（材料科学与工程专业论文）人纤维蛋白凝胶及其复合支架的制备与性能.pdf

巍江太学硕士学位论文( 2 0 0 7 ) 人纤维蛋白凝胶 及其复合支架的制备与性能 摘要 本文构建纤维蛋白凝胶和聚乳酸( p l l a ) 多孔支架或聚( 乳酸一乙醇酸) ( p l g a ) 微载体的复合支架。采用冷冻一冻干的方法从人血浆中提取了纤维蛋 白原，在凝血酶的作用下形成纤维蛋白凝胶。采用热致相分离的方法制各了多孔 的p l l a 支架。采用乳液挥发的方法制备了p l g a 微球，并用纤维蛋白原对微球 进行表面修饰。将纤维蛋白凝胶和p l l a 多孔支架、p l g a 微载体复合，分别制 备了纤维蛋白凝胶填充的p l l a 多孔支架和纤维蛋白凝胶与p l g a 微载体的复合 支架。 采用冷冻一冻干的方法从人血浆中提取了纤维蛋白原。将等体积的纤维蛋白 原溶液与凝血酶溶液混合，制备了纤维蛋白凝胶。采用紫外光谱跟踪了凝胶的形 成过程，发现凝血酶浓度、反应温度对凝胶时间有决定性影响，而纤维蛋白原浓 度对凝胶时间的影响较小。经二氧化碳临界点干燥后，采用扫描电镜观察了不同 条件下形成的纤维蛋白凝胶的微观结构。热稳定分析显示纤维蛋白原形成凝胶 后，热分解温度提高到2 8 8 0 c ，比纤维蛋白原的热分解温度提高了3 0 左右。 在三蒸水中平衡1 1 小时后，纤维蛋白凝胶的吸水率从最初的5 0 倍下降到3 0 4 0 倍。通过紫外光谱跟踪检测，测定了纤维蛋白凝胶在不同溶液中的失重。体 外细胞培养表明，成纤维细胞可以在凝胶中很好地铺展和增值。 纤维蛋白凝胶的长期稳定性，对所修复组织的重建和再生至关重要。为了减 缓纤维蛋白凝胶的降解和流失，我们进一步构建了纤维蛋白凝胶填充的p l l a 多 浙江大学硬士学位论文( 2 0 0 7 ) 孔支架的复台支架。首先利用热致相分离的力法制备了p l l a 多孔支架，将纤维 蛋白凝胶填充到p l l a 支架中，制备了纤维蛋白凝胶填充的p l l a 复合支架。测 定了不同填充条件形成复合支架的填充率和凝胶释放。分别测定了p l l a 支架和 填充的复合支架的力学性能，发现复合支架比p l l a 支架具有更好的力学性能。 体外软骨细胞培养实验表明，与未填充的p l l a 多孔支架相比较，纤维蛋白凝胶 填充的p l l a 支架能有效的负载细胞，同时维持细胞的球状形态，有效地促进细 胞的生长和活性物质的分泌。 采用乳化溶剂挥发法制备了p l g a 微球。采用氨解和接枝技术相结合的方 法，在p l g a 微球表面固定了纤维蛋白原分子，以提高p l g a 微球的细胞相容 性。氨解过程中，微球重量随氨解时间线性下降，而微球表面的自由氨基随氨解 时间的延长，先增加后恒定在一稳定值。采用戊二醛为偶联剂，将纤维蛋白原接 枝在p l g a 微球表面。纤维蛋白原的固定量随自由氨基含量的增加而增大。将纤 维蛋白原与p l g a 微载体均匀混合，在凝血酶的作用下形成纤维蛋白凝胶p l ( 3 a 微载体复合支架。通过激光共聚焦显微镜原位观测了复合支架的结构，并进一步 利用扫描电镜观察了冻干处理后支架的形貌。通过调节凝血酶的浓度可以有效地 阻止微载体的沉降。微载体凝胶复合物的弹性模量随着微载体加入量的增加而 增大，但总体模量值较低。体外软骨细胞培养表明细胞在微载体凝胶复合支架 中能够生长和增殖。细胞活性随着培养时间的延长而增加，而后保持不变。软骨 细胞在凝胶内为圆形，而在微载体表面呈铺展的多边形。凝胶中软骨细胞会随着 纤维蛋白凝胶的降解后向p l g a 微载体表面迁移，铺展和增殖。 关键诃：纤维蛋白凝胶，聚乳酸，聚( 乳酸一乙醇酸) ，微载体，复合支架，软 骨细胞 玎 濑江大学硬士学位论文( 2 0 0 7 ) p r e p a r a t i o na n dp r o p e r t i e so f h u m a nf i b r i ng e la n di t sc o m p o s i t es c a f f o l d a b s t r a c t c o m p o s i t es c a f f o l d sc o n s i s t i n go ff i b r i ng e la n dp o l y l - l a e t i d e ( p l l a ) p o r o u s s p o n g e sa n dp o l y ( 1 一l a c t i c - c o - g l y c o l i ca c i d ) ( p l g a ) m i e r o c a r r i e r sw g t ef a b r i c a t e d f i b r i n o g e nw a si s o l a t e df r o mh u m a np l a s m ab yaf r e e z e - t h a wc i r c l e ( e l a t i o no ft h e f i b r i n o g e nw a sa c c o m p l i s h e db ym i x i n gw i t ht h r o m b i n p l l ap o r o u ss p o n g e sw e r e f