（微生物学专业论文）nsda基因中断及orfx基因整合表达对阿维链霉菌次级代谢的影响.pdf

摘要 n s d a 基因( n e g a t i v er e g u l a t o ro fs t r e p t o m y c e sd i f f e r e n t i a t i o n ) 是一个在链霉菌基 因组中广泛存在的全局性负调控因子，天蓝色链霉菌的n s d a 基因中断菌株能够提前 且超量产生放线紫红素、钙依赖抗生素和次甲基霉素，同时产孢量也相应增多；阿 维链霉菌n r r l 8 1 6 5 的m d a 基因中断菌株的阿维菌素产量较出发菌株提高3 5 倍。 o r f x 基因是2 0 0 3 年在阿维链霉菌中发现的一个调控基因，研究发现含o , - f x 基因的 d n a 片段转化变铅青链霉菌t k 2 1 后能显著提高放线紫红素和十一烷基灵菌红素的 产量；用多拷贝质粒构建包含o r f x 基因的d n a 片段的重组质粒，转化阿维链霉菌 后显著提高了阿维菌素的产量。过去对这两个基因的研究工作均以原始菌株为材料， 只是从理论上研究这两个基因的作用机制，未在工业菌株中应用。本研究的目的是 研究n s d a 基因中断和o r f x 基因整合表达对阿维链霉菌次级代谢的影响，探究它们 在链霉菌工业育种中的作用。 本研究采用了p c r 介导的基因置换技术构建n s d a 基因中断菌株。合成一对长 度分别为5 8 ，5 9 n t 的引物，其5 端的3 9 n t 序列分别与n s d a 基因两侧同源，3 端则 分别与安普霉素抗性标记盒( a a c ( 3 j 1 v + o r i t ) 两侧序列一致。以该引物扩增的p c r 产物电转化能表达拯c d 重组酶且含有目标质粒的e s c h e r i c h i a c o l i 菌株 b w 2 5 1 1 3 p l j 7 9 0 p b i b 0 5 0 1 ，获得了阳性重组质粒p b i b 0 5 0 2 , 将该质粒中的约 4 s k b b g l h 酶切片段插入基因置换载体p i l l 2 1 2 ，再接合转移至阿维链霉菌b i b 9 9 0 3 ， 筛选得到表型为a p r a i 。l h i o s 的接合子b i b 3 0 0 9 ，p c r 验证n s d a 基因已被正确中断。 y m s 平板培养显示，b i b 3 0 0 9 的产孢量较出发菌株明显减少，色素产量也明显降低。 发酵分析以及h p l c 分析显示，b i b 3 0 0 9 的发酵液中菌丝量较出发菌株有所减少， 阿维菌素产量大幅降低，为出发菌株的1 4 - 1 5 ，产量只有2 9 6 t g m l 。 本研究根据g e n e b a n k 公布的阿维链霉菌基因组中预测的o r f x 基因序列 ( n p _ 8 2 8 5 2 0 1 ) 设计p c r 引物p 1 、p 2 ，以b i b 9 9 0 3 总d n a 为模板扩增o r f x 基因， 以p u 8 6 0 0 为出发质粒，构建了含红霉素抗性基因启动子( e r m e p * ) 和o r x 结构基 因的重组质粒p b i b 8 2 7 。通过接合转移将p b m s 2 7 导入阿维菌素的工业菌株b i b 9 9 0 3 中，经p c r 验证得到重组菌株b i b 0 8 2 7 。y m s 平板培养显示，b i b 0 8 2 7 的产孢量较 出发菌株明显增多，色素产量有所减少。发酵分析以及i - i p l c 分析显示，b i b 0 8 2 7 的发酵液中菌丝量较出发菌株有所增加，阿维菌素产量大幅提高，为出发菌株的2 5 倍，产量达到3 3 5 7 x g m l 。传代稳定性实验证明，b i b 0 8 2 7 传代1 0 代后依然稳定， 在工业生产上有较大的应用价值。 关键词：阿维链霉菌：n s d a 基因；p c r 介导的基因置换；o r x 基因；整合表达； 阿维菌素 a b s t r a c t n s d a ( n e g a t i v er e g u l a t o ro fs t r e p t o m y c e sd i f f e r e n t i a t i o n ) g e n ei sag l o b a l l yn e g a t i v e r e g u l a t o rg e n e ，w h i c hw i d e l ye x i s t si ns t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o rn s d an u l lm u t a n t s p r o d u c e dm o r ea o d n o r h o d i n , c d a , m e t h y l e n o m y c i na n ds p o r e st h a nw i l dt y p es t r a i n c o m p a r e dw i t ht h es t a l _ ts w a i no fs t r e p t o m y c e aa v e r m i t i l i sn