（光学专业论文）相关谱技术在生物大分子检测上的应用.pdf

华南师范大学硕士学位论文答辩合格证明 学位申请人奎至簦向本学位论文答辩委员会提交 题为搁垫谴选苤查垒翔坳挺魁上鱼垂固的硕士论文， 经答辩委员会审议，本论文答辩合格，特此证明。 学位论文答辩委员会委员( 签名) 论文指导老师( 签名) ：丛 1 0 0 5 年6 月佃日 予一 一 一 一 当一 、一一b庞一丕啦腻觅麓一舢一基触 摘要 摘要 相关谱技术是一种统计方法，它通过对时间序列的涨落信号作相关运算( 自 相关和互相关) ，从而得到引起涨落过程的参数，例如扩散系数，浓度，结合和 分离常数等。目前应用广泛的两种相关谱技术包括：光子散射相关谱技术 ( p h o t o ns c a t t e r i n gc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y , p s c s ) 和荧光相关谱技术( f l u o r e s c e n c e c o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y , f c s ) 。 参与改进了本实验室自行研制的小型低强度激光光子散射相关谱仪。与现有 的同类型仪器相比，该仪器采用双层折射率样品匹配池，从而可以减小杂散光的 干扰；采用带梯度折射率透镜的单模光纤接收、传输散射光信号提高了散射光的 收集传输效率；用低强度的激光避免了对样品的辐射损伤，同时可以使激光器和 系统集成在一起，整个系统小型实用。 用标准的不同粒径的聚苯乙烯球检验了自行设计的系统，系统的测量范围从 几个纳米到一个微米都很精确。 利用光子散射相关谱技术研究了牛血清白蛋白分子的扩散系数在不同强度 离子溶液中随着蛋白分子浓度变化的规律。结果表明在低离子强度环境中蛋白的 扩散系数随蛋白的浓度增加而增加，随着离子强度的逐步增大，蛋自分子的扩散 系数随其浓度的增加而减小。利用平均势场理论的两体硬球相互作用模型解释了 蛋白分子的相互作用变化规律：随着离子强度的增加，离子氛厚度减小，蛋白分 子间的相互作用由排斥变为吸引，蛋白开始聚集。根据扩散系数随蛋白浓度变化 的斜率与离子浓度变化的相关性，回归出了蛋白相互作用参数，蛋白所带的有效 电荷z p 一9 0 e 、h a m a k e r 常量= 2 8 k b t 。这项工作说明了光子散射相关谱技术是 研究蛋白分子相互作用的一种有效技术。 参与了从德国z e i s s 公司进口的荧光相关谱仪的组装工作。与现有的同类型 仪器相比，该仪器采用双通道探测，不仅可以同时进行自相关荧光谱测量，还可 以进行荧光互相关光谱测量；该仪器装有三个激光器光源，一个氩离子激光器和 两个氦氖激光器，可以提供五种波长的激光，从而扩大了染料分子的选择余地； 该仪器测量时间短，灵敏度高，平均1 0 秒钟1 个样品，可以检测到单个荧光分 子：该仪器完全由计算机控制，操作简单。 摘要 用标准荧光分子r h o d a m i n e6 g 和c y 5 校准了4 8 8 n m 的6 3 3 n m 两种波长的有 效激发体积的大小，激发体积均小于i f l 。 利用该系统对浓度非常稀的核酸样品进行测量，单分子探测的实现充分表明 该技术在核酸检测应用中的广阔前景。 提出并从实验上证明了一种独特的不需要通过目前普遍使用的p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 扩增的直接检测方法。此方法将高灵敏度荧光互相关 光谱检测技术、限制性内切酶切割核酸和双基因探针杂交标记技术结合，用于检 测被测样品基因组d n a 中的是否含有特定的核酸。为了验证方法的可行性，我 们以转基因生物样品作为例子，检测原理如下：首先利用限制性内切酶f o ki 和 b s r di 切割基因组d n a 得到c a m v 3 5 s 启动子中长度为1 6 9 b p 的一段序列：然后 使用一对r h o d a m i n eg r e e n 和c y 5 荧光染料标记的基因探针和酶切得到的 c a m v 3 5 s 启动子1 6 9 b p 片段进行杂交；最后通过荧光互相关光谱检测，判断被 测样品中是否存在同时结合了两个基因探针的杂交产物，从而鉴定是否转基因物 种。由于荧光互相关光谱检测的灵敏度可以达到单分子水平，所以不需要对样品 进行p c r 扩增反应，而且检测样品量少。利用该技术分别检测了转基因烟草， 转基因大豆和转基因番茄等物种。实验结果表明：此方法可以准确地判断样品中 3 5 s 启动子的存在，转基因d n a 分子的检测灵敏度是3 4 7 x 1 0 1 0 m 。该方法不需要 任何的基因扩增，从而避免了p c r 方法存在的非特异性扩增和假阳性等问题， 由于灵敏度高，可靠性强，检测量少和操作简便，该方法有望成为一种高效的特 定核酸检测技术。 