（环境科学专业论文）内蒙古高原干涸湖泊湿地甲烷氧化菌群落的trflp分析.pdf

堕茎堕奎兰堡主兰垡笙茎 量是影响甲烷氧化菌群落的主要因素，土壤含水量、碳氮比、有机质含量分别 对样点s l 、s 2 、s 3 的甲烷氧化菌群落影响显著。土壤微生物群落总体受到高p h 值( 8 5 9 7 ) 的胁迫，而对甲烷氧化细菌未见影响。 利用t - r f l p 技术，分析结果会受到几个重要因素的影响，包括：p c r 引物 的特异性、限制性内切酶的选择、样品d n a 的浓度、峰值图的筛选等。 关键词：甲烷氧化菌；t r f l p ；多样性；群落结构；干涸湖泊 内蒙古大学硕士学位论文 t e r m i n a lr e s t r _ i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o i 删o r p h i s ma n a l y s i so fm e t h a n o t r o p h si nw e t l a n d s o i l so fd r y u pl a k ei nt h e 州e rm o n g o l i ap l a t e a u a bs t r a c t 【e t h a n ei sn o to n l yi m p o r t a n ts o u r c eo fe n e r g ya n dc h e m i c a lr a wm a t e r i a l ，b u t a l s oo n eo ft h em o s ti m p o i r t a n tg r e e n h o u s eg a s e s ，w h i c hi so n l ys e c o n dt oc a r b o n d i o x i d ei nt h ea t m o s p h e r e a e r o b i cm e t h a n o t r o p h sa r et h es 0 1 eb i 0 1 0 9 i c a ls i n kf o r m e t h a n ei na e r o b i cs o i l s ，w h i c hi ss i g n i f i c a n tt or e d u c et h eg r e e n h o u s eg a se m i s s i o n a n dm a n a g et h ec a r b o nc y c l i n g w e t l a n d sr 印r e s e n tam 句o r9 1 0 b a ls o u r c eo f m e t h a n e ， a n dt h e ya r eb e i n gd i s n l p t e db yh u m a na c t i v i t y s oi ti s s i g n i f i c a n tt ob i 0 1 0 9 i c a l l y c o n t r o lt h eg r e e n h o u s ee 分e c ta n da t m o s p h e r i ce n v i r o n m e n tb ys t u d y i n ge c 0 1 0 9 i c a l d i s t r i b u t i o no f m e t h a n o t r o p h s i n s o i l s ， e x p l o r i n g t h ee 矗e c t so f e c 0 1 0 9 i c a l e n v i r o n m e n to nc o m m u n i t ys t r u c t u r ea n dd i v e r s i t yi nd r y i n g - u pw e t l a n d b yu s i n g m o d e mm o l e c u l a re c o l o g yt e c h n i q u e s ，t h e r ea r em a n ys t u d i e so fm e t h a n o t r o p h si n f a m l a n d s ，f o r e s t s ，g r a s s l a n d s ，w e t l a n d sa n ds e a ，b u tl e s si nw e t l a n do fd 巧一u p1 a k e t h em e t h o do ft e r m i n a lr e s t r i c t i o n 行a g m e n t1 e n g t hp 0 1 y m o 印h i s m ( t - r f l p ) w a su s e dt os t u d yt h ek e y 如n c t i o n a lg e n ep 脚d 彳o ft h ea e r o b i cm e t h a n o t r o p h sb y i i i 内蒙古大学硕士学位论文 c a p i l l a 巧e l e c t r o p h o r e s i si nt h ew e t l a n