等手段把煤转变为液体、气体【5 。j 等其它类燃料代替油类物质，就是其高效转化利用的一种。而从煤炭中提取化工 产品，通常采用的是物理的、化学的外加一定的压力一定的温度的条件下来进行。 从煤炭转化为油类物质和提取化工品的过程来看，成本较高、条件苛刻。而采用 微生物转化技术来处理煤炭，使之转化成另一种产品，或者作为燃料，或者从中 提取化工品，或作为其它类物质，具有工艺简单、低能耗、无污染等许多常规处 理技术难以比拟的优点。因此，微生物转化技术处理煤炭已成为了国内外研究的 热点。我国政府制定的s 一8 6 3 计划生物技术领域，也把环境生物技术列为7 个 重大关键技术研究与开发项目之一。 鉴于我国褐煤产量多、传统利用价值低、长期堆放造成环境污染及微生物转 化技术具有的优点等特点，本研究选择“球红假单胞菌降解褐煤的研究”作为研究 课题，研究褐煤的微生物降解。 1 2 煤炭微生物转化降解技术 煤生物加工的研究起源于金属矿的生物加工，由于金属矿的品位越来越低， 利用常规的加工提质手段，成本太高，而利用微生物来加工提纯金属矿如铜、金 等其成本降低很多，而且条件温和，不污染环境。煤生物加工研究的热点主要集 中在两个领域阳】：煤的生物净化和生物转化。 ( 1 ) 煤的生物净化 安徽理工大学硕士论文1 绪论 煤生物净化即生物脱硫，它可在常温、常压下进行，生产成本低，不仅不会 降低煤的热值，还能脱除煤中有机硫，从而引起世界各国的广泛关注。这方面研 究开展较早，研究结果报道较多【1 0 5 1 ，未来微生物脱硫技术只要解决好高效功能 菌的选育、硫代谢产物的控制与处理等问题，着重开展多因素、多菌群、多相反 应的复合技术的研究，其大规模应用前景乐观1 7 】。 ( 2 ) 煤的生物转化 煤的生物转化，主要是利用真菌、细菌和放线菌等微生物的转化作用来实现 煤的溶解与液化，使之转化成易溶于水的物质，从中提取有特殊价值的化学品以 及制取清洁燃料、工业添加剂及植物生长促进剂，作为后续的研究，寻找合适菌 种，可把溶煤产物转化为单一的低分子芳烃，就是具有很高价值的化学品，如果 把溶煤产物再进行厌氧微生物处理得到甲烷、甲醇和乙醇等物质，则可替代石油 作为清洁燃料。 煤炭的生物转化是煤的综合加工利用中的新尝试，在我国尤有研究价值。其 一，我国有丰富的煤炭资源，热值和利用价值都较低的褐煤、风化煤及泥炭的储 量和产量很大，尤其适用于煤炭的生物转化。其二，从国家能源安全这一战略角 度考虑，不能过分依赖国外石油和天然气资源。其三，石油资源逐步减少和枯竭 也必须寻找新的可靠的替代品。我国化石燃料总资源4 1 6 万亿吨，其中9 5 6 煤 炭，3 2 石油，1 2 天然气。而占9 5 以上的煤炭是必然和必须的替代品。尤 其目前国家还有许多特大型煤化工转化基地，有着重要的研究意义。 煤炭的微生物转化与利用研究开辟了一条实现煤炭高效、清洁利用、可持续 发展的新道路，利用微生物把煤降解转变成其它类燃料或从中提取附加值高的化 工品，这在当前能源、资源危机和环境保护问题日益紧迫的全球形势下，对维护 全球的健康发展和人类生存有着重要的贡献和深远的意义。煤的微生物转化利用 研究目前虽然尚处于初期，有许多问题亟待解决，但与传统的工业转化方法相比， 具有能耗低、转化条件温和、转化效率高、转化产物应用价值高、设备要求简单 等一系列优越性而日益受到人们的重视和关注。 1 3 煤及煤降解的可行性 煤是古代植物在不同自然环境下，经过一系列生物、化学及物理化学变化而 产生的复杂大分子固体混合物，具有多环芳香烃复杂结构，如图1 【l 。从其过程 来看，经历了两个阶段：泥炭化阶段与煤化阶段。