a b r i c a t e db yt h e r m a l l yi n d u c e dp h a s es e p e r a t i o n ( t i p s ) p l g am i c m s p h e r e sw e r e f a b r i c a t e db ye m u l s i o n - s o l v e n te v a p o r a t i o n t h e i rs u r f a c e sw e r ef u r t h e rm o d i f i e db y f i b r i n o g e mt h ef i b r i ng e la n dp l l ap o r o u ss p o n g e so rp l g am i c r o c a r r i e r sw e r e f m a h yc o m p o u n d e dt of o r mt h ec o m p o s i t es c a f f o l d s f i b r i n o g e nw a si s o l a t e df r o mh u m a np l a s m ab yaf r e e z e t h a wc i r c l e i t ss t r u c t u r e w a sc h a r a c t e r i z e db ye l e e t r o p h o r e s i s g e l a t i o no f t h ef i b r i n o g e nw a sa c c o m p l i s h e db y m i x i n gw i t ht h r o m b i n a b s o r b a n c eo ft h ef i b r i n o g e n t h r o m b i nm i x t u r ea t5 5 0 n m a sa f u n c t i o no f r e a c t i o nt i m ew a sm o n i t o r e db yu v - v i ss p e c t r o s c o p y i tw a sf o u n dt h a tt h e e l o t t i l 】gt i m ei ss i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e db yt h et h r o m b i nc o n c e n t r a t i o na n dt h e t e m p e r a t u r e ，w h i l el e s si n f l u e n c e db yt h ef i b r i n o g e nc o n c e n t r a t i o n a f t e rf r e ed r i e d ， t h ef b r i ng e lw a sc h a r a c t e r i z e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，r e v e a l i n g f i b r o u sm i c r o s t r u c t u r e t h e r m a ls t a b i l i t ya n a l y s i sb yt h e r m a lg r a v i m e t r i ca n a l y s i s f o u n dt h a tt h ec m s s l i n k e df i b r i ng e lw a sd e g r a d a t e df r o m2 8 8 0 c ，w h i c hi sa b o u t3 0 0 c h i g h e rt h a nt h a to ft h ef i b r i n o g e n t h eh y d r o g e lh a sa ni n i t i a lw a t e r - u p t a k er a t i oo f 一5 0 ，d e c r e a s e dt o3 0 - 4 0a f t e ri n c u b a t e di nw a t e rf o r1lhd e p e n d i n go nt h et h r o m b i n c o n c e n t r a t i o n t h ef i b r i ng e l sl o s tt h e i rw e i g h t si np b sv e r yr a p i d l y , w h i l es l o w l yi n d m e m f e t a lb o v i n es e l u n la n dd m e m i nv i t r oc e l lc u l t u r ef o u n dt h a th u m a n f i b r o b l a s t sc o u l dn o r m a l l yp r o l i f e r a t ei nt h ef i b r i ng e lw i t hs p