（微生物与生化药学专业论文）多杀菌素产生菌菌种选育及原生质体制备.pdf

浙江大学硕士学位论文 搞要 多杀菌素( s p i n o s a d ) 是由放线菌刺糖多孢菌( s a c c h a r o p l y 5 p o r as p i n o s a ) 产生的新 型大环内酯类化合物，是一种绿色广谱杀虫剂，兼具生物农药的安全性和化学农药 的快速效果。多杀菌素具有，以获得高产菌株。以多杀菌素产生菌最s p i n o s a5 - 1 1 为出发菌株，经紫外线诱变处理后，在含不同浓度的多杀菌素梯度平板上筛选多杀 菌素抗性菌株，经摇瓶发酵筛选得到一高产变异株10 7 2 ，其产量较出发菌株增加 5 9 1 。将变株ss p i n o s al0 7 2 在3 l 发酵罐上进行发酵试验，其产量达到4 5 3 m g l 。 考察了葡萄糖及无机磷酸盐对刺糖多孢菌菌体生长及多杀菌素产量的影响。研 究结果表明：在多杀菌素发酵过程中，葡萄糖浓度的提高( 1 8 6 5 8 8 9 m ) 促进了 菌体的生长，多杀菌素效价增加；葡萄糖浓度的进一步提高( 5 8 8 7 9 6 9 l ) ，菌体 生长保持相对稳定，效价缓慢下降；葡萄糖浓度增加到11 5 3g l ，菌体生长受到明 显抑制，效价大幅下降。磷酸盐浓度的提高( 3 6 8 2 9 4 1 m m o l l ) 菌体密度和多杀菌 素效价增加，磷酸盐浓度的进一步提高( 2 9 4 1 4 4 1 2m m o l l ) ，菌体浓度缓慢增加， 多杀菌素效价降低：当磷酸盐浓度增至5 7 6 2m m o l l ，菌体密度和多杀菌素效价均 明显下降。因此，在磷酸盐浓度为2 9 4 1m m o l l ，葡萄糖浓度为5 8 8g l 条件下的 发酵过程中，多杀菌素产量最高。将出发菌株s p i n o s a l0 7 2 在5 l 发酵罐上进行发 酵试验，培养基中葡萄糖浓度为5 8 8 9 m ，磷酸盐浓度为2 9 4 lm m o l l ，多杀菌素效 价达5 0 7 m g l 。 初步确定了多杀菌素产生菌原生质体制备的条件和过程，原生质体再生率达到 1 6 1 。 关键词多杀菌素，刺糖多孢菌，推理育种，多杀菌素抗性变株，磷酸盐，葡 萄糖，原生质体制各率 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t s p i n o s a dr e p r e s e n t san e wc l a s so ff e r m e n t a t i o n d e r i v e dt e t r a c y c l i cm a c r o l i d e sw i t h u n i q u ea c t i v i t ya g a i n s tav a r i e t yo fl e p i d o p t e r o u sp e s t sa n dp o s s e s s e sv e r yf a v o r a b l e m a m m a l i a nt o x i c i t ya n de n v i r o n m e n t a lp r o f i l e s a d d i t i o n a l l y , s p i n o s a de x h i b i t sag r e a t d e a lo fs e l e c t i v i t yt o w a r d sb e n e f i c i a li n s e c t s ，e s p e c i a l l yp r e d a t o r se n a b l i n ge x t e n s i v e u t i l i t y i nd b ma n do t h e ri p mp r o g r a m s b e c a u s eo fi t sv a r i o u sb e n e f i c i a lf e a t u r e s ， s p i n o s a dl o o k sf o r w a r dt og r e a tp r a c t i c a lm e r i t sa n dt h u sb r o a dm a r k e t i n gp r o s p e c t s a f t e rss p i n o s a5 - 11w a sm u t a g e n i z e dw i t hu v t h es p i n o s a dr e s i s t a n tm u t a n t sw e r e s c r e e n e dd i r e c t l yo nt h eg r a d i e n tp l a n t sc o n t a i n i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fs p i n o s a d o v e r p r o d u c t i o no fs p i n o s a db yt h em u t a n t 最s p i n o s a 10 7 2w a so b t a