关键词：相关谱技术：光子散射相关谱；荧光相关谱：牛血清白蛋白；蛋白相互 作用；单分子检测；转基因检测 2 一 一一些塑坠g t h et e c h n i q u eo fc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p yi sas t a t i s t i c a lm e t h o d ，i nw h i c ht h e t i m es e r i a lf l u c t u a t i o ns i g n a l sa r ec o r r e l a t e dt oo b t a i ni n f o r m a t i o na b o u tt h ep r o c e s s t h a t g i v e s r i s et ot h e f l u c t u a t i o n s , s u c h a sd i f f u s i o n c o e f f i c i e n t ，c o n c e n t r a t i o n ， a s s o c i a t i o na n dd i s s o c i a t i o nc o n s t a n t p h o t o ns c a t t e r i n gc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p ya n d f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p ya r et w om a j o rt y p e so f c o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y w eh a v e d e v e l o p e d a c o m p a c tp h o t o ns c a t t e r i n g c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y i n s t r u m e n tw i t hl o wp o w e r l a s e r c o m p a r e dw i t hc u r r e n ti n s t r u m e n t s ，t h es e t u pc a n d e c r e a s ed i s t u r b a n c eo fd i s o r d e rr a d i a t i o nb yu s i n gd o u s el a y e rr e f r a c t i v ei n d e x s a m p l em a t c h i n gv e s s e l ，a n di tc a ni n c r e a s ec o l l e c t i n ga n dt r a n s m i t t i n ge f f i c i e n c yo f r a d i a t i o nb ya d o p t i n gs i n g l em o d ef i b e rw i t hg r a d i e n tr e f r a c t i v ei n d e xl e n s w i t ha l o wp o w e rl a s e r , t h es a m p l eh a sal o ws c a t h e ，a n dt h el a s e ra n dt h em e a s u r e m e n t s y s t e mc a n b ei n t e g r a t e dc o n v e n i e n t l y t h e s e t u pw a s c a l i b r a t e dw i t hd i f f e r e n td i a m e t e rl a t e x ，a n dt h em e a s u r a b l er a n g e o ft h es e t u pi sf r o ms e v e r a ln a n o m e t e r st oo n em i c r o n t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w a ss t u d i e db y p h o t o n s c a t t e r i n gc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p yi n d i f f e r e n ti o n i cs t r e n g t hs o l u t i o n s t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fp r o t e i ni n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gp r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ，a n dt h a tw h e nt h ei o n i cs t r e n g t hi n c r e a s e dg r a d u a l l y t h ed i f f u s i o n c o e f f i c i e n td e c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n gp r o t e