（分析化学专业论文）活性氧化学发光分析特性研究.pdf

活性氧化学发光分析特性研究 黄荣富 摘要：本论文由综述和研究报告两部分组成：第一部分为综述，介绍了活性氧类 物质在化学发光分析中的研究进展；第二部分为研究报告，主要利用电化学还原 和光化学反应两种方法产生活性氧，分别研究了它们作为化学发光氧化剂时的化 学发光分析特性。 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 是指在没有任何光、电、热的作用下，基 态分子吸收化学反应放出的化学能跃迁到激发态，处于激发态的分子以光辐射的 形式返回基态，产生化学发光。一个化学反应要产生化学发光现象，必须具备以 下几个条件：( 一) 化学反应是放热反应，能产生足够的能量形成激发物质( 可见 区：1 7 1 2 9 9k 3 m o l 1 ) ，因此化学发光反应多是氧化还原反应；( 二) 有有利的反 应过程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受而被激发；( 三) 激发态物质 以光辐射的形式回到基态，有较高的发光量予产率。利用化学发光的相对强度对 待测试样进行定量和定性的分析方法就称为化学发光分析法。化学发光分析法具 有很多优点如灵敏度高、线性范围宽及仪器设备简单等。 活性氧类物质是一类很不稳定的物质，具有很高的反应活性，可以用化学发 光法进行检测。同时，活性氧类物质具有很强的氧化性，并且最终的还原产物为 水，因此可以作为氧化剂而被应用于化学发光分析中。本论文的研究工作旨在研 究利用活性氧类物质作为化学发光反应中的氧化剂时的化学发光分析特性。 在本论文的具体工作中，我们分别利用电化学还原溶解氧产生超氧阴离子和 血卟啉的光化学反应产生单线态氧，研究这两种活性氧作为化学发光试剂时的化 学发光分析特性。具体工作包括： 1 通过将羧基化的多壁碳纳米管与表面活性剂( 十六烷基三甲基溴化铵， c t a b ) 形成的复合物分散在液体石蜡中，间接的将碳纳米管修饰到石墨电极表面。 在此碳纳米管修饰石墨电极上，电化学还原溶解氧生成超氧阴离子，原位地研究 了超氧阴离子作为氧化剂时的化学发光分析特性。实验发现超氧阴离子能快速的 氧化硫离子产生化学发光，并被罗丹明b 的氧化产物所增敏。同时我们还证明了 在此电化学发光反应中，电化学反应速率大大快于后面的化学发光反应速率，因 此电化学发光反应速率由化学发光反应步决定，电化学反应并不影响后续的快速 的化学发光反应。基于快速化学发光反应带来的时间分辨效应建立了一种高选择 性的测定硫离子的电化学发光新方法。在最佳的实验条件下，该方法对于硫离子 检测的线性范围为6 0 x1 0 - 1 0 i o xl o - s m o l u i ，检出限为lx1 0 ”m o l u 1 。 2 在本研究工作中，我们在化学发光反应前面偶合血卟啉的光化学反应，利 用血卟啉在光照条件下产生的单线态氧作为化学发光反应的氧化剂，与化学发光 试剂o u m i n 0 1 ) 反应产生化学发光，研究光化学反应产生的单线态氧参与的化学发光 的分析特性。由于在化学发光反应前面偶合一个光化学反应，可实现利用光化学 反应来控制后续的化学发光反应，并基于时间分辨技术，间接的测定了光化学反 应底物血卜啉的浓度此外，我们还研究了和血卟啉同类的光敏剂原卧啉以及其 它类光敏性物质卤化银( 如溴化银) 的光诱导化学发光反应。在最佳的实验条件 下，该方法对于血卟啉检测的线性范围为1 0 1 2 0 0n g m l 1 ，检出限为0 5n g m l 1 关键词：化学发光；活性氧；电化学还原；超氧阴离子；光催化；单线态氧 n t h e a n a l ) r t i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) w i t hr e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s r o n g f uh u a n g a b s t r a c t ：t w op a r t sa r ei n c l u d e di nt h i st h e s i s i nt h ef i r s tp a r to ft h i st h e s i s ，t h e p r o p e r t i e so fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a n dt h e i ra n a l y t i c a la p p l i c a t i o n si nc l a n a l y s i sa r er e v i e w e d i nt h es e c o n dp a r t , w em a i n l yf o c u s e do nt h es t u d yo ft h e a n a l y t i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f t w o s o r t so f r o s ，s u p e r o x i d ei o