r e a d i n gm o r p h o l o g ya n d 1 1 1 浙江大学碗士学位论文( 2 0 0 7 ) e v e nd i s t r i b u 的n i ti se s s e n t i a lt h a tt h ef i b r i ng e lm a i n t a i n si t sl o n g - t e r ms h a p i n gs t a b i l i t ya n d m e c h a n i c a ls t r e n g t hf o ra p p l i c a t i o ni nc a r t i l a g et i s s u ee n g i n e e r i n g u t i l i z i n gt h et i p s t e c h n i q u e ，p l l as c a f f o l d s 、】v i t l lg o o dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e sw e i _ ep r e p a r e d f o l l o w e d w i t hi n c o r p o r a t e dw i t hf i b r i ng e l t h ei n c o r p o r a t i n ge f f i c i e n c ya n dr e l e a s eo f p r o t e i n w e r ed e t e c t e dw i t hd i f f e r e mc o n c e n t r a t i o no f f i b r i n o g e n i n m e c h a n i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n e x p e r i m e n t s ，t h ec o m p r e s s i v em o d u l u so ft h ep l l as c a f f o l d i n c o r p o r a t e dw i t hf i b r i ng e li su pt o7 1 2 m p a m o r p h o l o g ya n dd i s t r i b u t i o no ft h e c h o n d r o c y t e sw e r es t u d i e db yc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ( c l s m ) a n d s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) t h ec e l lg r o w t hb e h a v i o r sw e r ed e t e r m i n e db y m t ta s s a y , a n dg l y c o s a m i n o g l y c a n ( g a g ) s e c r e t i o n t h ec e l ln u m b e rw a s d e t e r m i n e db yd n a c o n t e n t c h o n d r o c y t e sc u l t u r e di nt h eh y b r i ds c a f f o l ds h o w e d s i g n i f i c a n t l yi m p r o v e dc e l ls p r e a d i n ga n dg r o w t h t h i sc o n v e n i e n ta n de f f e c t i v e m e t h o dp r o v i d e sau s e f u lp a t h w a yo fs c a f f o l dp r e p a r a t i o na n dc e l lt r a n s p l a n t a t i o n , w h i c hc 龇a c h i e v es u i t a b l em e c h a n i c a lp r o x i e sa n dg o o dc e l lp e r f o r m a n c e s i m u l t a n e o u s l y p l g am i c r o s p h e r e sw e r ef a b r i c a t e db ye m u l s i o n - s o l v e n te v a p o r a t i o n , f o l l o w e d w i t ha m i n o l y s i si nh e x a n e d i a m i n e n - p r o p a n o ls o l u t i o nt oi n t r o d u c ef r e ea m i n og r o u p s o nt h es u r f a c eo f m i c r o s p h e r e s f i