r r l 名1 6 5 ，t h el e v e lo f a v e n n e c t i np r o d u c e db y & a v e r m i t i l i sn s d ad i s r u p t i o ns t r a i ni n c r e a s e d3 - 5f o l d s o r f x g e n ei sar e g u l a t o rg e n ed i s c o v e r e di nt h eg e n o m eo f & a v e r m i t i l i si n2 0 0 3 t h el e v e lo f a c f i n o r h o d i na n dm e t h y l e n o m y c i np r o d u c e db y & v d a n st k 2 1i n c r e a s e dd r a m a t i c a l l y w h e nt h ed n a f r a g m e n tc o n t a i n i n g 西承g e n ew a st r a n s f o r m e di n t oi t w h e nt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dc o n t a i n i n gt h eo r f xg e n e ，w h i c hw a sd e n v e df r o mm u l t i e o p yv e 虻- - t o r , w a st t a n s f o r m e di n t o & a v e r m i a l i s ，t h el e v e lo fa v e r m e c t i nw a se l e v a t e dp r o m i n e n t l y i n t h ep a s t , t h es t u d yo nt h en s d aa n do r f xg e n es t a r t e dw i t ht h ew i l dt y p es t r a i n s t h e f u n c t i o no ft h et w og e n e sw a so n l yi n v e s t i g a t e di nt h e o r ya n dt h ep o s s i b l ei n d u s t r i a l a p p l i c a t i o nw a sn o tc a r r i e do u t t h eg o a lo ft h i ss t u d yi st ot e s tt h ee f f e c to fn s d ag e n e d i s r u p t i o na n di n t e g r a t i v ee x p r e s s i o no fo r f xg e n e0 2t h es e c o n d a r ym e t a b o l i s mo f & a v e r m i a l i s ，a n di n v e s t i g a t et h ea p p l i c a t i o no ft h et w og e n e si nt h ei n d u s t r i a lb r e e d i n go f s t r e p t o m y c e s i nt h i ss t u d y , p c r - m e d i a t e dg e n er e p l a c e m e n tt e c h n i q u ew a sa p p l i e di nt h e c o n s t r u c t i o nn s d ag u n ed i s r u p t i o ns t r a i l lf i r s t l y , ap a i ro fl o n g ( 5 s , s 9 n 0p r i m e r sw e r e p r e p a r e d , w h i c hh a v ea t5 e n d3 9 n tm a t c h i n gt h ef l a n k i n gs e q u e n c eo fn s d a 。a n dt h e 3 s e q u e n c em a t c h i n gt h et i g h t o rl e f te n do ft h e a p r a m y c i n r e s i s t a n tc a s s e t t e s ( a a c ( 3 ) v + o r i t ) t h e l i n e a rd n ap c r - a m p l i f i e d b y t h e s e p r i l n e r sw a s e l e c t r o - t r a n s f o r m e dt ot h es t r a i nb w 2 5 1 1 3 p l j 7 9 0 p b i b 0 5 0 1w h i c he x p r e s s e