（细胞生物学专业论文）雷公藤甲素对t821白血病的作用实验研究.pdf

i _ 1 s l 。 l i i iiii ii i i i ii ii ii iiii y 18 16 6 8 4 u n i v e r s i t yo fs c i e n c e a n dt e c h n o l o g yo fc h i n a adi s s e r t a t i o nf o rm a s t e r sd e gr e e t h e b i o l o g i ca c t i v i t yo f t r i p t o l ideint ( 8 ；2 1 ) a c u t e m y e l o i d l e uk e mi ac e ll s a u t h o r sn a m e ： g u i s h e n gz h o u s p e c i a l i t y ： s u p e r v i s o r ： 1 1 11j ri n l s n e qt l m e ： c e l lb i o l o g y d r g u a n g b i a oz h o u m a y1 9 m ，2 0 1 0 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或 撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作 了明确的说明。 作者签名：f 鱼业签字日期：塑：笪：2 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学 拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入中 国学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名： 签字日期： 口保密( 年) 国趣丝 导师签名： f 圈乞黪 型乜! 笪= l 签字日期：3 壁丝：笪! ! 摘要 一。摘，要一 雷公藤甲素是从雷公藤、昆明山海棠等中草药中提取的内酯醇类二萜化合 物。之前的研究中发现雷公藤具有抗炎症反应，抗排斥反应，以及抗肿瘤活性， 而发现其中的提纯物雷公藤甲素具有一定的细胞毒性，能够诱导一些肿瘤细胞 韵凋亡，如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胆管癌等。很 有可能是一个潜在的治疗相关肿瘤疾病的先导化合物。但是，雷公藤甲素对白 血病的相关细胞毒性实验鲜有报道，尤其是在t ( 8 ：2 1 ) m 2 型急性髓系粒细胞白 血病m 2 中没有报道过。在本篇论文中我们发现雷公藤甲素可以抑制t ( 8 ：2 1 ) 急 性髓性粒细胞白血病m 2 型细胞系k a s u m i - i 、s k n o - i 病人原代白血病细胞的增 殖，诱导细胞凋亡，而对正常人外周血单个核细胞细胞的抑制以及凋亡诱导不 明显。并且，进一步的研究，我们发现雷公藤甲素可以诱导a m l 卜e t o 蛋白的降 解，切割致病融合蛋白a m l i - e t o ，而a m l i - e t o 蛋白在该型白血病的治疗中发 生重要作用。同时，我们发现在雷公藤甲素的作用下，可以下调k a s u m i 一1 细胞 原癌基因c - k i t 的表达，近而抑制j a k - s t a t 信号通路。我们还发现雷公藤甲素 可以下调p 6 5 蛋白表达，抑制n f kb 的d n a 结合水平，阻断k a s u m i 一1 细胞中 n f kb 的持续性活化，而s t a t 3 和n f - kb 在k a s u m i - i 细胞总都处于过表达和 持续性激活状态，在该型白血病的发生中发挥重要作用。以上结果显示，雷公 藤甲素在治疗具有t ( 8 ：2 1 ) 染色体易位的m 2 型急性髓系白血病中，是一个潜在 的先导化合物。 关键词：雷公藤甲素急性粒细胞白血病t ( 8 ：2 1 ) 染色体易位 a m l i e t o c k i tj a k s t a tn f kb a b s t r a c t a b s t r a c t t r i p t o l i d ei sac o m p o u n di s o l a t e df r o mt h et r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n a lh e r b s t r i p t e r y g i u mw i l f o r d i io rt r i p t e r y g i u mh y p o g l a u c u m ( d e v l ) h u m h t h a ts h o w s p o t e n ta n t i i n f l a m m a t o r ya c t i v i t i e s t r i p t o l i d ec a na l s oi n d u c ea p o p t o s i si ns e v e r a l c a n c e rc e l ll i n e si n c l u d i n gt h