（生物化学与分子生物学专业论文）fxr对apom表达的影响及其机制的初步探讨.pdf

致 射5 5参考文献5 6文献综述载脂蛋白m 的研究进展6 l参考文献6 6攻读硕士学位期间发表的论文6 8附录：常用试剂的配制6 9第三军医大学硕士学位论文英文缩写a p o ma sp - g a lb s e pc ac d c ac y p 7 a ld b dc d n af x rf x r eh d lc hl b dl u cp i j pr t p c rr x rs h pl d lw ba aa m pa p sd e p cd a b英文缩写一览表英文全称a p o l i p o p r o t e i nma t h e r o s c l e r o s i sb e t a g a l a c t o s i d a s eb i l es a l te x p o r tp u m pc h o l i ca c i dc h e n o d e x y c h o l i ca c i dc h o l e s t e r o l7 a h y d r o x y l a s ed n a - b i n d i n gd o m a i nc o m p l e m e n t a r yd n af a m e s o i dxr e c e p t o rf x rr e s p o n s ee l e m e n th i g h d e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o ll i g a n d b i n d i n gd o m a i nl u c i f e r a s ep h o s p h o l i p i dt r a n s f e rp r o t e i nr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nr e t i n o i dxr e c e p t o rs m a l lh e t e r o d i m e rp a r t n e rl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n阮s t e mb l o ta c r y l a m i d ea m p i c i l l i na m m o n i u mp e r s u l f a t ed i e t h y lp y r o c a r b o n a t ed i a m i n o b e n z i d i n e中文全称载脂蛋白m动脉粥样硬化p 一半乳糖苷酶胆盐输出泵胆酸鹅脱氧胆酸胆固醇7 0 【羟化酶d n a 结合域互补d n a法尼酯x 受体f x r 反应元件高密度脂蛋白胆固醇配体结合域荧光素酶磷脂转运蛋白逆转录聚合酶链反应视黄醛x 受体小异二聚体伴侣分子低密度脂蛋白免疫印迹实验丙烯酰胺氨苄青霉素过硫酸铵二乙基焦磷酰胺二氨基联苯胺第二军医大学硕+ 学位论文d m s os d sp a g et w e e n 2 0t r i st e m e dt gt cd i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e十二烷基硫酸钠p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳p o l y o x y e t h y l e n e - 2 0 一s o r b i t a nm o n o l a u t a t e吐温2 0t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e四甲基乙二胺t r i g l y c e r i d e甘油三酯f o t a lc h o l e s t e r o l总胆固醇2t os o l v et h ep r o b l e m ，w ew i l lf u r t h e rc l a r i f yt h er o l eo ff x ra n da p o mi nt h eo c c u 盯e n c ea n dd e v e l o p m e n to fa s ，t a r g e tt op r e v e n ta n dc u r et h e nf i n a l l yp r o v i d ean e ws c i e n t i f i ce v i d e n c ef o rf i n d i n gan e wt h e a s 3第二军医人学硕十学位论文o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t ef x re f f e c t st oa p o me x p r e s s i o n ，a n dt h ep o s s i b l em e c h a n i s mo ff x r m e t h o d o l o g y ：( 1 ) s e l e c th e p a t o m ac e l lh e p g 2a n df e t a ll i v e