（分析化学专业论文）功能化硅壳纳米颗粒应用于质粒dna分离纯化的研究.pdf

硕 学位论丈 摘要 随着d n a 测序、基因治疗、基因疫苗等领域的广泛发展，对拓展各种高效的质粒 d n a 分离纯化方法提出了越来越迫切的需求。硅壳纳米颗粒作为一种新型功能性纳米 材料，由于其制备简便，具有良好的化学稳定性、较大的比表面积及较好的生物相容性 等特点，在生物分离领域表现出了广泛的应用前景。本论文利用氨基化硅壳纳米颗粒 氨基化硅壳磁性纳米颗粒与质粒d n a 的静电吸附原理，建立了基于氨基化硅壳纳米颗 粒氨基化硅壳磁性纳米颗粒的质粒d n a 快速分离纯化方法。该方法免去了传统分离纯 化质粒d n a 的酚氯仿法的毒副作用和操作繁杂等缺点，为d n a 的分离纯化提供了一 种新的手段和方法，同时也进一步拓展了功能化硅壳纳米颗粒在生物医学研究中的应 用。本论文还发展了一种基于硅壳荧光纳米颗粒的肿瘤检测新方法。 1 、氨基化硅壳纳米颗粒分离纯化质粒d n a 的研究 利用中性p h 环境下带j 下电的氨基化硅壳纳米颗粒与带负电的质粒d n a 的静电相 互作用原理，发展了一种基于氨基化硅壳纳米颗粒的质粒d n a 分离纯化方法。以 p e g f p n 3 质粒d n a 的分离纯化为目标，分别考察了氨基化硅壳纳米颗粒对质粒d n a 的吸附能力，以及吸附在氨基化硅壳纳米颗粒表面的质粒d n a 解离情况，在此基础上， 进一步考察了采用氨基化硅壳纳米颗粒分离纯化获得的质粒d n a 的生物活性。结果表 明质粒d n a 可以很好的吸附在氨基化硅壳纳米颗粒上形成氨基化硅壳纳米颗粒一质粒 d n a 复合物，同时成功实现了氨基化硅壳纳米颗粒一质粒d n a 复合物中质粒d n a 的 解离，而且通过该方法分离纯化的质粒d n a 依然具有很好的生物活性。 2 、氨基化硅壳磁性纳米颗粒分离纯化质粒d n a 的研究 利用中性p h 环境下带正电并在外磁场作用下具有超顺磁性的氨基化硅壳磁性纳米 颗粒与带负电的质粒d n a 的静电相互作用原理，发展了一种基于氨基化硅壳磁性纳米 颗粒的免离心质粒d n a 分离纯化方法。以p e g f p n 3 质粒d n a 的分离纯化为目标， 分别考察了氨基化硅壳磁性纳米颗粒对质粒d n a 的吸附性能，以及影响吸附在氨基化 硅壳磁性纳米颗粒表面的质粒d n a 解离效果的因素，同时将本法跟传统分离纯化质粒 d n a 的方法进行了比较，在此基础上，进一步考察了采用氨基化硅壳磁性纳米颗粒分 离纯化获得的质粒d n a 的生物活性。结果表明在外磁场作用下，可以实现氨基化硅壳 磁性纳米颗粒质粒d n a 复合物的快速分离，同时成功实现了氨基化硅壳磁性纳米颗粒 一质粒d n a 复合物中质粒d n a 的快速解离，并且最终解离效果对解离状态、解离温 度、解离时间和次数等依赖不明显。同时本方法比传统方法具有更好的分离纯化效率， 而且通过该方法分离纯化的质粒d n a 依然具有很好的生物活性。 3 、硅壳荧光纳米颗粒一氨基葡萄糖复合物( f s n p s d g ) 与肿瘤细胞的作用研究 基于肿瘤细胞葡萄糖代谢旺盛的机理和本实验室发展成熟的硅壳荧光纳米颗粒标 基于功能化硅壳纳米颗粒在质粒d n a 分离纯化中的应用 记技术，发展了一种新型的肿瘤检测方法。通过物理吸附法制备了硅壳荧光纳米颗粒一 氨基葡萄糖复合物( f s n p s d g ) ，并选择三株肿瘤细胞和一株正常细胞作为考察分析对 象，基于肿瘤细胞表面高表达对葡萄糖具有高亲和力的葡萄糖转运蛋白考察了 f s n p s d g 对固定后肿瘤细胞的识别情况，在此基础上进一步考察了f s n p s d g 与活细 胞的作用研究，即肿瘤细胞对f s n p s d g 吞噬情况。结果显示利用物理吸附法制备出 f s n p s d g 可以较好的识别固定后的肿瘤细胞，并且肿瘤细胞对f s n p s d g 吞噬量明显 高于正常细胞。 关键词：氨基化硅壳纳米颗粒；氨基化硅壳磁性纳米颗粒：静电吸附；纯化；质粒d n a i i i 硕【：学位论文 a b s t r a c t t h ed e m a n df o re f f i c i e n tp r o d u c t i o nm e t h o d so fp l a s m i dd n a h a si n c r e a s e dv a s t l yf o r w i d e l ya p p l i c a t i o n si ng e n et h e r a p y , g e n ev a c c i n e ：d n as e q u e n c ea n ds oo n a sak i n do f n e wf u n c t i o n a l i z e dn a n o m a t e r i a l s ，s i l i c ac o a t e dn a n o p a r t i c l e sh a v er e c e i v e dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o n si nt h ef i e l do fb i o s e p a r a t i o nf o rt h e i rb i o c h e m i c a ls t a b i l i t y , l a r g es u r f a c ea r e aa n d g o o