na n ds i n g l e to x y g e n , w h i c h w e f eu s e da sc h e m i l u m i n e s c e n c eo x i d a n t si nc l r e a c t i o n , r e s p e c t i v e l y c h e m i l u m i n e s c e n c ei st h ee l e c t r o m a g n e t i c ( u l t r a v i o l e t , v i s i b l e ，o rn e a ri n f r a r e d ) r a d i a t i o nb ym o l e c u l e so ra t o m sr e s u l t i n gf r o mat r a n s i t i o nf r o ma l le l e c t r o n i c a l l y e x c i t e ds t a t et oal o w e rs t a t e ( u s u a l l yt h eg r o u n ds t a t e ) i nw h i c ht h ee x c i t e ds t a t ei s p r o d u c e di nac h e m i c a lr e a c t i o n b e c a u s et h ee m i s s i o ni n t e n s i t yi saf u n c t i o no ft h e c o n c e n t r a t i o no ft h ec h e m i c a ls p e c i e si n v o l v e di nt h ec lr e a c t i o n , m e a s u r e m e n to f e m i s s i o ni n t e n s i f i e sc a l lb eu s e df u ra n a l y t i c a lp u r p o s e s t h eu s e f u l n e s so fc ls y s t e m s i na n a l y t i c a lc h e m i s t r yi sb a s e do ns o m es p e c i a lc h a r a c t e r i s t i c s , s u c ha sh i g hs e n s i t i v i t y , e x c e l l e n td e t e c t i o nl i m i t s ( d o w nt os u b - f e m t o m o l el e v e l si ns o m ec a s e s ) d y n a m i c w o r k i n gr a n g eo v e rs e v e r a lo r d e r so fm a g n i t u d e ，e m p l o y m e n t so ft h er e l a t i v e l ys i m p l e i n s t r u m e n t a t i o na n ds oo n f o rar e a c t i o nt op r o d u c ed e t e c t a b l ec le m i s s i o n , i tm u s t f u l f i l lt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n ：as i n eq u an o nf o rc lt oo c c m i st h a tt h ep r e c u r s o r ( s ) o f t h el i g h t - e m i t t i n gs p e c i e sm u s tp a r t i c i p a t ei nar e a c t i o nt h a tr e l e a s e sac o n s i d e r a b l e a m o u n to fe n e r g y f o rv i s i b l ee m i s s i o n ( s a y4 0 0 7 5 0m ni nw a v e l e n g t h ) 1 7 1 2 9 9 k j r a o l i sr e q u i r e d s e c o n d l y , 慨s h o u l db eas u i t a b l er e a c t i o np a t h w a yf o rt h e e x c i t e ds t a t et ob ef o r m e d t h i r d l y , ar a d i o a c t i v ep a t h w a yf o rt h ee x c i t e ds t a t et ol o s ei t s e x c e s se n e r g ys h o u l de x i s t ，w h i c hh a sh i