（应用化学专业论文）苹果多酚的分离纯化及抗氧化性研究.pdf

摘要 基于苹果产业的发展现状，以及苹果多酚的多重功效，研究开发苹果酚类物 质，对提高苹果产业附加值，改善我国苹果加工企业产品结构，增加企业、果农 经济效益意义深远。针对苹果疏果问题，本课题首先对当地苹果在生长过程中酚 含量变化进行了测定，确定了酚含量最高值的时间，此时对苹果适当疏果，可更 有效的利用苹果废置资源；接下来通过溶剂选择、单因素实验、响应面法分析、 树脂纯化、高效液相鉴定，确定较好的多酚分离纯化工艺，为中试实验提供数据； 最后利用酚类物质盼沉淀特性，研究酚类物质及有金属离子存在下与抗氧化特性 之间的关系。 通过本课题的研究，苹果在落花后两周左右总酚和总黄酮含量均达到较高 值，可适当疏果，从疏果中提取高含量酚类物质，变废为宝。 采取单因素实验、多因素的响应面法分析，用甲醇、乙醇、水( 1 ：l ：1 ) 的复 合浸提液，得总酚和总黄酮最佳提取条件分别为：温度9 4 4 和7 4 9 5 、浸提 时间1 0 6 8 m i n 和1 4 1 5 m i n 、液料比3 0 2 m l g ；总黄烷醇较优提取条件为：温度 7 5 、浸提时间1 4 5 m i n 、液料比7 6 4 m l g 。树脂的纯化工艺研究中，l x 1 树 脂是较好的纯化多酚的树腊，对l x 1 树脂层析柱( 6 7 c m x 2 1 c m ) 的动态实验研 究，吸附液流速为4 7 m l m i n 时，6 0 0 m l 和4 5 0 m l 吸附液可使树脂对总酚和总 黄酮吸附达到饱和，l x - 1 树脂对总酚和总黄酮的动态吸附容量为0 6 6 m g m l 树 脂和0 1 7 5 m g m l 树脂：用8 5 乙醇，洗脱液流速为3 5 m l m i n ，3 0 0 m l 洗脱液 可将树脂中总酚和总黄酮充分洗脱。通过高效液相仪对树脂纯化过程中吸附液与 解吸液的分析发现，l x 一1 树脂可用于苹果多酚纯品的制备。 在酚类性质研究中发现，镁盐有较强的降总酚能力，铝盐则对黄烷醇类有很 好的沉淀效果。两种盐在碱性环境下，沉淀效果更强。节果多酚类物质是有效的 自由基清除剂，在一定范围内对d p p h 清除率与总酚含量有较好的线性关系，黄 烷醇类物质的多少明显影响a b t s + 的清除率。此外，当酚含量较低时，铝、镁 离子可提高d p p h 和a b t s + 的清除能力。 关键词：苹果多酚、总酚、总黄酮、总黄烷醇、抗氧化、响应面法 i i t h e s e p a r a t i o np u r i f i c a t i o na n da n t i o x i d a t i o n r e s e a r c h o fa p p l ep o l y p h e n o l s a b s t r a c t w h e r e a st h ec u r r e n td e v e l o p m e n to fa p p l ei n d u s t r i e s ，a n dt h em u l t i p l ee f f i c a c i e s o fa p p l ep o l y p h e n o l s ，t h er e s e a r c ha n de x p l o i t u r eo fa p p l ep h e n o l i cs u b s t a n c e si s m e a n i n g f u l , i tc a ni n c r e a s et h ea d d e dv a l u eo fa p p l ea n dm e l i o r a t ei n d u s t r i a l s t r u c t u r ei na p p l ep r o d u c t i o n m e a n w h i l e ，i tc a ni m p r o v et h ei n c o m eo ff r u i tg r o w e r s i nt h er c s e a r c h i n gt h e m e , t h ei s s u et h a th o wd o e st h ea p p l ep o l y p h e n o l si nl o c a l d i s t r i c tc h a n g ei nt h eg r o w t hi sd o n ef i r s t l y , a i m i n gt od e t e r m i n eb e t t e rf r u i tt h i n n i n g p e r i o da n du s et h ep o l y p h e n o lr e s o n r e ce f f e c t i v e l y n e x t , a c c o r d i n g t os o l v e n tc h o i c e ， s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sa