ds o i l so fd r y - u p1 a k ei nt h ei n n e rm o n g o l i a p l a t e a u b a s i n g o nt h e b i o d i v e r s i t ya n a l y s i s ， h i e r a r c h i c a lc l u s t e r a n a l y s i s a n d p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ( p c a ) ，t h er e s u l t sa sf 0 1 1 0 w s ： t h ed i v e r s i t ya n de v e n n e s si n d e x e so fm e t h a n o t r o p h sw e r eh i g h e ra tt h el a t e r d i 。y u pp l o t s ( s 1a n ds 2 ) ，a n dt h eo p p o s i t er e s u l t sw e r es h o w na tt h ee a r l i e rd i y u p p l o t ( s 3 ) a n dt h ea d j a c e n ts t e p p e ( s 4 ) t h e m e t h a n o t r o p h s s i m i l a r i t yc o e m c i e n t sg r a d u a l l yd e c l i n e df r o mt h ec e n t r eo f t h el a k et ot h ea d ja c e n ts t 印p e ，i n d i c a t i n gc o m m u n i t y sd y n a m i cs u c c e s s i o n t h e t e n n i n a lr e s t r i c t i o n 仃a g m e n to f9 5 b pr 印r e s e n t e dt h ed o m i n a n ts p e c i e so w n e d b ys1 ， s 2a n ds 3 4 5 7 b pr 印r e s e n t e da n o t h e rd o m i n a n ts p e c i e so fs 2 ，a n d131b pr e p r e s e n t e d a n o t h e rd o m i n a n ts p e c i e so fs 3 8 2 b pa n d8 9 b pr e p r e s e n t e dt h ed o m i n a n ts p e c i e so f s 4 b a s i n go nt h em u l t i v a r i a t ea n a l y s i so ft - i 江l p ，t h ep r i n c i p a lc o i l l p o n e n ta n a l y s i s b i p l o ts h o w e dt h a tt h es o i la m m o n i u mn i t r o g e nw a st h em a i nf a c t o rw h i c he f f e c t e d m e t h a n o t r o p h sc o m m u n i t y t h es o i lw a t e rc o n t e n t ，c na n ds o i lo 玛a n i cm a t t e rh a d s i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo nt h em e t h a n o t r o p h so fs1 ，s 2a n ds 3 ，r e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n ， h i g hp hv a l u e ( 8 5 9 7 ) h a di n h i b i t o 巧e f f e c t so nt h ew h 0 1 es o i lm i c r o b i a lc o m m u n i t y ， b u ti td i dn o th a v ei n f l u e n c eo nm e t h a n o t r o p h s t h ea n a l y s i so ft - r f l pw a sa f r e c t e db ys o m ei 1 1 l p o r t a n t f a c t o r s ，i n c l u d i n gt h e s p e c i f i c i t yo fp c rp r i m e r ，t h es e l e c t i o no fr e s t r i c t i o ne n z y m e ，t h ec o n c e n t r a t i o no f d n a s a m p l e sa n dt h es c r e e n i n go ft h et - r f l pp e a kp r o f i l e s ，a n ds oo n i v 内蒙古大学硕士学位论文 k e y w 0 则d s ：m e t h a n o t r o p h s ；t - r f l p ；d i v e r s i t y ；c o m m u n i t ys t m c t u r e ；d 哆一u p l a k e v 内蒙古大学硕士学位论文 1 研究综述 1 1 研究背景 甲烷( c h 4 ) 是地球上储藏量极为丰富的一种重要能源，也是重要的化工原料，在人类 的生产生活中起着重要的作用。