（环境科学专业论文）镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权掣张 学位论文 是如需保密，解密时间2 0 1 0 年1 2 月3 1 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：多囊纱时间：二。罗年6 月信日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必 须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 历、 黼搬移翩鲐讯 岁 签名嗍力呻“刖如 签名嘲：p ? 每 、茂f 婚 v 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 4 7 目录 目录1 摘要3 缩略语表6 a b b r i c a t i o n f ； 1 前言7 1 1 金属结合蛋白7 1 1 1 金属硫蛋白7 1 1 2 人工合成金属结合肽9 1 1 3 植物螯合素9 1 1 4 金属吸附专一性改造。9 1 2 细胞表面展示工程菌1 0 1 2 1 微生物细胞表面展示技术简介1o 1 2 2 运载蛋白1 0 1 2 3 靶蛋白1 2 1 2 4 出发菌株选择1 2 1 2 5 细菌表面展示系统类别1 3 1 3 植物根际圈修复重金属污染。1 3 1 3 1 植物根对重金属的吸收1 3 1 3 2 根际微生物对重金属吸附的影响1 4 1 3 3 根际分泌物对重金属吸附的影响1 6 1 4 研究目的和意义一1 6 2 材料与方法l8 2 1 质粒和菌株1 8 2 2 引物与e c 2 0 的设计与合成1 9 2 3 微生物及植物的培养1 9 2 3 1 抗生素1 9 2 3 2 微生物培养基。1 9 华中农业大学硕士论文雷磊中国武汉2 0 0 9 年6 月 2 3 3h o a g l a n d s 营养液。2 0 2 4 实验试剂2 0 2 4 1 质粒和总d n a 提取、质粒转化时相关试剂2 0 2 4 2 琼脂糖凝胶电泳和s d s p a g e 电泳试剂2 1 2 4 3 酶切、酶连、p c r 和d n a 回收试剂2 1 。 2 5 仪器。2 1 2 6 实验方法2 2 2 6 1 质粒构建与蛋白表达2 2 2 6 2 菌体镉吸附实验2 3 2 6 3 工程菌植物共生水培实验2 5 2 6 4e c 2 0 的获得与检测：。2 7 3 结果与分析2 7 3 1 质粒构建与蛋白表达2 7 3 2 工程菌镉抗性测定2 9 3 3 工程菌镉吸附量测定3 1 3 4 植物与工程菌共生水培实验3 3 3 4 1 植物表型的观察与测定3 3 3 4 2 植物根际镉含量测定3 3 3 5e c 2 0 的获得。3 6 4 小结和讨论3 6 4 1 小结。3 6 4 2 讨论3 7 参考文献4 0 致谓 4 7 附勇乏4 8 附录1 i n a x - n - m m t 4 a 的测序结果4 8 附录2 i n a x - n - m m t 4 a 融合基因的模拟翻译结果4 8 附录3 e c 2 0 的测序结果4 9 附录3 e c 2 0 的模拟翻译结果4 9 2 本研究以野油菜黄单胞菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s ) a t c c 3 3 9 1 3 冰晶核蛋白n 端( i n a x - n ) 为运载蛋白，采用c 端融合的方法，将猴金属硫蛋白a 结构域四聚体 ( m m t 4 a ) 成功展示在重金属高度耐受性恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) x 4 菌株( 以下简称x 4 ) 的细胞表面，并测定了工程菌镉吸附能力及其与多种植物共生 条件下的镉吸附能力。实验结果表明，与出发菌相比，重组工程菌具有更高的镉吸 附能力。 基于广宿主载体p t r l 0 2 ，将p c r 得到的野油菜黄单胞菌a t c c 3 3 9 1 3 冰晶核蛋 白n 端基因n a x - n 和m m t 4 a 基因进行融合表达，并在其上游加入镉响应启动子 c a d r 元件，构建表面展示载体p c i m ，通过电转化转入恶臭假单胞菌x 4 。在1 0 0 1 t m o l l 镉离子浓度下诱导融合蛋白表达并在x 4 表面展示。通过细胞分级实验和 s d s p a g e 分析等方法对n a x 表面展示效率进行验证。 镉胁迫生长曲线和比生长速率证明工程菌x 4 p c i m 具有比出发菌株x 4 更高的 镉耐受性，工程菌x 4 p c i m 的镉最低抑菌浓度比出发菌株x 4 高2m m o l l 。