i n c o n c e n t r a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o fb s a a p p a r e n td i f f u s i o nc o e f f i c i e n t sw a si n t e r p r e t e di nt h ec o n t e x to f a t w o - b o d yp o t e n t i a lo f m e a nf o r c et h a ti n c l u d e sr e p u l s i v eh a r d s p h e r ea n dc o u l o m b i c i n t e r a c t i o n sa n da t t r a c t i v ed i s p e r s i o n ：w i t hi n c r e a s i n gi o n i cs t r e n 舒h ，d e b y es c r e e n i n g d e c r e a s e d ，a n dp r o t e i ni n t e r a c t i o nc h a n g e df r o mr e p u l s i o nt oa t t r a c t i o n ，a n dp r o t e i n a g g r e g a t i o n s w a so n s e t f r o mt h ec o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o fb s aa p p a r e n t d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t s ，p r o t e i ni n t e r a c t i o np a r a m e t e r sh a v eb e e nr e 孕e s s e d i tb e a r sa n e te f f e c t i v ec h a r g eo f - 9 0 ea n dh a sah a m a k c rc o n s t a n t o f2 8 k b t t h i sw o r k 一竺塑坠塑 d e m o n s t r a t e dt h a tp s c sw a sa ne f f e c t i v et e c h n i q u eo f s t u d y i n gp r o t e i ni n t e r a c t i o n s t h em a i nc o n t e n to ff c sw o r ki sa sf o l l o w s ：t a k e p a r t i nt h e a s s e m b l yo f c o n f o c o r2f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o n s p e c t r o m e t e r t h a ti s b o u g h t f r o mz e i s s ( g e r m a n y ) c o m p a r e dw i t hc u r r e n ti n s t r u m e n t s ，t h es e t u ph a st w od e t e c t i o nc h a n n e l s t h a tc a n n o t o n l yp r o v i d e c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y b u ta l s oc r o s s c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y a na r g o n i o nl a s e r ( 4 5 8 ，4 8 8a n d5 1 4 n m ) a n dt w oh e l i u m - n e o nl a s e r s ( 5 4 3a n d6 3 3 n m ) a r eu s e df o rt h ee x c i t a t i o no ft h es a m p l e f i v el a s e rl i n e sc a l l p r o v i d em a n y s e l e c t i o n sf o rt h ed y e s t h es e n s i t i v i t yo ft h i si n s t r u m e n ti sl l i g ha n dt h e m e a s u r i n gt i m ei sl i t t l e t h ea v e r a g em e a s u r i n gt i m ef o ras a m p l ei s1 0 s ，a n dt h e s i n g l em o l e c u l ec a nb ed e t e c t e d t h eo p e r a t i o ni sv e r ye a