sa - r e d e n z y m ea n dc o n t a i n st a r g e tp k 蛐地t h e nap o s i t i v er e c o m b i n e dp l a s m i d ( p b i b 0 5 0 2 ) w a s o b t a i n e d t h e4 5 k bf r a g m e n tf r o mp b i b 0 5 0 2d i g e s t e db y 剐w a si n s e r t e di n t o p i l l 2 1 2 ，a n dt h e ni n t r o d u c e di n t osa v e r m a l sb i b 9 9 0 3b yc o n j u g a lw a n s f e r a n a p r a s t h i o si s o l a t eb i b 3 0 0 9w a so b t a i n e da n dn a d ad i s r u p t i o nw a sc o n f i r m e db yp c r c o m p a r e dw i t ht h es t a r ts 雠mb i b 3 0 0 9p r o d u c e df e w e rs p o r e sa n dl e s sp i g m e n to n y m s p l a t e h p l ca s s a y so f t h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho f b i b 3 0 0 9i n d i c a t e dt h a tt h el e v e lo f a v e r m e c t i nd e c r e a s e dd r a m a t i c a l l y , a n do n l y2 9 6 ，u g m la v e r m e c t i nw a sp r o d u c e d , w h i c h r e a c h e d1 4 - 1 5o ft h ey i e l do ft h es t a r ts t r a i n i nt h i ss t u d y , t h ep c r p r i m e r sp 1a n di 2w c r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep r e d i c t e d g e n es e q u e n c e so fo r f xg e n ei nt h e & a v e r m i t i l i sg e n o m ep u b l i s h e di nt h eg e n e b a n k d 懈s t r u c t u r a lg e n ew a sa m p l i f i e dw i t hg e n o m i cd n a o fb i b 9 9 0 3a st e m p l a t ea n dp 1 a n dp 2a sp r i m e r s r e c o m b i n a n tp l a s m i dp b i b 8 2 7 , w h i c hc o n t a i n e dt h es t r u c t u r a lg e n eo f o r f xa n de r m e p * w a sd e r i v e df r o mp u s 6 0 0 t h er e c o m b i n a n ts 1 曲b i b 0 8 2 7w a s o b t a i n e db yi n t r o d u c i n gp b i b 8 2 7i n t ot h ei n d u s t r i a ls t r a i nb i b 9 9 0 3t h r o u 【g hi n t e r g e n e r i c g e n et r a n s f e r c o m p a r e dw i t ht h es t a r ts t r a i n ，b i b 0 8 2 7p r o d u c e dm o r es p o r e sa n dl e a s p i g m e n to ny m sp l a t e f e r m e n t a t i o na s s a y si n d i c a t e dt h eb i o m a s so ft h ef e r m e n t a t i o n b r o t ho fb i b 0 8 2 7i n c r e a s e ds l i g h t l yw h e nc o m p a r e dw i t ht h es t a r ts t r a i n h p l ca s s a y s s h o w e dt h el e v e lo fa v e r m e c t i np r o d u c e db yb i b 0 8 2 7m a e h e d3 3 5 7 m n l l , 1 5 - f o l d i n c r e a s i n gw h e nc o m p a r e dw i t ht h es t a r ts t r a i n t h ec h a r a c t e r i s t i co fh i g h - l e v e lp r o d u c i n g s t l a i nb i b 0 8 2 7w a ss t a b l ea f t e rt e nr o u n d so fn o n - s e l e c t i v eg r o w t h , w h i c hc o u l db e a p p l i e di nt h ei n d u s u i a lp r o d u c t i o no fa v c 玎n c c 6 n k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e sa v c r m i t i l i s ；n s d ag e n e ；p c r - m e d i a t e dg e n er e p l a c e m e n t ；o r f x g e n e ；i n t e g r a t i v ee x p r e s s i o n ；a v e r m e c t i n b p c a t c o a d m s o d o e d 王a g + c h h 畔l c 缩略语( a b b r e v i a t i o n s ) a p r a m y c i nr e s i s t a n c eg o n e a p r a m y c i n a m p i c i l l i n a t t a c h m e n ts i t eo f p h a g e b 1 a c t a m a s eg e n e b a s e p a h g o n ec n i i n gc h l o r a m p h e n i e n l a c e t y l 蝴 c o e n z y m e a d i m e t h y ls 础o x i d e d i s s o l v e do x y g e n e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d p e r c e n t a g eo f g + c c o n t e n t h o u r h i g hp e r f o r m a n e e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i s o p r o p y l - t h i o g a l a t o p y r a n o s i d e k i l o b a s e s k a n a m y c i n g o n ee n c o d i n gf o ri n t e g r a s eo fp h a g e m i n u t e 越s ss p e c t r u m n e g a t i v er e g u l a rg a n eo fs t r e p t o m y c e s d i f f e r e n t i a t i o n o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e m i g i no f r e p l i c a t i o n 耐g i no ft r a n s f e r p o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n p o l y k e f i d es y n t h a s e i v 安普霉素抗性基因 安普霉素 氨苄青霉素 噬菌体d h a 附着位点 b - 内酰胺酶基因，编码氨苄 青霉素抗性基因 碱基对 氯霉素酰基转移酶基因。编 码氯霉素抗性基因 辅酶a 二甲基亚砜 溶解氧 乙二胺四乙酸 g + c 百分含量 h 高效液相色谱 异丙基硫代半乳糖苷 千碱基对 卡拉霉素 噬菌体整合酶基因 m i n 质谱 链霉菌分化负调控基因 光密度 开放阅读框 复制起始位点 接合转移起始位点 聚合酶链式反应 聚酮合成酶 醐舡：姚 脚b融置懈蒯 吣? m l i 呱| 2 t k o 船 ) 【- g a l r e s i s t a n c e g e n ee n c o d i n gr e c o m b i n a s e r e p l i c o n s e n s i t i v i t y s e c o n d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s t r o n gi n c o m p a t i b i l i t yr e g i o no f p m o l t r i s - a c e t a t e - e d t a b u f f e r t r i se d t 氏b u f f e r n - t t 自t ( h y d m s y m e t h y l ) m e t