i n e da n di t s f e r m e n t a t i o no u t p u tw a si n c r e a s e db y5 9 1 c o m p a r e dw i t ht h a to f t h es t a r t i n gs t r a i n t h ee f f e c t so fg l u c o s ea n di n o r g a n i cp h o s p h a t eo nm y c e l i u mg r o w t ha n ds p i n o s a d p r o d u c t i o nw i t hs a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s aw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e i n c r e a s eo fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nf r o m18 6 9 lt o5 8 8 9 lc o u l dp r o m o t et h em y c e l i u m g r o w t ha n ds p i n o s a dp r o d u c t i o n a n dw h e nt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e df r o m 5 8 8 9 lt o7 9 6 9 l ，n oo b v i o u sc h a n g ei nm y c e l i u mg r o w t hb u ts l i g h td r o pi ns p i n o s a d p r o d u c t i o nw a so b s e r v e d ，w h i l ei n c r e a s e df r o m7 9 6 9 lt o 1 15 3 9 l ，s u b s t a n t i a ld e c r e a s e i nb o t hm y c e l i u mg r o w t ha n ds p i n o s a dp r o d u c t i o no c c u r e d t h ei n c r e a s eo fp h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o nf r o m3 6 8m m o l lt o2 9 4 1 m m o l lr e n d e r e dc o r r e s p o n d i n gi n c r e a s ei n m y c e l i u mg r o w t ha n ds p i n o s a dp r o d u c t i o n w h e np h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d f r o m2 9 41 m m o l lt o4 4 1 2 m m o g l ，m y c e l i u mg r o w t hs l i g h t l yi n c r e a s e da n dd r o p p e di n s p i n o s a dp r o d u c t i o n ，w h i l ei n c r e a s e df r o m4 4 1 2 m m o l lt o5 7 6 2 m m o l l ，b o t hm y c e l i u m g r o w t ha n ds p i n o s a dp r o d u c t i o nd e c r e a s e ds h a r p l y c o n c l u s i v e l y , t h eo p t i m a li n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ea n dp h o s p h a t ei s5 8 8 9 la n d2 9 4 1 m m o l l ，r e s p e c t i v e l y t h e s p i n o s a d f e r m e n t a t i o ni nt h ep r o d u c t i o nm e d i u mc o n t a i n i n g 5 8 8 9 lg l u c o s ea n d 2 9 4 l m m o l f lp h o s p h a t ew a ss c a l e du pi n5 lf e r m e n t a t i o na n dt h es p i n o s a dp r o d u c t i o n r e a c h e d5 0 7 m g l ，w h i c hw a s2 8 h i g h e rt h a nt h a ti nt h ef l a s kf e r m e n t a t i o n