b r i n o g e nw a si m m o b i l i z e do nt h em i c r o s p h e r e sw i t h ad i a m e t e ro f 1 0 0 p ma f t e rt h ea m i n og r o u p sw e r gt r a n s f e r r e di n t oa l d e h y d eg r o u p s b yat r e a t m e n to fg l u t a r a l d e h y d e w e i g h tl o s so ft h em i c r o s p h e r e si n c r e a s e dw i t ht h e p r o l o n g a t i o n o fa m i n o l y z i n gt i m e t h en h 2a n d f i b r i n o g e nc o n t e n t s o nt h e m i c r o s p h e r es u r f a c ew e r eq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e db yn i n h y d r i na n a l y s e sa n du v - v i s s p e c t r o s c o p y t h ep l g am i c r o s p h e r e sw e r em i x e dw i t ht h ef i b r i n o g e ns o l u t i o nf i r s t l y g e l a t i o no ft h e f i b r i n o g e nw a sa c c o m p l i s h e db ym i x i n gw i t l lt h r o m b i n t h e a b s o r b a n c eo ft h ep l g am i c r o s p h e r e s f i b r i n o g e n t h r o m b i nm i x t u r ea t5 5 0 h ma sa f u n c t i o no f r e a c t i o nt i m ew a sm o n i t o r e db yu v - v i ss p e c t r o s c o p y i tw a sf o u n dt h a tt h e as t a b l es t r u c t u r ec a nb ef a b r i c a t e dw i t ht h et h r o m b i nc o n c e n t r a t i o nw a sh i g h e rt h a n 15 u m 1 t h e g e l a t i o n t i m ew a sl e s si n f l u e n c e d b yt h ep l g am i c r o s p h e r e s i v 巍江大学硬士学位论文( 2 0 0 7 ) c o n c e n t r a t i o n s e ma n dc l s mo b s c r v a t i o i l 5i n d i c a t e dt h a tt h em i c r o s p h e r e s d i s t r i b u t e di nt h ef i b r i ng e la n df o r m e dt h eh y b r i ds c a f f o l d t h ee l a s t i cm o d u l u so f t h e s c a f f o l di n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fm i c r o s p h e r e s c o n t e n t i nv i t r oc h o n d r o e y t e c u l t u r es h o w e dt h a tc e l l sc o u l ds u r v i v e ，g r o wa n dp r o l i f e r a t ei nt h i sh y b r i dc e l lc a r r i e r s c a f f o l d c e l lv i a b i l i t yi n c r e a s e dw i t ht h ep r o l o n g a t i o no fc u l t u r et i m e c l s ma n d s e mo b s e r v a t i o n si n d i c a t e dt h a te h o n d r o c y t e si nt h ef i b r i ng e lm o v e dt ot h es u r f a c c s o ft h ep l g am i c r o c a r r i e r s ，a n dt h e na t t a c h e d ，s