s yb e c a u s et h ef l u o r e s c e n c e c o r r e l a t i o ns p e c t r o m e t e rc a nb ec o n t r o l l e da u t o m a t i c a l l yt h r o u g h ac o m p u t e r t w o d y e sr h o d a m i n e6 g a n dc y 5w e r eu s e dt oc a l i b r a t et h ee f f e c t i v ee x c i t e d v o l u m eo f4 8 8 n ma n d6 3 3 n ml a s e rl i n e s t h ee x c i t e dv o l u m e sw e r eb o t hl e s st h a nl f l d i l u t es o l u t i o n so fn u c l e i ca c i dw e r em e a s u r e db yt h es y s t e m t h er e s u l ti n d i c a t e s f c sc a nd e t e c t u l t r a s e n s i t i v e l y t h e s i n g l e m o l e c u l e t h er e a l i z a t i o no fs i n g l e m o l e c u l a rd e t e c t i o np r o m i s e si tu s ei nt h en u c l e i ca c i dd e t e c t i o n an o v e lm e t h o df o rt h ed i r e c td e t e c t i o no f s p e c i f i c n u c l e i ca c i d sw i t h o u t a m p l i f i e db y t h e g e n e r a l m e t h o do fp c ri s f t r s f l yp r e s e n t e d a n d p r o v e db y e x p e r i m e n t s i no u rm e t h o d ，f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y ( f c s ) ，c l e a v i n g n u c l e i ca c i db yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa n dt w on u c l e i ca c i dp r o b e sh y b r i d i z a t i o n t e c h n i q u e sa r ec o m b i n e dt od i s t i n g u i s ht h es p e c i f i cn u c l e i ca c i d s i no r d e rt ot e s tt h e f e a s i b i l i t yo ft h em e t h o d ，w e m e a s u r e dt h eg m o s ( g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m s ) a s a ne x a m p l e t h ed e t e c t i o np r i n c i p l ei sb e l o w ：f i r s t l y , t w or e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e s f o kia n db s r dia r eu s e dt oc l e a v et h eg e n o m i cd n aa n dt h e1 6 9 b pf r a g m e n t so f c a m v3 5 sp r o m o t e ra r er e t r i e v e d ，s e c o n d l y , t w on u c l e i ca c i dp r o b e sl a b e l e db y r h o d a m i n eg r e e na n dc y 5 d y e sr e s p e c t i v e l yh y b r i d i z ew i t h c l e a v e d1 6 9 b pf r a g m e n t s o fc a v l v3 5 sp r o m o t e ，t h i r d l y ，t h eh y b r i d i z a t i o np r o d u c t ss i m u l t a n e o u s l yw i t ht w o d y e l a b e l e dp r o b e sa r cd e t e c t e db yf l u o r e s c e n c ec r o s s c o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p ya n d 4 竺! ! 