db i o c o m p a t i b i l i t y i nt h i ss t u d y , w ep r o v i d e dan e wm e t h o df o r t h ep u r i f i c a t i o no f p l a s m i dd n a b a s e do nt h ee l e t r o s t a t i ca d s o r p t i o np r i n c i p l e so fa m i n o s i l i c ac o a t e d ( m a g n e t i c ) n a n o p a r t i c l e s w i t h p l a s m i d d n a t h i sm e t h o da v o i d st h e d i s a d v a n t a g e s o f p h e n o l c h l o r o f o r mt e c h n i q u es u c ha st o x i c i t ya n dc o m p l e x e so p e r a t i o n t h er e s u l t sr e p o r t e d h e r eo p e nu pn e w p e r s p e c t i v e sf o ra m i n o s i l i c ac o a t e d ( m a g n e t i c ) n a n o p a r t i c l e si nt h ef i e l do f b i o m e d i c i n ea n dw i l lh a v eg r e a tp o t e n t i a li np u r i f i c a t o no fg e n o m e a n dan o v e lm e t h o df o r m o n i t o r i n gc a n c e rw a sd e v e l o p e db a s e do nt h e t h es i l i c ac o a t e df l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e s 1 r e s e a r c ho np l a s m i dd n a p u r i f i c a t i o nu s i n ga m i n o - s i l i c ac o a t e dn a n o p a r t i c l e s b a s e do nt h ee l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o nb e t w e e nt h ea m i n o s i l i c ac o a t e dn a n o p a r t i c l e s ( a s n p s ) w i t hp o s i t i v es u r f a c ec h a r g ea n dp l a s m i dd n a w i t hn e g a t i v ec h a r g ea tn e u t r a lp h ， a na p p r o a c hf o rt h ep u r i f i c a t i o no fp e g f p - n 3p l a s m i dh a sb e e nd e v e l o p e d t h ea d s o r p t i o n p e r f o r m a n c eo fa s n p sa n dt h ep l a s m i dd n ai s o l a t e df r o mt h ea s n p s p l a s m i dd n a c o m p l e x e sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d m e a n w h i l e ，t h eb i o a c t i v i t yo fp u r i f i e dp l a s m i dd n au s i n g a s n p sw a sa l s os t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep l a s m i dd n ac a nb ea b s o r b e dt ot h e a s n p sv e r yw e l lt of o r ma s n p s p l a s m i dd n a c o m p l e x e s a n dt h ep l a s m i dd n a w a s i s o l a t e df r o mt h e a s n p s p l a s m i d d n ac o m p l e x e s s u c c e s s f u l l y f u r t h e r m o r e ，t h e b i o a c t i v e t i t yo fp u r i f i e dp l a s m i dd n au s i n ga s n p sw a sv e r yw e l l 2 r e s e a r c ho n p l a s m i dd n ap u r i