o s ed e r i v e df r o mb r e a s tc a n c e r , p a n c r e a t i cc a n c e r , l u n g c a n c e r , o v a r i a nc a n c e r , a n dg a s t r i cc a n c e r b u ti t se f f e c t so na c u t em y e l o i dl e u k e m i a ( a m l ) w i t ht ( 8 ；21 ) r e m m nu n k n o w n i nt h i ss t u d y , w es h o w t h a tt r i p t o l i d ei n h i b i t s c e l lp r o l i f e r a t i o na n di n d u c e sa p o p t o s i si nad o s ea n dt i m ed e p e n d e n tm a n n e ro f t ( 8 ；21 ) 一b e a r i n gk a s u m i 一1 ，s k n o 一1c e l l sa sw e l la sp r i m a r yc e l l sh a r v e s t e df r o m p a t i e m sw i t ht ( 8 ；21 ) a m l ，b u te x h i b i t sl o w e ra d v e r s ee f f e c to nn o r m a lm o n o n u c l e a r c e l l si s o l a t e df r o mp e r i p h e r a lb l o o do fh e a l t h yd o n o r s f u r t h e rr e s u l t ss h o wt h a t t r i p t o l i d et r i g g e r sc l e a v a g eo ft h er e s u l t a n ta m l 1 一e t of u s i o np r o t e i no ft ( 8 ；21 ) ，a n d c a u s e st h ed o w n r e g u l a t i o no fc k i t o n c o p r o t e i n f o l l o w e d b yi n h i b i t i o n o f j a k - s t a ts i g n a l i n g t r i p t o l i d ed o w n r e g u l a t e sp 6 5a n di n h i b i t st h ed n ab i n d i n g a c t i v i t yo fn f v b o u rd a t ai n d i c a t et h a tt r i p t o l i d em i g h tb ea ne f f e c t i v ea g e n tf o r t ( 8 ；2 1 、l e u k e m i a 。 k e yw o r d s ：t r i p t o l i d e ，a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ( a m l ) ，t ( 8 ；2 1 ) ，a m l l 一e t o ， c - k i t , j a k s t a t , n f - kb i i 目录 目录 第一章绪论1 1 1 引言：1 1 2 雷公藤甲素概述2 1 2 1 雷公藤甲素的性质2 1 2 2 雷公藤甲素的应用2 1 3 t ( 8 ：2 1 ) 髓系粒细胞白血病概述3 1 3 1 白血病概述及分型3 1 3 2t ( 8 ：2 1 ) 型白血病研究进展5 1 4t ( 8 ：2 1 ) 白血病治疗概述8 1 4 1 白血病目前治疗方法8 1 4 2t ( 8 ：2 1 ) 白血病潜在治疗策略9 第二章实验材料与方法1 3 2 1 实验材料1 3 2 1 。1 实验所用细胞系及标本1 3 2 1 2 实验所用主要试剂1 3 2 1 3 实验所用试剂配方1 4 2 1 3 实验所用主要仪器1 6 2 2 实验方法1 6 2 2 1 细胞中总r n a 的提取1 6 2 2 2 一步法半定量p c r 检测1 7 2 2 3 细胞增殖实验和细胞毒性检测1 8 2 2 4 瑞氏一姬姆萨染色及形态学检测1 9 2 2 5 流式细胞仪a n n e x i n v 检测凋亡1 9 2 2 6 核蛋白抽提1 9 2 2 7 免疫印迹分析w e s t e r nb l o t i n g 2 0 2 2 8 流式细胞仪检测线粒体跨膜电位2 1 目录 2 2 9 凝胶迁移或电泳迁移率实验( e m s a ) 2 l 2 2 1 0c d 3 4 + 细胞分选2 4 2 2 1 1d n al a d d e r 检测细胞的凋亡2 4 2 2 1 2 统计分析2 5 第三章实验结果及分析2 6 ： ：。 3 1 雷公藤甲素对白血病细胞系及正常细胞系增殖影响2 6 2 1 1 雷公藤甲素对自血病细胞系的影响2 6 2 1 。