h y l - 2 - a m t n o - e t h a n e s u t p h o n i ca c i d t h i o s u e p t o n t h i o s t r e p t o nr e s i s t a n c eg e n e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l - b e t a - g a h c t o p y r a n o s i d e v 抗性 重组酶基因 复制子 敏感性 s 十二烷基磺酸钠 质粒p i j l 0 1 强烈不相容区 t r s - 乙酸- e d t a 缓冲液 t r i s - e d t a 缓冲液 n 三( 羟甲基) 甲基县氨基 乙烷磺酸 硫链丝菌素 硫链丝菌素抗性基因 5 一溴- 4 - 氯- 3 吲哚b 一半乳糖 苷 s e s r 鹏 研s s 姘 捌 吧 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密雹 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同2 r _ 作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：茏s 厌时间：妙印啤午月z 6 日 糊黼叛黼撇名：耶似 签名日期：1 ，吖年斗月“日 签名日期：力啼矸月刁日 1 1 阿维链霉菌简介 第一章前言 链霉菌是一种具有分枝状菌丝体结构的好氧革兰氏阳性土壤细菌( w a k c s m 衄 a n dh e r i r e i ，1 9 4 3 ) ，属于原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要的微生物类群 之一。其g + c 含量高达7 0 - 8 0 ，是迄今为止自然界中已知g + c 含量最高 的一类生物。1 9 7 5 年，日本北里研究所( k i t a s a t oi n s i t u t e ) 的科研人员从日本静冈 县伊东市河奈( 唧柚a ) 地区一份土壤样品中分离获得链霉菌的一个菌株，经研究 后发现该菌株的发酵液具有很高的驱肠道寄生虫活性。后由美国默克公司( m e r c k ) 对该菌株进行鉴定，结果显示该菌株与以往发现的链霉菌属的所有种均不相同，确 定为一个新种，命名为阿维链霉菌( s t r e p t o m y c e s a v e r m i t i l i s ) ，原始菌株号为m a 4 6 8 0 。 2 0 0 3 年5 月，研究人员完成了阿维链霉菌m a 4 6 8 0 的全基因组序列分析( o m u r a e ta 1 ，2 0 0 1 ；i k e d ae ta 1 ，2 0 0 3 ) ，序列分析覆盖了全基因组的9 9 ，获得大量完整、系 统的遗传信息和研究数据。分析表明：s a v e r m i t i l i sm a 4 6 8 0 染色体含有9 ，0 2 5 ，6 0 8 对碱基，g + c 含量7 0 7 ，编码至少7 5 7 4 个基因，这是当时发现的最大的原核生 物的基因组( 表1 1 ) 。从整个基因组中，总共检测到2 5 条与次级代谢有关的生物合 成基因簇，其长度占全基因组的6 4 ，它们分布广泛，其中近一半位于线性染色体 两端的区域内。这些基因簇参与了阿维菌素、寡霉素、黑色素、类胡萝卜素、铁载 体以及间苯三酚等的合成。同天蓝色链霉菌基因组比较发现，位于染色体中央的 6 5 m b 区域高度保守，该区域内，许多基因的碱基组成和排列顺序相同，基本结构 甚至与某些具有环状染色体结构的细菌相似。这一发现暗示，链霉菌同那些染色体 为环状的原核生物可能具有共同的祖先。 1 9 7 6 年，默克公司从阿维链霉菌发酵液中分离出具有驱虫活性的一组物质，并 命名为阿维菌素( a v e r m e c t i n ) 。随后的结构鉴定表明( b u r g c ta 1 ，1 9 7 9 ；e g e r t o ne ta 1 ， 1 9 7 9 ) ，阿维菌素是一组结构相似的十六元大环内酯齐墩果糖双糖衍生物，共有8 个 组分，分别为a l a 、a l b 、a 2 a 、a 2 b 、b l a 、b i b 、b 2 a 和b 2 b ( 图1 1 ) ，其中a 组分 为大量组分，含量占8 0 以上。 阿维菌素具有独特的作用机制，它们不抑制蛋白质的合成，也不抑制离子载体， 而主要是通过触杀和胃毒作用来发挥对害虫的毒杀效果。神经毒理学研究表明 ( s o d e r l u n de t a l ，1 9 8 7 ) ，阿维菌素作用的靶位点为昆虫外周神经系统的一种重要的 抑制性神经递质一y 一氨基丁酸( g a m m a - a m i n o b u t y r i ca c i d ，g a b a ) 受体。