t h ep r e l i m i n a r yc o n d i t i o n sf o rp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o no fl s s p i n o s aw e r es t u d i e d ， a n dt h ep r o t o p l a s tf o r m a t i o nr a t er e a c h e d16 1 k e y w o r d ss p i n o s a d ，s a e c h a r o p l y s p o r as p i n o s a ，r a t i o n a ls e l e c t i o n ，s p i n o s a d r e s i s t a n tm u t a n t ，p h o s p h a t e ，g l u c o s e ，p r o t o p l a s tf o r m a t i o nr a t e i i 浙江大学硕士学位论文 刖吾 化学杀虫剂在全球范围内，尤其在农业发展中国家的广泛使用，已导致严重的 环境污染和抗性问题。因此，新型、高效、低毒、环保的生物杀虫剂品种的开发变 得日益迫切。 从土壤中提取的一种放线菌刺糖多孢菌带来了一个进一步发展生物杀虫剂 的机遇，并为世界提供了一类崭新的产品多杀菌素。多杀菌素首先被陶氏农业 科学公司( t r a c e rn a t u r a l y t ei n s e c tc o n t r 0 1 ) 商业化，商品名叫做“菜喜”( 多杀菌素含量 为2 5 的悬浮剂) 和催杀( 多杀菌素含量为4 8 的悬浮剂) 。多杀菌素是一种绿色广谱 杀虫剂，兼具生物农药的安全性和化学合成农药的速效性。因其低毒，低残留，对 天敌安全，对哺乳动物和环境无毒害，分解快等优点而获得美国“总统绿色化学品挑 战奖”。与一般的杀虫剂相比，多杀菌素见效极快，药后当天见效，可用于防治各种 鳞翅目( 如小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾等) 的害虫幼虫，是一种优质的天然农作物保 护剂。 国内对多杀菌素的研究尚处于实验室小试阶段。本论文的研究工作本共分为五 章，各章的具体内容安排如下： 第一章文献综述将对多杀菌素的理化性质，合成机理及研究进展进行综述，提出 本沦文的研究思路和研究内容。 第二章材料和方法描述了本实验中所用的仪器，试剂及相关方法。 第三章多杀菌素高产菌种的理性筛选将通过对多杀菌素产生菌的推理选育，旨在 获得高产菌株。 第四章多杀菌素发酵培养基的优化通过研究发酵培养基中初始葡萄糖和磷酸盐 浓度对菌体生长和多杀菌素合成的作用，确定适合多杀菌素合成的最优葡萄糖和磷 酸盐浓度并在此基础上进行多杀菌素发酵由摇瓶到发酵罐的放大。 第五章多杀菌素原生质体的制备及再生条件的初步研究。 第六章总结与展望 i i i 浙江大学硕士学位论文 1 1 生物农药 1 1 1 生物农药概述 第一章文献综述 生物农药是利用微生物本身或其代谢物防治病、虫、草等的药物制剂，它包括 农用抗生素、细菌农药、真菌农药和病毒农药等，具有选择性高、易于降解、不易 积累、用量少、污染小、对人畜毒性小、环境兼容性好、病虫害不易产生抗性等特 点。生物农药是生态系统的调节者，生态系统的协调发展是保证农业可持续发展的 前提，所以发展生物农药是环境及农业可持续发展的需要。近几年来，虽然生物农 药的销售额每年仅约为3 亿美元，占整个农药市场的1 ，但却以1 0 2 0 的速度上 升，发展势头迅猛，可见生物农药已经成为全球农药产业发展的新趋势。 生物农药包括生物体农药和生物化学农药。生物体农药指用来防除病、虫、草 等有害生物的商品活体生物。生物化学农药是指从生物体中分离出的，具有一定化 学结构的，对有害生物有控制作用的生物活性物质。该物质若可人工合成，则合成 物结构必须与天然物质完全相同( 但允许所含异构体在比例上的差异) 。生物农药的 种类按开发对象和来源分类如图1 1 所示。 浙江大学硕士学位论文 r 生物农药 b i o - p e s t i c i d e 、 ll 生物体农药 o r g 孤i s mp e s t i c i d e s 动物体农药 z o i ep e s t i c i d e s 植物体农药 b o t a n i c a lp e s t i c i d e s 天敌昆虫、捕食瞒、转基因昆虫等 n a t u r a le n e m yi n s e c t sa n dm i t e s t r a n s g e n i e i ns e c t s ，e t c 转基因作物 t r a r t s g e n i cp l a n t s 真菌、细菌、病毒、线虫、微 孢子虫 微生物体农药f u n g i ，b a c t e r i a , v i r u s ，n e m a t o d e ， m i c r o b i a lp e s t i c i d e sm i c r o s p o r i d a n 植物源生物化学农药 rb o t a n i cb i o c h e m i c a l p e s t i c i d e s 生物化学农药j动物源生物化学农药 b i o c h e m i c a l z o i c b i o c h e m i c a l p e s t i c i d e sp e s t i c i d e s 微生物源生物化学农药 。