n dr e s i np u r i f i c a t i o n , ab e t t e r p u r i f i c a t i o np r o c e s sw h i c hi st h eb a s i co f p i l o tp r o c e s si sa c c o m p l i s h e d t h r o u g hw i t h h p l c ，t h ea d s o r p t i o ns t a t ea b o u to p t i m i z a t i o nr e s i n i sa n a l y z e d f i n a l l y , u s i n g p r e c i p i t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fp h e n o l i cs u b s t a n c e s , t of i n do u tt h er e l a t i o n s h i p b e t w e e na n t i o x i d a n tp r o p e r t i e sa n dp h e n o l i cs u b s t a n c e s ，a n di n v e s t i g a t eh o wt ov a r y a b o u ta n t i o x i d a n t p r o p e r t i e sw h e n t h em e t a li o n sa r ep r e s e n t t h r o u g ht h ei s s u e s , t h ec o n t e n to ft h et o t a lp o l y p h e n o l sa n dt h et o t a lf l a v o n o i d s h a v ea h i g h e r v a l u ea f t e rt w ow e e k sw h e nt h ef l o w e 璐d r o p t h ea p p l ec a nb ep r o p e r l y t h i n n e da tt h a tt i m et og e th i g hc o n t e n to fp h e n o l i cs u b s t a n c e sf r o mt h ef r u i tt h i n n i n g e x t r a c t t a k i n gs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，m u l t i f a c t o rr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ，w h e nt h e e x t r a c t i n gs o l u t i o ni sc o m p o u n d e db ym e t h a n o l ，e t h a n o l ，w a t e r ( 1 ：l ：1 ) ，o p t i m u m e x t r a c t i o nc o n d i t i o n so ft h et o t a lp h e n o l sa n dt h et o t a lf l a v o n o i d sa l eb e l o w ：t h e t e m p e r a t u r ei s9 4 4 ca n d7 4 9 5 1 2r e s p e c t i v e l y , t h et i m ei s1 4 1 5 m i na n d1 0 6 8 m i n s e p a r a t e l y , t h er a t i oo fl i q u i da n dm a t e r i a li s3 0 2 m a b e t t e re x t r a c tc o n d i t i o no f t h et o t a lf l a v a n o l si st e m p e r a t u r e7 5 ，t h ee x t r a c t i o nt i m e 1 4 5 m i n ，7 6 4 m 1 g l i q u i d - m a t e r i a lr a t i o i nt h ep u r i f i c a t i o np r o c e s so fr e s i n , l x 一1i sab e t t e rr e s i nf o r s e p a r a t i o no fp o l y p h e n o l s t h ed y n a m i ce x p e r i m e n t a ls t u d ya b o u tl x - 1r e s i n ( 6 7 c r a x 1 1 1 2 1 c m ) s h o wt h