p r e a da n dp r o l i f e r a t e d t h e s er e s u l t s s h o wt h a tt h ep l g am i c r o e a r r i e r s f i b r i ng di sap r o m i s i n gc a n d i d a t ea sai n j e c t a b l e s c a f f o l d k e yw o r d s ：n n j e c t a b l e ，f i b r i ng e l , p o 时一l l a c t i d e , p o l y ( i - l a c t i e - c o - g l y e o l l ea c i d ) , m i c r o c a r r i e r s , h y b r i ds c a f f o l d , c h o n d r o c y t m v 辫江太学硕士学位论文( 2 0 0 7 ) 第一章文献综述 自古以来，组织和器官的缺损或功能衰竭就严重她威胁着人们健康和生命。 尤其到了现代，全世界每年约有上千万人遭受各种形式的创伤，导致器官的功能 丧失。有数十万人迫切需要进行各种器官移植，但可供移植的器官数量有限及机 体免疫排斥等方面的因素很难满足临床救治的需要。因此，借助于现代科学技术， 使受损的组织器官获得完全再生或在体外复制出所需要的组织或器官进行替代 性治疗便成为生物学、基础医学和临床医学关注的焦点。2 0 世纪9 0 年代，组织 工程作为一种崭新的组织和器官再生的治疗手段被提出并越来越被人们所接受， 成为一种新的器官和组织再生的治疗手段。 1 1 组织工程简介 组织工程思想萌芽于2 0 世纪3 0 年代【1 1 ，发展于2 0 世纪8 0 年代 2 - 4 。1 9 8 7 年春， 美国自然科学基金工程理事会在研讨生物工程前景时，正式确立了组织工程这一 概念。此后美国多次举行专家小组讨论会，以促进多学科的交叉和发展。1 9 8 8 年在美国l a k et a h o 举行的专家小组会上首次确定了组织工程的定义，从而明确 了组织工程的研究范围和目标。同年美国国家科学基会会受理和资助了组织工程 方面的研究项目。 其后，组织工程的研究逐步明确为应用细胞、支架材料以及生物活性物质构 建能够修复和再生受损组织或器官的细胞一支架复合物。从1 9 9 3 年，l a n g e r 和 v a c a n t i 较系统地提出了组织工程的概念与思想后，组织工程的研究开始进入全 面与高速发展的阶段，成为再生医学将来发展的重点方向。组织工程的基本原理 和方法是首先在体外构建具有一定形状和结构的组织和器官，然后将体外扩增的 自体或异体细胞种植于体外构建的组织或器官细胞模拟物( 支架) 中，形成细胞 支架复合物。然后将该细胞支架复合物在体外模拟人体的环境中培养，形成组 织工程化的组织或器官后植入人体；或者在体外不经过培养，直接植入人体受损 的组织或器官部位，通过植入细胞的增殖与分化以及类细胞外基质支架相匹配的 降解吸收而形成结构与功能与目标组织或器官相一致的新组织或器官，从而达到 创伤修复和功能重建的目的。随着组织工程学的进一步的发展，直接将体外构建 的支架材料移植到体内，同样达到了修复受损组织和器官的日的。如图1 1 所示， 体外构建的支架原位地移植到人体受损的组织或器官部位，通过材料本身的物理 或者化学结构诱导人体自身细胞的长入，从而达到创伤修复和功能重建的目的。 濒江大学硬士学位论文( 2 0 0 7 ) 组织工程学的产生足继细胞生物学和分子生物学之后。生命科学发展史上的又一 新的里程碑，标志着医学将走出组织移植、器官移植、挖肉补疮的范畴，步入制 造组织和器官的新时代。随着对生物材料研究与理解的深入，发展到今天，要求 材料能够积极诱导特定的细胞和组织反应，抑制不希望的细胞和组织反应，即所 谓第三代生物材料。再生医学与组织工程的根本目的是能够重建具有三维结构的 组织和器官。这就要求材料不仅应具备特定的生理活性，还应该具有特定的三维 拓扑结构，以诱导细胞和组织的长入，并控制再生组织和器官的三维形状。 m g 1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f t i s s u ee n g i n e e r i n g 1 2 组织工程的研究内容 由组织工程的基本原理和方法可知，组织工程组织或器官的构建涉及到以下 三个方面的内容；即种子细胞、支架材料以及细胞支架复合物构建组织工程化 组织或器官p 】。 1 2 1 种子细胞 种子细胞是组织工程的前提与基础，再生组织或器官的结构与功能的实现最 终取决于支架材料中种植的种子细胞的增殖与细胞外基质的分泌。理想的种子细 胞应该具备来源稳定、取材方便、体外培养增殖力强、细胞表型稳定、耐机体免 疫性高、无致瘤性等特点f 6 1 。干细胞无疑是最理想的种子细胞1 7 1 。所谓干细胞是 指一种具有无限或长期自我更新( s e l f - r e n e w ) 能力，并且至少可以向一种成熟 功能细胞分化的细胞群体引。