在泥炭化阶段，成煤的植物残 体在泥炭沼泽中受到微生物及自然因素的作用首先分解，纤维素很快分解成单糖 安徽理工大学硕士论文1 绪论 图1 原煤结构和桥键图示“m f i g1 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fs t r u c t u r a lg m u p sa n dc o n n e c t i n gb r i d g e si nb i t u m i n o u sc o a l 【1 剐 类，木质素逐渐氧化成为复杂的、结构多变的腐植酸及水能溶解的苯环衍生物， 结果植物残体就逐渐转化成为“腐植质”。其中含有大量的活泼官能团，如一0 h 、 c 0 0 h 及活泼的n 氢，它们相互作用，反应合成了新的产物，如腐植酸和沥青 等。形成的泥炭当被其它沉积物覆盖时，泥炭化阶段作用结束，生物化学作用逐 渐减弱直至停止，紧接着在温度和压力为主的物理化学作用下，进入煤化阶段， 泥炭逐步转化为褐煤、次烟煤、烟煤，如图2 【l8 1 。 煤生物转化是煤在酶或微生物参与下发生大分子的氧化解聚作用，称之为生 物降解或生物溶解，两者在概念上没有什么区别。煤生物转化基本可以说是煤形成 过程的逆过程，通过微生物的作用来达到它的降解。 煤在变质过程中，芳香环或侧链上的含氧官能团中的氧和氢以1 ：2 比例结合 成水失去，因而芳香环缩聚。那么反过来能否使煤和水重新结合，此外，线型有 机高分子化合物，无论是合成的或天然的，诸如合成的聚酯类、聚酐类、聚酰胺 类和天然蛋白质、纤维素、淀粉等都可水解，降解为具有简单结构的化合物。煤 是否也能在一定条件下水解或在生物作用下降解转化为简单的化合物。 组成煤的高分子有机聚合物是多环芳香烃结构，光合细菌用于厌氧降解芳香 族有机化合物研究与实践已有很多报道【1 9 1 】；此外，现有的现代生物工程技术的 手段为培养专门的有高效降解高聚物能力的菌种等方面提供了有力的保证。 安徽理工大学硕士论文1 绪论 c h 2 一 h g h 一阳l a u k b i l u m i n o u 3 s u b b l t 咖j n o u ， of c 呦c a 啪h 舶“ 叫 l 图2 不同变质程度煤的部分典型结构” f i 酷r e p r e s e n 诅t i v ep a n i a ls 仉l c t u r eo f d i 髓r e n t 埘她o f c o “1 8 】 1 4 国内外研究概况 煤微生物降解的研究作为一门新的矿物加工技术，时间并不长，从2 0 世纪 8 0 年代开始进行研究。8 0 年代初，德国f a l ( o u s s a 博士和美国m s c o h e n 【2 3 】教 授等分别报道了某些真菌能在煤块上生长，并将煤转化成黑色水溶液以来，煤的 生物降解在世界上已引起了许多研究者的兴趣2 4 t 6 】，研究者们开始探索用微生物 来加工煤，主要是用微生物或微生物酶清洁液化煤，尤其是一些低能量煤2 “。 有报道国外研究者们分离出一系列能降解褐煤及经过氧化处理呈氧化状态的烟煤 及无烟煤的微生物，细菌、放线菌、真菌类中的一些种属，它们都能不同程度的 降解溶解煤。 1 4 1微生物降解的煤种及降解煤的微生物 1 可被微生物降解的煤种 试验过的煤种有风化褐煤、褐煤，甚至年轻烟煤。美国北达科他州( n o n h d a l ( o t a ) 的一种天然风化褐煤( l e o n a r d i t e ) ，未经任何预处理，就能很容易为一 些真菌所降解，最大溶解可达7 0 9 0 【2 4 ，2 5 1 。 s c o t t 【2 4 j 提出，对于作用强的真菌种类，煤溶解程度似乎与煤种关系较大，而 与微生物种类关系次之。风化褐煤中植物残骸尚明显可见，含氧高达2 8 2 9 ， 容易被溶解。含氧高达4 0 的北达科他( n o r t hd a k o t a ) 褐煤也很容易为真菌降 砖 安徽理工大学硕士论文1 绪论 解。