阿维菌素能 促进g a b a 从神经末梢释放，增强g a b a 与线虫抑制性运动神经元突触后膜上受 体及昆虫和其他节肢动物突触后节点肌细胞膜上受体的结合力，并通过激活氯通道 表1 1 阿维链霉菌基因组特征 i h m e1 1g e n o m i cf e a t u r e so f a v e r m t s 1 蟪性籀色体 l e n g t h ( b p ) 9 , 0 2 5 蓐0 8 g + cc a n t 翻l t ( 7 0 7 p 窿棚n d 氍 c i - m g 商蜘蝴 c c x - a 岫r v 面f 耐t hf u n c t i o n a s s i 掣l e d4 5 6 3 c 蹦l 蛳r v e dw i t ht m k n o w nf u n c t i o nz t a g n 伽- c o n ，e r v e d2 7 3 t o t a l a v e 脚r a 髀惭c d 】s 妇( b p ) 酬严惭】 蕊敬( 1 6 s 譬。5 鄹 缸n r n 7 5 7 4 i o m 8 6 2 6 6 b ( 4 3 甲e d e 帕 l 器掣( ， n 洲“篆恕l 嚣黠i t h 出。m u a t z n 8 一t柚n e r y 岫wt u n c h o c o n t e r v e dw i t hu n k n o w mf u n c t i o n n o n 删e d t o t a l 会篡髻嚣5 h 脚 置n a r 1 州a t r n a t m 献a 9 4 , 2 8 7 69 2 3 3 4 5 1 s 9 6 骘0 昌 7 吼o o o 0 一abq 璃a i 砷鼬吗。鲫 衄a毛q玛qbq珊d 蛐a鼍a毛qb旺珊母 b hg 玛a 鲫 砷 ha 毛a 的i 助hg 玛a b q 球】帅 e 2 b h q ba b a 圈l i 阿维菌素化学结构式 f i g 1 1s t r u c t u r eo fa v e r m e c t i n s 2 引起突触小泡中氯离子的释放，使进入细胞内的氯离子增加，细胞膜超极化，导致神经 信号传导阻滞。它还可能作用于昆虫和线虫骨骼肌中g l u 门控氯通道，导致昆虫或线 虫因肌肉麻痹而死( s o d c r l u n dc ta 1 ，1 9 8 9 ) 。由于哺乳动物外周神经传导递质为乙酰 胆碱，以g a b a 作传导递质的神经仅存在于中枢神经系统，血脑屏障作用可以阻断 阿维菌素进入，同时它们对哺乳动物的神经功能产生影响时所需浓度比寄生虫要大 得多，因此，它们对哺乳动物具有很高的安全性( m e k _ e l l a ra n d b e n c h a o u i ，1 9 9 6 ) 。 阿维菌素有很高的杀死体外寄生虫的活性，但是没有抗细菌和真菌的活性。阿 维菌素对许多危害农作物的昆虫都具有杀虫活性，能有效防治双翅目、同翅目、直 翅目、鳞翅目及鞘膜翅目等农业害虫及多种害螨，特别是对常用农药具有抗药性的 害螨和害虫具有优良的防效( 张敏恒，1 9 9 8 ) 。目前在农业上应用的一般是阿维菌素 b 1 ，它的杀螨效果是常用杀螨剂的5 0 - 2 0 0 倍，对土壤线虫也卓有成效，效果是常用 杀线虫剂的1 0 - 3 0 倍( 胡瑞茂，1 9 8 6 ) 。阿维菌素可适用性十分广泛，如棉花、果树、 茶、蔬菜、药用植物和园林花草等。由于阿维菌素可在日光下迅速分解，半衰期为 6 5 h 1 0 h ，叶面残留量极低，因此对害虫的天敌和有益昆虫影响较小，对入、畜和生 态环境有较高的安全性，而滞留于植物组织中的阿维菌素却能保持很长的残效，持 效期约为7 - 1 5 d ( c a m p b e l l ，1 9 8 9 ) 。由于阿维菌素具有高效、低毒、广谱的杀虫特性， 自踟年代上市以来被广泛用于农业和畜牧业，产生了巨大的经济效益，被誉为当今 活性最高的杀虫剂。 1 2 阿维菌素的生物合成 通过掺入同位素标记前体、鉴定生物合成阻断突变株中关键中间体、生物合成 阻断突变株或野生型菌株对中间体的转化实验，结合体外测定与阿维菌素生物合成 有关的酶等实验，阿维菌素的生物合成途径已基本阐明o k r a aa n d6 m u r a , 1 9 9 3 ； i k e d ae ta 1 ，1 9 9 9 ) ，生物合成基因簇( 图1 2 ) 已被克隆和测序，大部分基因的功能 已经确定( m a c n e f lc ta 1 。1 9 9 3 ；i k c d ac ta 1 ，1 9 9 9 ) 同时i k e d a 等人又于2 0 0 3 完成了 阿维链霉菌全基因组的测序( i k c d ac ta 1 ，2 0 0 3 ) ，从而为人们认识这一重要抗生素和 其它类似抗生素的生物合成机理以及利用基因工程手段合成新的阿维菌素衍生物提 供了理论依据。现在人们对阿维菌素的生物合成途径及控制每一步反应的基因( 如 图1 3 ) 都有了大致的了解。阿维菌素的生物合成可分为4 个阶段： l 起始单元的生物合成； 2 聚酮体的生物合成； 3 聚酮体的后修饰( 包括氧化环化反应、还原反应和甲基化反应) ； 4l 齐墩果糖的生物合成及与阿维菌素糖苷配基的连接。 3 o德饕瓣孵秘再釉 _ illll i i iitliliiiil 一_ 稿v 蝴黼 图1 2 阿维菌素生物合成基因簇 瑰1 2g e n ed u s t e rf o ra v e r m e c f i nb i o s y n t h e s i s r - h ，o f 审t h k s h h h - o s - a c k m o a - o m m - 曩 - 棚，- 5 _ ” i y - _ r 鼬舯 晰l 硷 = j c = 令 吖寸糍吖移遥 蹲。