a tw h e nt h el i q u i da d s o r p t i o nv e l o c i t yi s4 7 m l m i n , 6 0 0 m la n d 4 5 0 m la d s o r p t i o nl i q u i d 啪r e a c hs t a t eo ft h er e s i na d s o r p t i o ns a t u r a t i o nf o rt h e t o t a lp h e n o l sa n dt h et o t a lf l a v o n o i d s d y n a m i ca d s o r p t i o nc a p a c i t yo ft h er e s i na b o u t t h et o t a lp h e n o l i c sa n dt h et o t a lf l a v o n o i d sa r e0 6 6 m g m i x e s i na n d0 1 7 5 m g m l r e s i n ；8 5 e t h a n o laf l o wr a t eo f3 5 m 1 m i ne l u a t e t h et o t a lp h e n o l i c sa n dt h et o t a l f l a v o n o i d sc a nb ef u l l yc l e a r e db y3 0 0 m le l u a t e t h ea d s o r p t i o nl i q u i da n de l u a t e f r o mt h er e s i np u r i f i c a t i o na r ea n a l y z e db yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , f i n d i n gt h a tl x - ir e s i nc a nb eu s e di nt h ep r e p a r a t i o no f p u r ea p p l ep o l y p h e n o i s a f a rt h es t u d yo fp o l y p h e n o l sc h a r a c t e r s , t h er e s u l t ss h o wt h a tm a g n e s i u ms a l t c a nd e c r e a s em o r et o t a lp o l y p h e n o l s ，b u ta l u m i n i u ms a l ti sb e t t e rf o rt h ed e p o s i t i o no f f l a v a n o l s i na l k a l i n ee n v i r o n m e n t ，t h ep r e c i p i t a t i o no ft w os a l t si sm u c hs t r o n g e r a p p l ep o l y p h e n o l si se f f e c t i v ef r e er a d i c a ls c a v e n g e r , c l e a n u pr a t eo fd p p h + r e l a t e s w i t ht h ec o n t e n to ft o t a lp o l y o h e n 0 1 h o w e v e rt h ec o n t e n to ft o t a lf l a v a n o l ( i n c l u d e c a t e c h i na n dp o l y p r o e y a n i d i n ) a f f e c t so b v i o u s l yt h ec l e a n u pr a t eo f a b t s w h e nt h e t o t a lp o l y o h e n o lc o n t e n ti sl o w , a l u m i m u ma n dm a g n e s i u ms a l tc a np r o m o t ef r e e r a d i c a lc l e a n u p k e yw o r d s ：a p p l ep o l y p h e n o l s ，t o t a lp h e n o l s ，f l a v o n o i d s ，t h et o t a lf l a v a n o l ， a n t i o x i d a t i o n , r e s p o n s es u r f a c em e t h o d 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：指导教师签名： 年月曰年月曰 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 年月日 第一章概述 苹果为我国产量最大的水果，从资源总量上分析，我国苹果种植面积约2 6 7 万h m 2 ，总产量已达2 5 0 0 万t ( 吨) ，占全球苹果总产量6 0 0 0 万t ( 吨) 的4 0 ，资 源十分丰富。