f i c a t i o nu s i n ga m i n o s i l i c ac o a t e dm a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s b a s e do nt h ee l e c t r o s t a t i c a d s o r p t i o n b e t w e e nt h ea m i n o s i l i c ac o a t e d m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s ( a sm n p s ) w i t hp o s i t i v es u r f a c ec h a r g ea n dp l a s m i dd n aw i t hn e g a t i v ec h a r g e a tn e u t r a lp h ，a na p p r o a c hf o r t h ep u r i f i c a t i o no fp e g f p n 3p l a s m i dw i t h o u tc e n t r i f i g u a t i o n h a sb e e nd e v e l o p e d t h ea d s o r p t i o np e r f o r m a n c eo fa s m n p sa n dt h ef a c t o r st h a tw o u l d a f f e c tt h er e s u l to fi s o l a t i o nw e r es t u d i e d m e a n w h i l e ，t h ep u r i f i e de f f i c i e n c yo ft h i sm e t h o d w a sc o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a lm e t h o d a tl a s t ，t h eb i o a c t i v i t yo fp u r i f i e dp l a s m i dd n a u s i n ga s m n p sw a ss t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea s m n p s p l a s m i dd n a c o m p l e x c a rb es e p a r a t e dq u i c k l yu n d e rt h em a g n e t a n dt h ep l a s m i dd n aw a si s o l a t e ds u c c e s s f u l l y f r o mt h ea s m n p s - p l a s m i dd n a c o m p l e x e s w ea l s of o u n dt h a tt h er e s u l to fi s o l a t i o nd i dn o t o b v i o u s l yr e l i e do nt h et e m p e r a t u r e ，c o n d i t i o n ，t i m ea n dt i m e so ft h ei s o l a t i o n i na d d i t i o n ， i v 基于功能化硅壳纳米颗粒在质粒d n a 分离纯化中的应用 t h ee f f i c i e n c yo ft h ep l a s m i dd n a p u r i f i c a t i o nu s i n ga s m n p sw a sb e t t e rt h a nt r a d i t i o n a l m e t h o d a n dt h eb i o a c t i v e t i t yo fp u r i f i e dp l a s m i dd n a u s i n ga s m n p s w a sv e r yw e l l 3 r e s e a r c ho nt h ej n t e r a t i o nb e t w e e nc a n c e rc e l l sw i t hs i l i c ac o a t e df l u o r e s c e n t n a n o p a r t i c l e s - g l u c o s a m i n ec o m p l e x e s ( f s n p s d g ) an o v e lm e t h o df o rm o n i t o r i n gc a n c e rw a sd e v e l o p e db a s e do nt h er a p i dm e t a b o l i z a t i o n o fg l u c o s ei nc a n c e rc e l l sa n dt h es i l i c ac o a t e df l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e sl a b e lm e t h o d t h e s i l i c ac o a t e df