rc e l ll 0 2a st h ec e l lm o d e l t e s t1t r e a t e dt h ec e l lm o d e lb yc d c af o r2 4 h ，t h e nd e t e c tt h ec h a n g e so fa p o me x p r e s s i o nb yu s i n gr t - p c r ；t e s t2 ，t r e a t e db yc d c af o r12 h ，t h e nt r e a t e db yi n h i b i t o rg u g g u l s t e r o n e sf o r2 4 h ，d e t e c tt h ec h a n g e so fa p o me x p r e s s i o nb yu s i n gr t - p c r ( 2 ) s e l e c th e p a t o m ac e l lh e p g 2a sc e l lm o d e l ，d e t e c tt h ed i f f e r e n c e so fa p o me x p r e s s i o nb yu s i n gw e s t e r nb l o t ( 3 ) s e l e c tc 5 7 b l 6m i c ea sa n i m a lm o d e l ，f e e dt h e mw i t hc d c a ，a n dd e t e c tt h ec h a n g e so fa p o me x p r e s s i o nb yr t - p c r ，a n dt h e nd e t e c tt h ed i f f e r e n c e so fp r o t e i nb yw e s t e r nb l o tm e t h o d ( 4 ) t h r o u g hb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，o n l i n ep r o j e c t e da p o mg e n e5 f l a n k i n gp r o m o t e rr e g i o n 一18 6 3 b pd e p a r t m e n tm a ye x i s tf x rb i n d i n gs i t e s ( d r 2 ) ；h e p g 2c e l l se x t r a c t e dg e n o m i cd n a ，u s i n gp c ra m p l i f i c a t i o no fr e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r ea p o mr e p o r tp g l 3 一b a s i c a p o m ( 一19 0 0 一+ 16 5 ) w i t hd r 2s e q u e n c ep g l 3 - b a s i c a p o m ( 一18 0 0 + 16 5 )n o n d r 2s e q u e n c e u s eo fl i p o s o m e s ，w i t ht h ef x ra n dr x rp l a s m i dw e r et r a n s f e c t e di n t oh e p g 2c e l l si nt r a n s i e n t ，b yl u c i f e r a s er e p o r t e rg e n ea s s a yt oo b s e r v et h ef x rg e n ee x p r e s s i o no nt h ea c t i v i t yo fa p o m c o n c l u s i o n r e s u l t s ：( 1 ) f x ra g o n i s t ( c d c a ) t r e a t m e n to fh u m a nh e p g 2h e p a t o m ac e l l sa n df e t a ll i v e rc e l l sl 0 2 ，w ef o u n dt h a tf x rl i g a n d sw a sd o s e d e p e n d e n tr e d u c t i o ni na p o me x p r e s s i o n ；( 2 ) i nf x ri n h i b i t o r ( g u g g u l s t e r o n e s ) t r e a t e dh e p g 2h u m a nh e p a t o m ac e l l sa n df e t a ll i v e rc e l l sl 0 2 ，w ef o u n dt h a tf x rl i g a n d sw a sd o s e d e p e n d e n ti n c r e a s e sa p o me x p r e s s i o n( 3 ) c 5 7 b l 6m i c ew e r