而大多数未经预处理的褐煤及年轻烟煤却不能为所试验的真菌所降解。因此， 一般来讲，煤溶解程度减小次序为：风化煤，暴露于空气中的煤，未暴露于空气 中刚开采出来的煤。 从上述报道的试验结果来看，低价煤也需经过预处理才容易为真菌所降解。 为此，人们试验了各种氧化预处理方法。c a t c h e s i d e 【2 6 】用8 m 硝酸处理莫厄耳 ( m o r v v e l l ) 及洛阳( l o y y a i l g ) 褐煤1 8 小时，然后用云芝进行溶解。煤失重可达 8 0 9 0 。试验的7 种菌种中，有6 种菌可溶解莫厄耳( m o 州e 1 1 ) 氧化褐煤，溶 解达3 5 l o o 。烟煤经硝酸氧化，微生物对其溶解能力也能增加，但不如褐煤 显著。d a v i s o n l 2 7 j 用硝酸氧化怀俄达克( w y o d a l 【) 年轻烟煤，然后拟用青霉菌 ( p a e c i l o m ”e st l ) 进行溶解，煤只失重3 1 0 。f a i s o n 2 8 l 用假丝酵母( c a n d i d a m l 1 3 ) 处理硝酸氧化的怀俄达克( w y o d a k ) 煤，溶解物收率小于1 5 。q l l i g l e y 【2 、 s t r a n d b e r g 用硝酸氧化煤也得到类似结果。也有人采用其它氧化方法。b e 姐【3 l 】 将依利诺衣斯( 1 1 l i n o i s # 6 ) 煤在1 5 0 0 c 下空气氧化7 天，然后用青霉菌作用，只 得到3 水溶性产物；但经生物作用后，煤用6 5 6 8 n a 0 h 溶解可得8 0 9 0 溶解产物。而煤未经预处理，用n a 0 h 浸取，只得6 浸出物。还有人单独用过 氧化氢、臭氧等( 或联合) 进行氧化预处理，褐煤生物溶解能力大为增强。 在国内，大连理工大学韩威、杨海波等用硝酸氧化平庄、扎赉诺尔褐煤，然 后放在固体表面培养的裂褶、云芝等真菌菌丝体上，进行生物作用，煤失重及收 集产物的分析表明，溶解也达3 0 6 0 ，但他们的研究表明，有些褐煤虽经氧化 处理，其溶解程度仍很小【32 1 。柳丽芬等人用瓦克青霉、斜卧青霉、绿脓杆菌等菌 在固体表面培养基上培养，来溶降解风化褐煤和经盐酸处理的风化煤，结果表明， 酸处理有助于煤生物降解【3 3 】。 2 降解煤的微生物 已经分离鉴定出来用于溶降解煤试验的微生物有很多。细菌类有b a c i l l u s s u b t i l i s ， b a c i l l u sp 啪i l u s ， b a c i l l u sc e r e u s 3 4 1 和p s e u d o m o n a s c e p a c i a s 订a i n d l c 0 7 【3 5 】。放线菌类有s t r 印t o m y c e sn a v o v i r e n s 州，s t r e p t o m y c e sv i r i d o s p o m s ， s t r e p t o m y c e ss e t o l l i i7 5 2 和s 仃印t o m y c e sb a d i u s2 5 2 1 3 7 ，3 引。