（材料科学与工程专业论文）电纺PLGA及PLGA羟基磷灰石纳米纤维材料研究.pdf

摘要 组织工程是指应用生命科学与工程学的原理和方法来设计、组建、维护人体 细胞和组织的生长，以恢复受损的组织或器官的功能的一门学科。组织工程的发 展，为解决许多临床问题提供了希望。 组织工程支架材料一直是研究的主要内容之一。几乎所有可生物降解的天然 大分子和合成高分子生物材料均可用于组织工程支架研究。近年来，发展了十余 种组织工程“硬支架”的制备技术，如致孔剂法、热致相分离法、固体曲面制造 技术、静电纺丝法等。其中，静电纺丝技术由于能够直接制备得到连续的聚合物 纳米纤维，因而有其独特优势。电纺纳米纤维支架形态结构类似细胞自j 质，有利 于细胞的粘附生长。通过材料结构设计，又可制得多组分复合的网状或取向的纤 维支架，对细胞的分化与生长产生特殊的刺激和影响，从而实现对细胞一支架相 互作用的控制。目前，电纺纤维支架已经广泛用于各种组织工程的研究。 骨组织工程近年来成为研究的重点和热点。骨组织工程的三个关键要素为骨 组织工程支架材料、信号分子和靶细胞。支架材料方面，单一的生物活性陶瓷或 聚合物材料均存在其缺陷。将聚合物的可加工性和生物活性陶瓷的机械强度及生 物活性结合起来，制备骨组织工程复合材料，成为当前的研究趋势。 本文研究了聚( 丙交酯乙交酯) 共聚物( p l g a ) 溶液的电纺行为。扫描电 子显微镜( s e m ) 观察各种条件下制备的纤维形貌并统计平均直径发现，溶液浓 度、溶剂挥发性、电压、溶液流速、喷嘴到收集装置之间的距离以及环境温度等， 均能影响电纺过程和所得纤维形貌。动态力学分析( d m a ) 证明，随着纤维直 径的增大，纤维膜初始的储能模量减小。材料的体外降解实验发现，其质量损失 在初始阶段较快，经历一段平台期后，再次加快。在这一过程中，材料体积发生 较大收缩。 在此研究基础上，我们将两种羟基磷灰石( 尺寸较大的羟基磷灰石颗粒h a p 和尺寸较小的针状羟基磷灰石( a h a ) 引入到材料中，制备了p l g a h a p 和 p l g a a h a 两种复合纤维材料。观察其表面形貌和内部结构认为，a h a 在p l g a 纤维中的分散状况较好。d m a 测试发现，材料中加入h a p 和a l i a 后，其玻璃 化转变温度t g 升高，材料硬度变大。降解实验中，复合纤维膜材料体积收缩加 剧，p l g a a h a 复合材料质量损失较快。 将骨髓间质细胞( m s c s ) 在材料表面培养周后观察细胞形态发现，细胞 在两种复合材料上黏附并保持其表型，细胞表面有大量分泌物。我们初步认为， 这两种复合材料有望用作骨组织工程支架材料。 关键词：组织工程，静电纺丝，p l g a ，羟基磷灰石，骨 i i a b s t r a c t t i s s u ee n g i n e e r i n g w h i c hu s e st h ep r i n c i p l eo fe n g i n e e r i n ga n dl i f es c i e n c e s1 0c r e a t e a r t i f i c i a lc o n s t r u c t sf o rd i r e c tt i s s u er e g e n e r a t i o n , h a sa t t r a c t e dm a n ys c i e n t i s t sa n d s u r g e o n sw i t hah o p et ot r e a tp a t i e n t si nam i n i m a l l yi n v a s i v ea n dl e s sp a i n f u lw a y s c a f f o l dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nm o s tt i s s u ee n g i n e e r i n gs t r a t e g i e s a l m o s ta l l b i o d e g r a d a b l en a t u r a lb i o m a c r o m o l e c u l e sa n ds y n t h e s i z e dp o l y m e r sb i o m a t e r i a l s h a v eb e e ns t u d i e d 舾t h es c a f f o l d i n gm a t e r i a l s r e s e a r c h e r sh a v ed e v e l o p e dv a r i o u s t e c h n o l o g i e st of a b r i c a t et i s s u ee n g i n e e r i n g ”h a r ds c a f f o l d ”，i n c l u d i n gp a r t i c l e l e a c h i n g ，t h e r m a l l y i n d u c e d p h a s es e p a r a t i o n , s o l i d f r e e - f o