近年来随着产量的快速提高，苹果供求矛盾愈来愈突出起来，出现 了价格下跌、果农收入下降的现象。特别是1 9 9 8 年以来，在全国各苹果主产区 更是出现了苹果积压滞销、卖果难的情况，个别地区甚至出现了砍树毁园现象， 严重影响了当地经济的发展。造成这种相对过剩、严重积压的问题关键就是苹果 加工业的滞后、加工能力的不足。而我国目前的苹果加工企业主要集中于苹果浓 缩汁等半成品的生产，产品结构单一、附加值低，企业经济效益低下，严重影响 着我国苹果加工业的发展，难以满足苹果生产快速发展的要求。因此，充分利用 苹果资源，研究开发新的苹果深加工产品，改善我国苹果加工企业产品结构、提 高企业经济效益己成为当务之急。 苹果多酚是苹果中所含多酚类物质的总称，是一类成份复杂的混合物，具有 很强的抗氧化活性和许多生理功能。人们对苹果多酚的研究最早开始于对苹果及 苹果制品褐变的控制研究。苹果多酚是褐变反应的底物之一，并且与苹果及其制 品的感官品质密切相关，因此人们对苹果中多酚类物质的组成、苹果多酚与褐变 的关系、多酚物质与苹果汁的稳定性及颜色变化之间的关系等进行了大量的研 究。随着对水果多酚的生物活性及应用研究的深入和苹果产业的快速发展，人们 开始关注苹果多酚的分离提取、生物活性及应用等。对苹果多酚的深入研究，不 仅可以极大地促进苹果加工业的快速发展，而且对于提高苹果产业的整体效益、 增加农民收入和促进农业结构的调整都具有十分重要的意义。 1 1 苹果多酚的组成及结构 苹果中的多酚组成复杂，依据现有研究，主要包括下列五类( 见图1 - 1 ) ： 黄烷3 醇类，主要由儿茶素、表儿茶素及它们的聚合物组成：羟基苯甲酸类， 主要由绿原酸、对香豆奎宁酸组成；二氢楂尔酮类，主要由根皮素和其配糖 体组成。花色素类，仅发现其以半乳糖配体的形式存在。黄酮醇类，主要由 栎精和异鼠李素的配糖体形式存在。这五类多酚中由于黄酮醇类的形成需要光的 作用，因而仅在表皮中被发现【悃，其它几类则在苹果组织中普遍存在着。且在 表皮中苹果多酚含量更高，而绿原酸则在大多种类苹果果肉中有最高含量，原花 青素则是苹果中含量最为丰富的【3 川。对于成熟苹果，主要多酚类为绿原酸、儿 茶素类以及原花青素等，未成熟苹果中则含有较多的二氢楂尔酮类、槲皮酮等化 合物。 黄烷- 3 一醇类 删 o h 羲饕 1 釉 函帆磊瑚 r l 黄酮醇类 9 1 0i i1 2 1 3 1 41 51 6 1 7 1 8 伽 r l删删伽删伽 伽 伽 叫o 口1 3o o b r 2hg a l g l u r h a r a ir h a - g l ux y la r a zg l ur h a - g l u 图i - i 苹果中多酚组成及结构图p 1 2 l 图中简写：g a l 半乳塘苷。g 抽葡萄糖苷，r h a 鼠李糖苷，a m 。呋喃阿拉伯糖苷， a r a 2 毗喃阿拉伯糖苷，x y l 木糖昔：( 5 ，1 7 ，1 8 并未被普遍证实) 1 2 苹果多酚的理化性质 根据目前研究，苹果多酚的理化性质如下： ( 1 ) 颜色：苹果多酚2 0 酗j 水溶液呈红褐色，1 0 0 粉末呈淡黄褐色，在其使用( 量) 范国内对制品色泽无影响。 ( 2 ) 风味：液状及粉状苹果多酚产品均略有苹果的风味，稍具苦味，其苦味程度仅 2 n o o o l l 2跏叫州吣州州州叫州 殂毖嚣孔篮 碡 睡咖 、h，【 4 n i 硼毋伽 o j h l i 啦 酊 为茶多酚抽提物的1 3 1 5 ，在其用量范围内对制品无特别影响。 ( 3 ，水溶性：纯苹果多酚粉状产品，在室温下水中溶解度达3 0 ，是茶多酚的l o 倍且加工适应性高。 ( 4 ) 稳定性：苹果多酚的0 1 1 水溶液在p h 2 1 0 范围由加热3 0 m i n 1 0 0 、 3 0 m i l l 1 2 0 ，其保存率均在8 0 。 ( 5 ) 保藏性：粉状产品于室温下可保存一年，其性质及各项生理功能几乎不变。 1 3 多酚与褐变 苹果在收获、储藏中的碰伤以及果汁、果酱的加工过程中都会产生严重的褐 变现象，这对食品工业有重要的影响。褐变的产生影响了产品的外观、风味和营 养。然而，有时候人们又需要一定的色度，如苹果酒的生产，因而需要褐交反应 机理的深入研究。在食品工业中，褐变原因主要为以下五方面：酚的酶氧化、马 里兰反应、抗坏血酸的氧化、焦糖化以及脂类氧化后的聚合。苹果工业中褐变现 象则主要是由于生物体内有活性的酶促进下( 如多酚氧化酶( p p o ) 、过氧化酶 ( p o d ) ) 与酚类物质发生氧化反应，产生了有色物质。 1 3 1 苹果多酚氧化酶的作用 多酚氧化酶( p p o ) 1 1 3 1 包括单酚酶和双酚酶两种，是一种广泛分布于植物和 有机体内的含铜酶。