l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e s g l u c o s a m i n ec o m p l e x e s ( f s n p s - d g ) w a sp r e p a r e d b yp h y s i c a la d s o r p t i o n t h r e ek i n d so fc a n c e rc e l l sa n do n ek i n do fn o r m a lc e l lw e r ec h o s e f o rt h ea n a l y s i s ，r e s p e c t i v e l y t h e r e c o g n i t i o no ff s n p s - d gt oi m m o b i l i z e dc a n c e rc e l l s w a si n v e s t i g a t e db a s e do i lt h e p r i n c i p l e t h a t u c o s et r a n s p o r t o rh i g he x p r e s so nt h e m e m b r a n c eo fc a n c e rc e l l s a n dt h e nu p t a k eo ff s n p s d gb yt h ec a n c e rc e l l sw a sf u r t h e r s t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ef s n p s d gd a nr e c o g n i z et h ei m m o b i l i z e dc a n c e r c e l l sv e r yw e l l ，a n dt h eu p t a k eo ff s n p s - d gb yc a n c e rc e l l sw a sm o r ed e a r l yt h a nt h e n o r m a lc e l l s k e yw o r d s ：a m i n o - s i l i c ac o a t e dn a n o p a r t i c l e s ( a s n p s ) ；a m i n o s i l i c ac o a t e dm a g n e t i c n a n o p a r t i c t e s ( a s m n p s ) ；e l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o n ；p u r i f i c a t i o a ；p l a s m i dd n a v 硕l ：学位论文 本文常用英文缩略词表 v l 湖南大学 学位论文原创性说明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名： 罐囱珐日期：加吕年7 月i1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密卧 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 寝淘落日期：弘髫年，7 月i1 日 撕聂帅 硕士学位论文 第1 章绪论 自2 0 世纪5 0 年代w a t s o n 和c r i c k i l 】提出d n a 双螺旋模型以来，分子生物学在广 度和深度上都获得空前的发展。核酸作为分子生物学研究的基础，在生物领域尤其是遗 传学方面的研究日渐深入，在此基础上产生的基因工程技术已在医药【2 5 。、农业【6 j 、畜牧 业t 7 - 8 】等领域获得广泛应用。如：利用基因工程技术开发新型治疗药物成为了制药行业 的一支奇兵，每年平均有3 4 个新药或疫苗问世，诸如人胰岛素 9 1 、人尿激酶原t l 劭、人 生长激素f 1 1 1 、干扰素 1 2 】、激活剂【1 3 】、乙肝疫苗【1 4 】等已广泛应用于治疗癌症、肝炎、发 育不良、糖尿病和一些遗传病上，在很多领域特别是疑难病症上，起到了传统化学药物 难以起到的作用1 3 1 5 6 1 ；运用基因手段诊断，从基因中寻找病根，为一些“不治之症” 寻找了新的诊断渠道，其特异性非常强，只要检测出该病变基因的存在就能确诊，目前， 我国已具有对珠蛋白基因缺陷性贫血、苯丙酮尿症、血友病、杜氏肌营养不良症等遗传 疾病进行基因诊断的能力【1 7 】；运用基因工程技术或基因打靶的手段，将病毒的基因杀灭， 插入校正基因的基因治疗方法已经变革了整个医学的预防和治疗领域。 在上述这些技术实现的过程中，核酸的分离纯化是一个最基本也是最重要的前提， 如游离核酸与肿瘤、妊娠相关性疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤、急救医学等 有着密切关系【墙】，它的分离检测对疾病的早期诊断、分期、监测、预后判断等有非常重 要的意义；质粒是细胞内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞 一些特殊表型，随着基因操作技术的发展，质粒克隆载体已成为分子生物学领域内一个 倍受关注和进展非常迅速的研究方向，它在基因测序和基因治疗中发挥着极其重要的作 用，在这里质粒分离纯化的意义也是不言而喻的。