ef e df o o dc o n t a i n i n gc d c a ，f x ra c t i v a t i o ni nv i v or e d u c e dt h ee x p r e s s i o no fm o u s ea p o m ( 4 ) i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys h o w e dt h a tm i c e ：w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fc d c a ，m o u s el i v e ra n dk i d n e ya p o me x p r e s s i o ni nad o s e d e p e n d e n td e c r e a s e ( 5 ) d e t e r m i n a t i o no fl i p i d si nm i c er e s u l t s ：h d la n dt cc o n c e n t r a t i o n sd e c r e a s e dw i t hc d c a l d lc o n c e n t r a t i o na n di n c r e a s e dw i t ht h ec d c a t h i si sc o n s i s t e n tw i t ht h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s t gc o n c e n t r a t i o n sw i t hc d c af i r s ti n c r e a s i n ga n dt h e nd e c r e a s i n g 4第三军医人学硕士学位论文( 6 ) a c c o r d i n gt ob i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so fh u m a na p o mg e n et r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t eu p s t r e a m3 0 0 0 b pr e g i o n ，t h e r ei so b t a i n e di n - 18 6 3 b pd e p a r t m e n tm a yf x rb i n d i n gs i t e s( d r 2 ) b yc o t r a n s f e c t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a t ：f x rc a nr e d u c et h eh u m a na p o m ( 一1 9 0 0 + 16 5 ) p r o m o t e rf r a g m e n tc o n t a i n i n gt h ed r 2s e q u e n c eo ft r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y , a n dt h er e d u c t i o nf r o m4 0 o ft h ec o n t r 0 1 a n df x rs e q u e n c e sd on o tc o n t a i nd r 2p e o p l ea p o m( 一18 0 0 + 16 5 ) p r o m o t e rf r a g m e n th a dn oe f f e c to na c t i v i t y c o n c l u s i o n ：( 1 ) w i t ht h ef x ra g o n i s t ( c d c a ) t r e a t m e n tc e l l s ，d i s c o v e rf x rl i g a n d sw a sd o s e d e p e n d e n tr e d u c t i o ni nt h ee x p r e s s i o no fa p o m ；( 2 ) w i t hf x ri n h i b i t o r ( g u g g u l s t e r o n e s ) t r e a t e dc e l l sa n df o u n dt h a tf x rl i g a n d sw a sd o s ed e p e n d e n ti n c r e a s e st h ee x p r e s s i o no fa p o m( 3 ) f x ra c t i v a t i o ni nv i v or e d u c e dt h ee x p r e s s i o no fm o u s ea p o m ( 4 ) r e s u l t sw e r et r a n s f e c t e db yd r a w ：f x rm a yb eh u m a na p o mg e n ep r o m o t e rt h r o