g l lq u a n t u me f f i c i e n c y ( q u a n t u my i e l d ) r o s sc a l lg e n e r a t ee l e c t r o n i c a l l ye x c i t e dp r o d u c t s ，w h i c he m i tt h ew e a kc ld u r i n g t h e i rd e c a yt ot h eg r o u n ds t a t e a l t h o u i g hi ti sn o te a s yt od e t e c tt h el i g h te m i s s i o n d i r e c t l yb yc lt e c h n i q u e s , i tc a nb ce n h a n c e db yc lr e a g e n t s , s u c ha sl u m i n o l ， l u c i g e n i na n ds oo n t h ep u r p o s eo ft h i st h e s i sw a st os t u d yt h ec la n a l y t i c a l p e r f o r m a n c e sw h e nr o s w e r eu s e di nc lr e a c t i o n 簦t h eo x i d a n t s i nt h i st h e s i s ，s u p e r o x i d ei o n s ，p r o d u c e db ye l e c t r o - r e d u c i n go x y g e ni na q u e o u s s o l u t i o n ，a n ds i n g l c to x y g e n ，g e n e r a t e db yp h o t o c h e m i c a lr e a c t i o no fh e m a t o p o r p h y r i n ， 1 1 1 w e r eu s e di nc lr e a c t i o na so x i d a n tr e s p e c t i v e l y u n d e rt h i ss i t u a t i o n , t h ec l c h a r a c t e r i s t i c sw e r es t u d i e di nd e t a i l t h ew o r k sa r ei n c l u d e di nt h ef o l l o w i n g s ： 1 an o v e lm e t h o df o ri m m o b i l i z a t i o no fc a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) o i lt h es u r f a c e o fg r a p h i t ee l e c t r o d ew a sp r o p o s e d , b e c a u s et h ec n t s - c t a bc o m p l e xc a l lb ew e l l d i s p e r s e d i n t o l i q u i dp a r a l 五1 1 w e f u r t h e rf o u n dt h a t s u p e r o x i d e i o nw a s e l e c t r o g e n e r a t e do nt h i sc n t s - m o d i f i e de l e c t r o d e 。w h i c hc a nr e a c t e dw i t i ts u l f i d ei o n c o m b i n g w i t haw e a kb u tf a s te l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) e m i s s i o n , a n d t h i sw e a ke c ls i g n a lc o u l db ee n h a n c e db yt h eo x i d a t i v ep r o d u c t so fr h o d a m i n eb i n a d d i t i o n , t h er a t ec o n s t a n to ft l i se l e c t r o e h e m i c a ir e a c t i o nk 0w a si n v e s t i g a t e da n d c o n f i r m e dt h a tt h es p e e do f e l e c t r o g e n e r a t i n gs u p e m x i d ei o nw a si na c c o r d a n c ew i t ht h e s u b s e q u