翠。 _ 哪2 口叶_ 啼埔i 知y - 2 臼一目i 紧”蹬_ 蹬 j 一舢一l 一詈 一 霄蛩一棼酱爻。述。，_ 苗。 图1 3 阿维菌素生物合成流程图 f i g 1 3p r o p o s e db i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f a v e r m e c t i n 4 1 2 1 阿维菌素起始单元的生物合成 通过在阿维菌素合成过程中掺入同位素标记前体的研究表明( 如图1 4 ) ：阿维 菌素的聚酮骨架由七个乙酸盐，五个丙酸盐和一个带有支链的脂肪酸首尾聚合而成 ( c a n e e ta 1 1 9 8 3 ) 。阿维菌素“a ”组分中的2 甲基丁酰基( c 2 5 - c 2 8 ) 和b ”组分中 的异丁酰基( c 2 5 c 2 7 ) 分别由l 异亮氨酸和l 广缬氨酸衍生而成。l 广异亮氨酸和l 缬氨酸通过脱氨、转氨和脱羧作用形成支链脂肪酸( o m u r ac ta 1 ，1 9 9 1 ) 。齐墩果 糖由葡萄糖分子直接转化而来( c h e n , e t a l ，1 9 8 9 b ) 。s c h u l m a n 等的研究表明，齐墩 果双糖是先进行甲基化然后再连接到糖苷配基上最终形成阿维菌素的( s c h u l m a ne t a 1 1 9 8 7 ) 。阿维菌素中与大环内酯c - 5 和双糖中的c - 3 和c 3 ”相连的三个甲氧基， 均来源于甲硫氨酸上的甲基( s c h u l m a ne ta l ，1 9 晰) 。 o 口l l c 氖 丫 一帅 叩“”“ 淼 图1 4 阿维菌素起始单元的生物合成途径 f i g 1 4 b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s o f s t a r t e r i t s o f a v e r m e e t i a 1 2 2 阿维菌素聚酮体的生物合成 阿维菌素的起始糖苷配基是通过在起始单位( 2 甲基丁酸或异丁酸) 上按 p - a a a p - p a p a - p - a ( p 代表丙酰，a 代表乙酰) 的顺序添加1 2 个延伸单位 缩合而成，整个过程由阿维菌素聚酮合酶催化完成。阿维菌素的生物合成基因簇全 长8 2 k b ，共有1 8 个开放阅读框架( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 9 ) ( 见图1 2 ) 。基因簇内部的6 0 k b 片段含有4 个大的开放阅读框架，因转录方向相反被分成两组：a v e a l - a v e a 2 和 a v e a 3 a v e a 4 ，它们分别编码4 个多功能蛋白a v e s l ，a v e s 2 和a v e s 3 ，a v e s 4 ， 5 共同组成阿维菌素聚酮合酶。该聚酮合酶由1 2 个模块组成，共有5 5 个活性位点( 见 图1 5 ) 。模块1 、4 、5 和1 0 中的酶域相同，都由1 3 - 酮脂酰基a c p 合成酶( k s ) 、酰 基转移酶( 皿、酮基还原酶( k r ) 和酰基载体蛋白( a c p ) 组成；模块3 和1 1 中只有 k s 、a t 、a c p ；模块2 、6 、7 、8 、9 和1 2 中除k s 、a t 、k r 、a c p 外，还有d h 结构域，但模块7 中的d h 和模块1 0 中的k r 是没有活性的。模块2 中的d h 在脱 水酶共有的活性位点h x x x g x x x x p 有一个错配的氨基酸( p 突变为s ) ，似乎只有部 分活性( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。在所有的模块中都没有e r 结构域，这与阿维菌素糖苷 配基中没有完全饱和的b 碳链是对应的。在a v e s l 的n 端有一个负载域，包括两个 活性位点a t 和a c p ，在a v e s 4 的c 端有一个硫酯酶域。每个模块负责一步掺入前 体如乙酸或丙酸的聚合反应及6 酮基的还原，最后所形成的聚酮在t e 的作用下从 p k s 上释放出来成环内酯化。 图1 5 阿维菌素p k s 结构域及其产物的推测 f i g 1 5p r e d i c t e dd o m a i ns t r u c t u r ea n dp r o d u c t so ft h ea v e r m e c t i np k s 6 1 2 3 阿维菌素聚酮体的后修饰 起始糖苷配基合成后要经过一系列的修饰才能形成阿维菌素糖苷配基，包括呋 喃环的闭合，c 5 位酮基的还原和甲基化( 图1 5 ) 。c 6 和c s a 间呋喃环的闭合是在 c 8 a 的烯丙基甲基上引入氧原子后形成的( p a n g e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，该过程由a v e e 编码的 细胞色素i 4 5 0 羟化酶催化完成( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。