可工业利用的甲烷主要来源于天然气和厌氧发酵沼气。天然 气作为清洁能源在世界能耗构成中比重持续增加，目前已仅次于石油占第二位。来源于厌氧 发酵所产生的甲烷是有机物在厌氧和一定的温度、湿度、酸碱度等条件下，被厌氧细菌降解 或利用产生的，是清洁可再生的能源形式。在自然界中，甲烷发酵的原料十分广泛丰富，几 乎所有的有机物都可作为其发酵的原料，如农作物秸秆、人、畜和家禽粪便、生活污水、工 业和生活有机废物等【l j 。 除了作为能源以外，甲烷还是一碳化工中重要的原料，以甲烷为原料生产一碳化学品可 以进一步合成重要的化工产品。甲醇是天然气工业的重要产品，也是一碳化学的起始化合物 之一，它既是清洁的能源，又是重要的基础化工原料。 甲烷除了具有巨大经济价值之外，还是大气中含量仅次于二氧化碳( c 0 2 ) 的温室气体。 虽然大气中甲烷的含量仅为二氧化碳的l 2 7 ，但甲烷引起的温室效应是同等质量二氧化碳的 2 0 3 0 倍【2 ，3 】。据科学家们测算，在过去的2 0 0 年里，大气中甲烷的含量以每年1 的速度增 加，而由于人类活动所造成的温室效应约2 0 与甲烷排放有关 4 】。根据i p c c 报告统计【5 】，全球 大气甲烷的源总量为5 2 5t a ，其中自然源约占3 0 ，人为源约占7 0 。自然源以湿地土壤为 主，还包括淡水、海洋、白蚁和野生反刍动物等。人为源包括稻田、家养反刍动物、城市固 体废弃物和污水处理、化石燃料开采、生物体燃烧过程中的泄露等。少量甲烷会被输送到平 流层，对平流层起到了间接的破坏作用【6 j 。对极地冰芯的研究表明：工业革命前大气中甲烷 的浓度约为0 6 0 8 “l l 【5 j ，受人类活动影响，大气甲烷的浓度不断升高，目前已达到平均浓 度1 7 “l l ，北半球比南半球平均高出o 1 4 “l l ，季节波动为0 0 3 叫“7 | 。 大气中甲烷含量的持续增加主要是由于甲烷排放源的增加和甲烷汇的减少。而甲烷的唯 一生物汇为土壤中甲烷氧化菌( m e t h a i l eo x i d i z i n gb a c t 舐a ，m e t h a i l o t r o p h s ) 的氧化作用，大 约占大气甲烷汇的1 0 瞵j 。目前还没有化学催化剂能在常温下直接将甲烷转化成甲醇，而甲 烷氧化菌中的甲烷单加氧酶( m e t h a n em o n o o x y g e n a 8 e ，m m 0 ) 是唯一可以在常温下活化分 子氧，将甲烷氧化成甲醇的生物酶，从而对甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究成为当代酶催 塑鍪查奎兰堡主堂篁笙苎 化化学研究的热点之一【9 1 。 甲烷被甲烷氧化菌氧化成c 0 2 时，大气辐射潜力减少，这是因为单位摩尔c h 4 是单位摩 尔c 0 2 辐射潜力的2 0 3 0 倍，甲烷氧化产生的水分与大气总水量相比显得微不足道【1 0 】。然而， 在土壤甲烷氧化过程中，大部分c h 。c ( 一种重要的一碳物质) 被微生物转化为生物量，而 不是c 0 2 1 1 。土壤对大气甲烷源、汇贡献率分别约为6 0 和5 1 2 】。具体到某种土壤是净源 还是净汇，取决于甲烷的生成与氧化活动的相对程度。 自然湿地是由陆地生态系统和水生生态系统交互作用形成的独特生态系统。湿地具有调 节气候、蓄洪防旱、净化环境、维持生物多样性等重要的生态功能和价值 13 1 ，被誉为“地球 之肾”。湿地是目前遭受人类活动破坏较为严重的生态系统，湿地资源的同益退化已引起全世 界的广泛关注。湿地向大气排放的甲烷约占甲烷排放总量的1 5 2 0 ，被认为是全球的主要 的甲烷排放源。湿地温室气体排放与全球环境变化 1 5 舶】、构建人工湿地模型与湿地生态工 程 1 7 】、退化湿地恢复【18 1 、保护生物多样性与可持续发展【1 9 2 0 1 等成为当前的热门研究领域。目 前对农田【2 l 】、森林2 2 1 、湿地吲等土壤的甲烷氧化菌研究较多，而对退化湿地的研究很少见报 道。 综上所述，甲烷不仅是重要的化工原料，也是造成温室效应最为重要的气体之一。甲烷 氧化细菌能够参与碳循环，对减少自然界中温室气体甲烷的释放并对碳循环有着重要意义， 同时，甲烷氧化细菌对人类活动排放的甲烷气体的控制方面也有重要的应用潜力，因此甲烷 氧化细菌作为甲烷的唯一生物汇，研究其多样性和在不同土壤尤其是退化湿地的中的分布， 探索湿地退化过程中生态环境的变化对其多样性和群落结构的影响，对控制温室效应和大气 环境具有积极的意义。 