因此，本章将重点综述针对不同来源 核酸的传统的分离纯化技术以及现在不断发展的技术在核酸分离纯化中的应用，然后在 此基础上提出本论文的主要构思。 1 1 核酸分离纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离纯化主要是指将核酸与 蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离纯化核酸时应遵循的原则就是要保 证分离纯化的核酸分子一级结构的完整性以及排除其他分子的污染9 1 。 1 2 传统的核酸分离纯化方法 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大 分子物质的分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。首先核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来的第一步是细胞裂解，细胞裂 基于功能化硅壳纳米颗粒在质粒d n a 分离纯化中的应用 解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。其次是酶处理，即在核酸提取过程 中，可通过加入适当的酶使不需要的物质降解，以利于核酸的分离与纯化。最后就是核 酸的分离纯化，核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物 质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，可选用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等 方法将核酸分离纯化【1 9 】。 1 2 1d n a 的分离纯化 为了分离纯化得到结构完整的d n a ，针对不同来源的d n a 建立了不同的分离纯化 方法。下面将对动物、植物、微生物来源的d n a 和d n a 片段的传统分离纯化方法进 行简要的介绍。 1 动物基因组d n a 的分离纯化 酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法是提取d n a 最为经典的方法，目前很 多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均利用蛋白酶k 和十二烷 基硫酸钠( s d s ) 消化破碎细胞。酚抽提法是b l i n 和s t a f f o r d t 2 0 】在g r o s s b e l l a r d 等人工 作的基础上改进而成，用酚氯仿去除蛋白质，最后用乙醇沉淀d n a 。异丙醇法是先用 酚氯仿去除蛋白质，再用异丙醇沉淀d n a 。甲酰胺法是基于k u p i e c1 9 8 7 年的报道【2 1 1 ， 利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与d n a 的结合，然后利用透析来处理d n a 样品。这 些经典方法获得的d n a 纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长， 且所用试剂具有一定的毒性。 2 植物基因组d n a 的分离纯化 利用基因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领 域，植物基因工程操作离不开植物基因组总d n a 的制备，不同植物的核酸结合蛋白的 情况各不相同，因而要采取不同的提取方法嘤】。由于植物中次生代谢产物多酚类化 合物可介导d n a 降解，而多糖的污染也是影响植物d n a 纯度最常见的问题，这些多 糖能抑制限制酶、连接酶及d n a 聚合酶等酶类的生物活性。因此要从富含多酚和多糖 的植物组织中分离获得高质量的基因组d n a 也并非易事【2 3 1 。 分离纯化前首先是植物样品的采集和保存，植物组织材料的采集与保存对提取 d n a 的产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料，采集的过 程中应尽可能使组织材料保持水分，在取样时立即用浸湿的纱布包裹采集的组织材料， 放置在密闭的冰盒中，这样可使组织材料3 5 天仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时， 在可能的条件下冷冻保存( 如放置于液氮中) ；当不具备冷冻条件时，最好用装有无水 c a s 0 4 的瓶子分别保存，使其迅速干燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进 2 硕上学位论文 行d n a 的提取工作。对具有大量次生代谢物( 如丹宁、酚类、醌类等) 的植物材料， 应尽可能采集幼嫩组织，最好进行冷冻保存并在短时间内进行d n a 提取。植物组织材 料的化学保存法，如乙醇、丙二醇处理法，通常会导致d n a 剧烈降解，因此不作为推 荐的保存方法【2 4 l 。对于采集回来的样品如要长期保存，应经液氮处理后贮存在8 0 c 冰 箱或直接储放于液氮中，且在与提取缓冲液接触前，应防止冰冻的样品在空气中融化， 否则酚类易被氧化。 传统常用的分离纯化方法是十六烷基三乙基溴化铵( c t a b ) 法和十二烷基磺酸钠 ( s d s ) 法。