真菌类的担子菌属中 有t r 锄e t e sv e r s i c o l o r ，p o l y p o m sv e r s i c o l o r l 2 3 ，姗，p o r i ap l a c e n t a 【4 0 】和p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i 啪【4 1 4 3 】酵母菌中的一些种4 4 ，4 5 1 及丝状真菌中的a s p e 晒l l u ss p 【4 6 ， a s p e r g i l l u st e r r e u s l 【4 4 1 ，a s p e r g i l l u st e r r i c o l a ，a p e r g i l l u so c h r a c e o u s f 37 1 ，p a e c i l o m y c e s s p p 2 4 ，4 4 ，4 7 1 和c u n n i n 曲锄e 1 1 as p 【4 5 】。在这些种属中，云芝、青霉、假单胞菌的液 安徽理工大学硕士论文1 绪论 化能力较强。 1 4 2 降解煤方式的研究 在降解煤方式上国内外研究者主要集中在固体降解煤和液体降解煤两种方式 上，如国外的c o h e n 【2 3 】、s c o t t 2 4 ，国内的韩威、杨海波 3 2 l 等都进行了这方面的研 究，一般来说，固体降解煤比液体降解煤效果要好，液体降解煤主要是为了进行 大规模工业应用，而进行研究的。液态降解煤又可分为菌体液体培养降解煤和菌 体培养液( 不含菌体) 降解煤，它们主要是用来对降解煤机理进行研究，考察是 哪种因素使得煤发生降解作用。 1 4 3 褐煤微生物转化降解的机理 褐煤是由芳香环组成并由盐桥、脂肪链等连接起来的大分子网状结构化合物， 它很难进入微生物细胞内，所以褐煤的生物降解是由微生物分泌到细胞外的一些 碱性物质、生物酶、螯合剂、表面活性等起作用的。研究者们对此提出了多种机 理，具体说来，主要有三种：碱作用机理、生物螯合剂的作用机理、酶作用机理。 ( 1 ) 碱溶1 3 4 j在1 9 8 7 年c o h e n 曾指出p h 升高有利于煤的溶解，q u i 9 1 e y 同 年第一次指出了氨、生物胺、多肽及其衍生物在褐煤液化过程中起重要的作用，这 是由微生物利用复杂的培养基产生的，以溶解煤中的羧基。s t r a n d b c r g 和l e 谢s 迸 一步证实了这一结论。s 仃e p t o m y c e ss e t o n i i7 5 v i 2 在没有煤诱导的条件下就可向胞 外分泌一种可以溶解煤的活性成分( c s ) ，这种c s 具有热稳定性，分子量较小，对 蛋白酶不敏感，表明煤的溶解不是一个酶促过程，复杂的氮源和氨基酸可以促进菌 体生长和c s 活性增加，培养液的p h 越高，煤的溶解量就越大，而p h 的高低与培 养基中多肽或多胺的量有关。 ( 2 ) 螯合剂和表面活性剂【2 3 ，3 7 】1 9 8 8 年，q u i g l e y 等人注意到多价阳离子如c a 2 + ，f e ”，a 1 ”等可以在羧基等基团之间作为盐桥。c o h e n 指出在生物液化风化 褐煤时，有螯合剂草酸胺的参与，这些螯合可以将金属离子从褐煤中去除。袁红莉也 证实加大e d t a ( 乙二胺四乙酸) 的浓度，煤溶解的就越多，而且培养液中f e 的含 量也随之增加。p o l m a r i 等人的工作表明微生物分泌的生物表面活性剂能像化学合 成的表面活性剂如t w 8 0 一样液化部分的褐煤。表面活性剂主要作用是还原煤中的 n 和s ，具体机理有待进一步研究。 ( 3 ) 生物酶以上几种机理的共同不足之处在于其作用并不能打断煤分子的 共价键，也就是不能从根本意义上把褐煤大分子降解。由于褐煤是与木质素结构 安徽理l ：大学硕士论文l 绪论 十分相似的大分子化合物，决定了降解褐煤的酶主要是木质素降解酶系中的一些 酶类。目前报道最多的是锰过氧化物酶( m n p ) 、木素过氧化物酶( l i p ) 和漆酶( 1 a _ c c a s e ) 。