坠坚 g m oi sd i s t i n g u i s h e d a st h ed e t e c t i o na n d a n a l y s i sb yf c s c a nb ep e r f o r m e da tt h e l e v e lo f s i n g l em o l e c u l e ，t h e r ei sn on e e df o ra n yt y p eo fa m p l i f i c a t i o n g e n e t i c a l l y m o d i f i e dt o b a c c o s ，g e n e t i c a l l ym o d i f i e d s o y b e a n sa n dg e n e t i c a l l ym o d i f i e dt o m a t o e s ， a r em e a s u r e db yt h i sm e t h o d t h er e s u l t si n d i c a t et h i sm e t h o dc a nd e t e c tc a m v 3 5 s p r o m o t e ro fg m o se x a c t l ya n dt h es e n s i t i v i t yc a nb ed o w n t o3 4 7 x 1 0 - ”m b e c a u s e n oa n yt y p eo fa m p l i f i c a t i o ni s i n v o l v e d ，t h i sm e t h o dc a na v o i dt h en o n - s p e c i f i c a m p l i f i c a t i o n a n d f a l s e - p o s i t i v ep r o b l e m s o fp c r d u et oi t s h i e # s e n s i t i v i t y , s i m p l i c i t y , r e l i a b i l i t ya n d l i t t l en e e df o rs a m p l ea m o u n t s ，t h i sm e t h o d p r o m i s e s t ob ea h i g he f f e c t i v ed e t e c t i o nt e c h n i q u ef o rs p e c i f i cn u c l e i ca c i d k e y w o r d s ： c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y ；p h o t o ns c a t t e r i n g c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y ( p s c s ) ；f l u o r e s c e n c e c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y ( f c s ) ；b o v i n e s e r u m a l b u m ；p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n ；s i n g l e m o l e c u l e d e t e c t i o n ； g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p s d e t e c t i o n 5 第一章绪论 第一章绪论 1 1 光子散射相关谱技术和荧光相关谱技术及其在生物学上的应用 光子散射相关谱技术是在激光问世后发展起来的新兴测量技术，它通过测量 溶液中微粒的扩散系数，从而得知粒子的大小及其分布。测量尺寸范围从几个纳 米到几个微米。该技术能够对样品实时、无扰快速测量，已经在生物、物理、化 学、医学等领域得到了广泛的应用i 卜1 2 】。 在生物学的应用方面，黄耀熊小组建立了显微光子散射相关谱系统，将光子 散射相关谱技术与显微镜技术结合起来实现了对单个活细胞的无损在位实时测 量，先后对正常红细胞和血影细胞进行了显微光子散射相关谱测量，表明了该系 统适用于对单个活态细胞内不同位置的动态特性扫描测量和在临床科学中的潜 在应用价值 1 3 - 1 5 1 。r b a r - z i v 等人将显微光子散射相关谱技术和光镊技术结合起 来，进行了单个粒子的光子散射相关谱测量，其装置空间分辨率可以达到几个纳 米【1 6 l 。 吕鹤书等人以溶菌酶为模型蛋白，应用光子散射相关谱技术对其结晶性能进 行了研究，结果表明一定范围的蛋白质浓度不会影响蛋白质聚合性质，而起沉淀 剂作用的盐对多色散性的影响较大1 7 】。有人也将该技术用来研究奇异果甜蛋白 晶体的成核和生长。 