目前，通过对干细胞进行体外分离与纯化、定向诱 导分化以及体外大量扩增，并以此作为组织工程的种子细胞，可实现体外重构人 骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪、神经、血管、皮肤、角膜以及造血和免疫等组织 或器官。1 9 9 8 年底，美国两家科研单位先后成功地培养出入胚胎千细咆，这种细 2 新江大学颈士学位论文( 2 0 0 7 ) 胞与自体细胞不同，具有持续生长和分化的能力。此项研究成果使解决组织工程 研究中人体细胞来源问题出现了转机，并开启了能够在实验室培养出人体任何组 织或器官的科学大门近年来，原位诱导越来越受到重视，将一定结构和形状的 材料移植到人体，通过材料本身的特定的物理化学结构，诱导周围组织细胞的长 入，达到原位修复的目的。也开拓了种子细胞的来源。 1 2 2 组织工程材料 组织工程材料设计的基本原则是根据仿生材料学的思想，最大程度地体外模 拟目标组织或器官的细胞外基质的组成、结构和功能。组织工程对生物材料的选 择和要求非常的严格，要求材料在满足加工的条件下，具备良好的生物相容性、 生物安全性和生物降解性2 1 。目前，组织工程相关生物材料的研究重点为第三 代生物材料生物活性材料，即期望可降解的生物活性材料能在分子水平刺激 细胞的特异性响应【1 3 1 。 根据以上特性，天然生物大分子、人工合成聚合物材料、无机生物材料及其 复合材料成为组织工程领域的首选材料，尤其是具有生物降解性能的天然或合成 高分子材料。 天然的生物大分子主要有：胶原【1 4 4 7 】、明胶、纤维蛋白、蚕丝蛋白、壳聚糖 8 - 2 3 、琼脂糖、透明质酸、海藻酸盐等，具有良好的生物安全性和生物相容性， 但是天然生物材料的降解速率一般都较快1 2 4 - 2 9 1 。 合成的高分子材料主要有：聚乙交酯( p g a ) 、聚丙交酯( p l a ) ，乙交酯 和丙交酯的共聚物( p l 3 a ) 、聚己内酯( p c l ) 、聚羟基丁酸酯( p h a ) 、聚 氨酯( p u ) 等，具有可调的表面性能和生物降解速率，易实现标准化，但是材 料表面缺乏细胞可以识别的位点，不具备生物活性，而且材料的降解产物可能存 在一定的毒性 3 0 - 3 6 1 。 近年来，将不同的材料按照材料使用的要求，设定特定的结构和化学组成成 为研究的焦点。充分地利用不同材料各自的特点，有机地集合不同材料的特性， 合理地设计材料，将大大扩展传统材料的应用和新生材料的开发与应用。 1 2 3 组织工程支架 生物体的组织或器官可被认为是由一定功能的细胞及其分泌的细胞外基质 ( e c m ) 所组合成的复合材料。在组织工程中，人工构建细胞外基质模拟物一 组织工程支架是体外构建一定结构和形状的组织和器官的最关键部分。因此对三 维组织工程支架的构建提出了以下的要求。 ( 1 ) 良好的生物安全性，无毒性、无刺激性、无致敏性，无致癌和致畸性： 浙江大学硕士学位论文( 2 0 0 7 ) ( 2 ) 良好的生物相容性，对人体组织、血液和免疫等系统无不良反应； ( 3 ) 能有效地调节细胞在组织工程材料表面的黏附、增殖、迁移以及分化 等行为； ( 4 ) 可控降解性，具有与组织再生相匹配的降解速率，而且降解产物无毒， 能通过代谢途径排出体外； ( 5 ) 适宜的机械性能； ( 6 ) 良好的塑型和加工性能； ( 7 ) 来源广泛，价格适宜，方便消毒和存储。 根据以上特性，具有生物降解性能的天然或合成高分子材料成为组织工程支 架的首选材料。组织工程支架分为三维多孔支架和注射型支架。加工与制备具有 特定微结构的三维多孔组织工程支架有多种方法，如相分离、致孔剂、电纺丝和 三维打印等，在本章后面的部分会对其进行详细的介绍。 可注射型支架是将细胞与一种具有流动性的、生物相容性好的材料复合，直 接通过注射器注射到机体缺损部位。材料能在原位形成具有一定机械强度、一定 形状并且可与体液进行交换的支架，细胞在支架中生长并最终形成组织。也可将 材料直接注入体内，利用注射物周围组织的细胞扩展生长增殖形成组织。细胞生 长所需营养是由机体体液交换提供，同时其体内环境也利于其分化和功能的表达 以及组织的形成。支架通过注射完成植入，故可降低手术难度，减少手术创伤， 特别适用于微创伤的修复【3 7 1 。可注射性支架材料应具备良好的生物相容性、适宜 的机械强度、温和的固化成型条件和易操作性f 3 9 】。如图1 2 所示，将溶液状态 的细胞凝胶前体注射到受损的组织处，通过条件的改变在原位处凝胶，形成一 定的形状。注射型支架目前主要用于骨组织和软骨组织再生修复治疗，但将是今 后组织工程支架发展的重要方向之一。 f 唔1 2s c h e m a t i cd i a g r a mo f i n j e c t a b l es c a f f o l du s i n gi nt i s s u ee n g i n e e r i n g 4 新江大学硬士学位论文( 2 0 0 7 ) 1 2 4 组织工程化组织或器官的构建 在种子细胞和支架材料研究的基础上，构建组织工程化组织或器官同样是组 织工程研究的重点内容。组织工程化组织或器官构建的主要是实现种子细胞与支 架材料间有效地复合及其在体外培养条件的控制等。目前，种子细胞与支架材料 复合的方法主要包括瑚】浸渍法，沉淀法、吸附法和注射法等。 根据构建组织或器官的大小，细胞，支架复合物的培养方式主要分为静态培 养和动态培养。