1 2 甲烷氧化细菌与甲烷单加氧酶 1 2 1 甲烷氧化菌的分类与代谢途径 甲烷氧化菌( m e t l l a n eo x i d i z i n gb a c t 耐a ，m e t l l a n o 仃o p h s ) 分为好氧甲烷氧化菌( a e r o b i c m e t h a r l o t r o p h s ) 和厌氧甲烷氧化菌( a e r o b i cm e m a l l o t r o p h s ) ，厌氧甲烷氧化菌是一类在厌氧 条件下氧化甲烷的古菌，目前对其研究还较少，本文所指甲烷氧化菌均指好氧甲烷氧化菌。 甲烷氧化菌是甲基氧化菌的一个分支，其独特之处在于能利用甲烷作为唯一的碳源和能源。 几乎所有的甲烷氧化菌都是专性甲烷氧化菌。 内蒙古大学硕士学位论文 1 9 7 0 年w h i t t e n b u r y 等 2 4 】分离和鉴定了1 0 0 多种能利用甲烷的细菌，奠定了现代甲烷氧 化菌分类的基础。根据甲烷氧化菌的形态特征、代谢途径、胞质内膜精细结构、主要磷脂酸 成分和一些生理特征的不同对甲烷氧化菌进行分类，甲烷氧化菌主要分为甲基单胞菌属 ( 讹砌y f d 朋d 玎船) 、甲基细菌属( 心历y 肠施c 地厂) 、甲基球菌属( 讹砌y 三d c o c c “) 、甲基孢囊菌 属( 讹砌y 肠c y 加) 、甲基弯曲菌属( 心扬y 肠s 砌螂) 、甲基微菌属( 心砌y 肠m f c 加6 f “m ) 、 讹砌y ，d c 以厶施朋、讹砌y 肠印办以p m 等吲。如表1 1 所示，可分类为属丫变形杆菌亚门( y s u b d i v i s i o n o f m em 把d 6 口c f p 厂施) 的i 型菌，利用戊糖磷酸核酮糖途径( r i b u l o s em o n o p h o s p h a t ep a t h w a y ， r u m pp a t h w a y ) 同化甲醛，主要含1 6 一c 脂肪酸，胞内膜成束分布，细胞形态如图1 1 所示； 属于u 变形杆菌亚门( o 【s u b d i v i s i o no f m em 纪d 6 以c 纪r 尬) 的i i 型菌，利用丝氨酸途径( s 谢n e p a t l l w a y ) 同化甲醛，主要含1 8 一c 脂肪酸，胞内膜分布于细胞壁的周卧2 6 2 7 1 ，细胞形态如图 1 1 所示。近年来又发现了丝状甲烷氧化菌c 增挖d 觑r 觑p d 舾p d r a 和a d n d 娩r 抚如c 口【2 8 。2 9 】以及三 种极端嗜酸( p h 2 ) 的甲烷氧化菌，均属于疣微菌门( 殆“m i c 阳6 砌) 【3 0 3 2 1 ，极大的拓展 了对甲烷氧化菌的认识，同时也暗示了甲烷氧化菌广泛的存在于自然界中。 表1 1 甲烷氧化菌的分类 1 】 t a b l e1 1t l l ec l a s s i f i c a t i o no fm e t h 柚。仃o p h s 内蒙古大学硕士学位论文 图1 1i 型和i i 型甲烷氧化菌的扫描电镜照片3 3 】 f i g1 1t l l ei m a g eo ft y p eia n d 呻ei im e t h a n o t r o p h sb ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e 此外，人们将一类类似于尬砌y 肠c d c c 螂c 叩，甜肠f 淞的甲烷氧化菌归为x 型。x 型与i 型 相似，均具有r u m p 途径，但含有低水平的存在于丝氨酸途径中的核糖双磷酸羧化酶，该类 甲烷氧化菌的生长温度比i 型和i i 型高，d n a 中的g c 比大多数的i 型高3 钔。还有研究发 现，i i 型菌和x 型菌能固氮，而大多数i 型菌不能固氮3 5 1 。i 和x 型属于甲基球菌科 ( 尬砌y z d c o c c 以c e 口e ) ，i i 型属于甲基孢囊菌科( 尬觑y 如c 瑚砌c e 以e ) 3 6 1 。 在甲烷氧化菌细胞内，甲烷单加氧酶( m e m a n em o n o o x y g e n a s e ，m m o ) 是利用甲烷的 第一个关键酶，m m o 在分子氧的作用下将甲烷氧化为甲醇( c h 3 0 h ) ，甲醇在甲醇脱氢酶 ( m e t h a l l 0 1d e h y d r o g e n a s e ，m d h ) 的作用下氧化为甲醛( h c h o ) ，继而通过丝氨酸循环或 戊糖磷酸核酮糖途径进行细胞合成，同时在甲醛脱氢酶( f o n l l a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ，f a d h ) 和甲酸脱氢酶( f o n n a t ed e h y d r o g e i l a s e ，f d h ) 的作用下甲醛被进一步氧化成甲酸( h c o o h ) ， 最终氧化成c 0 2 和h 2 0 ，并为细胞代谢提供还原性辅酶n a d h ，c 0 2 则重新回到大气碳库【3 7 1 ， 如图1 2 。 