e n tf a s tc lr e a c t i o n t h u s , t h ef a s tc lr e a c t i o no fs u p e r o x i d ei o nw i t ht a r g e t b r o u g h ti nt h ep o s s i b i l i t yo fh i g hs e l e c t i v i t yb a s e do nt i m e - r e s o l v e d ，r e l a t i v et oo t h e r i n t e r f e r e n c e s b a s e do nt h e s ef i n d i n g s a ne x c e l l e n t l ys e l e c t i v ea n d h i g h l ys e n s i t i v ee c l m e t h o df o rs u l f i d ei o nw a sd e v e l o p e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c i n g e c ls i g n a l sw e r el i n e a rw i t ht h es u l f i d ei o nc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g ef r o m6 0 x l o 1 0 t o1 o l o m 0 1 l 1 ，a n da2 0 x 1 0 1 0m o l l 1d e t e c t i o nl i m i t s 3 0 ) w a sa c h i e v e d 2 c o u p l i n go fap h o t o c h e m i c a lr e a c t i o nw i t hc o n v e n t i o n a lc lr e a c t i o n , t h e g e n e r a t i o no f c le m i s s i o nw a si n i t i a t e db yt h ef o r w a r dp h o t o c h e m i c a lr e a c t i o np r o d u c t s t h e r e f o r e , t h ep h o t o c h e m i c a lr e a c t i o np r o d u c t so fh e m a t o p o r p h y r i n , s i n g , l e to x y g e n , w a sp r o d u c e da n dt o o kp a r ti nt h es u b s e q u e n tc lr e a c t i o na sa l lo x i d a n ti ns i t u , c o m b i n i n gw i t has t r o n gc le m i s s i o n b a s e do nt h e s ec o n s i d e m t i o m t h ec o n v e n t i o n a l c lr e a g e n t sc a nb em i x e di na d v a n c ei n s t a t i cs o l u t i o na n dt h eg e n e r a t i o no fc l e m i s s i o nw a sc o n t r o l l e db yt h ef i r s tp h o t o c h e m i c a lr e a c t i o n o nt h eo t h e rh a n d ，w e i n v e s t i g a t e dp o r p h y r i n a n ds i l v e rb r o m i d ei n p h o t o i n d u c e d c li n s t e a do f h e m a t o p o r p h y r i na n dt h e yp r o m i s e dt h es i m i l a rk i n e t i cc a l v e d u et ot h ek i n e t i c d i s t i n c t i o nb e t w e e nb a c k g r o u n d ( d u et or e s i d u a lp h o t o si ns o l u t i o na f t e ri l l u m i n a t i o n ) a n dc ls i g n a l ，at i m e - r e s o l v e dc la n a l y s i sf o rh pd e t e r m i n a t i o nw a sp r o p o s e d t h e p h o t o - i n d u c e dc ls i g n a l sw e r el i n