在氧的作用下催化两种反应( 图1 2 ) ，在循环i 中，单酚通 过四个酶位，发生羟基化作用生成邻苯醌；在循环中，邻二酚经过五个酶位生 成邻苯醌，然后通过产物的聚合成黄色、褐色或黑色的化合物。 由于酶发挥其活性是有一定限制的，苹果多酚氧化酶对酚的作用一般在p h 值3 6 5 ，温度为2 0 3 0 c 的范围内。 ( 1 ) p p o 与个别酚的氧化特性 四甲基儿茶酚( 4 - m e t h y l c a t e c h 0 1 ) 是苹果多酚结构中最基本的结构单元，是最 常用于p p o 研究底物的对比物。r i c h a r d - f o r g e t l l 4 l 等的研究给出了其在p p o 催化 下的反应历程【图1 3 】，四甲基儿茶酚经p p o 氧化生成邻苯醌后有两条反应途径， 一条经水的羟基化后生成1 , 3 。4 三羟基甲苯，再经b 、c 途径生成对苯醌类物质； 另一条经聚合路径d 、e 生成低聚物。几茶酚的反应历程有助于理解其它多酚的 反应历程，然而其它多酚有更为多样的结构式，表现出更为复杂的反应历程。 伽 图1 - 2 苹果多酚酶经单酚的羟基化和邻二 酚的脱氢作用生成邻苯醌的催化循环图 ( m ：单酚，d ：邻二酚) 图1 3 四甲基几茶酚p p o 作用的反应机理图 绿原酸和儿茶素被认为是p p o 引起褐变的主要底物，绿原酸的颜色变化 由浅到深再变浅，最终为黄色；儿茶素是不断变深的，最终为褐色。由于绿原酸， 儿茶素邻苯醌的不稳定性，以及其产物形式的复杂性，且不同p h 值、离子强度 以及催化剂的用量等均会对反应体系造成重大影响。儿茶素的产物主要以二聚和 低聚物的形式存在，如脱氢二儿茶素a 、脱氢- - ) l 茶素b 、三聚的脱氢儿茶素。 对于几茶素，其低聚物普遍通过“尾头”的c - c 或c - o c 形式连接而成 h a t h w a y 、w e i n g e s 1 6 1 、g u y o t 1 7 】等提出以下反应历程( 见图1 - 4 ) ：儿茶素在酶的 催化作用下在b 环先形成邻苯醌，由于邻苯醌的亲电性，它与另一个几茶素的 环a ( 亲核的) 发生1 ，4 - 亲核加成，形成“尾头”c - c 连接的联苯形二聚物， 再进一步反应生成其它物质。 o g u y o l l 7 l 则给出了“尾头”c o c 连接的低聚物形成历程( 见图1 - 5 ) ：几茶 素和其半醌自由基( 产生过程见图1 6 ) 作用脱氢后形成c 0 c 连接形式的聚合 4 崤 融 物。 图1 5 。尾头”c o - c 连接的低聚物形成历程 与上述机理略有矛盾的是，在酶钝化的情况下，几茶素并不发生反应，而其 邻苯醌含量仍会迅速消失，这说明上述反应的的发生是在酶的作用下完成的。此 外，w e i n g e s 1 6 】和m 鲥d 姐i 【1 8 1 提出儿茶素的反应中有8 羟基儿茶酚或5 羟基儿 茶酚的出现，可能有助于儿茶素的邻苯醌的消失，或者有更为复杂的反应机理。 研究发现p h 值是对儿茶素氧化反应影响最大的因素，r i c h a r d f o r g e t 1 4 l 和 g u t o y l l 9 】认为低的p h 值有助于邻苯醌经a 、b 、c 途径( 图1 - 3 ) 发生反应，而 较高的p h 值则经过d 、e 途径( 图1 - 3 ) 发生反应。实验研究还发现，儿茶素 的氧化产物中大部分物质为无色物质，少数为有色物质，且低的p h 值有助于无 色物质的生成，高的p h 值有助于有色物质的生成，g u t o y 1 9 1 认为，高的p h 增加 了儿茶素的亲核特性，利于1 ，4 - 亲核加成，低的p h 值有利于半醌自由基的生 成，从而进行自由基反应历程。 绿原酸在反应过程中可与其邻醌发生作用，产物主要为二聚体1 1 4 l 。反应中三 苯酚通常是非聚合反应途径( 图1 - 3 ) 中的过渡态物质，往往瞬问产生，而后立 刻消失，而在绿原酸的产物中有一定量的三苯酚结构物质存在，从而证实了其反 应更易通过聚合路径。 氧和酚消耗量的比值也是人们认识酚类反应历程的一个重要方法。p f o 催化 氧化邻二酚为邻苯醌时理论耗氧量为0 5 m o l m o l 酚，而根据邻苯醌非常活泼的 亲电特性，其可通过下面三方面的反应改变氧和酚消耗量之比。 邻醌和邻二酚作用产生一个缩合产物，这个机理类似于m i c h a e l 的1 ，4 亲核加 成，从而导致了在每分子醌形成中有额外的邻二酚的消耗，使得氧酚比率小 于0 5 。 在大量邻二酚的存在下，通过反岐化作用邻醌形成了半醌自由基，根据这个机 理，一个邻二酚和一个邻醌反应产生两个半醌自由基，而每个半醌自由基再和 5 一个邻二酚反应。因此这个机理导致了每形成l m o l 酚时就有3 t o o l 邻二酚的 消耗，从而使得氧酚比率大幅度的降低。 邻醌在偶合氧化下展示了氧化其它酚的能力，使得邻醌转变成邻二酚。根据这 个机理，氧，酚比率可能会更高。 仗o h 。发0 3 如 酚醌 其它酚 2 例l ! l 通奄 图1 - 6 改变氧和酚消耗量之比 的三种途径 在多酚耗氧量的实验研究中，绿原酸、儿茶素、儿茶酚等的初始氧酚消耗比 总是接近于0 5 ，从而证实了多酚反应的第一步是氧化成邻苯醌。