m i c r o b i a b i o c h e m i c a l p e s t i c i d e s 毒素、激素、防卫素、植物源昆 虫激素、异株克生物质等 p h y t o t o x i n ，pl a n t h or m o n e = p h y t o a l e x i n ，p h y t o g e n o u s i ns e c t h o r m o r l e a l l e l o c h e m i c a le t c 昆虫信息素、昆虫激素、毒素等 p h e r o m o n e ，i n s e c th o r m o n e , a n i m a l t o x i n , c t c 抗生素、毒素类等 a n t i b i o t i c ，t o x i n ，e t c 图1 1 生物农药分类图 f i g 1 1c l a s s i f i c a t i o no fb i o p e s t i c i d e s 生物农药的出现和应用已有悠久的历史，但直至l j 2 0 世纪3 0 年代之后才有了一定 的发展。从7 0 年代起，发展非常迅速。该类农药在长期的研究和应用中所表现出的 特点可初步归纳为以下几点：专一性强、活性高、对环境安全、对非靶标生物相对 安全、开发利用途径多、作用机理不同于常规农药、种类繁多、研发的选择余地大 等口】。随着人类环保意识的增强及农业可持续发展战略的实施，生物农药作为一类 高效安全的农药，必将具有广阔的发展前景。 1 1 2 我国生物农药的发展嘲 我国微生物资源丰富，发展生物农药的条件得天独厚。近年来，我国开发的生 物农药及其它农药技术已得到国际农药界的关注。优先发展生物农药，并以生物农 药带动其它高科技农药的全面发展，将成为我国农药产业发展的方向。随着科学技 术的发展，我国已有苏云金杆菌、春雷霉素、井冈霉素、公主岭霉素等生物农药实 用化的商品。随着对生物农药研究的深入，将有更多的品种实用化，投入市场，在 农业领域中应用。目前传统生物农药已经产业化，基因工程农药进入商品化，遗传 厂j、ll 浙江大学硕士学位论文 工程作物己经接近实现。 生物农药研究领域十分广泛，种类繁多，然而我国在农药科研方面投入的资金 与国外各大农药公司相比要少得多，因此，我国的生物农药研究和开发要根据现有 基础和优势有针对地发展。近年来，国内外己陆续开发成功大批生物农药产品，投 入工业化生产。我国的生物农药产业基于：以传统改造为主，优先安排能带来效益 的项目；发挥化工优势，稍加努力就可突破的项目先安排；优先安排生物工程重大 技术关键项目等原则，确定了中长期科技发展重点项目为：( 1 ) 利用发酵工程生产农 药；( 2 ) 利用细胞融合技术来提高微生物的生产能力：( 3 ) 生物活性物质的结构改造及 仿生合成；( 4 ) 利用生物工程技术生产动植物来源农药；f 5 ) 利用酶工程改造农药及 其中间体；( 6 ) 筛选新的微生物资源。 1 2 多杀菌素的性质 多杀菌素类化合物( s p i n o s y n s ) 是9 0 年代初期开发的一类大环内酯化合物。该化 合物不仅有很高的生物活性，而且对非靶标生物的毒性很低，对人和其它哺乳动物 非常安全。多杀菌素从发现和确定生物活性到早期开发的整个过程历时1 2 年。产生 该类化合物的土壤放线菌是刺糖多孢菌( s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) ，是美国礼来 公司对大量土样进行分析后筛选出来的【4 “，其显微镜下形态见图1 2 。 图1 2 电子显微镜下，刺糖多孢菌的多刺表面( 左) 及其剖面图( 右) f i g 1 2s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p h so f s a c c h a r o p o l y s p o r a s p i n o s a 浙江大学硕士学位论文 1 2 1 多杀菌素化学结构 1 9 9 0 年，b o e c k 等人首次从多刺糖多孢菌( s a c c h a r o p o l y s p o r a 印i n o s a ) n r r l 一18 3 9 5 培养液中分离出了多杀菌素组分a ，b ，c , d ，e ，f , h ，j 和多杀菌素a 假糖苷 配基，其中最主要组分和杀虫活性最高的是多杀菌素a ( s p i n o s y na ) ，约占8 5 9 0 和多杀菌素d ( s p i n o s y nd ) 【8 ，约占1 0 1 5 。多杀菌素b ，c ，e ，f , h ，j 组分和多杀菌 素a 假糖苷配基均为次要组分。 从结构上看，这些化合物属大环内酯类，分子内包含一个独特的四核环系，并 连接着两个不同的六元糖( 见图1 3 ) 。