此外， 本研究还测定了生长态条件和静息态条件下x 4 p c i m 和出发菌株x 4 对镉的吸附作 用，工程菌对镉的吸附量比出发菌株高出2 倍以上，静息态条件下的吸附结果表明 吸附过程在5m i n 内时间完成。 工程菌x 4 p c i m 和出发菌株x 4 在水培条件下与小麦、豇豆、玉米根际定殖共 生与镉相互作用结果显示：工程菌x 4 p c i m 和出发菌株x 4 与植物共生都表现出钝 化重金属，保护植物生长的作用。其中工程菌x 4 p c i m 与植物的共生体系比出发菌 株x 4 与植物共生体系表现出更强的镉吸附能力 关键词：猴金属硫蛋白；野油菜黄单胞菌；冰晶核蛋白；镉；细胞表面展示；恶臭 假单胞菌 3 华中农业大学硕士论文雷磊中国武汉2 0 0 9 年6 月 a b s t r a c t b yt h eb a c t e r i ac e l l s u r f a c ed i s p l a yt e c h n i q u e s ，a l li n d u c i b l eb a c t e r i a lc e l l s u r f a c e d i s p l a yv e c t o rp c i mh a sb e e nc o n s t r u c t e d t h ei c en u c l e a t i o na c t i v i t yp r o t e i ni d e n t i f i e d f r o mx a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sa t c c 3 3 9 1 3 ( i n a x ) w a su s e da sa na n c h o r i n gm o t i f a c l u s t e ro f4d i r e c tr e p e a t so fm o n k e ym e t a l l o t h i o n e i nad o m a i n ( m m t 4 a ) w a su s e da st h e t a r g e tp r o t e i n b yt h ew a yo fc t e r m i n a lf u s i o nt ot h en - d o m a i no fi n a x ，m m t 4 aw a s s u c c e s s f u l l yd i s p l a y e do nt h es u r f a c eo ft h eh e a v ym e t a l - r e s i s t a n tb a c t e r i a ls t r a i n p s e u d o m o n a s p u t i d ax 4 ( h e r e i n a f t e rs h o r tf o rx 4 ) t h ec a d m i u ma d s o r p t i o nc a p a b i l i t yo f t h ee n g i n e e r e ds t r a i nx 4 p c i ma n di t ss y m b i o s i ss y s t e mw i t hp l a n t sw e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h o s eo fx 4 c o n s e q u e n t l y , t h ee n g i n e e r e ds t r a i nx 4 p c i mi sp r o m i s i n gt ob e u s e di nt h eb i o r e m e d i a t i o no fc a d m i u m c o n t a m i n a t e de n v i r o n m e n t b a s e do nt h eb r o a d - h o s t r a n g ev e c t o rp t r l0 2 ，f u s i o ne x p r e s s i o no ft h eg e n e n a x a n dm m t 4 aw e r ef e a s i b l e t h ei c en u c l e a t i o np r o t e i nnt e r m i n a lg e n e ( i n a x - n ) f r o mx c a m p e s t r i sa n dm m t 4 aw e r ec l o n e d ，i n s e r t e di n t op t r l0 2a n dr e n a m e da sp c i m t h e e x p r e s s i o nw a sr e g u l a t e db ya nu p s t r e a mc a d m i u m s p e c i f i cr e s p o n s i