这些酶的优点在于：a 胞外酶，解决了大分子物质穿过细胞壁和细胞膜进 入细胞内的困难：b 底物专一性不太强，具有较高的氧化还原电位，可以氧化一 系列的芳香族化合物c 可以利用一些具有反应活性可扩散的小分子来扩大底物范 围，这些小分子在酶和最终还原剂之间起氧化还原介质的作用，从而解释了为什 么大分子底物可以被酶的活性中心氧化。 1 4 4 微生物降解煤产物分析 生物降解煤产物的分析是基于现代煤化学和生物学的分离技术和分析手段所 进行的有关产物组成、结构和性质的分析。它是煤降解产物的应用基础，也是降 解煤机理的研究基础。常规应用的是工业分析、元素分析、红外光谱、x 射线衍 射、核磁共振波谱、质谱分析等。也有用紫外、气( 液) 相和凝胶色谱及凝胶电 泳等方法。煤降解产物的许多性质被研究者所研究，其中包括产物组成、产物结 构、溶解度、分子量、酸沉淀性质、吸光度、蛋白质含量和发热量等，但结论各 异。 1 产物组成 尽管由于煤种、菌种、微生物培养条件及降解煤方式上存在差异，但通过与 原煤比较，各研究者得出的元素变化趋势却是基本一致的。即与原煤相比，煤的 微生物溶解产物中h ，0 的含量随溶煤时间的增加而增大【4 8 ，4 9 1 。这表明，在生物 降解煤过程中，有水中h ，0 的介入，即发生了氧化水解过程。此外，f a i s o n 等 人【5 0 5 i 】指出，溶解产物中明显地富集了n 、s 、n a 、c 1 等元素。 2 产物结构 韩威、佟威、杨海波等人阮4 8 瑚】研究表明，硝酸氧化的扎赉诺尔褐煤经云芝 作用后，其红外光谱图特征与原煤基本相似。不同的是，在1 4 0 0 c m - 1 处出现了一 个较强的吸收峰，表明产物中含有较多的羧酸盐、胺盐。在1 7 1 5c m _ 1 及1 6 8 0c m 1 处峰消失或变弱，表明产物中酚、醇、醚或酯的化合物有所增加，含一c h3 的 结构基可能减少。c o h e n 等【2 3 的试验分析表明，褐煤经云芝作用后，其红外谱图 特征与原煤也大致相似，但无1 4 0 0c m “峰，而出现了1 6 8 0c m 。表明产物中增 加了芳酮或共轭羧基结构。可见，不同的煤种经同一种微生物作用后，其结构的 变化并不完全相同。但产物的结构特征仍与原煤类似。核磁共振分析表明，溶煤 产物中的c o 一官能团明显增多，表明该过程有氧化作用发生，导致极性增大及 安徽理t 大学硕士论文1 绪论 酸性增强。 3 产物的分子量及发热量 生物降解煤产物是一种很复杂的有机混合物。其平均分子量及分子量的分布 目前尚无标准的测定方法。由于技术、水平、仪器等方面因素，研究者测定时采 用的方法各不相同。从以前的研究来看，研究者常用蒸汽渗透压法、凝胶电泳法 或质谱法测定平均分子量：用超滤膜或凝胶渗透层析法测定分子量分布。所得结 果因煤种、菌种、研究者不同而差异较大。s c o t t 等【2 4 】的测定表明，溶解产物中 8 2 5 的分子量在3 万3 0 万；佟威测定的溶煤产物的平均分子量在3 5 3 万左【5 0 】。 一般认为，降解煤产物的分子量比原煤要小。但这与所用的菌种、煤样和试 验方法有关。有的菌种并不明显改变溶解产物的分子量：而有的菌种在用原煤作 唯一碳源时，溶解产物的分子量比原煤要大。 w i l s o n 等【5 2 j 研究表明，生物降解煤产物的发热量与原煤的发热量大致相当， 约为原煤的9 4 9 7 。这说明煤经微生物作用后，能量损失很小。 4 沉淀性与溶解性 微生物降解煤产物是酸可沉淀的，其沉淀是碱可溶的0 53 1 ，这一点被r a l p hjp 用试验初步证实，一些研究者研究表明，溶煤产物水溶液的浓度越大，越易被无 机酸沉淀。一般当p h 值小于2 时，绝大部分溶解产物都能被沉淀下来【5 3 ，4 9 1 。本 人用球红假单胞菌降解内蒙褐煤所得的结论正符合上述观点：微生物溶煤产物是 酸可沉淀的，其沉淀是碱可溶的。