2 雷公藤甲素对正常血细胞的影响2 7 3 2 雷公藤甲素诱导白血病细胞系凋亡2 8 3 3 雷公藤甲素降解a m l l - e t 0 融合蛋白d oll d 3 3 3 4 雷公藤甲素影响c - k i t ，j a k - s t a t 通路3 3 3 5 雷公藤甲素阻断n f kbd n a 结合能力3 5 第四章实验小结与讨论3 8 参考文献3 9 附录”5 5 致谓j 5 6 攻读学位期间发表的学术论文与取得的其他研究成果5 7 第1 章绪论 1 1 引言 第1 章绪论 雷公藤是传统中草药，雷公藤用做治疗疾病已经有很多个世纪，主要是用 作治疗一些免疫性疾病，如类风湿性关节炎( r h e u m a t o i da r t h r i t i s ) ，肾病综合症 ( n e p h r o t i cs y n d r o m e ) ，系统性红斑狼疮( s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s ，s l e ) ( j i a n g ，19 9 4 ；l e u e n r o t he ta 1 ，2 0 0 7 ；q i ne ta 1 ，19 8 3 ；t a oe ta 1 ，l9 8 9 ) ，雷公藤甲素 则是从雷公藤中提纯的一个二萜类化合物( k u p c h a ne ta 1 ，1 9 7 2 ) 。已有的研究表 明雷公藤甲素对许多肿瘤细胞有细胞毒性，例如乳腺癌，胰腺癌，肺癌，卵巢 癌，前列腺癌，胃癌，胆管癌等等( j a n ge ta 1 ，2 0 0 7 ；j i a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；j o h n s o ne ta 1 ， 2 0 0 7 ；k a n ge ta 1 ，2 0 0 9 a ；k i v i h a r j ue ta 1 ，2 0 0 2 a ；l e ee ta 1 ，2 0 0 2 ；l e ea n dr o s e n ， 19 9 9 ；l i a n ga n df u ，2 0 0 8 ；p h i l l i p se ta 1 ，2 0 0 7 ；t e n g c h a i s r ie ta 1 ，19 9 8 ；w e s t f a l le t a 1 ，2 0 0 8 ；z h o ue ta 1 ，2 0 0 8 ) 。之前有人发现在对某些肿瘤细胞作用过程中可以阻 断n f - kb 的活化( h ee ta 1 ，2 0 0 7 ；j a n ge ta 1 ，2 0 0 7 ；l e ee ta 1 ，2 0 0 2 ；l e ea n dr o s e n ， 1 9 9 9 ；l o ue ta 1 ，2 0 0 5 ；w ue ta 1 ，2 0 0 6 ；z h ue ta 1 ，2 0 0 9 ) ，可以抑制原癌基因 b c r a b l 的活性( l o ua n dj i n ，2 0 0 4 ；s h ie ta 1 ，2 0 0 9 ) ，可以影响p 5 3 信号通路( c h a n g e ta 1 ，2 0 0 1 ；j i a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；k i v i h a r j ue ta 1 ，2 0 0 2 a ；l i ue ta 1 ，2 0 0 9 ) ，但是对这些 肿瘤细胞的作用仍需要进一步的阐述。 白血病的发生常常是由于染色体的易位造成，而染色体的易位生成的融合 蛋白则是潜在的治疗白血病的靶点( d r u k e re ta 1 ，2 0 0 6 ；z h o ue ta 1 ，2 0 0 7 b ) 。在急 性粒细胞白血病中，染色体8 和2 1 的易位产生了a m l l e t o 融合蛋白，而该 型染色体易位则占据了大概4 0 的m 2 型急性粒细胞白血病。但是，前人的研 究发现，在小鼠致病模型中，a m l l 一e t o 融合蛋白并不能导致小鼠患病( h i g u c h i e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，因此在白血病的发生过程中一定存在其他的因素与该融合蛋白共 同作用( h i g u c h ie ta 1 ，2 0 0 2 ；k e l l ya n dg i l l i l a n d ，2 0 0 2 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 a ) ，例如突 变的受体酪氨酸激酶c k i t 被证实在t ( 8 ；2 1 ) 白血病发生的过程中起着重要的 作用( a s o ue ta 1 ，1 9 9 1 ；b e g h i n ie ta 1 ，2 0 0 2 ；p e t e r s o na n dz h a n g ，2 0 0 4 a ) 。c k i t 的突 变时一种功能获得性突变，它激活下游一系列信号通路，如 j a k s t a t , m a p k ，s t a t 3 n f kb ( l e ee ta 1 ，2 0 0 9 a ) ，由此导致了细胞的增殖调控 失去控制，对凋亡不敏感。