b l ep r o m o t e rc a d r b ye l e c t r o p o r a t i o n ，p c i mw a si n t r o d u c e di n t o 只p u t i d ax 4 t h ef u s i o ne x p r e s s i o n p r o t e i nw a si n d u c e db yc a d m i u mi o n sa t10 0l x m o l l t h er e s u l t so fc e l lg r a d i n ga s s a y a n ds d s p a g ei n d i c a t e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nw a sl o c a l i z e do nt h eb a c t e r i a lo u t e r m e m b r a n e t h ee n g i n e e r e ds t r a i nx 4 p c i ms h o w e dh i g h e rr e s i s t a n c e t oc a d m i u mt h a nx 4 b a c t e r i o s t a t i ct e s to fc a d m i u mi n d i c a t e dt h a tm i n i m a li n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) o f x 4 p c i mw a s2m m o f lh i g h e rt h a nx 4 u n d e rs t a t i cs t a t u s ，t h ea d s o r p t i o np r o c e s so f c a d m i u mf i n i s h e di n5m i n u t e s t h ea d s o r p t i o nc a p a c i t yo fx 4 p c i mf o rc dw a s2t i m e s l a r g e rt h a nt h a to fx 4i ng r o w i n gc u l t u r e h y d r o p o n i cc u l t u r ee x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u tw i t hw h e a t ，c o w p e a , m a i z ea n d r h i z o s p h e r eb a c t e r i a t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea s s o c i a t i o no fx 4 p c i ma n dx 4w i t h 4 5 s t r i s ；i c en u c l e a t i n g 华中农业大学硕士论文雷磊中国武汉2 0 0 9 年6 月 a a s a m p b p b s a d n t p e d t a h e p e s i n p i p t g k d a m m t o d 0 i 心 p c r s d s s d s p a g e t e t p b s t e t e m e d t r i s 缩略语表 a b b r i c a t i o n a t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o p h o t o m e t e r ， a m p i c i l i nn a s a l t b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 4 - ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) - 1 - p i p e r a z i n e e t h a n e s u l f o n i ca c i d i c en u c l e a t i o np r o t e i n i s o p r o p y l p - d - l t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l o d a l t o n s m o n k e ym e t a l l o t h i o n e i n o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d o d e c y ll a u r y l s u l f a t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t