但是对于不同菌种，不同的煤种，可能得到的 结论有所不同，根据安徽理工大学王龙贵教授的报道，他用真菌降解内蒙褐煤、 义马褐煤、淮南次烟煤，所得结论是：微生物溶煤产物是碱可沉淀的，其沉淀是 酸可溶的。而另外，微生物降解煤产物极易溶于水，较难溶于甲醇，在有机酸中 的溶解度，一般随有机溶剂的极性的升高而增大。 5 煤降解产物的应用 煤经好氧生物作用后，转化为一种水溶性的液态产物。该产物含有多种官能 团，具有较大的工、农、牧、医等方面的应用潜力。对此，研究者提出了各种可 能的用途。如f a i s o n 【5 4 ，5 5 l 提出，被木质素真菌所溶解的煤类物质可望像聚合木质 素那样在工业上用于抗氧剂、表面活性剂、树脂或黏合剂成分，特别是作商业离 子交换树脂或吸附剂用；在农业上用作土壤调节剂，改善植物根部的吸收作用； 医学上作为免疫辅药等。并且指出，真菌作用溶解煤而释放出低分子芳烃，这些 芳烃带有很多含氧官能团，是工业上有价值的化学品。k l e i n 等建议，可将煤 的转化产物合成聚羟基烯烃类精细化学品。c a t c h e s i d e 等【5 7 l 认为，目前微生物降 9 安徽理工人学硕士论文1 绪论 解煤技术在低阶煤选矿、低阶煤的特殊低分子量有机物的转化以及制取新的液体 燃料等方面的应用己成为可能。生物降解煤产物也可经厌氧菌作用而产生甲烷、 甲醇、乙醇等低分子量物质，可作为燃料。 生物降解煤的多酚多阴离子结构使之在农业方面得到应用，可以作为士壤调 节剂，改善植物根部的吸收作用，解除士壤中的有害化学物质。目前，这方面的 实际应用报道不多。佟威等【4 9 悃花盆士培养考察云芝培养液溶解硝酸氧化样品对 玉米种植的影响，结果表明浇灌煤溶物水溶液有助于玉米出苗及干旱时增加抗旱 能力。同时他们又考察了煤降解产物对蒜苗的生物的影响，发现煤降解产物对蒜 苗的生长具有明显刺激作用。武丽敏【2 】的研究表明，褐煤的微生物降解产物施用 于农作物时，同一菌种的降解液对不同作物的作用不同，不同菌种的降解液对同 一种作物的作用也不同。并指出，褐煤的微生物降解产物能增加士壤的肥力和活 性，对玉米、小麦等农作物的生长有明显的促进作用。 1 5 本论文的主要研究内容及主要创新点 1 主要研究内容： ( 1 ) 球红假单胞菌种的培育及驯化。 ( 2 ) 球红假单胞菌种诱变育种的研究。 ( 3 ) 球红假单胞菌降解褐煤正交试验研究 ( 4 ) 球红假单胞菌降解褐煤对比试验研究 ( 5 ) 球红假单胞菌降解褐煤产物的特性研究，用红外光谱( f t i r ) 、x 射 线衍射( x r d ) 及热分析( t g d t a ) 技术分析褐煤降解产物与原褐煤在结构组 成上的区别。 2 主要创新点： ( 1 ) 本论文选择了光合细菌球红假单胞菌作为降解褐煤的微生物，首次采 用了此类光合细菌应用于褐煤的降解试验中，实验结果表明，球红假单胞菌具有 一定的降解褐煤的效果。 ( 2 ) 比较系统地研究了各种因素如煤的预处理方式、煤的粒度、菌种、菌 液用量、煤浆浓度、降解作用时间等因素对降解效果的影响。 ( 3 ) 采用驯化育种、诱变育种等技术对菌种进行改良，并用于试验研究， 结果表明，改良后的菌种比自然菌种降解煤效率要高得多。 ( 4 )在研究中采用了f t i r 、x r d 及t g d t a 等多种现代分析测试技术， 对褐煤及褐煤降解产物及褐煤降解后残渣进行了比较和研究。 安徽理工大学硕士论文2 试验用材料、研究方法及主要设备 2 试验用材料、研究方法及主要设备 2 1 试验材料 2 1 1内蒙褐煤煤样 试验用煤样为内蒙平煤集团西露天矿褐煤，堆放时间为两年。原煤样经进行 破碎、磨矿、筛分，制成如下几个粒度级：3 0 5 r 姗、o 5 0 2 m m 、一0 2 m m 三 个粒度级的样品。