r mf a b r i c a t i o n , e l e c t r o s p i n n i n ga n ds oo n e l e c t r o s p i n n i n gh a sg a i n e dm u c ha t t e n t i o nd u et oi t s c o n s i s t e n c yi np r o d u c i n gf i b e r si ns u b m i c r o nr a n g e e l e c t r s p u nt h r e e d i m e n t i o n a l f i b r o u ss c a f f o l dm i m i c st h es t r u c t u r eo f n a t u r a le x t r a e e l l u l a rm a r x ( e c m ) a n df a v o r s c e l la d h e r e n c ea n d p r o l i f e r a t i o n b ys p e c i a lm a t e r i a ld e s i g n , m u l t i c o m p o n e n tf i b e r so r o r i e n t e df i b e r sc a nb ef a b r i c a t e d , w h i c hm a yi n t r o d u c es i g n a l sf o rc e l lg r o w t ha n d d i f f e r e n t i a t i o n s of a r , e l e c t r o s p u nf i b r o u ss c a f f o l d sh a v eb e e nu s e df o rc o n s t r u c t i n g o f m a n y t i s s u e si nt h et i s s u ee n g i n e e r i n gw a y i nr e c e n ty e a r s ，t i s s u ee n f f n e e r e db o n er e g e n e r a t i o nr e c i e v e dm o r ei n t e r e s t t h e r e a r et h r e ek e yf a c t o r si nb o n et i s s u ee n g i n e e r i n g ：s c a f f o l d ，g r o w t hf a c t o r sa n dc e l l s f o r s c a f f o l d i n gm a t i e r i a l s ，b o t hb i o a c t i v ec e r a m i c sa n dp o l y m e rm a t e r i a l sh a v et h e i rl i m i t s as t r a t e g yi st oi n t r o d u c eb i o a c t i v ec e r a m i c si n t op o l y m e rm a t r i c s ，w h i c hw i l l c o m b i n et h ep r o c e s s i b i l i t yo fp o l y m e ra n dt h em e c h a n i c a ls t r e n 昏ho fc e r a m i c s m e a n w h i l e b i o a c t i v ec e r a m i c sw i l la 1 i l a n c et h eb i o a e t i v i t ya n do s t e o c o n d u c t i v i t yo f t h em a r r i e s i nt h i sw o r k , w ef i r s t l ys t u d i e dt h ei n f l u e n c eo fe x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r sa n d s o l u t i o np r o p e r t i e so nt h ee l e c t r o s p i n n i n gp r o g r e s sa n dm o r p h o l o g yo ft h er e s u l t e d f i b e r s e l e c l o ns c a n n i n gm i c r o s c o p y ( s e m ) i m a g e ss h o w e dt h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e o fe l e c t r o s p a np r o d u c t sw i t hv a r i a t i o n so fs o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n ，s o l v e n tv o l a t i l i t y , a p p l i e dv o l t a g e , s o l u t i o nf l o wr a t e , n o z z l e - c o l l e c t i o nd i s t a n c ea n de n v i r o n m e n t i i i t e m p e r a t u r e d y n a m i c a lm e c h a n i c a la n a l y s i s ( d m a ) r e v e a l e dt h a tt h ei n i t i a t i n g s t o r a g em o d u l u so ft h ef i b e rm a t sd e c r e a s e dw i t l la ni n c r e a s eo ft h ea v e r a g ef i b e r d i a m e t e r s i nd e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t ，t h ew e i g h to ft h ef i b e rm a t sl o s tq u i c k l yi nt h e f i r s tw e e k , t h e nl e v e l e do f f a f t e r7w e e k s ，t h ed e g r a d a t i o nr a t es p e e d e du pa g a i n a t t h e $ f l l t l ep e r i o d ，t h em a t e r i a lv o l u m es h r i n k e dal o t a f t e ru n d e r s t a n d i n go ft h ei n f l u n c eo fe l e c t r o s p i n n i n gp a r a m e t e r s ，w ei n t r o d u c e d h y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e s ( h a p ) a n da c i c u l a rh y d r o a p a t i t e ( a h i ) i n t ot h ep l g a m a t r i x t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) r e s u l ti n d i c a t e dt h a ta l i ad i s p e r s e d b e t t e ri np l g af i b e r st h a nh a p d m ac u r v er e v e a l e dt h a tt h eg l a s st r a n s i t i o n t e m p e r a t u r eo 曲o f t h ec o m p o s i t e si n c r e a s e d 、 ，i mt h ea d d i t i o no fh a po ra h a , | n d t h ec o m p o s i t e sb e c a m eh a r d e rc o m p a r e dw i t ht h ep u r ep l g af i b e rm a t s i n d e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t , t h ec o m p o s i t e ss h r i n k e dm o r et h a nt h ep l g a f i b e rm a t s t h e p l g a a h ac o m p o s i t e sd e g r a d a t e dm o r eq u i c k l y f u r t h e r m o r e ，h u m a nb o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( m s c s ) w e r es e e d e do n b o t l lt h ec o m p o s i t es c a f f o l d sa n dt h ep l g af i b e rm a t s a n dc u l t u r e df o ro n ew e e k s e mi m a g e si n d i c a t e dt h a tm s c sa d h e r e dw e l lo nt h ec o m p o s i t es c a f f o l d sa n d m a i n t a i n e dt h e i rp h e n o t y p e c e l ls e c r e t i e sw e r ef o u n do nt h ec e l l $ 1 1 r f a c e