e t r a c y c l i n eh y d r o c h l o r i d e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e i r i se d t a t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e t r i ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 6 镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用 1 前言 镉是一类典型的分散型重金属元素，广泛存在于铜、铅、锌等有色金属矿藏中， 主要以硫化物形态存在。然而，人类的工农业活动让镉以各种途径进入环境中，造 成了严重的镉污染。土壤和水体中镉的可溶部分，称为可溶态和可交换态。镉在环 境中有稳定、积累和不易消除的特性，而镉迁移和转化的最大特点是不能且不易被 生物体分解转化后排出体外，不易随水移动，只能沿食物链逐级往上传递，并通过 食物链富集导致人体慢性中毒。研究表明，镉同时对各种动物具有致癌作用，镉污 染地区居民的癌症患病率及死亡率同非污染地区相比均呈现出上升的趋势。目前， c d 已被国际癌症研究组织( i a r c ) 归为第一类致癌物( m c g r e g o re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 传统治理土壤重金属污染主要是应用物理和化学方法，但是这些方法具有成本 高、工艺复杂、人力物力消耗大等缺点，且很难除去低浓度的金属离子，在大规模 应用中受到限制。而且理化方法往往会破坏土壤结构以及微生物区系，并且改变土 壤本身理化性质，从而造成“二次污染”。利用超累积生物治理重金属污染，生物 吸附和固定重金属是现今生物治理土壤重金属污染的主要方式( e c c l e s ，1 9 9 9 ；g a d d ， 2 0 0 0 ；m a l i k ，2 0 0 4 ；b u l o w , 2 0 01 ) 。 在土壤镉污染的治理修复方面，研究人员大都热衷于利用植物富集提取手段和 微生物修复手段，原理分别是利用某些对镉具有超富集能力高抗性的植物或者土壤 微生物将土壤中的镉大量地转移到植株和微生物表面或体内，从而达到修复土壤重 金属污染的目的。这种生物途径修复方法潜力大，而且具有维持土壤肥力，保持土 壤结构和保护区系内生物群落免遭破坏，还能营造良好的生态环境等优点。现在对 于重金属生物修复的研究热点主要集中在如下的方面。 1 1 金属结合蛋白 金属结合蛋白目前主要有人工合成金属结合短肽、金属硫蛋白、植物螯合素等。 1 1 1 金属硫蛋白 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，简称m t ) 是一种低分子，富含半胱氨酸的蛋白 质，其特殊的氨基酸序列构成赋予其结合c d 、z n 、c u 等多种金属离子能力。 7 华中农业大学硕士论文雷磊中国武汉2 0 0 9 年6 月 m a r g o s h e s 和v a l l e e 在1 9 5 7 年首次从马的肾脏中分离得到。到1 9 6 0 年，k a g i 和v a i l e e 首次将其提纯。金属硫蛋白在细菌、真菌和所有的动植物细胞中都广泛存在( v a s a k a n dh a s l e r , 2 0 0 0 ) ，且在生命活动中发挥重要作用。金属硫蛋白的合成受到重金属离 子、生长因子第二信使和各种压力、疾病等多种因素的诱导。越高等的真核生物中 的金属硫蛋白，有越复杂的结构。 典型的哺乳动物金属硫蛋白有以下特点：分子量低，一般在6 7k d a ；金属结 合位点多，每分子含有7 1 2 个金属离子结合位点；蛋白中半胱氨酸含量达2 0 3 3 ； 不存在二硫键、芳香族氨基酸以及组氨酸等结构；具有保守的半胱氨酸位置及 c y s x c y s 重复结构以及金属巯基化合物的特征性光学性质；该蛋白有a 和b 两个 结构域。m tc 端3 0 6 1 位氨基酸为仅结构域，n 端1 2 9 位为d 结构域，a 结构域与 p 结构域呈彼此独立的球形结构，整个分子连接呈哑铃形状。金属硫蛋白对金属的 结合是一个可逆而迅速的过程，且研究表明两个结构域在结构和功能上具有相对独 立性，a 结构域对镉离子的结合能力远远高于b 结构域，两者络合常数相差1 0 0 0 倍。 m t 对金属离子吸附不是一个简单的结合过程，该过程还通过某些方式促进了 细胞表面其它结构与金属离子的结合，并影响通过对环境中生理生化过程，协同作 用于吸附过程。 金属硫蛋白主要参与三类生物过程：气态调节媒介、细胞凋亡过程和z n 、c d 、 c u 等重金属的结合、交换。