比如说白血病和胃肠道间质瘤等( r o n n s t r a n d ，2 0 0 4 ； w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 b ) ，因此a m l l e t o 和c k i t 可以作为治疗m 2 型白血病潜在 的靶点。 第1 章绪论 在本文的工作中，我们发现雷公藤甲素可以抑制a m l l e t o 和c k i t , 诱 导白血病细胞k a s u m i 1 和s k n o 一1 凋亡，因此雷公藤甲素是治疗m 2 型t ( 8 ； 2 1 ) 白血病的潜在的先导化合物。 1 2 雷公藤甲素概述 1 2 1 雷公藤甲素的性质 雷公藤甲素是中草药雷公藤( t r i p t e r y g i u mw i l f o r d i i ) ，昆明山海棠 ( t r i p t e r y g i u mh y p o g l a u c u m ( d e v l 夕h u 纪h ) 等的提纯物。雷公藤又称菜虫药、 黄藤根、断肠草、黄藤根或霹雳木等，属于卫矛科雷公藤属植物，雷公藤分布 广泛，在广东，安徽，浙江、江西，湖南，福建，台湾，云南等地都有大量发 现。雷公藤的化合物组分非常繁杂，含有苷类、倍半萜类，环氧二萜类，三萜 类，生物碱，多糖和卫矛醇等1 5 0 多种成分( a s a n oe ta 1 ，1 9 9 7 ) 。目前发现的活 性成分主要包括雷公藤红素( t r i p t e r i n e ) ，雷公藤内酯酮( t r i p t o n i d e ) ，雷公藤甲素 ( t r i p t o l i d e ) ，雷公藤乙素( t r i p d i o l i d ) 等( m i l a n o v ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。而其中的成分雷公 藤甲素( 雷公藤内酯醇p g 4 9 0 ) ，是雷公藤中的环氧二萜内酯成分，其结构如图 1 o 1 2 2 雷公藤甲素的应用 中草药雷公藤的使用有着很悠久的历史，是民间经常使用的药材。目前主 2 第1 章绪论 要用作很多免疫系统方面相关的疾病，如在做人体器官移植中的抗排斥效应。 在治疗类风湿性关节炎，肾病综合症，系统性红斑狼疮疗效也很好( q i ua n dk a o ， 2 0 0 3 ) 。不过在治疗类风湿关节炎中，由于具有较大的毒副作用没有被广泛采用 ( c a n t e re ta 1 ，2 0 0 6 ；c h e na n dc h a o ，2 0 0 2 ) 。而其中的成分雷公藤甲素是雷公藤中 的二萜内酯成分，是目前发现的主要疾病治疗药物活性组分之一，并且雷公藤 甲素的抗肿瘤作用也逐渐被大家认识并引起高度关注。雷公藤甲素也已发现在 很多肿瘤细胞中具有细胞毒性，在白血病细胞，实体瘤细胞中都能促使细胞凋 亡( c h e n ，2 0 0 1 ) ，是一个潜在的抗肿瘤化合物。比较突出的是比如说在治疗前列 腺癌中已经进入一期临床( k i v i h a r j ue ta 1 ，2 0 0 2 a ) 。 研究发现，雷公藤甲素能够诱导一系列的肿瘤细胞发生凋亡( m i y a t ae ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。在胃癌细胞系a g c ，及s g c 7 9 0 1 ，m k n 2 8 中雷公藤甲素的影响，研究 发现与p 5 3 及n f 。kb 密切相关，雷公藤甲素可以抑制n f kb 的激活，促进 p 5 3 的表达( j i a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在上皮细胞前列腺癌中，雷公藤甲素也诱导前列 腺癌细胞的表达，但是对正常原代细胞缺影响不大，雷公藤甲素在前列腺癌中 同样也促进p 5 3 蛋白的表达，( k i v i h a r j ue ta 1 ，2 0 0 2 b ) 。在肺癌中，如a 5 4 9 ，h t l 0 8 0 ， 雷公藤甲素也诱导了p 5 3 蛋白的表达，由此可见p 5 3 在这些肿瘤细胞中都发挥 了重要的作用( c h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) ，并且能够增敏t r a i l 诱导肺癌细胞的凋亡 ( l e ee ta 1 ，2 0 0 2 ；l e ea n dr o s e n ，1 9 9 9 ) 。在胆管癌细胞系h u c c a 1 ，h u b c c a 1 ， k k u 1 0 0 中，雷公藤甲素也能通过激活c a s p a s e 3 诱导凋亡( p a n i c h a k u le ta 1 ， 2 0 0 2 ；t e n g c h a i s r ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在乳腺癌细胞m c f 一7 ，m d a m b 。