a l lt h e s e r u s u l t ss u g g e s tt h a tt h ep l g a h ac o m p o s i t e sh a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nb o n e t i s s u ee n g i n e e r i n g k e yw o r d s ：t i s s u ee l l g i n e e r i n g ；e l e e t r o s p i n n i n g ；p l g a ；h y d r o x y a p a t i t e ；b o n e 第一章文献综述 1 1 再生医学与组织工程 再生医学是一门古老而年轻的科学。从广义上讲，再生医学是研究组织再生 的一门科学。按照这一说法，再生医学的历史十分悠久，因为自人类出现起就有 创伤，有创伤就有组织修复和再生。为了促进创伤组织的修复，进行相应的治疗 至少有数千年的历史。例如，约在公元前3 5 0 0 年，古埃及的医生已可做截肢术 和包扎伤口；公元前4 6 0 3 7 7 年，西方现代医学之父希波克拉底( h i p p o c r a t e s ) 通过仔细的骨折断端对接而使断离的软组织和骨折断端愈合；公元前2 1 1 6 世 纪的我国夏代，人们用砭石、骨针进行伤口按压、放血、排脓，以此来减轻痛苦、 促进组织再生和伤口愈合。直到近代，随着医学的发展，已有许多方法可促进创 伤组织的愈合，但基本上都是采用生物学的方法，依靠体内组织细胞的再生潜力 进行“生理性”修复【l 】。 2 0 世纪8 0 年代工程学的理论和技术被引入再生医学中，形成了组织工程学。 到9 0 年代后期干细胞技术方面出现突破，再生医学上升到一个新的高峰，焕发 出新的活力。就再生医学本身而言，在国际上还未被明确界定，尚存在不同的看 法【2 】。但一般认为，再生医学是利用人类的自然治愈能力，使受到巨大创伤的 机体组织或器官获得自己再生能力为目的的医学。目前，再生医学所包含的内容 主要包括以下四大块：干细胞与克隆技术、组织工程、组织器官代用品、异种器 官移植【3 】。 世界上患有组织缺损活器官衰竭的病人很多。在组织工程概念提出以前，临 床上，治疗这类疾病的主要方法有器官移植、人工替代材料、外科修复以及仪器 药物治疗等。然而，以上方法均存在其局限性。其中，自体器官移植( a u t o l o g o u s t r a n s p l a n t a t i o n ) 虽然效果显著，无免疫排斥反应，但须从健康部位取材，造成新 的缺损，且自体供区也有限；同种异体移植( a l l o g e n i ct r a n s p l a n t a t i o n ) 会长期 存在免疫排斥反应，且供体有限，不能满足大量患者需求；人工替代材料不能与 受损组织和器官愈合成整体，更不能参与正常的新陈代谢；外科手术或医疗仪器、 药物也存在不能很好地修复，引起其他疾病产生等问题。因此，用生物材料制成 人工组织和器官成为一条可行且非常重要的途径。 浙江大学硕士学位论文 “组织工程”的概念正是在这一背景下于上世纪8 0 年代提出的。1 9 8 8 年美 国l a k e t a h o 举行的专家小组会首次确定了组织工程的定义。所谓组织工程，是 指应用生命科学与工程学的原理和方法来设计、组建、维护人体细胞和组织的生 长，以恢复受损的组织或器官的功f 1 4 1 。其后，组织工程的研究范围和目标逐 步明确为应用细胞，支架材料以及生物活性物质构建细胞一支架复合物，以修复 和再生受损组织或器官。由此可见，组织工程学是一门交叉学科，它既依赖于材 料学、化学、细胞生物学、分子生物学、基因工程、医学和力学等学科的发展， 又有其独立于各个学科之外的独特性。组织工程学是继细胞生物学和分子生物学 之后，生命科学发展史上的又一新的里程碑，成为继器官移植和外科重建手术这 两大临床治疗手段后的第三大医学治疗技术 5 】。组织工程的诞生标志着“生物 科技人体时代”的到来，开创了再生医学的新时代，必将产生巨大的社会与经济 效益 6 】。 组织工程的基本思路是：将自体或异体细胞在体外扩增后，种植于体外构建 的细胞外基质( e x t r ac e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 模拟物( 支架) 中，细胞在支架提 供的空问结构中生长，形成细胞一支架复合物。然后将该细胞一支架复合物植入 受损的组织或器官部位，通过植入细胞的增殖，分化，以及类细胞外基质支架相 匹配的降解吸收而形成结构与功能与目标组织或器官相一致的新组织或器官，从 而达到创伤修复和功能重建的目的。图1 1 为组织工程基本原理的示意图。由此 可见，细胞，支架及其复合方法是组织工程的三大要素。 图1 - 1 组织工程示意图 2 第一章文献综述 上世纪8 0 年代以来，组织工程发展迅速，已经应用于人体几乎每一种实质 组织和器官的再生与重建的研究，在皮肤、角膜、肝、胰、软骨、骨、血管、尿 道、神经系统等领域均取得了一定成果【7 】。其中，关于组织工程的骨、软骨、 血管、皮肤，以及神经的研究最为活跃8 1 3 1 。目前，组织工程开始逐步向产业 化发展。 