u g hs p e c i f i cb i n d i n gs e q u e n c e ( d r 2 ) d o w na p o mg e n ee x p r e s s i o ns t u d yd i s c u s s e da b o v e ，a n da p o mf x ri nl i p i dm e t a b o l i s ma n dr e l a t e dd i s e a s e s ，a sp r o v i d e sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ee x p e r i m e n t a le v i d e n c ek e yw o r d s ：f a r n e s o i dxr e c e p t o r ；a p o l i p o p r o t e i nm ；c h e n o d e x y c h o l i ca c i d ；p r o m o t e r ；a t h e r o s c l e r o s i s 5第三军医大学硕士学位论文f x r 对a p o m 表达的影响及其机制的初步探讨摘要研究背景：动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 是严重威胁人类健康的心脑血管疾病。体内脂代谢紊乱与动脉粥样硬化斑块的形成密切相关。类法尼醇x 受体( f a m e s o i dxr e c e p t o r , f x r ) 是孤儿核受体( o r p h a nn u c l e a rr e c e p t o r ) 家族成员，是内源性胆汁酸( b i l ea c i d s ) 的感应：器( s e n s o r ) ，鹅脱氧胆汁酸( c h e n o d e x y c h o l i ca c i d ，c d c a ) 为其最适天然配体。f x r 通过调节诸多靶基因而调控脂类、胆固醇和葡萄糖的代谢，其在维持脂代谢平衡、胆汁酸代谢过程中发挥重要的调节作用。f x r 与a s 的发生密切相关。载脂蛋i 刍( a p o l i p o p r o t e i n m ，a p o m ) 是一种新近发现的载脂蛋白，它含有一个特征性的疏水结合盒。成熟的a p o m 保留了具有“疏水锚”作用的信号肽。研究发现a p o m 可能通过此信号肽锚着在高密度脂蛋白( h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，h d l ) 磷脂单层中，并且在h d l中含量极为丰富。研究结果表i f a p o m 可通过影响胆固醇的逆向转运过程参与h d l 的代谢过程，进而发挥重要的抗a s 的功能。由于f x r 和a p o m 均高表达于肝脏，且二者均与a s 密切相关。那么a p o m 是否受f x r 的调节? 弄清该问题，对进一步阐明二者在a s 发生发展中的作用，为防治a s 的新靶点提供新的科学依据。研究目的：探讨f x r 对a p o m 表达的影响及其调控的可能机制。研究方法：( 1 ) 选取肝癌细胞株h e p g 2 和胎肝细胞株l 0 2 为细胞模型，经f x r 激动) 菁u ( c d c a )处理细胞2 4 h 后，用r t - p c r 法检测a p o m 表达的变化；经f x r 激动) f u ( c d c a ) 处理细胞1 2 h 后，再用f x r 的抑制剂( g u g g u l s t e r o n e s ) 处理细胞2 4 h ，r t - p c r 法检测a p o m 表达的变化。( 2 ) 选取肝癌细胞株h e p g 2 为细胞模型，w e s t e r nb l o t t i n g 免疫印迹法检测a p o m 蛋白表达的差异。( 3 ) 选取c 5 7 b l 6 小鼠为动物模型，喂食c d c a 后，r t - p c r 法检测小鼠肝脏组织a p o mm r n a 表达的变化，w e s t e r nb l o t t i n g 免疫印迹法检测小鼠肝脏组织a p o m 蛋白表达的差异。同时用免疫组化法检测小鼠肝、肾组织的表达。用匀相测定法检测小鼠血脂的变化。6第三军医大学硕十学位论文( 4 ) 通过生物信息学分析，在线预测人a p o m 基因5 侧翼启动子区域a g g t c a g g a g t t c a存在f x r 可能结合位点( d r 2 ) ：提取h e p g 2 细胞基因组d n a ，p c r 法扩增人a p o m 报告基因，构建重组质粒p g l 3 b a s i c a p o m ( 一1 9 0 0 一+ 1 6 5 含d r 2 序列) 和p g l 3 - b a s i c a p o m ( 一1 8 0 0 + 1 6 5 不含d r 2 序y j j ) 。脂质体法将v p f x r 真核表达质粒瞬时共转染h e p g 2细胞，通过荧光素酶报告基因检测f x r 对a p o m 启动子活性影响。