将已制备的煤样分成两组，一组是不经过任何处理的原煤样； 另一种是用硝酸氧化处理煤样，方法为用浓度为6 5 6 8 的硝酸浸泡煤样二天， 用2 x z 2 型旋片式真空泵过滤，用蒸馏水清洗，直至滤液p h 值接近7 为止，烘 干、消毒备用。 对内蒙平煤集团的褐煤煤样取一0 2 r m 的煤样及硝酸预处理煤样经7 0 0 c 烘 干2 4 小时后冷却，进行工业分析见表l 示。 表1 02 m m 原煤样及硝酸预处理煤样的工业分析 ! ! 15 111 1 1 1 坠型! ! ! 竖堡! ! ：! ：翌翌! ! ! g ! ! ! ! ! ! ! ! 竺! ! ! ! 12 1 1 1 ：! 璺! ! ! 丛生! 生竺翌 煤种 m a d ( )a d ( )v a d ( )s t a d ( ) 2 1 2 球红假单胞菌 试验所用菌种取自中国矿业大学化工学院的保存菌种。密封，置于冰箱中。 球红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n a ss p h e r o i d e s 简称r s ) 的生物学特性 5 8 】： ( 1 ) 形态与染色：细胞球形，直径0 7 4 u m 。在含糖培养基中，细胞卵形， 2 2 5 2 5 3 5 m 。年幼培养物以极生鞭毛运动；在碱性培养基中，运动停止， 并产生丰富粘液，以二分分裂繁殖，代时1 4 4 m i n 。革兰氏染色显阴性，为革兰氏 阴性菌。鞭毛染色时鞭毛可被发现。在p h = 7 以上的培养基，细胞以球形为主， 大多数单个，稍有成链。经我们光学显微镜观察球红假单胞菌大部分为单个运动， 有部分喜欢聚集在一起，成链形或球形。 ( 2 ) 培养特性：光能异养菌，兼性好氧；可在光下厌氧生活，也可在黑暗下 好氧生活。营养要求不高，可长在具有简单有机物和碳酸氢盐，并补以硫胺素、 生物熊酸的矿物培养基中，最适生长需要在简单的有机底物中加入酵母膏。p h 值范围：6 o 8 5 ；最适p h = 7 。最适生长温度：2 5 3 0 0 c 。在有空气培养时菌液 安徽理工大学硕士论文2 试验用材料、研究方法及主要设备 呈红色，大多数培养物产生一种水溶性的卟啉类的蓝红色素，这种色素可溶于培 养基，可使得液体培养基呈现出暗棕红色。菌绿素a 和包括球烯和羟基球烯的群 2 类胡萝h 素，在好氧情况下转化成相应的酮式类胡萝h 素。 ( 3 ) 菌落特征：菌落比较小，较整齐，稍凸起，多数菌株为光滑型。 ( 4 ) 球红假单胞菌具有繁殖快，无毒、适合中性环境生长。 球红假单胞菌属于红螺菌目红螺菌科红假单胞菌属的一种菌，光能异养菌， 兼性好氧，可在光下厌氧生活，也可在黑暗下好氧生活，常生活在暴露在光下的 泥和水的沉淀物中。光合细菌是自然界中重要的微生物类群，在水生态系统中， 它们既作为生产者又作为分解者，可以利用和转化多种有机物和无机物。基于光 合细菌这一点及因实验室无法创造球红假单胞菌光照厌氧条件，故选择黑暗下好 氧生活，探索球红假单胞菌是否也能降解煤这种既含有有机物和无机物的复杂物 质。 查阅许多资料未见研究者用球红假单胞菌降解褐煤的研究，故决定用球红假 单胞菌进行微生物降解褐煤的新尝试。 2 2 煤样试验分析方法及煤微生物降解率计算方法 2 2 1 煤样试验分析方法 1 灰分的测定 灰分按g b 2 1 2 7 7 煤的工业分析方法中的缓慢灰化法测定 5 9 】。 测定方法要点：将煤样放入冷马弗炉中，在自然通风和炉门留有1 5 毫米左右 缝隙的条件下，用3 0 m i n 缓慢升至5 0 0 0 c ，在此温度下保持3 0 m i l l 后，升到 8 1 5 士l o o c ，然后关上炉门并在此温度下灼烧l 小时。自然冷却后，以残留物重量 占原煤样重量的百分数作为灰分。测定结果的计算： a 。d _ 旦1 0 0 ( 1 ) 埘 式