1 2 组织工程材料 2 0 世纪6 0 8 0 年代，在对工业化的材料进行生物相容性研究基础上，开发 了第一代生物医用材料及产品在临床应用，例如体内固定用骨钉和骨板、人工关 节、人工心脏瓣膜、人工血管、人工晶体和人工肾等。上述生物医用材料具有一 个普遍的共性：生物惰性。即生物医用材料发展所遵循的原则是尽量将受体对植 入器械的异物反应降到最低。这个原则维持了2 0 多年。在此期间，数以千万的 患者植入了由惰性材料制成的器械，他们的生活质量也在植入后的5 2 5 年里有 了明显的改善【3 】。 随着组织工程的发展，人们对于组织工程的机理研究深入，对生物材料提出 了更高的要求。传统生物材料的“生物惰性”以及“不可降解性”在多数情况下 已经无法适应组织工程支架的要求。组织工程材料设计的基本原则是根据仿生材 料学的思想，最大程度地体外模拟目标组织或器官的细胞外基质的组成、结构和 功能。目前，组织工程材料的设计已经由简单的物理和化学模拟发展到细胞与分 子水平的模拟。通过研究蛋白质在组织工程材料表面的吸附与构象变化，材料对 机体免疫系统的刺激与应答，材料对细胞因子和生长因子的释放以及材料与细胞 间的相互作用等基本问题的研究，最终制备出具有生物活性的、智能的组织工程 材料【1 4 】。 组织工程用生物材料按其应用目标的不同可以分为：结构类组织工程材料、 代谢类组织工程材料以及细胞类组织工程材料。其中结构类组织工程材料又可分 为软组织工程材料和硬组织工程材料。如果按材料的来源以及性能分，组织工程 材料又可分为：天然组织工程材料，合成组织工程材料以及组织工程复合材料。 1 2 1 组织工程用天然大分子材料 天然材料是由生物体内提取或自然环境中直接得到的一类大分子及其衍生 物。天然组织工程材料往往具有良好的生物安全性和生物相容性。但是，天然生 濒迂大学硕士学位论文 物材料的降解速率一般都太快，而且机械性能和加工性能也无法满足组织工程的 需要。由于不同生物个体的材料组成和性能有较大的差别，天然生物材料的质量 也难以实现标准化和稳定化。常用于构建组织工程支架的天然材料，按照结构与 组成，可分为天然蛋白质、多糖及其衍生物，此外还包括一些生物合成聚酯。典 型的蛋白类、多糖类物质以及它们的一些衍生物有胶原、明胶、环糊精、淀粉、 葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、纤维素、海藻酸衍生物、硫酸软骨素和肝素( 图 2 2 ) 等 1 5 1 。 海藻酸钠 碍国 掩c o o h 蛙c h 2 0 h掩姑 透明质酸 葡聚糖 壳聚糖 境蹙c h 2 0 s o 扛! c o o h 锚c h 2 0 s 0 3 h 肝素 图2 2 几种天然高分子及衍生物结构 1 2 2 组织工程用合成高分子材料 合成组织工程材料可以根据具体组织或器官的特点进行专门设计，其表面性 能以及生物降解速率都可进行调节，且具有较好的力学和加工性能，因而产品的 质量容易标准化，有利于大规模生产。合成组织工程材料的种类多、选择范围广， 是组织工程材料的一个重要来源。合成组织工程材料的最大缺点是材料表面缺乏 细胞可以识别的位点，通常不具备生物活性，而且材料的降解产物可能存在一定 的毒性 1 6 1 。 4 c i 6 一 黼 删 辑 酣 酸 一 “ 一 硫 一 第一章文献综述 目前应用最多的合成组织工程材料主要有聚乙交酯( p g a ) 、聚丙交酯 ( p l a ) 、聚( 丙交酯乙交酯) 共聚物( p l g a ) 、聚己内酯( p c l ) 、聚( 3 羟基 丁酸酯) ( p h b ) 和聚氨基酸等。 应用于组织工程的其他合成聚合物材料还有聚氨基酸、聚膦腈、聚酸酐、聚 碳酸酯和生物降解型聚氨酯等。 1 2 3 组织工程用无机材料 各种生物陶瓷也广泛应用于组织工程，特别是骨组织工程支架材料的构建， 主要有羟基磷灰石( h a ) 、b 磷酸三钙( p - t c p ) 等，将在以后的章节中详细介 绍，在此不再赘述。 1 2 4 组织工程用复合材料 人体的组织或器官在其组成、结构以及功能方面都具有高度的复杂性。因此， 对组织工程支架的要求也是多方面的，既需要材料具有良好的生物相容性和生物 活性，又需要具有一定的力学性能。单一材料构建的组织工程支架往往无法同时 满足这些要求。因此，利用具有不同性质的材料构建组织工程复合材料引起了人 们的广泛关注。通过改变支架材料的组成、配比以及不同材料间的界面可以获得 同时具有多种优良性能的组织工程复合材料。常见的组织工程复合材料主要包 括：天然组织工程材料间的复合、合成材料与天然材料间的复合，以及组织工程 有机材料与无机材料间的复合。除了以上的二元复合材料以外，还可以是多元复 合材料。 不同种类的天然组织工程材料间的复合，主要是为了从组分上尽可能地获得 与细胞外基质相类似的组织工程支架。如已应用于临床的组织工程皮肤i n t e g r a 和a p l i g r a f 都是以i 型胶原与g a g 形成的复合材料作为支架，从组分上模拟人 体皮肤中的细胞外基质，构建适于皮肤组织再生的三维微环境。此外，采用胶原 一壳聚糖、壳聚糖一明胶、胶原一透明质酸等复合材料构建组织工程支架的研究 都已有报道。如本课题组采用胶原一壳聚糖为主要材料，通过冷冻干燥和结构稳 定化，获得了适用于真皮再生的多孔支架。