一般认为，当支架的厚度小于2 m m 时，适宜采用静态培养方式； 当支架的厚度大于2 m m 时，则需要采用动态培养方式【4 ”。近来，应用生物反应 器体外构建细胞度架复合物的研究得到广泛开展1 4 2 - 4 9 l 。 1 2 5 正在构建的组织工程化器官 组织工程化组织或器官的研究目前多集中在皮肤、骨、软骨、肌腱以及人工 肝和人工胰脏等方面，还包括肝，心脏、神经、血管、角膜和脂肪等。可以说， 除大脑和胃以外的器官，都被尝试采用组织工程技术进行重建。如图1 3 所示， 组织工程化的皮肤及半月板已经开始被应用于l f 缶床。 f - 嗨1 3 ( a ) t h ei m a g eo f t h e 6 s s u e e n g i n e e r e ds k i n i m e g r a 。；( ”t h ei m a g e o ft h e t i s s u e - e n g i n e e r e ds k i n - a p l i g r a f ；( c ) t h ei m a g eo f ( h et i s s u e - e n g i n e e r e dm e n i s c u s 5 濑江大学碗士学位论文( 2 0 0 7 ) 早在t 9 9 4 年，k i m 和v a e a n t i 以p l a 为支架材料，以5 t 0 7 , r d 浓度接种 新生小牛关节软骨细胞于支架中，在体外培养周后，植入到裸鼠皮下。实验结 果显示，在第3 、6 、9 、1 2 周后所有3 6 个标本均形成了新生软骨组织，并与植 入复合物的形态相同。上海第二医科大学附属第九人民医院( 现为上海交通大学) 组织工程研究中心曹谊林教授领导的课题组近年来在组织工程化组织或器官的 构建方面取得了可喜的成就。他们采用p l u r o n i c 为支架材料，与猪肋软骨分离的 软骨细胞复合后，植入自体皮下可以形成具有弹性的软骨组织。华西医科大学的 杨志明教授将复合有成骨细胞和血管内皮生长因子的管状中空钙磷陶瓷材料中 植入血管束，成功地构建了具有血供能力的组织工程化骨嗍。 1 3 软骨组织工程及其材料 软骨损伤是目前常见的疾病，由于关节炎或运动创伤所造成的关节软骨损伤 给许多病人带来痛苦。软骨的代谢活跃而修复能力有限，没有血管，在损伤之后 不能形成纤维凝块，没有炎性细胞迁移进入，也没有血管未分化细胞进入损伤的 部位，所以不易自行进行修复。另外，软骨本身在损伤部位缺乏未分化的细胞， 损伤之后没有软骨细胞迁移生长到损伤的软骨之中。而且，随着年龄的增长，软 骨细胞的分裂能力逐渐降低产生细胞外基质的能力也随之降低。迄今为止，临 床上仍然缺少有效的方法修复受损的软骨组织。应用组织工程的方法和原理来进 行软骨组织的修复是目前的一个重要手段，且取得了良好的效果。l a n g e r 和 v a c a n t i 提出组织工程的概念之后，首先将这一想法应用于软骨组织的修复。他 们将软骨细胞接种在可生物降解的p l g a ( 或p l l a ) 支架后直接植入动物皮下 组织或经体外培养后植入动物皮下组织，诱发生成了与支架的三维形状相一致的 新生软骨【5 3 1 。目前软骨组织工程在种子细胞、支架材料以及生物活性因子等方 面都得到广泛研究，在有关组织工程的研究中所占的比重最大，取得的成功也最 多。但是尽管如此，到目前为止，仍然没有较好的材料能满足临床应用的需求。 这主要和软骨组织的结构有关。 1 3 1 软骨的组织学特点 人体的软骨属于结缔组织，其中含有少量的软骨细胞和大量细胞间质。软骨 细胞散在于软骨基质内的软骨陷窝内，陷窝周围的基质染色较深称为软骨囊。幼 稚的软骨细胞较小，常单个分碲于关节软骨的边缘区，呈扁圆形。由边缘向中央 软骨细胞的体积逐渐增大，呈椭圆形或圆形，具有较明显的软骨囊。幼小的软骨 6 濒江大学磺士学位论文( 2 0 0 7 ) 细胞可分裂，深部成熟的软骨细胞常2 8 个成群分布。软骨细胞间质的化学成分 主要包括胶原蛋白、蛋白多糖和少量的非胶原蛋白。软骨组织中的胶原主要为i i 型胶原，占胶原总量的9 0 以上。u 型胶原纤维在软骨内呈三维网状分布，为关 节软骨提供抗张强度。蛋白多糖通过连接蛋白以非共价键形式与透明质酸结合形 成巨大的蛋白多糖聚合体。蛋白多糖聚合体分子链上含有丰富的负酸根离子，可 以结合大量的水形成水凝胶，为软骨提供抗压强度和弹性。水分占软骨组织全重 的7 5 ，其中含有大量正离子以平衡蛋白多糖分子中的负电荷，并含有许多软骨 细胞所需的营养物质和细胞代谢产物。软骨组织内无血管，但由于软骨基质富含 水分，营养物质易于渗透，故软骨细胞仍能获得必要的营养。 软骨组织中的其它非胶原蛋白如锚着蛋白、纤维粘连蛋白等通过与细胞表面 受体和其它大分子之间的相互作用将软骨细胞粘连在软骨基质上，并稳定软骨基 质的结构。根据软骨基质成分和组织结构的不同，软骨分为透明软骨、纤维软骨 和弹性软骨。关节软骨属于透明软骨，它的特点是纤维含量比纤维软骨和弹性软 骨少，而蛋白多糖水凝胶含量相对较多，软骨基质为透明状。成熟的关节软骨根 据其细胞和基质的变化可分为浅表层、中层、深层和钙化层。其中中层和深层中 的蛋白多糖含量较高。图1 4 为关节软骨的结构示意图和组织学显微照片( h e 染色) 。