e a rw i t hh e m a t o p o r p h y r i nc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g e f r o m1 0t o1 2 0 0n g m l 1 ，a n da0 5n g m l - 1 d e t e c t i o nl i m i t sw a sa c h i e v e d k e yw o r d s ：c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) ；r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ；e l e c t r o r e d u c e d ； s u p e r o x i d ei o n ；p h o t o i n d u c e d ；s i n g l e to x y g e n i v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其它个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 煎隼整 日期： 兰回： 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 予版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名： 盘荦容 日期： 兰啤五 第一部分综述 活性氧在化学发光分析中的应用 1 1 化学发光分析的基本原理简介 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 是指在没有任何光、电、热的作用下，基态 分子吸收化学反应放出的化学能跃迁到激发态，处于激发态的分子以光辐射的形 式返回基态，产生化学发光。激发和发射是构成化学发光反应的最简单的并且是 最关键的两个步骤。利用化学发光的相对强度和光辐射的波长对待测试样进行定 量和定性的分析方法就称为化学发光分析法【”。化学发光反应可以简单的分为两种 类型：种类型是两种物质a 和b 经化学反应生成一种激发态产物c ，当c 返回到 基态时，以光子形式释放能量，产生化学发光，其基本反应式为： a + b - c 。+ d c 。_ c + h v 另一种类型是能量转移化学发光，它主要由三个步骤组成：首先，物质a 和b 通过反 应形成种激发态中间体c ，接着c 迅速将能量转移给另一能量接受体f ，f 接受 能量跃迁到激发态，形成激发态的f ，当f 返回基态时，产生化学发光。基本反应 式： a 十b _ c + d c + f _ + c + f f 一f + h v 根据以上的反应过程，一个化学反应要产生发光现象，必须满足以下三个条 件： 第一，此化学反应是一个放热反应，可提供足够的激发能( 在可见区4 0 0 - 7 5 0 n l n ，产生光辐射，自由能变g 应在1 7 1 - 2 9 9k j - t o o l 。之间) ，并由某一步骤单独 提供，因为前一反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光： 第二，有有利的反应过程，化学反应产生的能量至少能被一种物质所接受并 生成激发态； 第三，激发态分子具有一定的化学发光量子效率释放出光子，或者能够转移 它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子，即要有一定的发光量子产 率。 化学发光反应之所以能够用于分析测定，是因为化学发光强度与化学发光速 率相关联，因而一切影响反应速率的因素都可以作为建立测定方法的依据，既包 括一个发光过程也包括一个化学发光反应过程。所以化学发光强度取决与化学发 光反应的速率，激发态产物的效率和激发态物质的发光效率： i c l = q c l d c d t = i p r _ x t p l = m d c d t 式中i c l 是化学发光强度( 每秒发射的光子数) ； d c d t 是化学反应速率( 每秒的反应分子数) ； l 化学发光量子产率( 每一个参加反应的分子发射的光子数) ； 魄x 激发态量子产率( 每一个参加反应的分子产生的激发态) ： 啦m 发光量子产率( 每一个激发态产生的光子数) 。 对于一定的化学发光反应，币c l 为一定值。通常，可以用于分析化学的化学发 光系统的眦值在0 0 1 0 2 0 之间。化学发光测定易受化学反应条件，如p h 值、离子 强度、溶液组成、温度等的影响，影响反应速率或任意一个量子产率的因素都会 影响发光强度。因此，在一定化学反应条件下，通过测定化学发光强度就可以测 定反应体系中某种物质的浓度。原则上讲，对于任何化学发光反应只要是一级反 应或准一级反应，都可以用上式进行化学发光定量分析。 化学发光分析法有许多优越的分析特性，在分析化学中应用非常广泛。首先， 化学发光分析法最突出的优点是它的灵敏度非常高。与荧光法相比，化学发光分 析不需要外在的激发光源，避免了瑞利散射和拉曼散射所引起的干扰，使用光电 倍增管在高压下将光信号放大，大大提高了该方法的灵敏度，有些化学发光体系 的灵敏度可达到p m o l 级，甚至更低。