四核环系由一个5 ，6 ，5 一顺一反一反三环系稠合 一个十二元大环内酯组成，一个a ，o 一不饱和酮和一个独立的双键嵌在四核环系中。 四核环部分在两个相反端分别由两个羟基取代，与其相连的两个六元糖其中一个是 福乐氨糖，另一个是鼠李糖。在四核环系上有很多个手性中心。在天然多杀菌素分 离提取物中，两个最高活性组分s p i n o s y na 和d 的混合物被称为s p i n o s a d ，中文通用 名为多杀菌素，它是商业化产品的主要成分。 k i r s t 等人通过光谱学( n m r ，m s ，uv ，i r ) 和x 一衍射晶体学方法确定了多杀菌 素a 的结构。多杀菌素其他组分的结构可通过光谱学方法( n m r ，m s ，u v l r ) 以及 通过与多杀菌素a 的结构加以比较后确定。从结构上说，这些化合物属于大环内酯 类，且包含一个独特的四核环系，连接着两个不同的六元糖。这个独特的结构使得 它对于目标害虫有很高的活性，而对于非目标生物( 包括许多有益的节肢类昆虫) 是低毒的，于是多杀菌素成为了一种新型的良好的杀虫工具。 盟 o c h ， o c h ， o h o c h 3 o ( ；h l ， o c h ， 盟 o c 卜b o c h ， o c 托 o h o c 卜b o h b 4 o c o c h ， o c 卜b o c o h o h & 浙江大学硕十学位论文 图1 3 多杀菌素类化合物化学结构图 f i g ，1 3c h e m i c a ls t r u c t u r eo f n a t u r a ls p i n o s y n s s p i n o s y na 和s p i n o s y nd 化学名分别是： s p i n o s y n a ：( 2 r ，3 a s ，5 a r ，5 b s ，9 s ，1 3 s ，1 4 r ，1 6 a s ，1 6 b r ) 1 3 一 ( 2 r ，5 s ，6 r ) 一5 一( 二甲氨基) 四氢6 甲基一2 h 一吡喃一2 一基 丁氧基) - 9 一乙基一2 , 3 ，3 a ，5 a ，5 b ， 6 ，7 ，9 ，1 0 ，1 1 ，1 2 ，1 3 ，1 4 ，1 5 ，1 6 a ，1 6 b - 十六氢- 1 4 一甲基一7 ，1 5 一二氧代一1 h a s 一 茚戊烯骈 3 ，2 一d 】氧杂十二环一2 一基6 一去氧- 2 ，3 ，4 一三一o - 甲基廿l - 吡喃甘 露糖苷 s p i n o s y nd ：( 2 s ，3 a r ，5 a s ，5 b s ，9 s ，1 3 s ，1 4 r ，1 6 a s ，1 6 b r ) 一1 3 一 【( 2 r ，5 s ，6 r ) 一5 一( 二甲氨基) 四氢一6 甲基一2 h 一吡喃- 2 - 基】丁氧基 _ 9 一乙基一2 , 3 ，3 a ，5 a ，5 b ， 6 ，7 ，9 ，1 0 ，1 l ，1 2 ，1 3 ，1 4 ，1 5 ，1 6 a ，1 6 b 一十六氢一1 4 一甲基- 7 ，1 5 一二氧代- 1 h a s - 茚戊烯骈 3 ，2 一d 氧杂十二环一2 基6 - 去氧一2 ，3 ，4 一三一o 一甲基一u l 一吡喃甘 露糖苷 1 2 2 多杀菌素的理化性质 多杀菌素为白色或浅灰白色的固体，带有一种类似于轻微陈腐泥土的气味。在 水溶液中它的p h 值为7 7 4 ，对金属和金属离子在2 8 天内相对稳定，制成产品的保质 期为3 年。它属于非挥发性物质，蒸气压大约在1 3 x 1 0 1 0 p a 。( 表1 1 ) 概括了多杀菌素 a 和d 的其他一些物理、化学性质。 表1 1 多杀菌素a 和多杀菌素d 的物理与化学性质 t a b1 1t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fs p i n o s a daa n dd 浙江大学硕士学位论文 1 2 3 固体形态对活性的影响0 1 尽管可结晶性和生物活性并不是直接相关，但有实验表明，当化合物的固体形 态为晶体时，其相应悬浮剂的光半衰期要比由固玻璃态体泡沫所制得的悬浮剂的光 半衰期长很多。例如对质量比为8 5 ：1 5 的多杀菌素a ； i d 的混合物，由晶体制得的悬 浮剂的光半衰期是由固体泡沫制得的悬浮剂的光半衰期的8 倍以上。因此在田间使用 由晶体所制得的悬浮剂是提高多杀菌素类化合物生物活性的又一种方法。但是，并 非所有的多杀菌素类化合物都能够结晶，某些化台物只能形成一种胶状物。某些合 成的类似物可以在真空条件下除去溶剂形成玻璃态的固体泡沫，而且很容易做成悬 浮剂配方，但其光稳定性比由晶体制得的悬浮剂配方要差很多。人们也试图通过加 入光稳定剂和其他调节剂来加强化合物的光稳定性，但并未取得显著的效果。有报 道称，使用对氨基苯甲酸对阻碍多杀菌素类化合物的光分解作用不大【1 】。因此，提 高化合物的内在光稳定性被认为是更为有效的方法 1 2 4 多杀菌素的环境归趋 多杀菌素在环境中通过多途径组合的方式进行降解，主要为光降解和微生物降 解，最终变成碳、氢、氧、氮等自然成分。在土壤中光降解的半衰期是9 1 0 天。