研究结果：( 1 ) 在f x r 激动齐u ( c d c a ) 处理的人肝癌细胞h e p g 2 和胎肝细胞l 0 2 中，发现f x r显著下调a p o m 的表达( p o 0 5 ) 。( 2 ) 在f x r 活化后再用抑制剂( g u g g u l s t e r o n e s ) 处理的人肝癌细胞h e p g 2 和胎肝细胞l 0 2 中，发现f x r 显著上调a p o m 的表达( p o 0 5 ) 。( 3 ) c 5 7 b l 6 小鼠喂食含c d c a 的食物，f x r 活化后在体内可下调小鼠肝脏a p o m 的表达。( 4 ) 小鼠免疫组化结果显示：随着c d c a 浓度的增加，小鼠肝脏和。肾脏a p o m 的表达下降。( 5 ) 小鼠血脂测定结果显示：h d l 和t c 随c d c a 浓度的升高而下降，l d l 随c d c a浓度升高而升高，t g 随着c d c a 浓度的升高先升高再下降。( 6 ) 根据生物信息学分析人a p o m 基因转录起始位点上游3 0 0 0 b p 区域，得出在一1 8 6 3 b p 处存在可能f x r 结合位点( d r 2 ) 。通过共转染实验结果显示：f x r 可降低人a p o m ( 一1 9 0 0 + 1 6 5 ) 含有d r 2 序列启动子片段的转录活性，且下调幅度为对照的4 0 。而f x r 对不含有d r 2 序列的人a p o m ( 1 8 0 0 + 1 6 5 ) 启动子片段活性无影响。结论：( 1 ) 用f x r 激动剂( c d c a ) 处理细胞后，发现f x r 显著下调a p o m 的表达( p 0 0 5 ) 。( 2 ) 用f x r 抑制剂( g u g g u l s t e r o n e s ) 处理细胞后，发现f x r 显著上调a p o m 的表达( p 0 0 5 ) 。( 3 ) f x r 活化后可下调小鼠体内a p o m 的表达。( 4 ) 通过共转染实验结果得出：f x r 可能通过人a p o m 基因启动子特异结合序列( d r 2 ) 下调a p o m 基因表达。以上研究为初步探讨f x r 和a p o m 在脂代谢以及a s 等相关疾病中的作用提供了重要的实验依据。关键词：法尼酯x 受体；载脂蛋白m ；鹅脱氧胆汁酸；启动子；动脉粥样硬化7第三军医大学硕十学位论文f x r 对a p o m 表达的影响及其机制的初步探讨 _ 上j -月i j吾近年来，动脉粥样硬化日渐成为危害人类健康的重大疾病。其发病原因主要有：高血脂症、高血压、糖尿病和肥胖等。其中血脂异常是a s ( 动脉粥样硬化) 发生的重要原因。最近研究发现，某些核受体超家族成员可通过对其靶基因的调控参与调节血脂代谢水平，从而在临床治疗中发挥作用。法尼酯x 受体( f a r n e s o i dxr e c e p t o r , f x r ) 作为核受体超家族的一员，在多种代谢中发挥重要作用。类法尼醇x 受体( f a m e s o i dxr e c e p t o r ，f x r ) ，在1 9 9 5 年作为一种孤儿核受体被发现【l 】，因其转录活性可被超生理浓度的法尼酯增强而命名，随后被归为n r l h 4 人f x r 基因定位于1 2 号染色体( 1 2 q 2 3 1 ) ，由1 1 个外显子和l o 个内含子组成。f x r 基因的两个启动子和隐蔽剪接位点，使其具有四种亚型f x rc tl 、f x rq2 、f x rq3 、f x rq4 ，四种亚型的表达具有组织特异性【2 。3 】。f x r 属于核受体中的孤儿受体，具有典型的核受体结构，n 端依次为配体依赖的转录激活域( a f l ) ，高度保守的d n a 结合域( d b d ) ，c 末端为配体结合域( l b d ) 和配体依赖的转录激活域( a f 2 ) 4 - 6 。当被配体激活后，f x r 构像发生改变，往往与类视黄醇x 受体( r e t i n o i dxr e c e p t o r ，r x r ) 形成异源二聚体的形式与其靶基因启动子区的f x r 反应元件( f x r e s ) 结合【_ ”。典型的f x r e s 由反向重复序列a g g t c a 组成，重复序列之间有一个核苷酸相隔，即i r 1 ( i n v e r t e dr e p e a t ss e p a r a t e db yl b p ) 哺】。也有同向重复的a g g t c a 模序组成的f x r e s ，重复序列之间有3 个或4 个核苷酸相隔，如d r 一3 ( d i r e c tr e p e a t ss e p a r a t e db y3 b p ) 、d r 4 ( d i r e c tr e p e a t ss e p a r a t e db y4 b p ) 一以1 1 。生理浓度下的多种初级和次级胆汁酸，以及一些多不饱和脂肪酸可激活f x r ，其中以鹅脱氧胆汁酸( c h e n o d e x y c h o l i ca c i d ，c d c a ) 为f x r 的天然最适配体【l2 1 。f x r 作为胆汁酸的感受器，在肝细胞中激活后，可抑制胆汁酸的合成，增加胆汁的分泌，抑制肝脏对胆汁酸的吸收，从而调节胆汁酸的代谢【13 1 。