在蛋白相互作用方面，x u f e n gw u 等人用光子散射相关谱技术对a t p 溶液 中的平滑肌浆球蛋白进行了研究，结果表明在0 1 5 0 3 m k c i 浓度范围内，单体 蛋白的结构由折叠到展开变长发生了明显的变化【”1 。s e i i c h i t a k a y a m a 用光子散 射相关谱技术研究了m 9 2 + 和a t f 对杆状的合成肌纤维蛋白的影响，发现m 9 2 + 能够使蛋白纤维变粗变长，a t p 使纤维变短交细，a t p 起到了解聚的作用。 r a c z u r y l o 等人用光子散射相关谱技术研究了钙调结合蛋白的流体力学特性， 并建立了钙调结合蛋白的椭球模型，有力的证明了光子散射相关谱技术对生物材 料结构的无损伤测定功甜2 ”。 由于环境的变化，蛋白要发生聚集或者解聚，用光子散射相关谱技术来研究 蛋白的这些变化有天然的优势，这方面的研究非常的广泛。黄耀熊等人应用该技 第章绪论 术研究了形成自内障的人眼球晶体蛋白的聚集情况【2 2 1 ，m b d a t i l e s 则开发出了 适用于i 临床诊断白内障的光子散射相关谱医学设备1 2 3 1 。人们研究了淀粉样b 蛋 白从单体到纤维状多聚体的自发聚集动力过程，试图弄清h u n t i n g t o n 疾病的产生 机制f 2 4 1 。人们也研究了加热引起的乳球蛋白聚集情、况【吲，研究了d n a 片段与阳 离子聚乙烯电解质的相互作用 狮，用该技术观察了右旋糖苷与人低密度脂蛋白 的相互作用1 2 7 j 。 荧光相关谱技术通过对微小体积内荧光分子激发荧光的涨落做相关分析，可 以得到产生荧光涨落过程的信息。在传统的方法中，样品的体积由聚焦激光束和 针孔确定，荧光通过一个高数值孑l 径的物镜收集，并被一个高灵敏的单光子计数 探测器记录，测量到的荧光强度随时问涨落，相关运算就是对这种时间涨落做自 相关分析。归化的荧光自相关函数提供了两类的信息：振幅与被观察的平均荧 光分子数的倒数成比例；时间衰减曲线的形状反映了被观察分子的动力学特征。 最近几年来，荧光相关谱技术发展迅速，开辟了生物研究的新时代。其方法 上的进步主要有以下几方面：双光子激发，双光子激发f c s 固有的光轴切片效 应可以减少背景荧光和光损坏的影响，而且，它可以使荧光分子的激发光谱和发 射光谱间隔距离增大，从而减少激发光源散射光的收集；光子计数矩形图分析， 该分析方法之所以能很快在许多荧光相关谱测量中得到运用，其中一个原因在于 柱状图可以很容易地从产生自相关函数的数据中得到；互相关，互相关可以得 到比自相关更多的信息，它对于两种成分组成的复合物是非常灵敏的；成像荧光 相关谱，它是利用激光共聚焦扫描显微镜来产生高分辨率的像和对点与点之间的 荧光涨落做空间自相关运算。这种方法尤其适合用来定量分析聚类( c l u s t e r i n g ) 的密度和大小，已经用来研究许多细胞和模型膜的结构和动力学特征；全内反 射荧光相关谱，将全内反射激发和荧光相关谱结合起来，用来研究荧光标记蛋白 质与表面的吸附和解吸附动态作用，以及测量表面附近区域里分子的平动迁移运 动。荧光相关谱技术已经运用到多个生物过程，包括：荧光蛋白的光动力学，有 人通过研究绿色荧光蛋白突变体的相关函数随p h 值的变化来研究内在和外在的 质子化过程m 1 ，还有人通过研究相关函数随激发光源强度的变化来研究光诱导 的荧光基团异构化【矧，多项研究证据表明，除了三重态之外，至少还存在两个 独立的闪光过程，这说明绿色荧光蛋白交异体有多个暗状态：结合反应的平衡和 7 第一章绪论 动力学，荧光相关谱技术可以用来监测生物大分子的相互作用，前提条件是分子 的结合态与自由态的特征区别( 分子的扩散系数或者亮度) 要能从自相关函数上 区分开来。例如，当一个小的荧光分子结合到一个大的非荧光分子上时，导致荧 光分子通过测量区域的时间增加，这将改变荧光涨落的时间特性。通过自相关函 数的振幅和衰减常数，可以确定结合态和自由态成分的相对比例，以及总的荧光 粒子数目。利用这种方法，可溶性5 复合胺受体与几种荧光配体的结合常数己被 确定出来【3 0 l ，最近有人利用荧光相关谱技术用来监测染料a n s 与脱辅基红蛋白 相互作用的动力学；蛋白质的寡聚，扩散自相关函数的振幅和衰减时问分别 对大的荧光峰值和分子大小非常灵敏，这些特征使得荧光相关谱技术适合研究蛋 白质的寡聚问题。最近p i t s c h k e 等人研究荧光标记的合成p 淀粉样蛋白 ( a m y l o i d bp r o t e i n ) 探针的聚集【3 2 】，证明了p 淀粉样蛋白的低聚物要先于纤维的形 成( j 3 j 。朊病毒蛋白的寡聚与几种疾病有关，包括牛海绵状脑病和早老痴呆症 ( c r e u t z f e l d t j a c o bd i s e a s e ) ， b i e s c h k e 等人通过该方法研究了这种关系i 州；扩散 荧光相关谱已用于研究d n a 和蛋白质的相互作用，例如p 5 3 转录因子m j 和解旋 酶r e p a f 3 6 。有人用双色荧光互相光光谱来监测d n a 杂交的动力学1 3 7 】和限制性 核酸内切酶的切割反应 3 踟。通过对两个荧光基团之间能量共振转移引起荧光涨 落的研究，可以识别发夹状d n a 环波动【3 9 】和r n a 结构转变的动力学【蚰1 。