然而目前仍缺 乏反应过程中一些物质的耗氧情况，因而完全利用氧酚消耗比还不能推出反应历 程。但上述所述改变耗氧的三点结论有助于假设机理的判断。 根皮素配糖体并不是一个好的褐变底物，它的氧化非常缓慢，最终产生浅黄 色物质1 1 1 2 。其反应历程见图1 7 ：首先根皮素配糖体在酶的作用下通过迈克1 ， 4 加成生成三羟基根皮素，再通过a 环的芳构化、水加成及b 环的芳构化，形 成无色的化合物3 ，最后再经过酶的氧化，生成有色的化合物4 。 x 紫必。蓍崎o h 三俩w , o g l u + 豫 i 帕o c 一一 化台物4 h d o c 一一 图1 7 苹果多酚氧化酶氧化根皮素 配糖体的反应历程 原花青素不能直接与酶反应【蹈1 ( 可通过共偶合作用反应产生有色物质，见 本节( 2 ) ) ，这是由于其抑制了酶的活性，这种抑制能力受其羟基数和聚合度影 响，且抑制能力通常可在很短的时间内达到最大。可能是酶仅有少数位置可与多 酚键合，微量的原花青素与酶结合后形成很大的空间位阻，阻碍了其它分子与酶 6 的结合，而通过原花青素在酶周围的不断堆积，使其抑制能力迅速达到最大。 ( 2 ) 多酚的共偶合作用 当两种或两种以上的酚在苹果多酚氧化酶( p p o ) 存在下发生反应，个别酚 表现出的性质与原来单独在p p o 作用下的性质差别很大，这种反应特征称为共 偶合作用。如：原花青素并不是p p o 的底物【笠捌，然而，当加入绿原酸的氧化 产物时，原花青素会有明显的损失，机理如下：原花青素与绿原酸的邻苯醌作用 生成原花青素的邻苯醌，接下来其再与原花青素或绿原酸发生分子问的加成。而 在咖啡酒石酸存在下，原花青素也能快速的被反应掉 氧化缓慢的根皮素配苷，当其溶液体系中存在绿原酸或儿茶素时，会有更强 烈的棕色反应【冽。绿原酸和儿茶素的加入不仅加速了单酚酶的作用速率，使无 色的中间产物生成速率更快；而且进一步促进了颜色更深的棕色产物的生成。其 随着绿原酸和儿茶素的量的不断增加，初始反应速率越快，但儿茶素含量过高时， 则会明显降低反应初始速率。 绿原酸与儿茶素溶液相混时i 雒z 5 l ，其颜色的变化趋势类似于儿茶素，然而其 最终颜色为黄色。绿原酸减慢了儿茶素的醌形成聚合物的速率，加快了儿茶素的 反应速率，而自身的反应速率则降低了。这是由于绿原酸的醌氧化几茶素，生成 绿原酸和儿茶素的邻苯醌的原因。 1 3 2 过氧化酶的作用 过氧化酶( p r c o x i d a s c ) 是一个氧化还原酶，在过氧化物，特别是双氧水的 存在下，过氧化酶最主要的功能是氧化氢给予体。其对过氧化物底物有高度的专 一性，而可与许多氢给予体发生反应，如酚类物质。高等植物中所含的是高铁血 红素过氧化酶，高铁血红素i x ( 血色素或亚铁血红素) 作为辅基，其通过一个 氨基酸支链与铁的第五配位点结合而成。这种酶以溶解形式或与膜成键的形式存 在于植物体的各部分，而其在植物体内起着多重功能。 植物体内双氧水有多种产生方式，如可通过植物呼吸作用和光合作用得来， 此外在儿茶素的自氧化或p p o 的作用下也可产生1 2 日。而t o r r e s 等1 2 7 l 研究发现碰 伤苹果会产生比未伤苹果多两倍的双氧水量。因而过氧化酶氧化酚引起的褐变、 营养损失、风味变化等仍应是食品加工过程中所关注的。 没有双氧水加入时，苹果过氧化酶( p o d ) 难以氧化多酚物质【嚣捌( 土豆和 蘑菇p p o 可以直接氧化儿茶素) ，而在双氧水的存在下，p o d 不但可以氧化p p o 的底物，而且可以氧化难以被p p o 氧化的底物( 如栎精及其配糖体) ，以及可以 氧化p p o 的抑制剂( 如苯丙烯酸类) 。 在p p o 和p o d 共同作用的体系中，p o d 的加入加速了反应的进行，而起始 总的p p o 底物消耗量增加f 冽。绿原酸反应体系中产生的双氧水的量明显低于儿 茶素，而四甲基几茶酚溶液中几乎无双氧水的产生。因而可以看到，在酚的反应 过程中，不仅存在p o d 结合双氧水氧化多酚途径，而且存在p o d 结合多酚的邻 苯醌氧化多酚的途径。 1 4 多酚褐变及其抑制剂 褐变抑制剂依据来源可分为化学试剂和天然产品两类。 对于化学试剂根据其抑制机理的不同也可分为两大类，一类是通过抑制p p o 的活性来抑制酶与多酚的反应。依据p p o 特性1 3 0 1 ，多酚在反应过程中，氧先与 p p o 中的铜成键，再与酚发生反应。因而此类抑制剂可分为：( 一) 、与酶中的铜 发生络合反应阻碍氧与铜成键从而抑制酚反应的试剂如叠氮化合物、氰化物，二 已基二硫代氮基甲酸盐以及无机卤代盐，而无机卤代盐是此类中应用最为广泛 的。( 二) 、通过影响多酚与p p o 的活性位置作用的物质有柠檬酸【3 1 】、苯甲酸、 苯丙烯酸和芳基酸及其同系物 3 2 , 3 3 1 ，这类试剂与酚类物质结构相似，是一类竞争 性抑制剂，即首先和结合了氧的酶发生键和使得多酚难以和酶作用，达到了抑制 褐变的目的。另一类是通过与酚或酚氧化的产物作用起到抑制褐变的功效。