同时f x r 在脂质代谢中也具有重要的调控作用，调节胆固醇以及甘油三酯在血浆中的转运和在相应组织中的分解代谢。f x r 在肝脏、肠道、肾脏和肾上腺中高表达b 4 - 1 5 】，而在脂肪组织和心脏、卵巢、胸腺、眼、脾脏和睾丸中表达水平较低，不同异构体在不同组织的不同发育阶段其表第二军医人学硕士学位论文达水平也各不相同 1 6 - 1 7 1 。最近，z h a n g 等利用实时定量p c r 技术进一步证明，f x r 在心、肺、脂肪和胃血管内皮细胞也有低水平表达【l 引。体外研究中发现，f x r 在鼠和人的血管平滑肌细胞中有表达，并以f x r r x r 二聚体的形式调控细胞的调亡，同时也在肝细胞中以相同的方式诱导s h p 和p l t p 的表达【1 9 1 。最近有报道，f x r 在大鼠肺动脉内皮细胞中有表达，并可能通过干扰a p 1 和n f k b 作为转录因子结合内皮素一1 启动子中的相应反应元件，降低内皮素1 的转录活性【2 0 1 。f x r 在脉管系统中的表达及其对相应分子的调控，表明了f x r 作为药物靶点在心血管疾病中的治疗作用将越发突出。尤其需要指出的是，f x r 在脂代谢和血管系统对相应分子的调控，对于发生发展因素极其复杂的动脉粥样硬化病的预防和治疗具有重要意义。近年来发现f x r 在单核巨噬细胞等免疫细胞中也有表达 2 1 - 2 2 】，提示f x r 不仅在炎症相关心血管疾病中发挥调控功能，还参与了天然与适应性免疫反应的调节，进一步扩展了f x r 的调控领域。超速离心分离人血浆脂蛋白，发现a p o m 主要存在于h d l 部分，而在l d l 、极低密度脂蛋白( v l d l ) 和乳糜微粒中的量很小【2 3 】。胆固醇逆向转运是影响a s 的重要机制，h d l 的心血管保护作用主要是通过胆固醇逆向转运机制来实现的，a p o m 可通过对p r e l 3 h d l 的调节来影响胆固醇逆向转运的过程。w o l f r u m l 2 4 1 等从a p o m 基因沉默型小鼠和野生型小鼠的血浆中分别提取的h d l 和p r e l 3 h d l 来培养r a w 巨噬细胞，结果前者培养的r a w 巨噬细胞胆固醇流出较后者减少5 0 ；另外，使用含抗a p o m 抗体的h d l 培养的r a w 细胞，其胆固醇流出较不含抗体的h d l 培养组减少5 0 。有学者 2 5 - 2 6 1 发现，含有a p o m 的h d l 亚群与缺乏a p o m 的h d l 相比，前者能更有效地防止l d l 的氧化和促进胆固醇逆向转运。研究结果表明a p o m 在h d l 和p r e l 3 一h d l中的存在有助于体内胆固醇的逆向转运【27 1 。f x r 和a p o m 在体内的表达水平与脂代谢的平衡乃至a s 等相关疾病的发生密切相关，因此，对两者的研究，有助于发展针对f x r 基因表达调控的治疗策略；有助于进一步认识f x r 在脂代谢调节中的作用及与其它调节因子的相互联系，并在基因水平为脂代谢和a s 等相关疾病的防治提供新的途径。9第三军医人学硕士学位论文第一部分f x r 在细胞水平可以下调a p o m 基因的表达载脂蛋i 刍( a p o l i p o p r o t e i nm ，a p o m ) 是一种新近发现的载脂蛋白，它主要存在于高密度脂蛋白( h d l ) 中。本部分实验以胎肝细胞l 0 2 和肝癌细胞h e p g 2 为细胞模型，用f x r激动责u ( c d c a ) 和抑制剂( g u g g u l s t e r o n e s ) 分别作用细胞，检测细胞内a p o mm r n a 和蛋白表达的变化。材料与方法一、材料1 试剂1 1t r l z o l ( i n v i t r o g e n 公司)1 2d n am a r k e rd l 2 0 0 0 ( 大连t a k a r a 公司)1 3m m l v 反转录酶( i n v i t r o g e n 公司)1 4p c r 引物由上海i n v i t r o g e n 公司合成1 5r p m l l 6 4 0 无糖细胞培养液、d m e m 无糖细胞培养液、o p t t m ( 美国g i b c o 公司)1 6 新生胎牛血清( 美国g i b c o 公司)1 7c d c a 、a n d r o s t e r o n e ( s i g m a 公司)1 8d m s o ( s i g m a 公司)1 9e xt a qd n a 聚合酶( 大连t a k a r a 公司)1 10m o u s ea n t i h u m a na p o mi g g ( a b c a m )1 1 1m o u s ea n t i h u m a n1 3 - a c t i n 、g o a ta n t i - m o u s ei g g ( 北京中杉公司)1 12g o a ta n t i m o u s ei g g ( p i e r c e )1 1 3b r a d f o r d 蛋白浓度测定试费i j ( b i o r a d )1 1 4 化学发光底物( s u p e r s i g n a l w e s td u r ae x t e n d e dd u r a t i o ns u b s t r a t e ) 试剂盒( p i e r c e )1 15h o t s t a rt a q 酶( q i a g e n )1 1 6 蛋白质裂解液1 1 7 丙烯酰胺储存液丙烯酰胺2 9 2 9 ，双叉丙烯酰胺o 8 9 ，加蒸馏水溶解后，定容至1 0 0 m l ，4 c 保存。