由图所示，软骨细胞呈球形，分布在细胞外基质中。 ab m g1 4s c h e m a t i cd r a w i n go fa r t i c u l a rc a r t i l a g e ( a ) a n dh i s t o l o g yi m a g e s ( b ) ( h es t a i n i n g ) o f h y a l i n ec a r t i l a g es h o w i n gc h a n g e si no r g a n i z a t i o nw i t hd e p t hf r o mt h ea r t i c u l a rs u r f a c et ot h e s u b c h o n d r a lb o n e 1 3 2 软骨修复面临的问题 软骨组织工程，除了要解决如细胞束源、支架细胞相容性，体外组织构建 等组织工程共有问题之外，还有一些特殊的问题有待解决。由于人体内的软骨具 浙江大学硕士学位论文( 2 0 0 7 ) 有极特殊的力学性能，例如关节软骨，具有很好的弹性和韧性，可承受较大的负 荷，又具有光滑的表面，使关节活动时的摩擦力极小，但是至今软骨组织工程仍 无法再造与天然软骨具有相同力学性能的软骨组织，这是目前软骨组织工程所面 临的主要问题之一。此外，再生软骨组织中软骨细胞的去分化以及再生软骨的纤 维化也是软骨组织工程中常遇到的难题。这些问题归根结底，都是由于细胞在人 为模拟环境中( 包括三维支架环境及体内外培养环境) 构建软骨的能力不足有直 接的关系。因此要解决这一问题，就必须从设计软骨细胞生长环境入手，研究促 进软骨细胞正常表达功能的环境，进而构建这种环境从而解决上述问题。 1 3 3 软骨组织工程材料 1 3 3 1 软骨组织工程用三维支架材料 组织工程分为三维多孔支架和可注射性支架。三维支架主要是指在体外采用 技术手段制备的具有多孔和固定形状的支架，体外预先细胞培养后移植到体内。 多孔支架的制备方法很多f 图1 5 ) ，如致孔剂法【5 蟠5 1 ，冻干法 5 6 5 7 】、热致相分离法 1 5 8 , 5 9 1 、电纺丝法1 6 0 舵】、编织法 6 3 , 6 4 、超临界流体气体法f 6 5 1 、三维打印法i 删以及微 球烧结法【6 7 - 6 9 1 等。不同的制备方法适合与不同的材料及不同的应用领域。三维多 孔支架有效的模拟了细胞外摹质的物理环境，为细胞的生长提供了空间，同时， 三维支架往往具备较好的力学性能，使其具备更好的实验操作性能。 8 赣江大学硕士学位论文( 2 0 0 7 ) f 嘻1 5t h es t r u c t u r e so fp o r o u ss c a f f o l d sf a b r i c a t e dv i a ( a ) p a r a f f i nm i c r o s p h e r el e a c h i n g ，( b ) f i z e - d r y i n g , ( c ) t h e r m a li n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n ( t i p s ) ，( d ) e l e c _ b o s p i n n i n g , ( e ) m e s h , ( f ) s u p e r c r i t i c a lc 0 2 ，( g ) 3 dr a p i dp r o t o t y p i n g a n d ( ) m i c r o s p h e r e ss i n t e r 1 3 3 2 软骨组织工程用注射型水凝胶支架 除了传统的三维支架材料，近几年，水凝胶作为优异的细胞传递体系广泛的 应用于软骨组织工程。水凝胶既可以直接植入体内作为软骨组织的替代材料，也 可在水凝胶交联之前与细胞悬液混合，然后交联形成水凝胶细胞复合体，可在 体外进行软骨细胞的三维立体培养；或者通过注射的方法将材料和细胞的混合物 注入体内软骨组织缺陷处，然后在体内交联，以修复受损的软骨组织。 注射型水凝胶类支架包括天然水凝胶材料或聚合物水凝胶材料，以及以水凝 胶材料为载体的材料体系。这类材料在注射状态下具有可流动性质( 溶胶) ，注 入体内后则通过物理或化学作用形成具有一定形状和机械强度的支架( 凝胶) 。 水凝胶作为可注射型支架具有以下优缺点【7 0 1 。优点：( 1 ) 良好的生物相容性；( 2 ) 凝胶的水溶液环境有利于保护细胞；( 3 ) 水凝胶基体有利于营养物质和细胞分泌 产物的运输；( 4 ) 易采用细胞粘附配体进行改性。但是水凝胶材料同样具有一些 缺点，水凝胶材料机械强度较低，易于降解。但是这并不影响水凝胶材料的广泛 廊用。水凝胶成胶形式多种，但主要包括以下几种。 1 3 3 2 1 温敏型水凝胶类可注射支架 温敏型水凝胶是指当一定浓度的溶液在温度升高或降低到一定值时，溶液可 o 浙江大学预士学位论文( 2 0 0 7 ) 迅速形成凝胶。根据形成凝胶的温度变化过程可分为升温型水凝胶和降温型水凝 胶。温敏型水凝胶不需要添加任何助剂，只需改变温度就可凝胶化，最大限度的 降低了外界物质对细胞生长的影响，因此在可注