c t a b 是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐 溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使d n a 和多糖分开， 再用乙醇沉淀d n a 而除去c t a b 。在该法中使用的聚维酮( p v p ) 与多酚结合形成复 合物，从而可有效避免多酚类化合物介导的d n a 降解【2 6 1 。s d s 法避免了c t a b 法中试 验步骤多、操作繁琐的不足之处，利用s d s t r i s c 1 。e d t a 等直接裂解细胞使其释放出 d n a 的方法。在该法后续的d n a 纯化过程中通常采用酚氯仿处理，但对于植物d n a 纯化不是一个很好的选择，因为酚的使用可降低d n a 的提取效率和纯度。 3 真菌d n a 的分离纯化 对真菌d n a 的提取关键是破碎细胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷冻处理增加 细胞壁脆性的物理破壁法。在这两种方法中酶解破壁法较为简单，易于操作和控制，而 物理破壁法在处理过程中容易造成细胞核的大量破损。在提取获得核酸蛋白质复合物 后，对其中蛋白质的沉淀也多采用传统的氯仿异戊醇沉淀法或高盐沉淀法【2 7 1 。 4 质粒d n a 的分离纯化 质粒是一种在细菌和酵母中自然存在的小的双链d n a 环状分子，它们以独立的单 位进行复制。虽然它们只占据了宿主细胞总d n a 一小部分，但它们常常带有重要的基 因，如抗抗菌素基因。正由于质粒d n a 较小，并带有抗性基因，使之在重组d n a 技 术中得到广泛的应用【2 引，而获得大量高纯化的质粒d n a 分子也越来越成为分子生物学 实验室项最基本和重要的工作。通常在质粒d n a 的制备中细菌的裂解方法很多，如 碱裂解法、去污剂法、沸水热裂法、有机溶剂法和溶菌酶法等，不同方法各有利弊，一 般要根据质粒性质、宿主菌的特征及后续的纯化方法等多种因素综合后加以选择。其中 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒d n a 的方法，其基本原理为：在p h1 2 0 1 2 6 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体d n a 变性，而共价闭环( c c ) 质粒d n a 仍 为自然状态。将p h 调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体d n a 之间交联形成 不溶性网状结构。大部分d n a 和蛋白质在去污剂s d s 的作用下形成沉淀，而c c 质粒 d n a 仍然为可溶性状态。通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体d n a ，r n a 及蛋 基于功能化硅壳纳米颗粒在质粒d n a 分离纯化中的应用 白质，质粒d n a 尚在上清中。进一步的纯化方法常用的有酚氯仿法、聚乙二醇法和氯 化铯溴乙锭( c s c l e b ) 梯度平衡超速离心法。c s c l e b 纯化质粒d n a 是一种沉降平 衡离心，c s c l 介质密度为1 7g c m 3 ，超速离心一段时间后，形成1 1 9 0 5 2g c m 3 的密度 梯度。其一利用质粒d n a 、染色体d n a 、r n a 及蛋白质的密度不同，在c s c i 密度梯 度中平衡于各等密度位置，达到纯化质粒d n a 的效果。在中性c s c l 溶液中，其中r n a 的密度为2 0g c m 3 ，沉积于管底，蛋白质密度为1 3 1 4g c m ) ，浮于液面。不同构型的 质粒d n a 分子及细菌染色体d n a 的浮力密度均为1 7g c m 3 左右，如大肠杆菌染色体 d n a 为1 7g c m 3 ，由x 1 7 4 为1 7 1 8g c m 3 ，区别不大，形成的区带较接近，回收时不 易操作，故需加入e b 以增加这两者之间的密度差异。其二，利用不同的分子构型与 e b 的结合能力不一，不但可以较好的分开质粒d n a 与细菌染色体d n a ，而且可以分 开共价闭环( c c ) 质粒和开环( o c ) 或线性( l ) 质粒d n a 。e b 与d n a 分子结合后， 使得d n a 密度减小，c c 质粒分子具有超螺旋三级结构，e b 不易插入，所以与e b 的 结合量少，密度下降少，而线性( l ) 和开环( o c ) 质粒分子为正常的d n a 双螺旋二 级结构，当结合e b 达到饱和时，在中性c s c i 溶液中，c c 质粒比线性或开环质粒分子 的密度大0 0 4 ，从而可以相互分开，达到纯化闭环质粒d n a 分子的目的【2 9 j 。 5 d n a 片段的分离纯化 在含有各种不同大小的d n a 混合物中，分离纯化特定分子量的d n a 片段，是基 因工程技术中的基础工作。虽然层析、选择性沉淀等方法可达到上述目的，但是实验室 中最常采用的传统方法是凝胶电泳分离和回收的方法，主要为d e a e 纤维素纸插片电 泳法和电泳洗脱法。 ( 1 ) d e a e 纤维素纸插片电泳法 本法是d r e t z e n 于1 9 8 1 年 3 0 l 在g i r v i t z 的方法基础上改进而成。