1 0第三军医大学硕十学位论文1 1 84 x 分离胶缓冲液( p h 8 8 )t r i s 碱1 8 1 5 9 加入蒸馏水至7 5 蚰，用浓h c i 调节p h 至8 8 ，最后定容至1 0 0 m l ，4 保存。1 1 94 x 浓缩胶缓冲液( p h 6 8 )t r i s 碱6 0 5 9 加入蒸馏水至7 5 m l ，用浓h c l 调节p h 至6 8 ，最后定容至1 0 0 m l ，4 。c保存。1 2 01 0 s d s称取1 0 9s d s 溶于蒸馏水中，定容至1 0 0 m l ，室温保存。1 2 ll o a p s将l g a p s 溶于蒸馏水中，定容至1 0 m l ，分装后- - 2 0 。c 冻存。1 2 2 电泳缓冲液t r i s 碱3 0 9 ，甘氨酸1 4 4 9 ，s d sl g ，充分溶解于l l 蒸馏水中。此时p h 为8 3 ，室温保存。1 2 35 x 样品缓冲液l m o l lt r i s c i ( p h 6 8 ) o 6 m l ，5 0 甘油5 m l ，1 0 s d s2 m l ，i - m e0 5 m l ，1 溴酚兰l m l 加入蒸馏水至1 0 m l ，充分混匀溶解，分装后一2 0 冻存。1 2 4t b s 缓冲液t r i s c 11 2 1 9 ，n a c i8 8 9 加入蒸馏水至3 0 0 m l ，用浓h c i 调节p h 至7 5 ，最后定容至1 0 0 0 m l 。1 2 5t b s t 缓冲液t r i s c i2 4 2 9 ，n a c l2 9 2 9 ，t w e e n 一2 0o 5 m l ，t r i t o nx 一1 0 02 m l 加入蒸馏水至3 0 0 m l ，用浓h c l 调节p h 至7 5 ，最后定容至1 0 0 0 m l 。1 2 6 封闭液o 5 9 脱脂奶粉溶于1 0 m lt b s 缓冲液中，充分溶解混匀为5 脱脂奶粉液，临用前配制。1 2 7 转移缓冲液( 5 x )“s c 12 9 9 ，甘氨酸1 4 5 9 ，s d s1 8 5 9 ，甲醇2 0 0 m l 加入蒸馏水，用浓h c l 调剂p h 为8 3 ，定容至1 l ，室温保存。1 2 8 预染m a r k e r ( 宽分子量) ，购至f e r m e n t a s 公司2 细胞株人肝癌细胞系h e p g 2 和人胎肝细胞系l 0 2 由本室保存。第二军医大学硕士学位论文3 仪器3 1p c r 仪( b i o r a d 、3 2 台式低温高速离心机( 德国h e a r e u s ，b i o f u g e l 5 r 型)3 3 琼脂糖凝胶电泳装置( 北京六一仪器厂，d y y i i l 3 1 型)3 4 凝胶成像密度分析系统及密度分析软件q u a n t i t yo n e ( b i o r a d )3 5 恒温空气浴摇床( 上海福玛实验设备有限公司，k y c l 0 0 b 型)3 6 垂直蛋白电泳槽( b i o r a d )3 7 脱色摇床( 江苏海门其林医用仪器厂t s 1 型)3 8 水平离心机( 上海安亭科学仪器厂t g l 一16 g )3 9b l 31 0 电子天平( 德国s a r t o t i u s )3 1 0q l 9 0 1 漩涡混合器( 江苏海门麒麟医用仪器厂)3 1 1 隔水式恒温培养箱( 上海福马实验设备有限公司)3 1 2 细胞培养用恒温恒湿培养箱( t h e r m o )3 1 3 超净工作台( 苏州安泰空气技术有限公司)3 1 4 手提式压力蒸汽灭菌器( 上海医疗核子仪器厂)3 1 5 紫外分光光度仪( b e c k m a n 公司，d u 一6 4 0 型)3 1 6 湿转仪( b i o r a d )3 1 7 电热恒温水浴槽( 上海博迅实业有限公司，s s w 型)3 1 8 恒温磁力搅拌器( 上海沪西分析仪器厂，9 0 1 型)3 1 9 冷冻高速离心机( b e c k m a n )3 2 0 纯水系统( m i l l i p o r e )二、方法1 细胞培养与处理l 0 2 细胞株采用含1 0 胎牛血清、6 1 m m o l l 葡萄糖、i o o u m l 青霉素、1 0 0 i t g m l链霉素的r p m l 6 4 0 培养基培养，h e p g 2 细胞株采用含1 0 胎牛血清、6 1 m m o l l 葡萄糖、i o o u m l 青霉素、1 0 0 t g m l 链霉素的d m e m 培养基培养。均置于3 7 、5 c 0 2恒温培养箱内。待细胞进入对数生长期后，进行相关实验。