体外细胞培养结果证明细胞能够非常 容易地侵入到支架内部并扩增生长，分布均匀；动物实验结果证明该材料能够被 血管化，即能够成活 1 7 - 2 2 。 通过天然组织工程材料与合成组织工程材料复合，可以在保持支架材料的力 滟江足学硕士学位论文 学强度以及降解行为不变的前提下，获得具有生物活性的表面。c h e n 等报道了 一系列通过胶原或硫酸软骨素等天然材料与p l l a 、p o a 以及p l g a 复合构建组 织工程支架的研究。实验结果显示以上各种组织工程复合材料对软骨细胞、成纤 维细胞以及肝细胞等都有良好的细胞相容性。本课题组应用负压导入技术，将胶 原成功地引人p l l a 多孔支架中。体外软骨细胞培养结果证明，软骨细胞在该 p l l a 一胶原复合支架中铺展良好，具有典型的软骨细胞形态【2 3 】。 组织工程有机材料与无机材料构建的复合材料主要应用于骨组织工程。通过 磷酸钙无机材料与胶原、壳聚糖以及p l a 等天然或合成聚合物的复合，能提高 骨组织工程的强度、韧性，并且提高支架的生物相容性。t a n a k a 等将c “o h ) 2 和h 3 p 0 4 滴入猪真皮胶原溶液中，形成质量比为8 0 2 0 的h a 一胶原共沉淀物。 以该复合材料构建的支架在犬胫骨缺损实验中表现出良好的成骨细胞相容性，而 且能促进骨缺损的重建。c h e n 等将c a c h 和n a 2 h p 0 4 溶液依次滴入p l g a 一胶 原多孔支架中，在支架中原位合成羟基磷灰石，并以颗粒的形式沉积在支架表面， 从而构建了可应用于骨组织工程的p l g a 一胶原一羟基磷灰石复合支架【2 4 】。 1 3 组织工程支架制备技术 1 3 1 组织工程支架概述 在组织工程中，支架主要用于模拟正常组织细胞外基质( e c m ) 的生物学 功能，为细胞和组织生长提供适宜的环境，随着细胞的分裂而逐渐降解和消失， 从而将新的空自j 提供给组织和细胞，并使新生成的组织和器官具备与细胞支架相 同的几何外形。 迄今为止，有两种结构类型的支架被大量地用于组织工程化器官的构建，即 织态结构型 2 5 - 2 8 】( 所谓“硬支架”) 和水凝胶型 2 9 - 3 1 】( 所谓“软支架”) 。前 者的制备方法主要有致孔剂法、相分离法、电纺丝法、冻干法、快速成型法和非 编制状纤维成形法等。多孔聚合物支架的孔径大小根据其制作工艺的不同一般在 1 0 1 0 0 0l a m 之间，支架的孔与孔之间相互连通，细胞可深入支架内部生长，同 时营养液可渗入支架内部与细胞进行物质交换，从而实现细胞的立体培养。该类 支架的优点是微结构如孔径和孔隙率易于调控，机械强度较好；其缺点是必须通 过外科手术才能使用，以合成聚合物为支架时细胞相容性较差。 水凝胶是由亲水性聚合物经水溶胀形成的，细胞可渗透入其中进行生长；如 6 第一章文献综述 果将水凝胶制成多孔状，细胞也可由微孔进入多孔水凝胶内部生长。该类支架的 突出特点是可发生溶胶一凝胶的转变，通过注射的方法将复合有种子细胞的聚合 物溶液注射到所需部位，在温度( 如p l u r o n i c 水凝胶【3 2 】) 或化学( 如c a 2 + 交联 的藻酸钠水凝胶【3 3 】) 调控下原位形成凝胶，从而将细胞包埋并使其生长分化， 因此避免了创伤性的外科手术；其缺点是机械强度较小，形状保持能力差。 组织工程支架的种类非常众多，但通常认为理想的组织工程支架在设计过程 中应满足以下基本要求： ( 1 ) 良好的细胞相容性。除满足生物材料的一般要求如无毒、不致畸形， 降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应之外，还要有利于种子细胞的黏附、 增殖，更重要的是能激活细胞特异的基因表达，维持正常细胞的表型表达。 ( 2 ) 良好的生物降解性。支架材料在受损组织修复后应能降解，降解速度 应与组织再生的速度相匹配。 ( 3 ) 具有三维立体多孔结构。支架孔隙率和比表面积大。这种结构可以提 供宽大空间，利于细胞黏附生长，细胞外基质沉淀。营养和氧气进入，代谢产物 的排出，也有利于血管和神经长入。 ( 4 ) 适当的机械强度。支架应具备与所修复组织相匹配的机械强度，为新 生组织提供支撑。 ( 5 ) 为了防止感染，支架还必须易于消毒和保存。 因此，制备具有良好的细胞相容性和生物降解性的三维多孔支架一直是组织 工程学科研究的重点。在组织工程支架的制作过程中，除选材和后处理，对于支 架性能影响最大的步骤是多孔支架的制备工艺。制备工艺决定了支架的整体外 形、微观结构以及部分的力学性能和降解性能。其中，对于组织工程来说，最关 键的因素是多孔支架的微观结构，可以从几大要素对其进行评价： ( 1 ) 孔径及孔径分布。不同组织和器官的细胞不但在形状和大小上有所不 同，并且在细胞生长时的取向及结构密度上也不相同。例如成纤维细胞需要2 0 p m 左右的孔径，皮肤组织重建需要支架的孔径在2 0 1 5 0 呻之间，而骨组织工 程则需要1 0 0 2 5 0 p m 的孔径 3 4 3 5 。 ( 2 ) 孔隙率。孔隙率关系到多孔支架中空间的多少，以及制备支架所用生 物材料量的多少。进而影响到支架的细胞负载数量，生物材料降解产生的物质多 7 浙江大学硕士学位论文 少，以及材料的力学性能等种种因素。