亚硫 酸氢盐是最为有效的试剂，但根据t y a l o r ( 1 9 8 6 ) 的研究显示，食品中亚硫酸盐 的存在有害于人体健康，特别是对哮喘病人。因此取而代之的是一些无亚硫酸盐 的试剂，如谷胱甘肽、l 半胱氨酸、抗坏血酸( v ) 及其同系物、b 环式糊精素、 曲酸、a p p ( a s c o p y r o n ep ) 。亚硫酸氢盐、谷胱甘肽、l 半胱氨酸曲酸、 a p p ( a s c o p y r o n ep ) f 3 蝴j 均可与酚的反应产物邻苯醌作用，生成无色的物质，而这 些物质并不是p p o 的底物，且存在竞争抑制能力。对于l 半胱氨酸，其与绿原 酸的邻苯醌在苯环的2 位上成键，而对于儿茶素和表儿茶素在b 环( 见图1 1 ) 的2 或5 位成键；栎精邻苯醌p _ 7 i 则是在a 环( 见图1 - i ) 的6 或8 位成键。谷胱 8 甘肽与栎精邻苯醌的成健与i ，半胱氨酸的相刚删。v c 及其同系物抑制机理不同 于上述，它直接将酚的邻苯醌转化成邻二酚的形式。v c l 3 1 j 3 j 可使氧化的绿原酸 恢复其原有的颜色，而对于儿茶素或儿茶素与绿原酸的混合液，则只能使其颜色 部分恢复，且随着氧化时间的变长则越难恢复。b ，环式糊精素i 鲫】则是直接与多酚 类物质配合，从而保护了多酚被氧化。 此外，v c 的复合试剂显示了更强的抑制褐变能力p 1 , 3 2 , 4 0 , 4 1 1 。如v c 与一种试 剂的复合有柠檬酸、卤代盐、环式糊精素及酸式的多磷酸盐；两种试剂复合的有 v c 与i ，半胱氨酸、苯基丙烯酸和v c 与异抗坏血酸、柠檬酸。 目前，天然的抑制苹果多酚褐变试剂在苹果加工业受到更多重视，更能被广 大消费者接受。这类试剂有：蜂蜜、天然的脂肪醇、马里兰反应产物及“e n o k i t a k e ” 蘑菇的热水提取物等| 4 2 , 4 4 1 。其抑制能力可能是这些物质中含有抑制酶活性的物质 作用的结果。 1 5 苹果多酚的生理功能 研究发现，苹果多酚具有多重生理特性，如抗癌、抗氧化、降压、降脂及保 护肺功能、抗突变、防龋齿、影响细胞内钙离子等。 抗癌作用 日本弘前大学使用老鼠做为实验对象，对比了在被移植癌细胞后食用苹果多 酚水溶液和蒸馏水的效果。他们得出的结论是，在生存率和降低癌细胞增殖实验 这两方面，苹果多酚都显示了较好的抗癌功效。 抗氧化作用 苹果多酚具有抑制不饱和脂肪酸氧化的作用，如防止亚油酸、d h a ( - - 十 二碳六烯酸) 等的自动氧化，并可提高含油类食品的保质期。苹果多酚具有防止 类胡萝卜素的光分解作用，可防止维生素的氧化及有效保持s o d ( 超氧化歧化 酶) 活力。 降压、降脂及保护肺功能作用 苹果多酚具有显著降压、降血脂作用，被人誉为是“天然降压药”，对于高血 压病人或高血脂症患者尤为适宜。研究发现，苹果多酚中的槲皮苷和黄酮类抗氧 化剂，可保护肺免受污染和烟的影响，明显改善呼吸系统和肺功能。 9 抗突变作用 随着工业污染，人们饮食和居住环境发生变化，适应这些变化能力弱的人就 产生了各种病症，如支气管哮喘、鼻炎、人体过敏、特异性皮炎及麻疹等，主要 是因为组胺、化学游离因子等物质从细胞中释放，引起毛细血管的渗透性亢进而 造成的。用大白鼠进行实验，结果表明苹果多酚可以抑制3 5 的组胺游离。通过 抗突变试验表明苹果缩合丹宁的抗突变作用比绿原酸、表几茶素( e c ) 强，是苹果 多酚抗突变作用的主要成分。 抑口臭作用 口臭由各种原因引起，产生口臭气的主要物质是甲硫醇。消臭实验中，用含 硫的蛋氨酸为基质，加入含口腔细菌的人体唾液，3 7 下作用一定时间，会产生 甲硫醇。而在基质中加入苹果多酚，当加入量达3 0 0 z g m l 时，可使甲硫醇产生 量减少5 0 以上，当加入量达1 2 0 0 z g m l 时，能完全抑制甲硫醇的产生。 防龋齿作用 苹果多酚具有很强的抑制龋齿菌转葡萄糖基酶( g t a s e ) l 约作用，从而防止牙 垢的形成。因此，苹果多酚对预防龋齿非常有效。苹果多酚对g t a s e 的抑制能 力比绿茶中的没食子酸、表儿茶素高1 0 0 倍，其主要抗龋齿成分是苹果缩合丹宁。 影响细胞内钙离子的浓度 苹果多酚具有抑制细胞内钙离子浓度上升的作用，有利于细胞的稳定，因 此把苹果多酚添加于食品中，可直接稳定喉粘膜肥胖细胞，加在化妆品中可稳 定皮肤细胞，作外用药可用于过敏性皮炎的治疗。 1 6 苹果多酚的应用 苹果多酚具有抗氧化、消臭、保鲜、保香、护色、防止维生素损失等作用， 可以防止食品品质劣变。因此，可用于水产加工、肉制品加工、面包、糕点、油 脂，含油食品及清凉饮料等的加工制造，可显著提高其产品质量及保质期。苹果 多酚还具有多种保健功能，如预防龋齿、预防高血压、预防过敏反应、抗肿瘤； 抗衰老、抗辐射、抗突变、阻碍紫外线吸收、增白、保湿等生理功能，因此可用 于保健食品及化妆品的制造。 1 。7 影响苹果中多酚类物质组成及含量的因素 苹果中多酚物质的组成及含量常因品种、成熟度、种植条件和贮藏条件及时 间而异。 苹果中多酚物质的组成及含量在不同品种之间存在着较大的差异。