1 2 2 甲烷单加氧酶基因及其蛋白结构 甲烷氧化菌的特征酶是催化甲烷氧化第一步反应的甲烷单加氧酶( m a t h a n e m o n o o x y g e n a s e ，m m 0 ) ，甲烷单加氧酶通过将甲烷氧化为甲醇而去除甲烷，反应式如下： c h 4 + 0 2 + n a d h 2 c h 3 0 h + n a d + + h 2 0 4 内蒙古大学硕士学位论文 图1 2 甲烷氧化菌的代谢途径例 f i g1 2t h em e t a b 0 1 i cp a m w a yo fm e m a n o t r o p h s 注：s m m o ：可溶性甲烷单加氧酶；p m m o ：颗粒性甲烷单加氧酶；c ”c ：细胞色素c ；m d h ：甲醇脱氢酶；f a d h ：甲醛 脱氢酶；f d h ：甲酸脱氢酶 甲烷单加氧酶分两种不同的类型：颗粒状或膜结合甲烷单加氧酶( p a n i c u l a t em e m a i l e m o n o o x y g e n a s e ，p m m o ) 和可溶性甲烷单加氧酶( s o l u b l em e t h a l l em o n o o x y g e n a s e ，s m m o ) 。 虽然这两种酶在细胞内具有相似的功能，但它们的基因和结构都不相同。 s m m 0 存在于细胞质中，不含卟啉铁，底物广泛，许多的烃类化合物和芳香族化合物都 能被其氧化。只有少数甲烷氧化菌属( 某些i i 型菌、x 型菌胞砌y 肠c d c c 螂c 口筇“肠饥s 和几种 i 型菌如尬矗砂肠珑d 刀口j 和施吹) ，肠m 纪阳6 f “，z ) 能产生s m m o 基斟3 9 4 0 1 。s m m o 酶复合体包 含3 个部分：蛋白a 、蛋白b 、蛋白c 。蛋白a 是一个羟化酶，含3 对亚基形成a 2 p 2 丫2 构型， 三个亚基0 c 、p 、丫的大小分别是6 0k d a 、4 5k d a 、2 0k d a ，0 【亚基上的双铁中心是甲烷氧化 作用的活性位点，蛋白b 协助电子转运与蛋白a 和蛋白c 的相互作用，蛋白c 是s m m o 的 还原酶部分，催化还原力从n a d h 到羟化酶的传送【2 5 l 。 与s m m o 不同，p m m o 存在于细胞的膜结构中而非细胞质中，底物选择性相对较窄，能 氧化五碳以内的烷烃和烯烃，不能氧化芳香烃。p m m o 催化的羟化反应需要n a d h 。编码 p m m o 的基因在g 7 0 启动子的调控下，以p m o c 4 b 的顺序成簇排列于染色体上，其中p m d b 、 一 堕茎堕奎兰堡主兰垡笙茎 p m 卅、p m o c 分别编码的a 、p 、丫亚基，大小分别是4 7k d a 、2 7 k d a 、2 3k d a ，以a 3 p 3 丫3 三 聚体的形式构成p m m o 的蛋白，每个单体均由0 【p 丫组成，结构极为复杂4 卜4 2 1 。几种不同米源 的p m m o 蛋白己得到纯化，证实具有活性的p m m o 酶中含有f e 2 + 和c u 2 + ，并和c u 2 + 紧密结 合，从而调控甲烷氧化4 3 1 。目前关于p m m o 的结构还存在很多争议。 颗粒性甲烷单加氧酶( p m m o ) 是存在于除他卿肠c 8 眈s f 知舀护括之外的所有甲烷氧化菌 中【4 4 的催化甲烷氧化的酶，该酶的最保守亚基仪一亚基的基因p m 刎是最常用于检测甲烷氧化菌 多样性的功能基因。a 1 8 9 a 6 8 2 r 是最早被设计出来用于扩增p m 卅的寡核苷酸引物嘲，其它 一些用于扩增p m 卅的引物也相继被设计出来 4 6 】。基于p m 卅序列的系统发育分析大体与1 6 s r r n a 系统发育分析一致，p 聊以作为有效的标记基因已被广泛用于自然湿地甲烷氧化菌的多 样性检测 4 7 】。 1 2 3 甲烷单加氧酶的调控 在野生型甲烷氧化菌中，m m o 的表达受铜离子调控，在低c u 2 + 浓度( 4 斗m o l l 一1 ) 时，s m m 0 关闭；反之，当c u 2 + 浓度低( 7 o ) ( e b 或去离子水在6 0 7 0 。c 水浴预热后效果更好) ， 室温静置lm i n 。 ( 7 ) 1 0 0 0 0r m i n 离心1m i n 洗脱d n a ，置于一2 0o c 保存。 2 3 2 4 矽聊鲥基因扩增产物的酶切及酶切产物的纯化 t - r f l p 常用的限制性内切酶主要是以4 个碱基为的识别位点的内切酶，我们从常用的内 切酶中选取了彳觑i 和册z 口i ，酶切位点分别是a g c t 和g c g c ，在预实验中我们发现使用 双酶切比单酶切能获得更多的限制性酶切片段，所以对该基因使用双酶切能更大限度的反应 该功能群的多样性，更接近真实情况。 彳励i 和励口i 的双酶切反应体系：1 5 l 纯化p c r 产物，2 l1 0 hb u f f e r ，0 5 “l 彳砒 i( 1 0l l ) ，o 5 肛l 乒劢口i ( 1 0u l ) ，力d d h 2 0 至2 0p l ，3 7 酶切4h 。 