另外，化学发光分析的线性范围较宽，可以 达到二三个数量级，甚至能达到六个数量级。除此之外，化学发光分析法还有许 多优点，如仪器设备简单，分析快速，容易实现自动化等。因此，化学发光分析 已广泛地应用于生命科学，材料科学，食品科学，临床医学以及环境检测等领域， 成为现代分析领域中一种有效的微量及痕量分析技术1 2 ”。 1 2 活性氧的种类及性质简介 地球上除厌氧生物外，所有动植物和需氧生物都离不开氧。氧是生命运动过 程中不可缺少的一种气体，当人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中，就会感 到憋气甚至死亡1 6 1 。但是，氧具有很高的氧化性，处于空气中的人体各部位都在不 断被氧化而失去生理机能，它体现在人体的细胞水平上，尤其是人体各种器官随 着年龄的增长不断地老化更是这种作用的直观表现。氧参与新陈代谢、线粒体的 呼吸和氧化磷酸化，产生能量a t p 。氧在细胞生物化学中有正反双重作用，即适当 量的氧是正常细胞功能和生命所必须的，但过量的氧会导致细胞中毒、生物分子 2 的损害和正常信号路径的中断及特殊信号路径的激活掣7 】近年来，活性氧在人体 内的作用受到人们极大的关注，报道了大量有关活性氧，特别是超氧自由基和羟自 由基与机体细胞的许多功能活动以及各种疾病，如癌、动脉硬化、糖尿瘸、心脑血 栓、缺氧再灌注综合症、感染以及衰老效应等相关的研究论文和著作，引起人们对 活性氧的普遍兴趣，从而激发了人们更深入地去研究活性氧的各种特性，开发各种 相关的抗氧化、抗衰老物质，在医学和分子生物学领域已成为一项广泛引起重视的 研究课题。 所谓活性氧是指机体内或者自然环境中由氧组成、含氧并且性质活泼的物质 的总称 8 1 ，主要包括：种激发态的氧分子，即一重态氧分子或称单线态氧分子 ( 1 0 2 ) ；三种含氧自由基，即超氧阴离子自由基( 0 2 - ) ，羟自由基( h o ) 和氢过氧自由 基( h 0 2 ) ；两种过氧化物( h 2 0 2 ) 和过氧化脂质( r o o h ) 以及含氮氧化物( n o ，o n o o h 和o n o o - ) ，表1 - 1 列出了几种主要的活性氧物质。 表l 一1 活性氧的种类 氧依次接受一个电子生成0 2 、两个电子生成h 2 0 2 、三个电子生成h o 、四个 电子还原生成水。从氧的原子和分子的结构来看，氧在元素周期表中属于第六主 族，元素序数为8 ，原子核外有8 个电子，氧分子由2 个氧原子组成，一般所说的氧 气是指处于基底状态的三重态氧分子( 3 0 2 ) ，还有上表提到的活性氧。除了三重态 氧以外，其它具有人体毒性的活性氧都处于高能量的状态，化学反应活性强、存 在寿命短，如1 0 ：的平均寿命为2i t s ，h o 自由基2 0 0 i t s ，0 2 自由基5s l 引。按照自由 基的定义，含有一个或者一个以上不对称电子的原子或者分子都称为自由基。表 1 - 2 列出氧以及主要活性氧的分子轨道的电子排布和激发态的能量。 由于活性氧的高能量和氧自由基带有不对称的电子，虽然它们存在的寿命短， 但是反应活性却很强，在体内能破坏d n a 、蛋白质、醣类和脂类，引起心脏病、 3 癌症和衰老等严重疾病，因此对自由基的研究是近年来生物和医学界非常受关注 的一个研究领域。同时，生命系统有一套复杂的抗氧化防御系统，包括一些酶和 非酶，它们通过直接拦截或间接逆转氧化损害来抗击活性氧，中断自由基链反应。 防御活性氧浓度的增加1 9 。”，例如过氧化歧化酶( s o d ) 催化0 2 歧化为过氧化氢，过 氧化氢酶催化过氧化氢分解为水，谷胱甘肽过氧化物( g p x ) 氧化g s h 为g s s g ，铁 蛋白通过f e n t o n 反应抑g h o 的生成。此外，别的抗氧化剂，如维生素c 和e 、苯醌 还原酶( q r ) ，金属硫因( m d 也能抑制0 2 i 的生成。当活性氧的浓度超过细胞本身的 抗氧化防御能力时，氧化还原动态平衡被改变，产生通常所说的氧化应激【1 2 1 。氧 化应激与一些疾病如爱滋病、亨廷顿病、帕金森病、视网膜退化等发病机理有关。 由于活性氧类物质具有较强的氧化能力，较高的反应活性，能够与许多化合物发 生氧化还原反应，并且它的最终还原产物是水，因此被广泛的用于分析化学中。 表1 2 几种重要氧分子的结构状态 1 3 活性氧类物质在化学发光分析中的应用进展 化学发光法是仪器分析中灵敏度较高的方法之一，它的特点是化学反应与发 光现象同时发生，从而有望成为不稳定化合物的在线、原位分析的有效手段。近 年来，随着光电检测技术的不断进步，化学发光分析法已在在众多的领域得到了 广泛的应用。活性氧类物质是一类不稳定的化合物，由于化学发光法适用于不稳 定化合物的检测，因此应用化学发光法迸行检测得到了极大的关注。同时，由于 活性氧类物质具有很高的氧化活性，它们可以与许多不同的化合物发生氧化还原 反应，与一些化学发光试剂反应，产生化学发光，并由此产生的化学发光强度对 4 反应物或反应的催化剂进行定量或者定性分析。