在其他一些生物过程中也有金属硫蛋白的参与，如：参 与重金属解毒钝化过程；微量元素存储、生物体代谢和物质转运；细胞内自由基的 清除；抗电离辐射作用并对机体生长与发育、生殖、衰老、免疫、应激作用乃至肿 瘤发生等( 茹炳根等，1 9 9 1 ) 。随着对金属硫蛋白研究的深入，它的结构与功能之间 的关系、结合金属类别和基因的表达过程与表达调控机制逐渐被揭示。金属硫蛋白 的研究已成为分子生物学、生物化学、环境保护、医学等领域的热门研究对象。 基于金属硫蛋白的重金属结合能力，人们已经构建出很多工程菌，它们都表达 该类蛋白进行重金属的生物吸附。为了提高m t 的金属吸附能力和解决它在细胞质 内表达产生的毒害作用等一些问题，现在普遍将m t 与周质空间或外膜组分融合后 在相关宿主菌中表达，或者将m t 的表达与金属膜转运蛋白的表达相结合( j a c o b s 。 19 8 9 ；r o m e y e r ，e ta 1 ，19 9 0 ；s o u s a , k o t r b ae ta 1 ，19 9 8 ；v r a l l se ta 1 ，2 0 0 0 ；v a i l se ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。这种表面展示技术方法突破细菌膜壁阻隔，为解决环境中重金属污染问题提 供了一个有效的技术手段。 8 镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用 1 1 2 人工合成金属结合肽 金属结合肽是指人工合成的多聚组氨酸、多聚半胱氨酸，具有金属结合能力的 短肽，这种物质具有合成工艺简单，分子量小，能吸附各类重金属等优点，但其对 重金属的吸附往往缺乏一定专一性。王莉等利用苏云金芽孢杆菌s 层表面展示多聚组 氨酸，显示吸附能力随多聚体数依次增加，5 聚组氨酸具有最高的吸附能力( 王莉， 孙明，喻子牛2 0 0 3 ) 。s o u s a 等将6 聚组氨酸通 r 血a m b 表达于ec o l i 表面，重组菌的 重金属吸附能力提高1 0 倍( s o u s a e t a l ，1 9 9 8 ) 。n o r b e r t o 和c r u z 等通过外膜蛋i 刍o m p c 在ec o l i 表面分别展示6 聚组氨酸和1 2 聚组氨酸，发现两种短肽对重金属吸附能力比 对应野生型高，且前者提高倍数高于后者( n o r b e r t oa n dc r u z ，2 0 0 0 ) 。s a m u e l s o n 等 在葡萄球菌表面表达多聚组氨酸肽，重组菌对镉离子、镍离子的吸附能力最高达到 野生菌株3 倍多( s a m u e l s o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 1 3 植物螯合素 植物螯合素( p h y t o c h e l a t i n s ，简称p c s ) 是天然存在于植物和真菌中的一类金属 结合肽，它具有比金属硫蛋白更强的金属结合能力。富含( g l u 2 c y s ) 2 g l y 保守氨基酸 结构，实验证明人工合成该结构物质与天然植物螯合素具有相似的结合能力。b a e 等( 2 0 0 2 ) 将合成的p c s 展示于摩拉氏杆菌( m o r a x e l l as p ) 细胞表面，重组菌对汞 离子的吸附能力比野生菌提高1 0 倍。b a e 等( 2 0 0 2 ) 还将e c 8 ，e c l l ，e c 2 0 分别展 示于ec o l i 表面，测定到含有e c 8 和e c 2 0 的两种重组菌对重金属的吸附量达1 8 和6 0 n m o l l m g 。1 ( 以干重计) 。s r i p r a n g 等( 2 0 0 3 ) 将源于拟南芥的p c s 在华癸中生根瘤 菌( m e s o r h i z o b i u mh u a k u i i ) 中进行表达，重组菌对c d 2 + 的结合能力提高9 1 9 倍，并 在于紫云英盆栽实验中初步检测其应用能力。w u 等( 2 0 0 6 ) 在恶臭假单胞菌通过i n p 表面展示m b p e c 2 0 ，并定殖于水培向日葵根际，与空白对照相比，镉吸附量提高 了4 0 左右。 1 1 4 金属吸附专一性改造 为了解决金属结合蛋白对重金属的结合缺乏专一性问题。研究人员对靶蛋白进 行了多方面的改造，如杨志伟和邝宝( 1 9 9 5 ) 利用p s 3 0 0 型图像显示仪及h y d r a 程序 9 华中农业大学硕士论文雷磊中国武汉2 0 0 9 年6 月 对m t 分子进行改造，获得专一吸附m t 突变体。路延笃等( 2 0 0 8 ) 在大肠杆菌中表 达金属硫蛋白0 【结构域多聚体提高对镉金属吸附专一性。m e j a r e 等( 1 9 9 8 ) 将通过噬 菌体随机6 肽库筛选技术得到的1 个6 肽序列，改序列与外膜蛋白o m p a 融合表达后展 示于大肠杆菌表面，重组工程菌对c d 2 + 的结合能力和耐受性均增强。