酶切产物的纯化步骤如下： ( 1 ) 在酶切产物中加入1 “l 百y c o g e n ( 2 0m m l ，b e c k m a nc o u l t e r ，u s a ) 2p ln a 2 a c ( 3 m ) ，2 5 倍体积的9 5 冰乙醇，1 4 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 。 ( 2 ) 弃上清，加1 0 0p l 7 0 冰乙醇，1 4 0 0 0r m i n 离心5 m i n 。 ( 3 ) 再次弃上清，加1 0 0 “l 7 0 冰乙醇，1 4 0 0 0 r m i n 离心5m i n 。 内蒙古大学侦士学位论文 ( 4 ) 弃上清，避光自然干燥后加入4 0 l 甲酰胺( b e c k m a l lc o u i t e r ，u s a ) ，溶解备用。 注：若后续实验发现d n a 的浓度低不能满足要求，可省略步骤( 3 ) ，但d n a 中可能残留 少量盐离子，不影响后续毛细管电泳即可。 2 3 2 5 限制性酶切片段的毛细管电泳分离 使用g e n o m e l a bg e x p 遗传分析系统( b e e k m a nc o u l t e r ，u s a ) 进行毛细管电泳，步骤如 下： ( 1 ) 准备样品 取已纯化的酶切产物3 9 5 肛1 ，再加入o 3 一o 5 ls i z es t a l l d a r d 一6 0 0 内标( b e c k m a i lc o u l t e r ， u s a ) ，混匀后小心转移到样品板( b e c k m a nc o u l t e r ，u s a ) 中，注意不能出现气泡，每孔 加半滴矿物油( b e c k m a l lc o u l t e r ，u s a ) 覆盖样品。 ( 2 ) 准备缓冲液 在缓冲液板( b e c k m a nc o u l t e r ，u s a ) 中滴加2 3 体积电泳缓冲液( b e c k m a nc o u l t e r ， u s a ) 。 ( 3 ) 进入程序 打开g e n o m e l a bg e x p 遗传分析系统电源和电脑，进入w i n d o w s ，双击g e n o m e l a b s y s t e m ，进入软件。 ( 4 ) 装入胶管 从软件主界面进入r u n 界面，点击“r e p l e n i s h ”_ “h l s t a l lg e lc a n r i d g e ”，出现“i n s t a l l g e lc a n r i d g e ”对话框，点击“s e tt on e w ”，打开机器下侧挡板，从胶槽中取出黄色塑料管， 装入胶管，将胶槽推回原位置，确认胶管及胶槽卡紧，点击“d o n e ”。 ( 5 ) 装入样本 点击“r 印l e n i s h ”_ “r 印1 a c ew e t t i n gt r a y ”，出现“r 印1 a c ew e t t i n gt r a y ”对话框，待 程序允许后，开启机器上方盖子，取出水槽，用去离子水清洗水槽两遍，加入适量去离子水， 擦干水槽外表面，装入水槽，转动固定器锁定水槽，放入样品板和缓冲液板，盖上防止蒸发 盖，点击“d o n e ”( 为防止毛细管损伤，须在1 5 分钟内完成上述操作) 。 ( 6 ) 输入样本信息 从软件主界面进入“s e tu p ”界面，在“s 锄p l ep l a t es e l e c t i o n ”对话框中选择“c r e a t ea n e ws 锄p l ep l a t e ”，点击“o k ”，出现9 6 格样品编号表，每列8 格样品对应一次电泳的8 个 样品，在对应样品板的编号表中输入样品名，在每一列下面的程序选择框中选择电泳程序 f r a g 一4 。输入完毕后，点击“f i l e ”_ “s a v ea s ”，输入样品板名，点击“o k ”。 内蒙古大学硕士字位论文 ( 7 ) 运行样本 从软件主界面进入r u n 界面，点击“r u ns 锄p l ep l a t e s ”快捷键，在跳出的对话框中选 择刚才创建的样品板的名称，然后选择样品的位置，点击“s t a n ”开始运行样本。电泳开始 后在“r u nc o n t r o l ”界面中检查荧光显示峰基线，一般控制基线应小于3 0 0 0r f u ，若基线过 高，应停止电泳，对毛细管进行清洗或更换；“r u nc o n t r o l ”界面能显示电泳过程中的即时状 态，包括荧光显示峰、命令行和电流、电压数据。 ( 8 ) 卸样，换水 电泳结束后，点击“r e p l e n i s h ”_ “r 印1 a c ew e t t i n g1 r a y ”，出现“r 印l a c ew e t t i n gt r a y ” 对话框，待机器程序允许之后，开启机器上方盖子，取出样品板、缓冲液板。取出水槽，用 d d h 2 0 清洗两次，加入适量d d h 2 0 ，擦干水槽外表面，放回机器，转动固定器锁定水槽，点 击d o n e ( 同样须在1 5 分钟内完成) 。 ( 9 ) 卸胶 点击“r 印1 e n i s h ”- “r e l e a s eg e lc a r t d d g e ”，从胶槽中取出胶管，塞好塑料塞，4 保 存。将黄色塑料管插回胶槽，推回胶槽，关闭挡板。在弹出的对话框中点击“i i l s t a l lp l u g ”。 ( 1 0 ) 结束 关闭仪器电源，退出软件，关闭电脑。 2 4 数据处理 t - r f l p 分析使用g e n o m e l a bs y s t e m 的f r a 舯e n ta n a l y s e 模块分析毛细管电泳结果， m a x i m u mb i nw i d m ( 合并为一个峰的区域大小) 为2 n t ，y 恤e s h o l d ( 识别为信号峰所需最 小荧光量) 为5 0 0r f u 。参数设定好以后，点击“a n a l v s i s ”，系统会对每一个样品进行分析， 通过者显示“p a s s ”，未通过者会显示未通过原因，如“n os 锄p l e ”，“n op e a l ( f o u n d ”等。未 通过的样品需重新进行毛细管电泳，显示“p a s s ”的样品进行下一步检查；软件输出被检测 到的信号峰对应的末端片段大小和峰高。 选取在三个重复中反复出现的峰，假设每个峰代表1 个操作分类单元( 0 p e r a t i o n a l 1 a x o n o m i cu n i t ，o u t ) 。多样性采用如下指数计算： 基因的丰富度指数( r i c h n e s s ) ：萨t - r f s 的个数 香农威纳指数( s h a l l i l o n _ w e i n e r ) ：h ，_ 一p f ) ( 1 0 9 妒f ) 均匀性指数( e v e n n e s s ) ：d 坷饪乙。 内蒙古大学硕士学位论文 辛普森优势度指数( s i m p s o ni n d e x ) ：d = l 一p f 2 其中t _ r f ( t e 彻i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n t ) 表示末端限制性片段，单位b p ，p f 表示某个 峰的峰面积占该样点所有峰的总面积的比例，凰矿l 0 9 2 ( $ 。 使用p r i m e r5 2 9 对t - r f l p 的结果计算b r a v - c u n i s 相似系数，并根据结果进行等级聚 类分析。使用s p s s1 3 o 对环境数据进行在z s c o r e 标准化处理，转变成无量纲的数据。使用 c a l l o c of o rw i n d o w s4 5 进行环境因子对t _ r f 分布影响的主成分分析( p r i n c i p a lc o m p o n e n t a n a l v s i s ，p c a ) 。 1 9 内蒙古大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 甲烷氧化菌的t - r f l p 图谱 甲烷氧化菌p 聊叫基因的t - r f l p 毛细管电泳的部分图谱如图3 1 所示。根据电泳图谱显 示，样点s 1 、s 2 、s 4 的t _ r f 较丰富，s 3 的7 r - r f 数量最少，s 1 、s 2 有许多共有的t _ i 讧， s 2 的各个t - r f 的峰值较其他样点均匀。9 5 b p 为样点s 1 、s 2 、s 3 共有优势t - r f ，但在s 4 即草原样点没有分布。4 5 7 b p 为s 2 的另一优势t _ r f ，1 3 1 b p ( 1 3 0 9 2 b p ) 是s 3 的另一个优势 t _ r f 。8 2 b p 、8 9 b p 是s 4 的优势t - r f ，该点的其余t _ r f 的峰值都很低。 内蒙古大学硕士学位论文 图3 1p 聊卅基因的部分t r f l p 电泳图谱 f i g3 1p a n i a lc 印i l l a r ye l e c 仃o p h o r e s i sp r o f i l e so f p m 甜b yt - r f l p 3 2 甲烷氧化菌群落的多样性 甲烷氧化菌群落的多样性指数如表3 1 。甲烷氧化菌的基因的丰富度指数( r i c h n e s s ) 从 s 1 、s 2 、s 3 逐渐降低，说明随着湖泊退水的过程甲烷氧化菌的种类逐渐减少，在s 4 即草原 样点，甲烷氧化菌种类较丰富，但均匀性指数( e v e i l i l e s s ) 很低，因此s 4 的香农威纳指数 ( s h a l l n o n w e i n e r ) 和辛普森指数( s i m p s o ni n d e x ) 都较低，因为香农威纳指数和辛普森指 数是反映丰富度和均匀度的综合指标。应用多样性指数时，具高丰富度低均匀度的群落与具 低丰富度高均匀度的群落，可能得到相同的多样性指数，所以具低丰富度和高均匀度的s 3 与s 4 的香农威纳指数和辛普森指数相近，并低于高丰富度高均匀度的s 1 、s 2 。 结合t - r f l p 电泳图谱( 图3 1 ) ，我们可知甲烷氧化细菌在样点s 1 、s 2 的具有较高多 样性和均匀性，在样点s 3 、s 4 则优势种类更明显，群落结构相对单一。 