在一定条件下，活性氧能和鲁米 诺，光泽精，甲壳动物荧光素等化学发光试剂反应，产生不同强度、不同发射波 长的化学发光辐射。下面以此三种化学发光试剂为中心，分别介绍活性氧类物质 的化学发光研究应用进展。 ( 一) 活性氧类物质与鲁米诺的化学发光反应 鲁米诺( 5 a m i n 0 0 2 ，3 d i h y d r o p h t h a l a z i n e 1 ，4 - d i o n e ) 是化学发光研究中最常用的 试剂之一，对鲁米诺的研究与应用一直都非常活跃。在水溶液中，鲁米诺的量子 产率为0 0 1 ，在有机溶剂d m s o 中的量子产率为0 0 5 。通常，鲁米诺在碱性溶液中 ( p h = 1 0 左右) ，首先形成单价阴离子，然后直接被强氧化剂氧化而处于激发态， 从激发态回到基态发射4 2 5n n l 蓝光( 如图1 1 ) ；或是在催化剂，如酶，f e 2 + ，c o 计， n i 2 + ，c u 2 + 等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化 氢发生化学发光反应，产生光辐射i l 川。 鲁米诺在碱性介质中既可与羟基自由基( o h ) 反应产生化学发光，也可以与0 2 。 自由基或者单线态氧1 0 2 以及h 2 0 2 发生化学发光，反应的事实己经基本上得到公 认。同时，鲁米诺化学发光法还可以应用于h 2 0 2 ，0 2 ，1 0 2 ，o h 等活性氧类物质 的测定。然而，由于这些活性氧类物质都可以氧化鲁米诺产生化学发光，因此很 难用于确定其中单一活性氧物质的直接测定。在很多情况下，活性氧的鲁米诺化 学发光法只能作为定量或者定性分析的辅助手段。另一方面，在许多鲁米诺的化 学发光反应体系中，溶液中的氧直接或间接的被还原成活性氧类物质，在碱性条 件下氧化鲁米诺分子产生化学发光，再根据发光强度对底物分子进行定量和定性 分析。 冒宫? 瓣嚣瓣嚣 机6 妇：6 1 ：i h 26 罱薛一薛汕 图i 1 碱性溶液中l u m i n o l 与活性氧的化学发光反应的可能机理 ( 二) 活性氧类物质与光泽精的化学发光反应 光泽精( l u c i g e n 氓n ，n - d i m e t h y l ，9 ，9 d i a c r i d i n 啪) 也是常用的化学发光试剂 之一。早在1 9 3 5 年，g l e u 和p e t s c h i 4 1 就报道了第一篇关于光泽精的化学发光论文， 5 在碱性条件下，光泽精与0 2 等作用形成激发态n - 甲基吖啶( n - m e t h y l a c r i d a n ) 并发 出波长5 2 3n m 的微弱化学发光，如图1 2 所示。与鲁米诺的化学发光特性相比，光 泽精化学发光有以下优点：( 1 ) 光泽精的发光体n - 甲基吖啶酮比鲁米诺的发光体3 氨基邻苯二甲酸发光更强、发光效率更高；( 2 ) 光泽精的化学发光对某些还原剂非 常敏感，如抗坏血酸、肌酸酐、尿酸、葡糖醛酚，检出限一般为1 - l o p m o l l i ；( 3 ) 含洳羟羰基的化合物与光泽精会发生强烈的化学反应，如甘油、羟基乙醛、二羟基 丙酮酯等。同时，活性氧类物质也能氧化光泽精，产生化学发光。但是与鲁米诺 的活性氧类物质化学发光相比，光泽精只能与部分的活性氧类物质发生反应，表现 出对活性氧较高的选择性。研究结果表明，只在羟自由基存在条件下，观察不到 光泽精的发光：另外，有学者报道5 ，1 6 l 光泽精只在超氧活性自由基( 0 2 - ) 存在下才 发生发光现象，而在其它的活性氧物质存在时，如过氧化氢，不产生化学发光。 但是在实际应用中，h 2 0 2 的分解过程也产生0 2 ，因此难以定性地判断分析结果。 图1 - 2 光泽精与活性氧的化学发光反应的可能机理 ( 三) 活性氧类物质与甲壳动物荧光素及其类似物的化学发光反应 荧光素中最典型的一类试剂是英文名称为c y p d d i n a 的甲壳动物荧光素，它是 来自于日本海和加勒比浅海中的一种小甲壳动物，己经被广泛的应用于化学发光 研究中，其化学名称为2 甲基- 6 苯基- 3 ，7 - 二氢化咪唑【1 ，2 - a 】吡嗪一3 酮 ( 2 - m e t h y l 一6 p h e n y l - 3 ，7 一d i h y d r o i m i d a z o 一【1 ，2 - a p y r a z i n - 3 - o n e ) 的试剂，简称c l a 。但 直到二十世纪七十年代，e l 本化学家s u g i u r a 等人【”l 才成功的合成了这一发光试 剂。但在c l a 与活性氧类物质的化学发光反应中，只有0 2 和1 0 2 能与c l a 发生 特异性的化学发光反应，而h 2 0 2 和o h 都不能与c l a 发生化学反应，如图1 3 所 示： 6 羚。中 堕耋： 窜 - - 幽1 - 3 甲壳动物荧光素的化学发光反应 通常所说的活性氧类物质是指机体内或者自然界中由氧组成、含氧并且活泼 的物质，它们的反应活性都比分子氧强很多。由于自由基至少含有一个未配对的 电子，所以很容易氧化许多生物分子，如蛋白质，d n a s 和脂质体等。