y u 等( 2 0 0 2 ) 利用定点突变技术将金属硫蛋白的第3 3 位的半胱氨酸突变为蛋氨酸以研究金属硫蛋 白保守结构域功能，他们发现肽链第4 位的天冬氨酸突变为半胱氨酸的突变体对c d 2 + 吸附能力提高。s c h e m b r i 等( 1 9 9 9 ) 将随机肽库构建于大肠杆菌的表面菌毛蛋白f i m h 粘附素上，筛选出对z n 、c o 、m n 、c r 和p b 有较高专一结合性的多肽序列。w e m e r u s 等( 2 0 01 ) 用组合蛋白质工程手段将源于木霉属( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 纤维素酶c e l a 的纤维素结合域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n s ，c b d ) 中3 5 个氨基酸中的1 1 个氨基酸位 置随机排列，构建出c b d 库，库容量高达4 6 订吣，通过噬菌体展示技术筛选获得了8 个对n i 有特异吸附能力的c b d ，将这8 个c b d 蛋白与载体蛋白葡萄球菌蛋白a ( s p a ) 基因融合后，表达展示在肉葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sc a r n o s u s ) ，工程菌对n i 的结合 能力得到了不同程度的提高。 1 2 细胞表面展示工程菌 1 2 1 微生物细胞表面展示技术简介 微生物表面展示技术是利用基因重组方法把靶蛋白( 即外源肽段或蛋白质结构 域) 基因序列与特定的载体蛋白基因序列融合后导入微生物宿主细胞，从而融合表 达后使靶蛋白定位于微生物细胞表面。被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的 空间结构和生物活性。靶蛋白序列与载体蛋白序列的融合方式主要有n 端融合、c 端融合和三夹板融合。 自s m i t h 于1 9 8 5 年首次在( ( s c i e n c e ) ) 杂志上发表文章提出噬菌体展示技术以来， 微生物展示技术日趋发展成熟，应用范围越来越广泛，从噬菌体展示系统扩展到细 菌、杆状病毒和酵母菌等多种微生物。 1 2 2 运载蛋白 理想的表面展示运载蛋白受四个因素影响( l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) ：( 1 ) 有能够使得 1 0 镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用 蛋白前体穿过细胞内膜的信号肽或转运信号，即含有穿膜信号肽序列；( 2 ) 含有能 将融合蛋白固定于细胞表面的细胞膜锚定模体结构；( 3 ) 与乘客蛋白构成融合蛋白 后，运载蛋白本身性质要维持稳定且其表面定位特性不变；( 4 ) 能够耐受细胞周质 空间和外界环境中的酶作用，相关蛋白不被分解。目前报道证实具有上述特性的运 载蛋白，按其结构部位与功能分类，分为细胞膜孔道蛋白、细胞壁相关蛋白、s 层 蛋白、细胞表面附属物蛋白和其他类型蛋白等。下面主要介绍下本研究所用的冰晶 核蛋白( i n p ) 。 冰晶核蛋白( i n p ) 是存在于丁香假单胞菌( p s e u d o m o n a ss y r i n g a e ) 等细菌中 的一种可诱发生物冰核形成的分泌蛋白，作为一种优良运载蛋白被广泛应用在表面 展示系统中( l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。该蛋白序列主要分为n 端结构，c 端结构和中间的 重复区。与其它运载蛋白相比，i n p 可以携带较大分子量的靶蛋白( l ie t a l ，2 0 0 4 ) 。 作为运载蛋白，它可以保证外源蛋白可以在宿主中生长稳定期稳定表达，其表达的 融合蛋白9 0 锚定在细胞表面( s t a t h o p o u l o se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。i n p 中部存在的重复区域， 可以通过人为控制长短来调节展示靶蛋白的空间位阻。此外，i n p 分子结构本身具 有分泌、引导定位和锚定三种功能，表达的融合蛋白可以自行锚定在细胞表面，不 需要辅助蛋白的帮助。 目前文献报道，具有表达冰核活性的细菌有3 个属内十多个种( 如表1 1 ) ，主 要有假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、欧文氏菌属( e r w i n i a ) 和黄单胞菌属 ( x a n t h o m o n a s ) 。