内蒙古大学硕士学位论文 表3 1 甲烷氧化菌的多样性指数 1 a b l e3 1d i v e r s i t yi n d e x e so fm em e m a n o t r o p h sa td i f 诧r e n tp l o t s 3 3 甲烷氧化菌群落结构的相似性 各样点甲烷氧化菌群落的b r a y c u i t i s 相似系数矩阵及等级聚类结果如表3 2 和图3 2 所 示。样点s 1 和s 2 之间相似系数最大，样点s 2 与s 3 、s 3 与s 4 之问相似系数相近且很小。 表3 2 样点间甲烷氧化菌群落的b r a y c u n i s 相似性矩阵 t a b l e3 2b m y c u n i ss i m i l a d t ym a t r i xo fm em e t h a n o t r o p h sb e t w e e nd i 船r e n tp l o t s h 耋 蠹 d 一 堇 辨 s 3s l s 2 图3 2 各样点甲烷氧化细菌群落的等级聚类分析 f i g 3 2d e n d r 0 伊哪o f h i e r a r c h i c a lc l u s t e ra n a l y s i so ft h em e m a n o 仰p h sn o md i f f e r e n tp l o t s 2 2 堕鍪壹奎堂堡主主篁笙苎 结合t - r f l p 电泳图谱( 图3 1 ) ，我们发现甲烷氧化菌在s 1 和s 2 之间群落相似度高， 群落分布连续性较强，s 1 的很多t r f 在s 2 均有分布，并且相对丰度提高，部分种类在s 2 消失。对于样点s 3 ，存在于s 1 、s 2 的种类大部分消失，且s 3 与s 4 无共有的优势t r f ，说 明样点s 3 甲烷氧化细菌群落既不同于s 2 也不同于s 4 。 所以，由样点s 1 到s 4 甲烷氧化菌样点问群落相似度逐渐降低，说明甲烷氧化菌群落经 历了由适应水生环境向适应陆生环境的演变，处于动态演替中。 3 4 甲烷氧化菌群落与土壤环境因子的主成分分析 使用生态学软件c a n o c of o rw i n d o w s4 5 进行主成分分析( p c a ) ，得到了反应样点、物 种、土壤环境因子之间关系的p c a 排序图。排序图能直观的反应各因素之间的关系，从中我 们能以相对的概念解读出定性的信息，而各因素之问相互关系的量化信息需要从分析过程中 生成的：i ：1 0 9 文件中解读。 3 4 1p c a 排序图的解读 在使用c a i l o c o 作出的p c a 排序图中( 图3 3 ) ，物种和数量型环境因子用箭头表示，样 方用符号表示。 排序图中，样方点之间的距离远近可以代表样方之间的相异程度。如图3 3 ，样点s 1 、s 2 距离较近，相似度较高，与s 3 、s 4 距离较远，相似度小。 排序图中，从样方的点向环境因子的箭头做投影，投影点的位置可以近似表示该环境因 子数值在这些样方内的排序。由于环境因子均已经标准化，所以环境因子箭头的起始点也可 以认为是平均值的位点。如果样方的投影点在箭头的反向延长线上，则表示该物种在此样方 内多度小于平均值；反之，则大于平均值。根据排序图( 图3 3 ) 和各样点理化性质及生物学 活性( 表2 1 ) 可知： p h 、基础呼吸( b r ) 在s l 、s 2 较高，在s 4 最低； 诱导呼吸( p r ) 在s 1 、s 2 、s 3 较高，在s 4 较低； 含水量( s w c ) 、硝态氮( n 0 3 一- n ) 在s 1 、s 2 较高，在s 3 最低； 碳氮比( c n ) 、容重( b d ) 在s 2 、s 3 较高，在s 1 、s 4 较低； 微生物量碳( s m b c ) 、微生物量氮( s m b n ) 在s 3 、s 4 较高，在s 1 、s 2 较低； 铵态氮( n h 4 + _ n ) 在s 4 较高，在s 1 、s 2 、s 3 较低； 塑茎直奎堂堡主兰垡堡茎 有机质( s o m ) 在s 4 较高，在s 3 最低。 排序图中，从代表每个样方的点投影到某一物种的箭头，投影点的相对位置可以代表该 物种这些样方中多度值排序情况。物种箭头的起始点的位置表示物种多度平均值位置，如果 样方的投影点在箭头的反向延长线上，则表示该物种在此样方内多度小于平均值；反之，则 大于平均值。根据排序图( 图3 3 ) 和t r f l p 的结果( 图3 1 ) 可知： o o 0 s 3 s m s m b c 融 ，n 鞋杖 丝s t 确 p r b 嘭名 彤飞毒 s w c s o m n p h o b r s 2 1 o a x i s 2 。髫匙3 - 9 5 8 2 j么勿1 2 7 彳 ，。蒯 0 ：6 0 1 6 9 图3 3 甲烷氧化菌群落与土壤环境因子的主成分分析( p c a ) f 远3 3p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sb i p l o to fm em e m a n o 仃o p h si n