最近 y a k o v l e v a 等人将f c s 和p c r 方法结合起来，通过使用不同荧光标记的引物， 可以监测p c r 过程扩增d n a 产物出现的时间过程【4 1 l ；细胞内的动力学，最近 报道了f c s 用于细胞内研究的几项新应用，包括在大肠杆菌内将一种细胞内趋 化信号蛋白的浓度与鞭毛马达的活性联系起来【4 2 】，监测区别g f p 在质体细管和 植物细胞溶质内的主动运输和扩散运输h 3 1 ，识别微管蛋白在乌贼巨轴突里的输 运模式，研究细胞内钙离子浓度对钙调蛋白与钙腹调蛋白依赖性蛋白激酶i i 相互作用的影响等【4 5 】。 1 2 本工作面临的问题 i 2 1 光予散射相关谱方面： 虽然光子散射相关谱技术能快速、准确地测定溶液中大分子或胶体质点的平 动扩散系数，从而得知其大小或流体力学半径及其分布，但是目前商用的实现光 8 第一章绪论 子散射相关谱测量的光子散射相关谱仪由于光源采用大功率的激光器，系统的体 积庞大，调试烦琐，仅适合实验室的使用【4 6 , 4 7 l 。 长期以来水溶液中蛋白质的相互作用问题是人们研究的热点，而蛋白质的聚 集问题尤其引人注目 4 8 - 5 0 】，这是因为蛋白质的聚集跟晶体的制备和某些疾病的形 成有着密切联系。首先，高质量的蛋白质晶体对于晶体结构的分析是至关重要的， 而蛋白质晶体的制备关键是使溶液中蛋白质分子不断地聚集到形成的晶核上，然 后从溶液中沉淀出来，但是聚集条件与很多因素有关，包括温度、p h 值、盐浓 度、蛋白浓度等，使得这一过程相当复杂【5 1 5 3 1 。目前许多生物大分子的晶体培养 工作仍很困难，主要是摸索性和经验性的；病理上，几种严重危害人类身体健康 的疾病主要是由蛋白质的聚集造成的，例如白内障的产生是由于眼晶状体中的 口一晶体蛋白聚集导致光的强烈散射造成的 2 2 1 ，镰刀状细胞贫血症是由于异常血 红蛋白聚集成纤维状使得红细胞变形破碎造成的。蛋白质的聚集过程是一个分子 间相互作用的过程，涉及到诸多因素，如盐的浓度、蛋白质性质和浓度、p h 值、 温度等等。因此，弄清楚蛋白质分子间的相互作用是如何依赖实验条件的变化， 基于蛋白质的基本特征提出具有预见性的蛋白质相互作用模型是非常有意义的。 1 2 2 荧光相关谱技术方面： 转基因生物体或遗传工程体g m o ( g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m s ) 是借助 于基因工程技术将外源基因转入生物体内，实现基因在生物体内表达而获得一种 具有新的优良性状的生物体。目前，世界上转基因植物已经有一百多种，全球基 因植物f 开间试验数量超过1 万例。转基因作物在带来巨大效益的同时也有许多潜 在问题，转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论与普遍关注。关于 转基因植物检测方法目前主要是e l i s a 法和p c r 法，但都存在着一些不足之处。 e l i s a 法检测转基因植物时，因蛋白质容易热变性，所以很难检测转基因原料加 工的食品，另外，e l i s a 法的灵敏度较低，而且耗力耗时；普通p c r 法是特异 性扩增转基因植物中的启动子，终止子或外源基因，通过凝胶电泳，从而达到检 测的目的，此法比e l i s a 法灵敏度高，但是容易产生非特异性扩增和假阳性结 果，而且电泳中所使用的溴化乙锭( 船) 对操作人员有毒害作用。电化学p c r 方法来检测转基因植物，该方法灵敏度高，可靠性强，操作简便，结果准确，但 目前还只能实现定性得分析，并且该方法目前还必须跟p c r 扩增相联系，而p c r 9 第一章绪论 扩增费力费时。因此，对于高通量的分析研究来说，有必要发展一种高灵敏度、 可靠性强的技术，用来分析微量的、未经扩增的d n a 样品。荧光相关普技术由 于所需样品极少，可以实现单分子检测，不需要p c r 扩增，而直接检测转基因 植物，有望克服以上方法的缺点，成为种新的，高灵敏度的检测技术。 1 3 本工作的目的和内容 1 3 1 光子散射相关谱方面 设计改进小型实用的光子散射相关谱仪，使其适合生物大分子的快速准确测 量；研究蛋白分子在水溶液中的相互作用与实验条件变化的关系，推动寻找蛋白 结晶条件的发展。所以光子散射相关谱方面的工作包括以下内容： 1 、设计改进光子散射相关谱仪。本研究工作主要参与改进了本实验室自行研制 的小型实用低强度激光光子散射相关谱仪，与现有的同类型仪器相比，该仪器采 用双层折射率样品匹配池可以减少杂散光的干扰；采用带梯度折射率透镜的单模 光纤接收、传输散射光信号提高了散射光的收集传输效率；用低强度的激光避免 了对样品的辐射损伤，同时可以使激光器和系统集成在一起，整个系统小型实用。 2 、用标准聚苯乙烯球检验了所设计的光子散射相关谱仪。用该系统分别测量了 标准为1 0 0 0 纳米和1 0 0 纳米的聚苯乙烯球，所测量的结果与标称的结果一致。 3 、用光子散射相关谱技术研究了牛血清白蛋白分子的扩散系数在不同强度离 子溶液中随着蛋白分子浓度变化的规律。结果表明在低离子强度环境中蛋白的扩 散系数随蛋白的浓度增加而增加，随着离子强度的逐步增大，蛋白分子的扩散系 数随其浓度的增加而减小。