目前，己报道在黄单胞菌( x a n t h o m o n a s ) 中克隆到5 个i n p 基因 ( 表1 1 ) 。本研究所用的表面展示i n p 来自于黄单胞菌( x a n t h o m o n a s ) 。 华中农业大学硕士论文雷磊中国武汉2 0 0 9 年6 月 表1 - 1 已知序列的黄单胞菌属冰核活性蛋白基因 t a b l e1 - 1i c en u c l e a t i o np r o t e i ng e n e sw h i c hw e r es e q u e n c e d 来源g e n b a n k 登陆号 野油菜黄单胞菌b1 0 0 野油菜黄单胞菌8 0 0 4 野油菜黄单胞菌a t c c 3 3 9 1 3 野油菜黄单胞菌a c c c 黄单胞菌xt r a n s l u c e n s n c0 1 0 6 8 8 n c0 0 7 0 8 6 n c0 0 3 9 0 2 f j 7 9 7 3 9 9 x 5 2 9 7 0 1 2 3 靶蛋白 表面展示的靶蛋白选择取决于应用目的。不同的靶蛋白与相同的运载蛋白融合 后可能导致在同一宿主菌内有不同的定位。如何选择理想的靶蛋白是构建高效工程 菌的一个必需条件，在重金属污染治理应用中，靶蛋白通常指一类具有重金属吸附 能力的天然蛋白或人工合成短肽，在微生物体内通过一定系统表达或展示在微生物 特定位置，提高微生物对重金属的吸附能力。常用于重金属治理的靶蛋白有金属结 合短肽、植物螯合素、金属硫蛋白等。本研究所用的靶蛋白来自于后金属硫蛋白衍 生物。 1 2 4 出发菌株选择 构建高效的工程菌，首先应该具备的条件就是一个理想的出发菌株，该菌是将 被选择用于构建环境污染修复工程菌的出发菌株。因此出发菌株的遗传背景是影响 展示系统性能的关键因素，出发菌株应对异源蛋白具有很好的兼容性和较低的蛋白 酶降解活性，同时应具有容易培养或某种有利于表面展示的特性。一般为了便于操 作，要求宿主菌的遗传背景明晰，且具有一定的重金属吸附能力和抗性。来自于革 兰氏阳性菌( g + ) 与革兰氏阴性菌( g 。) 因其本身特点而各有优缺点。ec o l i 的遗 传背景清晰，且操作简便，可用质粒载体多，因此通常被选择作为出发菌株，但它 对重金属耐受性以及对重金属的结合能力有限，在土壤环境中竞争不过土著菌，因 此无法应用于实际修复中。于是科研人员不断尝试对具有一定重金属耐受力或重金 1 2 镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用 属抗性的土壤优势菌株进行筛选与改造，期望得到更好的出发菌株。 1 2 5 细菌表面展示系统类别 根据宿主菌种类不同，微生物表面展示体系主要可以分为g 。表面展示系统、g + 表面展示系统、噬菌体表面展示系统和酵母表面展示系统四类。 g 。细胞膜壁结构十分复杂，靶蛋白的展示须依次穿过细胞质膜、间质空间和外 膜。常用于g 细胞的运载蛋白有外膜蛋白( c h 衲i te ta 1 ，1 9 8 6 ；f r e u d le ta 1 ，1 9 8 6 ； s c h o r re ta 1 ，1 9 9 1 ) 、脂蛋白( c h a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ；f u c h se ta 1 ，1 9 9 1 ；t a y l o re ta 1 ，1 9 9 0 ) 、 附属结构蛋白( k u w 旬i m aa 1 1 da s i a ，1 9 8 8 ) 、自我转运蛋白( a u s e re ta 1 ，1 9 9 0 ； m a u r e re ta 1 ，1 9 9 7 ；v a l l se ta 1 ，2 0 0 0 ) 、s 层蛋白( b i n g l ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 等。 与传统物理化学处理方法比较，细菌表面展示的功能蛋白通过络合、离子交换、 吸收转化等机制来吸附和清除环境重金属污染，有效地突破了细胞膜壁系统的阻隔 作用，表面展示工程菌的应用将是一种非常高效、且选择性好的生物净化方法。 1 3 植物根际圈修复重金属污染 植物根系和土壤微生物两者相互作用所形成的独特圈带称为根际圈，植物的根 系在从土壤中吸收水分、矿质营养的同时，也向周围土壤分泌大量的有机物质，而 且其本身也产生一些刺激物，这些物质促进着某些微生物和土壤动物在根系周围迅 速繁殖、大量生长，使得根际圈内微生物量远远大于根际圈外，反过来，根际圈中 微生物活动，如氮代谢、发酵作用和呼吸作用，及土壤动物的活动等对植物根系也 产生重要影响，它们之间形成了如互生、共生、拮抗及寄生的关系( 陈素华等，2 0 0 2 ) 。 生长于污染土壤中的植物必先通过根际圈与土壤中污染物质接触，这些污染物质包 括不能降解的重金属等无机物和难以降解的多环芳烃类物质( p a h s ) 等有机污染物。 