在有的制 果酒的苹果品种中，多酚含量可高达7 9 k g f w ( f r e s h w e i g h t ) h 5 1 ，丽在普通苹 果品种中，总酚含量在0 5 2 9 k g f w 【撕1 。另外不同品种的苹果中多酚组成也存 在差异，p o d c s c d c k w l 等对a l v a 、e l s t a r 、j o n a g o l d 、s z a m p i o n 、w a r t a 等1 0 个 品种的成熟苹果中的多酚组成的研究表明，儿茶素类在s z a m p i o n 和e l s t a r 两个 品种中含量较高，而其它品种中主要的酚类物质却为绿原酸。而b u r d a l 4 s ! 等对 g o l d e nd e l i c i o u s 、e m p i r e 和r h o d ei s l a n dg r e e n i n g 等三个品种的研究却表明， 表儿茶素及原花青素b 2 是所研究品种中最主要的酚类物质。a m i o t 4 9 等发现 c a n a d a 果实中羟基肉桂酸衍生物和黄烷醇的含量分别为e l s t a r 的5 倍和2 倍， l i s t e r l 5 0 1 等在红苹果品种s p l e n d o u r 中还发现了青苹果品种g r a n n ys m i t h 中不存 在的花青素3 半乳糖苷。 关于苹果中多酚物质在果实发育及贮藏过程中的变化已有较多的研究。 m u r a t a 掣1 5 1 的研究表明，在苹果果实的发育过程中，总酚、绿原酸、表儿茶素 及儿茶素的含量均呈下降趋势，但下降速度却不尽相同；在发育早期的苹果果实 中，表儿茶素及儿茶素的含量要较绿原酸高，但在成熟过程中却比绿原酸下降得 快，因此成熟果中以绿原酸的含量较高。m o s c l 5 1 l 等在对苹果和梨发育过程中儿 茶素类和羟基肉桂酸衍生物的变化的研究中发现，这些物质是在果实发育早期形 成的，但在果实的快速生长过程中含量急剧下降，直至果实成熟。c o s e t e n g 、b u r d a 等【鹅1 的研究也证实了苹果果实发育过程中多酚含量下降的趋势。 在贮藏过程中，有的品种如g o l d e n | 5 2 1 ，e m p i r e 和r h o d ei s l a n dg r e e n i n g 4 s 果肉中主要酚类物质的含量没有较大程度的变化。但有的品种中，酚类组成成分 的含量则在冷藏过程中有所下降，如g a l a 中黄烷醇、花色苷和黄酮醇含量在冷 藏过程中有不同程度的下降，并且和普通冷藏相比，低氧冷藏过程中下降幅度稍 低l 列。 此外，生长条件也是影响苹果中多酚物质组成和含量的重要因素。同一品种 1 1 的苹果，栽培于不同地区的果园，由于受土壤、气候、种植条件等因素的影响而 使果实中多酚物质的组成及含量有所不同。l i s t e r 等i 别的测定结果表明，新西兰 的苹果g r a n n ys m i t h 和s p l e n d o u r 果皮中黄酮类化合物含量较其它地区高，并 认为这是由于该地区阳光充足、紫外光强度高造成的。l e e 和b e e c h 0 3 j 还发现生 长于肥沃土地上的苹果中多酚物质的含量较未施肥的低1 7 。 各种多酚物质在果实不同组织中的分布也存在着较大差异。m a y r 等【s 4 l 对 g o l d e nd e l i c i o u s 苹果的不同组织中多酚的种类、含量进行研究，发现在果肉和 果核中的绿原酸含量( 平均分别为2 0 7 和2 4 9 m g g 干物质) 远高于果皮( 平 均4 4 m g g 干物质) ，而在果皮中含有大量的槲皮素糖苷，在果肉和果核中还含 有较多的儿茶素和表儿茶素。这和h 等同的研究结果相吻合，l n 等对苹果皮 渣中的多酚物质进行分析，发现其中的多酚物质一半以上为槲皮素糖苷。a m i o t 等【4 9 l 的研究则表明，羟基肉桂酸衍生物和儿茶素类可占苹果表皮组织中总酚含 量的9 0 左右。二氢楂尔酮糖苷虽然在果皮和果肉中都有存在，但在种子中含 量最高。 1 8 苹果多酚的提取方法 1 ) 溶剂萃取法 溶剂萃取法是传统的提取工艺，该法利用有机溶剂浸提苹果粉末。溶剂常用 乙酸乙酯，萃取后，将乙酸乙酯相减压蒸馏浓缩，干燥后即得苹果多酚产品。 由于溶剂萃取法存在溶剂用量大、溶剂回收设备投资大、溶剂损耗大，以及 产品中存在有机残留等缺点，该方法在很大程度上限制了苹果多酚的生产和应 用。 2 ) 离子沉淀提取法 离子沉淀提取法是根据苹果多酚能与无机盐中的金属离子反应生成沉淀的 特性来生产苹果多酚，是一种较廉价的生产高纯度苹果多酚的方法。此法将冷冻 干燥的苹果粉末用提取液浸提过滤，调节滤液的p h 值为碱性，在滤液中加入沉 淀剂( 如：舢3 + 、z n 2 + 、f e 3 + 、m 9 2 + 、b a 2 + 、c a 2 + 等) 使苹果多酚沉淀，过 滤后沉淀用稀h 2 s 0 4 溶解，再用乙酸乙酯萃取，得到含苹果多酚的乙酸乙酯溶 液，再经减压蒸馏