d e a e 纤维素即二 乙基氨基乙基纤维素，在它的纤维骨架链上，连接有许多阳离子交换基团，是一种吸附 阴离子基团的阴离子交换纤维素，它能结合带负电荷的d n a 分子，d n a 片段经琼脂糖 凝胶电泳分离后，将感兴趣的电泳d n a 片段转移至d e a e 纤维素纸上，然后再用高离 子缓冲液从d e a e 滤膜上洗脱d n a 。本法的优点是操作简单，可以同时进行多个d n a 片段的回收，对于5k b 以下的d n a 片段回收率好，回收d n a 样品的纯度非常高，可 用于转基因动物实验。此法的缺点是对于5k b 以上的d n a 片段的回收率较低，结合在 d e a e 滤膜上的单链d n a 也很难洗脱，不宜用于1 5k b 以上的双链d n a 片段及任何大 小的单链d n a 回收。 ( 2 ) 电泳洗脱法 这种方法是特定的d n a 片段电泳迁移出凝胶介质，进入1 个可以回收的固定的小 容积溶液中。再从该溶液中纯化d n a 片段。其中有许多不同的操作方法，主要是透析 4 硕上学位论文 袋和非透析袋两大类。电泳洗脱d n a 片段的最大特点在于用其它方法回收率差的d n a 有较好的回收效果，其质量可以满足d n a 酶切反应和d n a 连接反应的要求。其中包 括透析袋电泳洗脱法、槽沟电泳洗脱法、“v 字形内槽电洗脱法和“眼镜 槽电洗脱 法等。 1 2 2i 埘a 的分离纯化 2 0 世纪6 0 年代w a t s o n 和c r i c k 的d n a 双螺旋结构模型引发了r n a 研究的第一 个高潮，由此揭示了r n a 的翻译功能。7 0 年代核酶( r i b o z y m e ) 、反义r n a ( a n t i s e n s e r n a ) 、r n a 剪接( r n a s p l i c i n g ) 与编辑( e d i t i n g ) 等的陆续发现导致r n a 研究出现 了第二个高潮。近年来r n a i 和s i r n a 的研究、r n a 催化活性的发现以及k n a 组学 ( r n o m i c s ) 概念的提出预示着r n a 研究的第三个高潮的到来【3 。r n a 的分离与鉴定 构成了r n a 研究的基础领域之一，如一些基础性的实验技术：n o r t h e r nb l o t 分析、r n a 保护性实验、原位杂交和逆转录p c r 等都需要高质量和高纯度的r n a 样品。 1 总r n a 的分离纯化 分离纯度较高、完整性较好的r n a 分子对于分子克隆的实验是非常重要的，而且 是进行基因表达分析的基础。传统常用的分离纯化方法如异硫氰酸胍氯化铯超速离心 法、盐酸胍有机溶剂法和氯化锂尿素法等对大多数的动植物材料都能得到质量较好的 r n a 样品。 ( 1 ) 异硫氰酸胍氯化铯超速离心法 异硫氰酸胍氯化铯超速离心法是使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍有效抑制r n a 酶 的活性，经过起始密度为1 7 8g m l 的c s c l 介质，进行密度梯度超速离心，r n a 沉淀 于底部，而d n a 与蛋白质在上清液中，使用这种方法，不但能得到高质量的r n a ，而 且能同时分离出细胞染色体d n a 。本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的 组织标本及富含r n a 酶的组织细胞( 如胰腺) 的r n a 提取尤为适宜。此法提取r n a 的质量好和成功率高，已成为提取哺乳动物细胞r n a 的常规方法，其缺点是操作复杂、 流程长，一次提取的样品数量有刚3 2 j 。 ( 2 ) 盐酸胍有机溶剂法 本法由m a c d o n a l d1 9 8 71 3 3 】年在s t r o m a n 报道【3 4 】的方法基础上改进而成，适用于没 有超速离心设施的情况下提取细胞总r n a 。它利用盐酸胍抑制r n a 酶，匀浆裂解细胞， 有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀r n a 分子而去除d n a ，提取的r n a 质量 较好，但整个操作过程繁杂费时。 基于功能化硅壳纳米颗粒在质粒d n a 分离纯化中的应用 ( 3 ) 氯化锂尿素法 本方法是利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制r n a 酶，3m o l ll i c l 选择沉淀 r n a 。其缺点是有时会存在d n a 污染，l i c l 沉淀r n a 会丢失一些小分子量的r n a ， 如5sr n a 等，优点是快速简捷，尤其适用于大量样品少量组织细胞的r n a 提取。其 质量可以满足n o r t h e r n 分析，o l i g o ( d t ) 提取m r n a ，s i 核酸酶或r n a s e 保护试验等。 此方法每1 0 7 个细胞能提取总r n a 约1 0l a g 。 2 m r n a 的分离纯化 通常，总r n a 的分离只是m r n a 纯化的第一步。最普遍的m r n a 分离依赖于与 真核生物m r n a3 端的p o l y ( a + ) 互补的o l i g o d t 序列。寡m r n a 的提取已有许多 成功的方法，如超速离心法、免疫法等，目前以寡聚( d t ) 纤维素柱层析法最为有效， 已成为常规方法。