水 中光降解的半衰期不到一天，而在叶子表面光降解的半衰期为1 6 1 6 天。无光条件 下土壤中有氧分解的半衰期是9 1 7 天。多杀菌素在p h5 - 7 时相对稳定，并且在p h9 时的半衰期至少有2 0 0 天，所以水解作用对它的降解影响不大。 6 浙江大学硕士学位论文 1 2 5 多杀菌素的生物毒性 在已知的害虫防治产品中，多杀菌素的作用机制非常新颖和独特。实验证明它 对昆虫存在快速触杀和摄食毒性，通过刺激昆虫的神经系统，导致非功能性的肌收 缩、衰竭、并伴随颤抖和麻痹。这种作用结果和烟碱性乙酞胆碱受体被激活的结果 是一致的。多杀菌素同时也作用于y 一氨基丁酸受体，这可能会进一步加强其杀虫 活性。迄今为止，尚未发现某类产品能以相同的作用方式影响昆虫的神经系统，而 且尚无有关多杀菌素交叉抗性的报道 1 2 - 1 5 。 根据中国农药毒性分级标准，多杀菌素属低毒杀虫剂。( 表1 2 ) 总结了多杀菌素 对哺乳动物、水生动物和鸟类的急性毒性数据 a n o n y m o u s ，1 9 9 6 1 。多杀菌素对哺 乳动物和鸟类相对低毒，对水生动物也只是轻微的中等毒性( 1 “。 表1 2 多杀菌素对哺乳类、鸟类和水生动物的急性毒性 t a b1 2a c m em a m m a l j a n ，a q u a t i ca n da v i a nt o x i c i t yo fs p i n o s a d 浙江大学硕士学位论文 对哺乳动物的慢性毒性测试显示了多杀菌素没有致癌、致畸、致突变和毒害神 经性，对许多益虫和有益生物有很高的安全边界( s c h o o n i v e r 和l a r s o n ，1 9 9 5 ) 。多 杀菌素对捕食性甲虫、口器昆虫、草蛉和螨类毒性较低。表1 3 表明了多杀菌素对 一些生物较低的毒性。 表1 3 多杀菌素与氯氰菊酯对一些有益生物的毒性比较 t a b1 3t o x i c i t yo fs p i n o s a da n dc y p e r m e t h r i nt os e l e c t e db e n e f i c i a lo r g a n i s m s 在防治鳞翅类昆虫上，多杀菌素与氯氰菊酯的效果是差不多的。对于综合计划 中的食肉性昆虫的防治，多杀菌素表现出很广范围里的选择性，这一点是很令人兴 奋的。用多杀菌素对蜜蜂进行点滴法实验，发现对蜜蜂的急性毒性小于1 毫克蜜蜂。 但是，一旦残留物变干，对蜜蜂的毒性就可以忽略了( m a y e ra n dl u n d e n ，1 9 9 8 ) 。 对农产品在安全预防、采收前期和返耕期去毒措施可以降低到最低限度。 浙江大学硕士学位论文 1 3 多杀菌素的生物合成 多杀菌素为新型大环内酯类化合物，由2 l 碳四元环内酯上连接两个脱氧糖( 三氧 甲基鼠李糖和福乐氨糖) 而成。多杀菌素的生物合成是采用聚酮合成途径。福乐氨糖 的两个n 一甲基基团和三氧甲基鼠李糖的三个o 一甲基基团都来自s 一腺苷甲硫氨酸。 多杀菌素的聚酮部分不同于常见的i 型聚酮( 如红霉素、雷帕霉素、泰乐菌素) ，其聚 酮内还含有3 个环内分子间的c c 键 1 8 - 1 9 】。 1 3 1 多杀菌素生物合成途径 多杀菌素为大环内酷类抗生素，这类抗生素种类很多，如红霉素、阿维菌素、 梅岭霉素、米拜菌素、纳麻霉素等，其结构i - 均属聚酮类物质，这类聚酮结构的生 物合成过程也呈现相似的规律口。之2 1 。多杀菌素的聚酮是在起始单位丙酸上按 a - a p a a a - a - a a - a ( a 乙酰，p 丙酰) 的顺序添加1 0 个酰基缩合而成的，这1 0 个 延伸单位的缩合及其还原修饰过程分别由装配成l o 个模件的一+ 系列酶所催化 2 3 - 2 6 。 聚酮链延伸完成后，在模件1 0 中硫酯酶的催化下环化，接着在s p n f ，sp n j ，s p n l 年n s p n m 基因所编码酶的催化下，在大环内酯核分子内c 3 c 1 4 ，c 4 c 1 2 及c 7 c l l 之问形成交 联桥。图1 4 展示了多杀菌素组分a 的生物合成途径： 1 3 1 1 三甲氧基鼠李糖的生物合成与连接 鼠李糖接到糖苷配基上是糖苷配基转换为多杀菌素必需的第一步，3 个甲基是鼠 李糖接好后再加上去的，并且连接顺序为2 一，3 - 和4 一o h 基。这3 个甲基均来源于s 腺苷甲硫氨酸，而鼠李糖则是由1 一磷酸一葡萄糖经n d p 4 酮6 脱氧一d 一葡萄糖合成的 2 5 - 2 6 。 1 3 1 2 福乐氨糖的生物合成 福乐氨糖由n d p - 4 - 酮一6 一脱氧一d 一葡萄糖( 上述合成三甲基鼠李糖的共同中问物1 经一系列酶( e hs p n n ，s p n o ，s p n q ，s p n r ，s p n r 基因编码) 催化生成n d p 一福乐氨糖，再由 福乐氨糖转移酶催化将n d p 一福乐氨糖连接到糖苷配基上合成多杀菌素【2 6 】 浙江大学硕士学位论文 l ! 