在制备多孔支架的过程中应综合考虑。 ( 3 ) 孔间连通性。组织工程要求支架提供种子细胞引入以及种子细胞生长 所需养分进入和代谢产物排出所必需的通路。这即要求多孔支架中的微孔应大部 分或全部为开放型的结构。 ( 4 ) 支架应具备一定机械强度和解剖学外形，并与所要修复的组织相吻合。 ( 5 ) 支架的其他微结构。由于组织工程目标器官和组织的多样性，针对具 体的器官或组织有时对支架的微观结构有特殊的要求。如为保证神经导管或肌腱 细胞能按一定方向生长或排列，组织工程支架也应呈一定的方向性排列。皮肤、 骨关节、血管都是由多层细胞组成的复杂结构，在组织工程支架设计和制备的过 程种，这些情况也应考虑，并做相应的调整。 目前文献报道了大量有关组织工程多孔支架的制各方法，其中有取自天然多 孔材料，经过一定的加工和处理制成的组织修复物，如利用异种骨、异体骨、珊 瑚、胶原蛋白等，这类材料的质量并不稳定，性能也受来源的影响不能随意调控。 所以研究工作者将更多的精力放在将天然或人造的无孔聚合物制备成为多孔支 架的方法上。以下对各类的“硬”支架材料做简单的介绍。 1 3 2 溶液浇铸，粒子沥滤( s o l v e n tc a s t i n g p a r t i c l el e a c h i n g ) 溶液浇铸粒子沥滤法也被称为致孔剂法( p a r t i c l el e a c h i n g ) ，是制备组织工 程支架的一种传统方法。在组织工程较早的研究当中，m i k o s 等用此方法制备了 高孔隙率生物降解聚合物支架 3 6 1 。该技术使用可溶性的致孔剂，例如食盐 ( n a c l ) 粒子，作为支架中多孔结构的模板。将聚合物溶解在易挥发的溶剂如 c h c b 或c h 2 c 1 2 中，然后将溶液浇铸到充满致孔剂的模具中；待溶剂挥发后， 将聚合物致孔剂的混合物在适当的条件下沥滤以去掉致孔剂，从而得到不含粒 子的聚合物支架。m i k o s 等人在研究中发现支架的微观结构与致孔剂的种类没有 特别的关联，而只决定于致孔剂的用量和颗粒的大小及形状。支架的孔隙率由所 加致孔剂的用量来调整，孔的直径由致孔剂的大小来决定，聚合物支架骤冷可产 生无晶质或半晶质状态从而控制聚合物的结晶度。 近年来很多学者对传统的致孑l 剂法进行了拓展。考虑到利用生物相容性良好 的材料作为成孔剂的原料，这样可以避免成孔剂残留所带来的危险，进一步的， 少量残留的成孔剂分子还可以增进多孔支架的细胞相容性。本课题组利用明胶作 8 第一章文献综述 为致孔剂，考察了致孔剂形状、聚乳酸溶液浓度、溶剂去除方法等制各条件对于 聚乳酸多孔支架的微观形态和力学性能的影响。相比于用氯化钠颗粒制备的聚乳 酸多孔支架，明胶为致孔剂的支架能更好地促进软骨细胞的粘附和增殖，表现为 软骨细胞在明胶改性的支架中数量更多，分布更均匀，形态更为铺展，m i t 活 性更高，g a g 的分泌量更多 3 7 1 。 图1 3 ( a ) 石蜡微球为致孔剂制备多孔支架过程示意图；( b ) 利用石蜡微球为 致孔剂制备的p l l a 多孔支架的激光共聚焦显微镜图片 1 3 3 热致相分离法( t h e r m a l l yi n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n ，t i p s ) ，冷冻干燥法 ( f r e e z ed r y i n g ) 热致相分离( t i p s ) 是利用高聚物均相溶液在淬冷条件下发生相分离的原理。 首先要求聚合物可以溶解在适当的溶剂中，即在临界温度( t c ) 以上聚合物形成 均相溶液，然后在可控制的条件下冷却到t c 以下，形成富聚合物和富溶剂的双 连续相。当相分离完成时，将溶剂以适当的方式脱除，通常是冷冻干燥或溶剂萃 取，就可以得到开孔的多孔聚合物膜。这种方法可得到任意形状的泡沫材料，如 9 浙江大学硬士学位论文 体型、薄膜、捧材等，只要设计相应的模具即可。t i p s 法制备的微孔材料，其 孔隙率、孔径大小、结构形态与聚合物稀释剂的种类、组成配比、聚合物浓度、 聚合物分子量等因素密切相关 3 8 1 。 本课题组在采用热致相分离技术制备了表面开孔、各向同性、孔间相互连通 的聚苯乙烯和聚氨酯多孔膜 3 9 - 4 2 1 的基础上，进一步发展了多步相分离法，调节 相分离过程中相分离的区域和相区生长行为，可以克服热致相分离技术难以获得 具有连通性好的大孔支架的缺点，获得的支架最大平均孔径在3 5 0 微米以上，并 具有良好的力学性f 1 4 3 。 冷冻干燥法( f r e e z ed r y i n g ) 制备多孔支架的过程与相分离法类似。高聚物 与分散体系形成的凝聚物或凝胶，在冷冻过程中，由于冰晶晶粒生长而形成连续 的互相贯穿的结构。在这一过程中高聚物可以穿插到晶粒之间的空隙之中。当冰 晶在真空中升华出去后，得到多孔的支架。 冷冻干燥法尤其适用于胶原、壳聚糖和明胶等加工性能不好的天然高分子。 因为通常以水为溶剂，故可保持这些天然高分子的生理活性，并可方便地引入各 种生长因子。本课题组对壳聚糖和胶原的混合溶液进行冻干处理，得到孔径在几 十1 0 0 w a 的多孔支架。通过化学方法使其交联以提高强度和稳定性，并引入各 类生长因子这类支架在皮肤组织修复、皮肤毛囊化及血管化的研究中有非常良 好的表现 4 4 4 6 】。 