利用平均势场理论的两体硬球相互作用模型解释了蛋 白分子的相互作用变化规律：随着离子强度的增加，离子氛厚度减小，蛋白分子 间的相互作用由排斥变为吸引，蛋自开始聚集。根据扩散系数随蛋白浓度变化的 斜率与离子浓度变化的相关性，回归出了蛋白相互作用参数，蛋白所带的有效电 荷z p 一9 0 e 、h a m a k e r 常量= 2 8 k b t 1 3 2 荧光相关谱技术方面 本方面研究工作主要参与了从德国z e i s s 公司进口的荧光相关谱仪的组装 工作，校准了两种波长的激发体积，并利用该仪器进行转基因物种的检测。与现 有的同类型仪器相比，该仪器采用双通道探测，不仅可以同时进行自相关荧光谱 1 0 第一章绪论 测量，还可以进行荧光互相关光谱测量；该仪器装有三个激光器光源，一个氩离 子激光器和两个氦氖激光器，可以提供五种波长的激光，从而扩大了染料分子的 选择余地；该仪器测量时问短，灵敏度高，平均1 0 秒钟1 个样品，可以检测到 单个荧光分子；该仪器完全由计算机控制，操作简单。具体工作包括如下： l 、用标准荧光分子r h o d a m i n e6 g 和c y 5 校准了4 8 8 n m 的6 3 3 n m 两种波长的有 效激发体积的大小，激发体积均小于l f l 。 2 、描了一种基于荧光相关谱技术的单分子检测方法。利用该系统对浓度非常稀 的核酸样品进行测量，单分子探测的实现充分表明该技术在核酸检测应用中的广 阔前景。 3 、提出并从实验上证明了种独特的不需要通过目前普遍使用的p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 扩增的直接检钡4 方法。此方法将高灵敏度荧光互相关 光谱检测技术、限制性内切酶切割核酸和双基因探针杂交标记技术结合，用于检 测被测样品基因组d n a 中的特定核酸序列。为了验证该方法的可行性，我们检 验了转基因生物，检测原理如下：首先利用限制性内切酶f o ki 和b s r di 切割 基因组d n a 得到c a m v 3 5 s 启动子中长度为1 6 9 b p 的一段序列；然后使用一对 r h o d a m i n eg r e e n 和c y 5 荧光染料标记的基因探针与酶切得到的c a m v 3 5 s 启动 子1 6 9 b p 片段进行杂交；最后通过荧光互相关光谱检测，判断被测样品中是否存 在同时结合了两个基因探针的杂交产物，从而鉴定是否转基因物种。由于荧光互 相关光谱检测的灵敏度可以达到单分子水平，所以不需要对样品进行p c r 扩增 反应，而且测量样品少。利用该技术分别检测了转基因烟草，转基因大豆和转基 因番茄等物种。实验结果表明：此方法可以准确地判断样品中3 5 s 启动子的存在， 转基因d n a 分子的检测灵敏度是3 4 7 x t 0 1 0 m 。该方法不需要任何的基因扩增， 从而避免了p c r 方法存在的非特异性扩增和假阳性等问题，由于灵敏度高，可 靠性强，测量样品量少和操作简便，该方法有望成为一种高效的特定核酸检测技 术。 1 1 第二章光子散射相关谱理论 2 1 引言 第二章光子散射相关谱原理 经典的瑞利散射( 静态光散射) 广泛用于大分子与胶体化学的研究中【“。基 于对体系平衡性质的测量，它可以给出分子量，均方根半径和第二维里系数等重 要数据。激光器问世后，光子散射相关谱这项新技术得到了迅速的发展l2 4 】，它 是探测质点运动的重要手段，其主要应用是能快速准确的测定溶液中大分子或胶 体质点的平动扩散系数，从而得知其大小或流体力学半径。此法不仅具有不干扰 不破坏体系原有状态的优点，对于多分散体系还能提供关于质点大小分布的信息 5 1 。与静态光散射不同，光子散射相关谱技术是研究与质点运动相关联的散射光 强涨落过程，故亦可用于测定非球形质点的转动扩散系数，研究分子的构相变化， 分子链的柔性，双分子反应的动力学过程等。此项技术适用的质点尺寸范围约 l n m 至1um ，运动过程的时标范围约是1 s 至1 s 【6 ，”。 2 2 原理 光传播时其交变的电磁场引起介质分子中电子作加速运动，振动着的电偶极 予为次波源向各个方向辐射电磁波，此即光散射的起因。当质点或分子的极化率 与周围介质的极化率不同时，便可观测到散射光。散射光的频率应与入射光的相 同。实际上，质点不停地作布朗运动。由多普勒效应知道，对处于静止参考系中 的观察者来说，质点辐射的次波频率与其运动的速度有关，质点运动有快有慢， 放频率有个分布范围。结果是散射光场以入射光频率为中心而展宽，故属于准弹 性光散射，称为光子散射相关谱。单分散性体系的散射光场的谱密度s 。如) 呈 l o r e n t z 型，用2 - 1 式子表示1 6 j ，图形如图l 示： 幽h ，) 南 ( 2 一1 ) 式中，) 为曲线下面积，代表积分散射光强，也是静态散射中所测的物理量。展 第二章光子散射相关潜理论 宽用半高半宽表示，简称线宽r ，它和描述布朗运动强度的平动扩散系数d 有如 下的关系： r = o q 2 ( 2 - 2 ) 图2 1l o r e n t z 型分布的谱密度图像 g 是散射矢量的大小，即q = ( 轨肛) s j n p 2 ) ，a 是入射光在介质中的波长，0 为 散射角。以半径为3 o n m 的球形分子为例，2 0 c 时在水中的d 值