叫 图1 4 多杀菌素组分a 的生物合成途径 f i g1 4p r o p o s e db i o s y n t h e t i cp a t h w a yt os p i n o s y na 1 3 2 多杀菌素生物合成途径中有关酶和其基因族 多杀菌素生物合成共涉及到2 3 个基因【2 4 - 2 5 ，其中5 个聚酮合成酶基因( p k s ) 合 成大环内酯结构，4 个基因将大环内酯修饰成糖菅配基，5 个基因合成和添加鼠李糖， 3 4 基因使鼠李糖甲基化，6 个基因合成和添加福乐氨糖。这些基因大部分组织成簇， 排列在长约8 0 k b 的基因组中，但也有个别基因( n d p 鼠李糖合成基因) 例外不在这 一基因簇中。多杀菌素生物合成基因簇的组织图谱见图1 ，5 ，其中各基因的功能见表 l4 。 浙江大学硕士学位论文 01 02 0 3 0 4 05 06 07 0 8 0 k b l 1 6sqomk1g a c ；二：二乞二t ，一 e 图1 5 杀菌素生物合成基因簇的组织图谱 f i g 1 5o r g a n i z a t i o no f t h es p i n o s y nb i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r ( 图中各字母所代表的基因见表1 4 ) 表1 4 多杀菌素生物合成基因簇中各基因的功能 t a b1 4t h ef u n c t i o no f e a c hg e n ei nb i o s y n t h e s i sg e n ec l u s t e r 基因大小( 氨基酸)推定功能 s p n a 2 5 9 6p k s s p n b 2 1 5 3p k s s p n c 3 1 7 l p k s s p n d 4 9 2 9p k s s p n e 5 5 8 9p k s s p n f 2 7 6 聚酮交链形成 s p n g 3 9 1 鼠李糖转移酶 s p n h 2 5 1 鼠李糖：o 一甲基转移酶 s p n i 3 9 6 鼠李糖：o 甲基转移酶 s p n j 5 4 0 聚酮交链形成 s p n k 3 9 6 鼠李糖：o 一甲基转移酶 s p n l 2 8 4 聚酮交链形成 s p n m 3 2 l 聚酮交链形成 s p n n 3 3 3 福乐氨糖：3 酮基还原酶 s p n o 4 8 7 福乐氨糖：2 ，3 脱氢酶 s p n p 4 5 6 福乐氨糖转移酶 s p n q 4 6 3 福乐氨糖；3 , 4 一脱氢酶 浙江大学硕士学位论文 s p n r 3 8 6 福乐氨糖转移酶 s p n s 2 5 0 福乐氨糖；二甲基转移酶 o r f r 1 1 9 9 未知 0 r f r 22 8 2 外切脱氧核糖核酸酶 o r f l 1 52 5 6 推定的氧化还原酶 0 r f l 1 62 8 2 推定的l y s r 调节因子 1 3 3 多杀菌素生产菌的遗传控制与改造 1 3 3 1 提高多杀菌素的产量 多杀菌素的生产需大量发酵培养刺糖多孢菌爿能生产出少量的多杀菌素产品， 如能提高刺糖多孢菌合成多杀菌素的能力，将会大大地提高产量，降低生产成本。 将刺糖多孢菌中编码多杀菌素合成限速步骤的有关基因克隆到其基因组中，增加限 速步骤基因的拷贝数，可能会增加多杀菌素的产量口。 将带多杀菌素生物合成基因簇的粘粒9 a 6 导入刺糖多孢菌n r r l l8 5 3 8 菌株，获 得被质粒9 a 6 转化的6 个独立分离菌株，这些分离菌株经发酵后其多杀菌素a 和d 的 产量均较亲本株高，发酵3 天后产量增加3 5 m g l ，5 天后增加3 7 m g l 【2 3 3 n ，鼠李糖生 物合成的4 个基n ( g t t ，g d h ，e p i 和k r e ) 并升；包含在多杀菌素合成基因簇中，而且作为细 胞壁组分的鼠李搪和作为多杀菌素组件的鼠李糖共享一套鼠李糖合成基因。鼠李糖 合成中的前2 个基因也是福乐氨糖合成所必需的，这些基因产物的供应可能制约多杀 菌素的产量口“。将涉及到鼠李糖合成的基因g t t ，g d h 和k r e 导入刺糖多孢菌 n r r l l 8 5 3 8 菌株，用带g t t ( 或e p i 或鲥h ) 和k r e 基因的质粒分别转化得到的菌株其多杀 菌素的产量并没有提高；而用同时带有g t t ，g d h 和k r e 基因的质粒转化得到的分离物， 多杀菌素a 和d 的产量得到了明显的提高，这可能是由于增加了g t t 和g d h 基因产物的 量从而克服了n d p 一4 一酮一6 一脱氧一葡萄糖的供应限制。n d p 一4 酮一6 一脱氧一d 一葡萄糖供应 量的大量增加导致鼠李糖和福乐氨糖合成的增加，使更多的糖苷配基能转化为多杀 菌素a _ 年d d 2 3 , 2 7 1 。 1 3 3 2 合成多杀菌素的新衍生物 浙江火学硕士学位论文 将某个基因片段克隆重组到刺糖多孢菌的基因组中，中断多杀菌素生物合成途 径中的某个步骤，可导致某些前体产物或支路产物的积累，这些产物有可能成为害 虫防治的新产品，也可作为进一步化学修饰的底物，从而研制出新的大环内酯类杀 虫剂。用于此目的的克隆片段一般为某基因缺失3 端和5 。末端碱基的中间片段，两 个末端碱基缺失分别至少在1 0 0 个以上，片段长度至少3 0 0 b p 以上，最好在6 0 0 b p 以上 2 2 , 2 8 , 2 9 1 。 