研究表明，根际圈通过植物根及其分泌物质和微生物、土壤动物的新陈代谢活动影 响污染物吸收、吸附、降解等一系列活动，在污染土壤植物修复中起着重要作用。 1 3 。1 植物根对重金属的吸收 植物在重金属污染的土壤环境中，根系从根际圈中吸收重金属，吸收量受如下 1 3 华中农业大学硕士论文雷磊中国武汉2 0 0 9 年6 月 因素影响：根系的生理功能、根际圈内微生物群落组成、土壤理化性质、重金属种 类及浓度、土壤环境中的氧化还原电位和p h 值等。植物对重金属的吸收有以下几种 情形：( 1 ) 完全的避害机制，这可能是当根际圈内的重金属浓度较低时，植物依靠 自身的调节功能完成自我保护，也有可能是无论根际圈内重金属浓度有多高，植物 本身就具有这种避害机理，避免吸收过多重金属，免受重金属毒害；( 2 ) 植物本身 通过适应性调节后产生重金属耐性，根系吸收根际圈内重金属，植物虽也能生长， 但根、茎、叶等营养器官及各种细胞器仍会受到重金属的毒害，导致植物生物量减 少。( 3 ) 某些植物因具遗传特性，将一些重金属元素作为营养需求，即便在根际圈 内该金属元素浓度过高时其生长也不受阻。如r e i l l y ( 1 9 6 7 ) 报道南非的一些唇形科 蒿莽草属( h a u m a n i a s t r u m ) 的某些种，只有在c u 含量大于o 1 9 k g 。1 的土壤上才能正 常生长。近年来兴起且具有广阔发展前景的污染土壤植物修复技术，其核心问题就 包含了上述三种情形( 唐世荣，1 9 9 6 ) ，尤其最后的那种植物类型是科研人员希望筛 选得到的。现在，运用超富集植物对污染土壤进行修复的技术应用仍然较少。主要 技术瓶颈在于：筛选得到的超富集植物往往只对一种重金属元素表现出较强的富集 能力，而对复合污染的几种重金属元素同时富集的能力较弱；同时还存在着植物生 物量小、生长周期长以及扎根浅等问题亟需解决。 1 3 2 根际微生物对重金属吸附的影响 细菌不仅是根际圈中种类最多、数量最大的生物，而且其在有机物分解和腐殖 质的形成过程中起着决定性作用，被认为是最活跃的生物因素，( m a r i l l e ye ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。这些微生物与根系组成一个特殊的生态系统，对重金属在根土界面的迁移 转化起了很大作用。植物与细菌有三种存在方式：如根瘤菌等，能与豆科植物共生， 此共生体系菌共生增加了植株的氮素吸收( a l a m ie ta 1 ，2 0 0 0 ) ；还有是细菌生长于 根的表面；最后一种是土壤细菌存在于根系周围。受根系的分泌活动及根表残体的 脱落影响，根际圈内细菌的生命活动十分活跃，研究表明，根际圈中微生物的数量 般为非根际圈中微生物数量的5 到4 0 倍( 王建林和曹志林，1 9 9 3 ) 。根部为菌体 提供了良好的氧化还原环境和定殖结构，根部的通气性和向地延伸性，也有促进了 土壤细菌的扩散移动。这些微生物的活动对根际土壤理化性质的改变、养分的有效 性以及重金属的固定活化等都具有十分重要的作用。 1 4 镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用 长期的研究表明，重金属对细菌毒性强弱与土壤细菌所含的蛋白质中巯基亲合 力的大小有关。重金属按毒性大小排列为h g 丝a g c u p b c d z n 。还有研究表明， 在红壤中加入c d 、z n 、p b 会导致生物量的显著下降，其生物毒性依次为c d z n p b ( k h a na n dh u a n g ，1 9 8 8 ) 。 一些微生物具有对重金属的耐受性和解毒能力，在较高浓度的重金属污染环境 中，这些微生物仍能存活和繁殖，表现出了一定的重金属耐受性。这种耐受性的获 得主要是通过胞外的沉淀和络合作用、金属离子的主动分泌、细胞内钝化以及转化 作用等方式实现的。还有某些微生物能够产生胞外聚合物，主要成分为：多聚糖、 糖蛋白、脂多糖等等，这些成分具有大量的阴离子基团，能够与重金属离子结合达 到解毒的目的。一些微生物能产生草酸、柠檬酸等物质，这些代谢产物能够与重金 属螯合，形成草酸盐、柠檬酸盐沉淀，进而减轻重金属对微生物细胞的伤害作用。 y o o n 等( 1 9 9 1 ) 对金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 的研究发现其体内具有 一种特殊的排镉系统，a t p 提供能量，镉以c d 2 + 2 h + 对输方式将细胞内c d 2 + 排到外 界环境中，达到解毒作用。近年，细菌体内金属硫蛋白的研究也引起了科研工作者 极大的兴趣，这类金属结合蛋白在蓝细菌( s y n e c h o c c c u ss p ) 、酵母以及粗糙脉孢菌 ( n e u r o p o r a c r a s s as p ) 中都有发现，并且m