此法利用m r n a3 末端含有p o l y ( a 十) 的特点，在r n a 流经寡聚 ( d t ) 纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，m r n a 被特异地结合在柱上，当逐渐降 低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，m r n a 被洗脱，经过两次寡聚( d t ) 纤维柱后，即可得到较高纯度的m r n a 3 5 j 。 1 3 现代技术在核酸分离纯化中的应用研究 通过传统经典技术得到的核酸是高纯度的，并适用于大部分分子生物学技术。然而 随着“后基因组时代 的来临，这些传统的核酸提取技术因操作繁琐、提取效率低、费 时费力或使用有毒的化学试剂且不易实现自动化仪器操作等原因，已不适应分子生物技 术的发展要求【1 9 1 。随着生物技术的飞速发展，许多快速、高效的技术方法不断的应用于 核酸分离分析。从近年来国内外的各种研究方法比较表明：简化操作程序，用非有机溶 剂法代替传统的有机溶剂法，减少提取过程对人的损伤，采与免疫技术相结合，用各种 固相吸附作用等已成为其发展趋势。 1 3 1 毛细管电泳技术应用于核酸分离检测的研究 毛细管电泳是以高压电场为驱动力、以毛细管为分离通道，依据试样中各组分间淌 度和分配行为上的差异而实现分离的一类分离技术。在过去的十年里，毛细管电泳发展 迅速，正逐渐成为d n a 分离 3 6 - 4 7 】的主要方法，在人类基因组测定中发挥了巨大的作用。 由于它有更高的分辨率、更高的灵敏度，且能分离微量物质，分离时间短，并有自动化 的可能，因而它比普通的凝胶电泳更为优越。在毛细管电泳中，常使用多聚物溶液作为 基质。甚至低浓度的多聚物溶液，而不是交链的多聚物。在电场的作用下，d n a 在多 聚物溶液中迁移，与多聚物分子相碰撞而分离。d n a 与多聚物分子碰撞后，发生短暂 6 的交联，并拖动其菸同向前运动，从而降低了d n a 的迁移率。越大的d n a 分子越有 可能与更多的多聚物相交联，因而运动速度越慢，从而达到分离目的。对于小分子量的 d n a ，使用高浓度低分子量的多聚物，分离效果好；对于大分子最的d n a 则应使用 低浓度高分子量的多聚物。毛细管电泳的峰问距离主要与基质特征、旗质浓度、电场强 度和毛细管长度有关：峰宽主要与基质浓度、电场强度、毛细管直径和毛细管长度有关 4 s 1 目前，毛细管电泳在d n a 分离中的应用正不断完善，特别是在其基质研究方面 正不断寻找低粘滞度，切粘滞度可调，具有包被毛细管内径能力的“理想”基质。1 9 9 9 年h a r t 等1 在传统的应用于毛细管电泳d n a 分离中的聚合物基质多是粘滞度过高而较 难泵入到毛细管中的基础上基于低分子量的羟基丙基甲基纤维桑发展了一种新的分离 d n a 片段的筛分基质，在相同的分离效果下此筛分基质比传统的筛分垫质的粘滞度至 少低一个数量级。2 0 0 5 年t a b u c h i 等【4 1 利用细菌纤维素作为添加剂发展了一种新的d n a 分离基质，如图l1 ，这种细菌纤维索本身有着从微米级到纳米级的三维空间结构，添 加这种材料到低浓度的聚合物基质中形成双重网格可以达到高分辨的d n a 电泳分离。 图i i 筛分基质示意图：a ) 细菌纤堆素基质的s e m 成像：b ) 细菌纤维煮基质的分离示意圈 f i g u r e l 1 d i a g r a m so f s i e v i n g m a t r i x 凸：劬s e m i m a g e so f b a c t e r i a lc e h u l o s e m e d i u m ；b ) s c h e m a t i c d i a g r a m f o rs e p a r a t i o n i nb a c t e r i a lc e l l u l o s e m e d i u m 毛细管筛分屯泳分为凝胶筛分电泳和无胶筛分电泳h ”。前者以凝胶作为筛分介质， 分离效率高但制拄技术要求高聚合反应受多种因素( 如缓冲液组成、氧含量、引发 剂和催化剂浓度以及反应温度等) 影响，易产生气泡，而造成分离过程的中断。此外， 由于聚合物直接在管内聚合，些重要的物理性质( 如：粘度、分子量等) 也无法测量。 后者一般以非交联的高分子化合物溶液作筛分介质，由于其具有便于注入和冲出毛细 管，易实现高效自动化分离等优点，因此在上世纪9 0 年代未绝大部分的基因排序中心 放弃凝胶电泳而选择使用无胶筛分的自动化毛细管阵列( c a p i l l a r ya r r a ye l e e t r o p h o r e s i s ， c a e ) ，这对人类基因组计划的提前完成起到了极大的促进作用。 1 3 2 微芯片毛细管电泳技术应用于核酸分离检测的研究 微芯片毛细管电泳技术就尾将样品处理、进样、分离、检测均集成在一块几平方俺 基于功能化硅壳纳米颗粒在质粒d n a 分离纯化中的应用 米的芯片上的一项微型实验室技术，又称集成毛细管电泳芯片( i n t e g r a t e dc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sc h i p s ，i c e 芯片) 。这项技术可望发展成微全分析系统和芯片实验室的主。 流技术p m 2 1 。它的研究和广泛应