将编码福乐氨糖转移酶基n ( s p n p ) 的部分片段导入刺糖多孢菌中，被转化的分 离菌株经培养后会积累未连接福乐氨糖的拟多杀菌素前体，而不产生多杀菌素a * d d ，拟多杀菌素可进一步用作化学修饰的底物而研制出新结构化合物 2 9 , 3 0 1 。 新衍生物也可通过基因突变的方法产生，例如：( 1 ) 删除或失活k r ，d h 或e r 结构 域，合成酯羟基或酮基的衍生物，这些结构在原多杀菌素内酯核上是没有的；2 ) 替 换a t 结构域，使其它羧基掺入到内酯核中”1 1 ；( 3 ) 将某个k r ，d h 或e r 结构域添加到 p k s 模件中，合成内酯核上带饱和键、羟基或双键的新衍生物；( 4 ) 增加或减少原p k s 中的延伸模件数，合成碳链长度不同的大环内酯衍生物。 随着对多杀菌素生物合成途径及其控制基因的了解，我们可以在某个基因中引 入突变来改善刺糖多孢菌合成多杀菌素的能力，或定向合成出某些新衍生物，作为 创制新杀虫剂的前体。虽然目前对多杀菌素合成的途径已大致明确，但这方面的研 究还不如阿维菌素、红霉素等抗生素进行得深入，如对多杀菌素合成途径中的某些 基因功能还未完全明确，整个合成途径的调控也还未知，对多杀菌素的结构改造研 究也只是刚刚开始，并且这些应用研究的成果均己申请了专利保护。 1 4 多杀菌素的化学修饰及其对杀虫活性的影响 对天然产物进行分子结构上的化学修饰，是对其进行改进的重要方向，有助于 开发出具有更高活性的新的化合物。1 9 9 3 年e v a n s 等人报道了多杀菌素类化合物 ( + ) a 8 3 5 4 3 a 的全合成方法。( + ) 一a 8 3 5 4 3 a 与现在确认的多杀菌素类化合物的结构并 不完全相同，存在一定的差别 3 2 i 。到目前为止，已有4 0 0 多种合成的或天然的多杀 菌素类似物得到鉴定。对多杀菌素类似物的杀虫活性评估可以通过给烟青虫( t b w ) 浙江大学硕士学位论文 幼虫服用大剂量药液来测定。 在目前的研究中，对多杀菌素的结构改造主要是对两个糖基的修饰。已有研究 表明对鼠李糖环上取代基的改造，使分子的生物活性有很大提高。当微量的多杀菌 素h 、j 和k 被发现和分离以后，一个更为可行的改造多杀菌素的方法出现了。即改 造糖基上醚的部分，第一个类似物是多杀菌素j 的一个衍生物，在鼠李糖基的3 位由 天然的甲基醚转变为乙基醚，仅多加了一个亚甲基，其活性就提高了1 0 倍。此外， 对另一个六元糖一福乐氨糖上的取代基进行改造，以及对四核环系上的取代基进行 改造，也将是下一步研究的热点，以期能够合成出新的类似物，在生物活性和杀虫 谱上能有更大的提高。 一种化合物控制特定害虫的能力由它内在活性和害虫暴露在该物质中的程度来 决定。研究发现对多杀菌素类化合物鼠李糖基的3 位取代基进行修改后，类似物对 鳞翅目的活性有很大的提高，但生物测定从温室条件转移到田间条件下其活性都有 一定的下降。其主要原因不是化合物的内在活性不够高，而是由其熔点、熔解热等 物理因素所决定的光分解速率过快造成的。在结构上，多杀菌素是一个相对非极性 的分子( 1 0 驴4 0 ，p h 7 ) ，水溶性低( 2 3 5 m l ，p h7 ) ，这使得多杀菌素在被喷施的作物 上不能很好的吸收和传导。因此拓宽杀虫谱的努力主要集中在提高其内在活性和在 作物表面的光分解稳定性上。所以，提高类似物的熔点、熔解热，延长该类化合物 的光半衰期，以及在田问使用由晶体制得的悬浮剂配方是提高多杀菌素类化合物杀 虫活性的一个重要的努力方向。 1 5 多杀菌素的发酵生产 1 5 1 菌种特性 刺糖多孢菌( s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) 属多孢菌属，是一种好氧型革兰氏阳 性的非抗酸性放线菌。它在大多数培养基( 女h i s p 2 ，a t c c l 7 2 、苹果酸钙等) | 二都能生 长良好，形成气生菌丝体。气生菌丝为粉黄色，营养菌丝为黄色至黄褐色，产浅粉 黄色抱子，在某些培养基上则生成白色孢子。气生菌丝分隔成以镰刀状和块状排列 的孢子链，具有独特的珠状外观，孢子链中有许多空格。孢予链外观为珠状，有孢 浙江大学硕士学位论文 子壳，表面为针状。刺糖多孢菌的生长温度为1 5 一3 7 。c ，对溶菌酶敏感，在高渗条 件下f l l 氯化钠) 条件下能够生长。 多杀菌素h 、j 年i i k 被发现和分离以后，一个更为可行的改造多杀菌素的方法出 现了。即改造糖基上醚的部分，第一个类似物是多杀菌素j 的一个衍生物，在鼠李糖 基的3 位由天然的甲基醚转变为乙基醚，仅多加了一个亚甲基，其活性就提高了1 0 倍。此外，对另一个六元糖一福乐氨糖上的取代基进行改造，以及对四核环系上的取 代基进行改造，也将是下一步研究的热点，以期能够合成出新的类似物，在生物活 性和杀虫谱上能有更大的提高。 一种化合物控制特定害虫的能力由它内在活性和害虫暴露在该物质中的程度来 决定。研究发现对多杀菌素类化合物鼠李糖基的3 位取代基进行修改后，类似物对 鳞翅目的活性有很大的提高，但生物测定从温室条件转移到田间条件下其活性都有 一定的下降。其主要原因不是化合物的内在活性不够高，而是由其熔