1 3 4 纤维粘接 p g a 纤维是最早用作组织工程支架的材料。由p g a 或p l g a 纤维构成的骨 架的优点是表面积大，有利于细胞的黏附和养分的扩散，故对细胞存活和生长有 利；缺点是内部结构稳定性不好。对此缺点可加以改进。一种方法是纤维固定技 术( 图1 4 ) 。m i k o s 等早期将p g a 纤维浸入到p l l a 的氯仿溶液中，待溶剂挥 发后，p g a 纤维网嵌入到p l l a 中。将混合物加热到两种聚合物的熔点以上， p l l a 首先熔融，充满p g a 纤维网络所有空洞。p l l a 的作用是稳定p g a 纤维 和防止p g a 开始熔融时纤维网络结构塌陷。经一定的热处理，交叉点的p g a 纤 维熔融后物理结合在一起。选定一种只能溶解p l l a 的溶剂将其溶解，即可得到 高度多孔的网状结构。采用这种成纤技术制得的多孔网状结构的孔隙率和孔直径 分别高达8 1 和5 0 0 i n n 。肝细胞在这种多孔网状结构经体外培养一周仍具有很 i o 第一章文献综述 好的活性，并且，有束状细胞群形成。第二种方法是通过雾化或喷雾对纤维表面 进行涂层【4 7 】。将p u a 或p l g a 溶解于c h c l 3 中，将溶液以雾状喷涂到p g a 纤维网表面。由于p g a 在c h c l 3 的溶解性较差，在这一过程中纤维形态基本保 持不变。溶剂挥发后形成一涂层。这种复合结构综合了纤维的力学性能和p l l a 的表面特性。尽管对孔隙率的大小没有报道，但孔的尺寸与前一种方法制备的粘 结纤维的孔尺寸相近 4 8 1 。 图i a 利用纤维粘接法所得支架及细胞在支架中的生长情况 1 3 5 超临界流体气体法( s u p e r c r i t i c a lf l u i d - g a s s i n gp r o c e s s ) 超l i 缶界流体气体法主要适用于聚合物高孔隙率支架的制备，如非结晶生物可 降解聚醚等。方法是：在加热模具中通过模压成型制备p g a 、p l l a 或p l g a 固 体片材。将这些固体片材置于高压c 0 2 ( 5 5 m p a ) 室内三天，然后使压力快速下 降到大气压强，使聚合物中形成气穴。所得支架的孔隙率高达9 3 ，孔直径可 以达到1 0 0 0 m 以上。 图1 5 超临界气体法不同的饱和压力得到p l a 支架。( a ) 压力1 5 0 b a r ，降温速 率5 1 ，s ，降压速率1 2 1 b a r s ；( b ) 压力2 4 2 b a r ，降温速率4 4 c s ，降压速率 1 3 3 b a r s 强江大学硬士学位论文 但是超临界流体气体法制备的多孔支架孔连通率较低，平均约为1 0 3 0 。 h a r d s 等人利用致孔剂法与之相结合，得到了高连通性的多孔支架材料。通过调 节致孔剂和高聚物的比例，以及致孔剂的尺寸，可以控制多孔支架的孔隙率与孔 径范围【4 9 】。 1 3 6 聚合物微球聚集( a s s e m b l yo fp o l y m e rs p h e r e s ) 微球聚集也可构成多孔骨架。骨架的孔隙率就是微球间的间隙，它直接与微 粒的直径相关。该技术的优点是微粒可包裹生长因子，进行可控释放。目前，利 用这类材料作为组织工程用支架的报道很少，难点在于微球间的粘接和成型。利 用乳液分散的办法，通过控制p l l a 溶液中良溶剂( 氯仿) 及不良溶剂( 正己烷) 的比例，可以制备出中间多孔的p l l a 微球。利用热压或者少量溶剂可以将微球 相互粘接。通过表面的生物蛋白涂层( 如胶原) ，可以改善微球的细胞相容性。 在微球上培养软骨细胞7 天后，发现软骨细胞能够良好地分裂铺展，还可以观察 到软骨细胞横跨不同的微球生长，使微球之间相互连接( 图1 6 ) 5 0 ，5 h 。 图1 6 ( a ) 聚乳酸微球表面软骨细胞的激光共聚焦显微镜照片，活细胞经荧光 索二乙酸酯染色，高亮显示，黑色区域为p l a 微球；( b ) p l a 微球被细胞相互 连接的扫描电镜照片 1 3 7 乳液冻干法( e m u l s i o nf r e e z e - d r y i n g ) w h a n g 等人将水等非溶剂分散于聚合物如p l g a 氯仿溶液中，在搅拌的作 用下形成乳液；以液氮淬冷后再进行冷冻干燥，得到了孔隙率高于9 0 ，平均 孔径1 5 3 5 t m a ，个别孔径高于2 0 0 1 a m 的多孔材料( 图1 7 ) 。孔的结构呈现高 连通性，适用于组织的生长和再生。但是乳液冻干法对于操作者和技术要求很高， 第一章文献综述 能否制备具有真正连通性的多孔材料取决于操作方法、工艺以及实验设备，目前 关于该技术的报道也相对较少 5 2 1 。 图1 7 乳液冻干法制各多孔支架示意图( 左) 及所得支架的扫描电镜照片( 右) 1 3 8 固体自由曲面制造技术( s o l i df r e e - f o r mf a b r i c a t i o n ) 或快速成型技术 ( r a p i dp r o t o t y p i n g ) 固体自由曲面制造技术( s o l i df r e e f o r mf a b r i c a