将l 0 2 和h e p g 2 细胞按1 0 x 1 0 5 孑l 接种于6 孔板，1 6 h 后弃培养液，分别进行以下处理：l 0 2 细胞和h e p g 2 细胞用c d c a ( 终浓度依次为0 1 - l m o l l 、2 5 1 t m o l l 、5 0 p , m o l l 、1 0 0 1 t m o l l ) 或用c d c a ( 终浓度分别为7 5 1 x m o l l ) 处理细胞1 2 h 后，再用抑制剂g u g g u l s t e r o n e s ( 浓度依次是0 、2 5 、5 0 及1 0 0 i - t m o l l ) 处理细胞2 4 h 后终止实验。阴性1 2第三军医人学硕士学位论文对照为d m s o0 1 。2 逆转录- 聚合酶链反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r t - p c r )2 1 细胞总r n a 的提取采用t r i z o l 提取细胞总r n a ，操作步骤按t r i z o l 试剂说明书进行。( 1 ) 在培养的细胞中，按照l x l 0 7 个细胞o e n 3 , l m lt r i z o l 液，反复吹打裂解细胞。( 2 ) 室温放置5 m i n ，使核蛋白充分裂解。( 3 ) 加入0 5 m l 氯仿，剧烈振荡1 5 s e c ，室温放置5 1 0 m i n 。( 4 ) 4 。c ，1 2 0 0 0r p m 离心1 5 m i n ，液体分为三层。( 5 ) 取无色水相移至另一干净e p 管中，加等量异丙醇颠倒混匀，室温放置1 0 m i n 。( 6 ) 4 c ，1 2 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，弃上清。( 7 ) 加入7 5 乙醇洗涤沉淀，使r n a 沉淀。( 8 ) 4 v ，7 5 0 0r p m 离心5 m i n ，弃上清。加入无水乙醇洗涤沉淀，利于尽快去除水分。( 9 ) 加入2 0 5 0 9 ld e p c 水溶解沉淀，紫外分光光度计测其浓度。2 2r t - p c r2 2 1 逆转录合成c d n a表1 1 o t a lr n ao l i g o ( d t ) 1 8 ( 5 0n g 9 1 )1 0 m m o ld n l l p s加h 2 0 至2 4 l a g1 9 l1 9 l1 3 7 9 l6 5 ，5m i n ，冰上放置5m i n ，再加入：5 b u f f e ro 1 m o l l d t tm m i j v4 9 l2 p l0 3 9 l3 7 ，5 2r a i n ，7 0 ，1 5 r a i n 。合成好的c d n a 分装冻存于一2 0 。2 2 2p c r人a p o m 和p - a c t i n 的引物选用p r i m e rp r e m i e r5 0 自行设计，由上海英骏公司合成。跹，p 反应条件：9 4 。c x 2 m i n 预变性；( 9 4 。c x 3 0 s ，6 0 。c x 3 0 s ，7 2 。c x l m i n ) x 2 5 个循环：7 2 1 0 i i l i n ；a p o m 和- a c t i n ：9 5 。c x 4 m i n 预变性；( 9 5 * ( 2 x 4 5 s ，5 4 c x 4 5 s ，7 2 * c x l m i n ) x 2第三军医大学硕+ 学位论文h s h pn m 0 2 1 9 6 92 3 25 ，r r g g c o c a a g a t l g 【 x 了硒a c 3 5 f c g k k x 了r m a a g a g g a t c g 3 h a p o mn m l18 3 9 319 75 - c a c a g t c a a c i b a c a a c t c t g g - 3 5 t i c a t c k t g g a t g g t a g c a c g - 3 h p - a c a nn m 0 0 11 0 12 5 25 - c c a t g t a c g 跚a t c c a g g 一3 5 - t c i l - - l - - i t a a t g t c a c g c a c g a - 3 3 w e s t e r nb l o t3 1 总蛋白的提取各种处理细胞培养液，预冷p b s 冲洗两次，吸尽p b s ，在6 孔板孔中加入2 0 0 1 x l总蛋白提取液( 含c o c k t a i l 蛋白酶抑制剂) ，冰上裂解3 0 m i n ，吹打收集细胞，4 c ，1 2 0 0 0 r p m ，离心2 0 m i n 。上清即为细胞总蛋白，7 0 c 保存备用。总蛋白定量：用考马斯亮蓝蛋白法检测。3 2s d s p a g e取出长短不一的两块玻板，用自来水洗净后，蒸馏水冲洗一次，置3 7 c 烘干( 戴手套操作) ，梳子用水洗净。配制1 2 分离胶，将凝胶溶液缓慢持续注入至液面距梳齿2 - 3 c m处，再在液面上小心注入一层水( 约2 - 3 c m 高) ，以隔绝空气，静置直至凝胶的形成。待分离胶完全聚合，吸净上层液体。混匀5 浓缩胶，在分离胶上面注入浓缩胶液至玻板顶端，然