这些年来， 活性氧类物质在生命科学、食物化学及有机合成中受到了广泛的关注，包括分子 类的活性氧类物质( 如过氧化氢等) ，离子类( 次氯酸根等) ，过氧化亚硝酸盐， 一些自由基( 如羟自由基) 和既是自由基又是离子的超氧阴离子自由基等。在活 性氧类物质中，羟基自由基就是活性最强的物质。在通常情况下，氧分子得到一 个电子被还原成超氧阴离子，得到两个电子被还原成过氧化氢，得到三个电子被 还原成羟自由基，得到四个电子被还原成水。下面就几种主要的活性氧类物质分 别介绍它们在化学发光分析中的应用。 1 3 1 超氧阴离子在化学发光分析中的应用 超氧阴离子自由基( 0 2 ) 是基态氧接受一个电子形成的第一个氧自由基，在水 中可视为一个碱，它可以和氢离子结合，它的电子排布和能量如表1 - 2 所示。0 2 是阴离子，又是自由基，性质活泼，具有很强的氧化性和还原性，既是氧化剂， 又是还原剂。0 2 在水中的存活时间约为1 秒，在脂溶性介质中的存活时间约为1 小 时，和其他氧自由基相比0 2 ：相对比较稳定i l s 】。但是，它可接受一个 i + ，形成质子 化的超氧阴离子自由基，即氢过氧自由基h 0 2 。0 2 r 在水溶液中易发生歧化反应生 成h 2 0 2 ，在酸性环境中高浓度的0 2 质子化产物h 0 2 便易发生此反应，如表1 3 所示。 表1 3 超氧阴离子的几个反应 7 超氧阴离子有很高的反应活性，它也可以和鲁米诺，光泽精，c l a 等化学发 光试剂反应产生不同波长的化学发光辐射【划。o o s t h u i z e n 等1 研究了在超氧阴离子 与不同的化学发光试剂，如鲁米诺，光泽精，m c l a 等的化学发光反应中的p h 值 的影响，发现在超氧化钾和黄嘌呤黄嘌岭氧化酶产生超氧阴离子时与l u m i n o l 产生 化学发光的最佳p h 值为9 0 和9 4 ，与光泽精产生最强化学发光的最佳p h 值为9 5 和 1 0 0 ，而与m c l a 反应的最佳条件是中性的生理条件。其实，在鲁米诺化学发光体 系中，很多反应都涉及到超氧阴离子参与。m e r e n y i l 2 q 等研究鲁米诺化学发光反应 机理时发现超氧阴离子在形成激发态中间体时发挥着极其重要的作用，其主要的 反应方程式如下：( 其中l h 2 ：l u m i n o l ；3 - a p * ：3 - a m i n o p h t h a l a t e * ) l h 2 一l h + rq k 舶7 ) l h - 一l 2 + 矿( p k a = 1 5 n l h + l + 旷( p k a - 7 7 1 l + 0 2 。- 3 a p + n 2( k 1 2 3 x 1 0 sm 一s 1 ) 3 - a p 一3 a p + h v ( f = 6 哟 超氧阴离子氧化光泽精产生的化学发光，首先l u c + 被氧化成一个二氧杂环丁 酮，再分解成激发态的n 甲基吖啶酮，这个激发态的吖啶酮回到基态产生化学发 光辐射，如图1 2 所示。z h a n 9 1 2 y 等人发现，在光泽精的化学发光反应中，加入吲 哚满z 酮( i s a t i n ) 能强烈的增敏此电化学发光强度，认为此增敏是电化学还原产生吲 哚满二酮和溶解氧的超氧阴离子和光泽精所引起的，由此建立了一种测定吲哚满 二酮的新方法。n a o h i r og o t o h 等【2 8 1 通过次黄嘌岭黄嘌呤氧化酶体系产生超氧阴离 子，利用维生素e 、维生素c 及其衍生物和c l a 与超氧阴离子的竞争反应，在2 5 ， p h i 7 8 时测定了它们与超氧阴离子的反应速度；m i n o mn a k a n o a 等1 2 9 】利用超氧阴 离子和m c l a 产生化学发光测定了人粒细胞中产生的超氧阴离子的量。 从表1 2 可知，超氧阴离子具有较高的能量。反应活性很强( 从热力学角度上 讲) ；从表1 3 可知，超氧阴离子发生氧化还原反应时具有较大的速率常数( 在动 力学角度上讲) ，因此超氧阴离子作为氧化剂广泛的用于化学发光分析中。自从 1 9 3 1 年h y l a n d 掣3 0 1 发现在含有空气的二甲亚砜( d m o s ) 溶液中加入碱能产生超氧 阴离子，这种方法已经广泛的用于产生0 2 ，其可能的反应机理为： ( c h 3 ) 2 s o + o h _ + c h 3 s o c h 2 - + h 2 0 c h 3 s o c h 2 + 0 _ c h 3 s o c h 2 + 0 2 根据这一机理，赵琢道等1 3 1 】利用碱性二甲基亚砜体系生成的超氧阴离子与鲁米诺 反应产生化学发光提出了一种测定超氧化物歧化酶活力的新方法。袁春莲等 3 2 1 应 用d m 0 s l u m i n o l 化学发光法研究了培植牛黄对碱性二甲基亚矾体系产生0 2 的清 8 除作用。辜红梅等p 习利用n a o h d m o s h 2 0 2 l u m i n o l 化学发光法研究了葡萄属植 物白藜芦醇及其低聚物对氧自由基作用的影响，并探讨了结构与活性之间的关系。 c u i 等i 蚓人通过利用n a o h d m o s l u m i n o l 体系产生超氧阴离子，系统研究了3 6 种 芳香化合物对超氧阴