Western Blot实验流程及注意事项.doc

Western Blot实验流程及注意事项实验方法原理： Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。SDSPAGE电泳1、 试剂：1.30%丙烯酰胺溶液和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis） 称取30g丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加双蒸水至100ml，过滤后存于棕色瓶中，于4保存。2.4X分离胶缓冲液 称取Tris18.17g，加入10%SDS贮备液4ml（或20%SDS贮备液2ml），用12mol/L Hcl调节PH至8.8，定容至100ml，4保存。3.4X浓缩胶缓冲液 称取Tris6.06g，加入10%SDS贮备液4ml，用12mol/L Hcl调节PH至6.8，定容至100ml，4保存。4.10%过硫酸铵 称取过硫酸铵0.5g加水至5ml，应现配现用。5.10X电极缓冲液 称取Tris30g、甘氨酸144g，加入10%SDS 100ml，定容至1000ml。6.2X样品缓冲液 称取蔗糖2g（或甘油2ml），加入10%SDS 2ml，加入溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml，-巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。7. 染色液 称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入甲醇450ml，冰乙酸100ml，水650ml。8. 脱色液 甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水830ml，混匀备用。9. 20%SDS贮存液 SDS 40g，200ml双蒸水溶解，密封室温保存。操作步骤一：制胶部分 试剂成份成份分离胶浓缩胶H2O5ml2ml30%Acr/Bis6ml0.6ml4X缓冲液3.8ml0.9ml10%过硫酸铵（APS）224ul56ulTEMED10ul10ul1. 将混合液充分混合后，缓慢倒入已经固定在夹心垂直板电泳槽里的狭槽中，本操作不能产生气泡，然后尽快在分离胶上轻轻覆盖一层水。2. 置于室温下40-60分钟（冬），是凝胶聚合完全，去除上层水相。将预先备好的浓缩胶慢慢灌入狭槽中，然后样品梳插于夹心槽上部，静止30分钟（冬），然后置于冰箱过夜（这样效果更好），次日取出胶，上下拉动梳子拔除（小心气泡），然后上样（一般20-30ul一个孔）。二：电泳1. 外层电泳液淹没底层膜，内层电泳液。90V 40min/140V 60min。我用120V一个小时。不确定。电泳液回收，一般可用三四次。三：转膜1. 转一张膜需准备6张7.08.3 cm的滤纸和1张7.38.6 cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套（手上的蛋白会污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜提前泡在转膜液中（用镊子捏）。2.电泳完毕将浓缩胶（上层胶）轻轻刮去（浓缩胶影响操作），下层胶染色部分都弃去。为区分上下层胶，在加样孔部分剪一个角为上层（蛋白质分子量小）。3.将夹子打开使白的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。纤维素膜纸盖于滤纸上，然后胶盖在纤维素膜纸上，对齐并擀去气泡。在胶上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。） 5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温，用400mA 100min。四、免疫反应1 转膜之后的纸移至含有封闭液（加一抗的5%的牛奶）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h，然后放入冰箱过夜。2 第二天取出把封闭液回收，用PBS洗脱，每次洗脱五分钟。3 然后加二抗和 PBS，比例为1:1000.室温下摇晃一个小时。然后显色。 5、 D