a v e e 和a v e c 基因位于 a v e a 1 a v e a 2 和a v e a 3 - a v e a 4 基因之间( 图1 2 ) 。a v e c 基因突变株仅产阿维菌素“2 ” 组分( c 2 2 ，2 3 位为c h 2 c h o h ) ( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 5 a ) ，但a v e c 的氨基酸序列与p k s 或f a s 中的脱水酶的氨基酸序列之间没有同源性，a v e c 的功能目前仍不清楚。 c - 5 位的酮基还原成羟基是由a v e f 编码的c 5 酮基还原酶催化的，a v e f 突变产 生c 5 o - 阿维菌素( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 5 b ) 。紧邻a v e f 上游的a v e d 编码c 5 o 甲基转移 酶( 图1 6 ) ，该基因负责将s 腺苷甲硫氨酸的甲基转移到阿维菌素“b ”组分的c - 5 位羟基上而形成阿维菌素“a 组分( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。a v e f 与a v e d 的转录方向一 致，可能属于同一个转录单位( i k e d ae ta 1 ，1 9 9 5 b ) 。 1 2 4l 齐墩果糖的生物合成及与阿维菌素糖苷配基的连接 齐墩果糖的生物合成由一系列酶所催化，负责合成和转移齐墩果糖的基因 ( m , e b h , a v e b i i l , a v e b i v , a v e b v , a v e b v l , a v e b v l i 和a v e b v l l l ) 位于阿维菌素生物合 成基因簇的右侧。图1 6 是w o h l e r t 等人提出的齐墩果糖生物合成途径( w o h l e r t e t a l ， 1 9 9 3 ) 。葡萄糖1 磷酸在a v c b i h 和a v e b i l 的作用下首先形成t d p - 4 - 酮- 6 - 脱氧葡萄 糖，然后在a r e b 二a v e 丑 ，的催化下合成d t d p - l 卉墩果糖，最后由a v e b i 编码 的糖基转移酶将d t d p 齐墩果糖连接到阿维菌素糖苷配基的c - 1 3 和c _ 4 位上形成阿 维菌素。 竺，键于媾f i 书亍丸i - 辨1 1 。，。- 日0 p 脚 l 一。j 一 篓，竺孵第呸 图1 6l - 齐墩果糖的生物合成途径 f i g 1 6p r o p o s e dp a t h w a y sf o rt h eb i o s y n t h e s i so fl - o l e a n d r o s e 7 1 3 阿维链霉菌生物合成调控 链霉菌存在着原核生物中罕见的庞大而复杂的调控网络。在遗传水平，链霉菌 次级代谢调控有三个层次，分别是：途径特异性调控( p a t h w a y - s p c c i f i cr e g u l a t i o n ) 、 多效调控( p l e i o t r o p i cr e g u l a t i o n ) 和全局调控( g l o b a lr e g u l a t i o n ) 。研究次级代谢调控的 分子机制将对利用代谢工程手段得到理想的天然产物和提高其产量具有极大的促进 作用。如可以利用增加正调控基因的表达或抑制负调控基因表达等方法提高终产物 的产量，或通过改造细胞内现存的代谢途径，控制代谢物质流，产生传统途径中的 中间产物或经修饰的终产物。 1 3 1 途径特异性调控 链霉菌次级代谢产物的生物合成基因常位于同一基因簇中，目前研究较多的是 抗生素生物合成基因簇。在基因簇中常包含一个或多个途径特异性调控基因，它们 一般调控一种抗生素或几种具有某些共同生物合成途径的抗生素的生物合成。这种 调控依赖于细胞生长周期。 目前在链霉菌中发现了很多途径特异性基因参与次级代谢的调控，如天蓝色链 霉菌( $ c o e l i c o l o r ) 中a c t i f - o r 4 调控放线紫红素( a c t i n o r h o d i n ) 生物合成；m 扣 调控十一烷基灵菌红素( u n d e c y l p r o d i g i o s i n ) 的生物合成( s e v c i k o v ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 波 赛链霉菌 彤w g 觚) 中，d n ri 是柔红霉素( d a u n o r u b i c i n ) 生物合成的激活因子( t a n g e ta 1 ，1 9 9 6 ) ；k a w a c h i 等( 2 0 0 0 ) 在维基尼链霉菌佤v i r g i n i a e ) 中发现了维基尼霉素 ( v i r g i n i a m y c i n , v 雌物合成的途径特异性调控基因v m s r 基因。 阿维链霉菌基因组中也存在很多途径特意