2 3 1 中通过影响 p 5 3 蛋白，e r k 激酶活性等诱导细胞凋亡( k a n ge ta 1 ，2 0 0 9 b ；l i ue ta 1 ，2 0 0 9 ；t a n a n dc h i u ，2 0 0 8 ) ，而在慢性粒细胞白血病系k 5 6 2 中，雷公藤甲素能够显著的下 调b c r - a b l ，由于该基因在慢性粒细胞白血病发病过程中发生重要的作用，从而 b c r a b l 的下调对该系列白血病的治疗有潜在的积极意义( l o ua n dj i n ，2 0 0 4 ) 。 1 3 t ( 8 ：2 1 ) 髓性粒细胞白血病概述 1 3 1白血病概述及分型 白血病是由于人体造血系统血细胞恶性增殖造成。它的发生主要是某一系 列淋巴细胞，单核细胞异常非调控的增生，并浸润到肝、脾、淋巴结等人体各 类脏器循环系统。白血病的发生有很多原因，有病毒原因引起的白血病，如人 类t 细胞白血病病毒i 型( h t l v - i ) 病毒感染造成人t 细胞白血病淋巴瘤。 有由于各种电离辐射引起的白血病：如较强的x 射线、y 射线等。二战时期美 第1 章绪论 国对日本广岛、长崎使用原子弹就造成该地区与历史同期水平相比白血病发生 率显著上升。有化学品接触引起的白血病，如烷化剂，苯，烷化剂等。也有遗 传因素引起白血病的发生。如上一代患有白血病，其下一代患病率会提高。 在白血病的发病过程中，可根据病人的发病程度及血液恶性细胞的分化程 度将其分为急性白血病( a c u t el e u k e m i aa l ) 和慢性白血病( c h r o n i cl e u k e m i a c l ) 。而根据血液恶性细胞的分化类型和阶段，又可将其分为：原粒细胞( 急性 粒细胞白血病) ；早幼粒细胞( 急性早幼粒细胞白血病) ；幼红细胞( 红白血病) ； 原始和幼稚单核细胞( 急性单核细胞白血病) ；成熟淋巴细胞( 慢性淋巴细胞白 血病) ，慢性粒细胞白血病c h r o n i cm y e l o i dl e u k e m i ac m l ) 。 根据w h o 及f a b 细胞分型指导，急性淋巴细胞白血病( a c u t el y m p h o c y t i c l e u k e m i a a l l ) 分为以下几类( b e n n e t t ，2 0 0 0 ；h a r r i se ta 1 ，1 9 9 9 ；v a r d i m a n ，2 0 1 0 ； v a r d i m a ne ta 1 ，2 0 0 9 ) ： l l ：其中原始和幼淋巴细胞主要以小细胞( 直径小于1 2 9 i n ) 为主； l 2 ：其中原始和幼淋巴细胞主要以大细胞( 直径大于1 2 9 m ) 为主； l 3 ：其中原始和幼淋巴细胞主要以大细胞为主，细胞大小相似，细胞的胞 浆嗜碱性，胞内出现明显的空泡。 根据f a b 细胞分型指导，急性非淋巴细胞白血病f a c u t e n o n l y m p h o c y t i cl e u k e m i aa n l l ) 或者急性髓性白血病( a c u t em y e l o i d l e u k e m i a a m l ) 可分为以下几类( b e n n e t t ，2 0 0 0 ；h a r r i se ta 1 ，19 9 9 ；v a r d i m a n ， 2 0 1 0 ；v a r d i m a ne ta 1 ，2 0 0 9 ) ：急性粒细胞白血病a m l 是成年人高发的一类疾病 ( b o h l a n d e r , 2 0 0 0 ) 。 m 1 型：为急性粒细胞白血病未分化类型，其中原粒细胞大于9 0 ； m 2 型：为急性粒细胞白血病部分分化型； m 3 型：为急性早幼粒细胞白血病，异常早幼粒细胞大于3 0 ； m 4 型：为急性粒单核细胞白血病； m 5 型：为急性单核细胞白血病； m 6 型：为急性红白血病； m 7 型：为急性巨核细胞白血病。 其中，我国将m 2 型又分为m 2 a 和m 2 b 两型，m 2 a 型即f a b 分类中的 m 2 型，m 2 b 系我国提出的一个亚型，m 2 b 型急性粒细胞白血病的特点为在骨 髓中原始及早幼粒细胞明显增多，但是以中性中幼粒细胞异常为主，其核常伴 有核仁，并且其核浆发育明显不平衡，此类细胞大于3 0 。 从分子遗传学角度，白血病的发生与某些染色体的断裂和易位有重要相关， 染色体的易位或者断裂能够激活或者失活一系列基因，从而使血细胞分化发生 4 第1 章绪论 异常，导致白血病的发生，如急性早幼粒细胞白血病a p l 中，常伴有特异性染 色体t ( 1 5 ：1 7 ) ( q 2 2 ：q 2 1 ) 易位产生融合蛋白p m l r a r ，急性粒细胞白血 病中m 2 b 中，常伴有t ( 8 ；2 1 ) ( q 2 2 ；q 2 2 ) 染色体易位产生融合蛋白 a m l l 一e t o ( e r i e k s o ne ta 1 ，1 9 9 2 ；m i y o s h ie ta 1 ，1 9 9 1 ；t i g h ee ta 1 ，1 9 9 3 ) ，急性粒 细胞白血病m 4 中t ( 1 6 ；1 6 ) ( p 1 3 ；q 2 2 ) ，或者t ( 6 ；9 ) ( p 2 3 ；q 3 4 ) 易位产生融合蛋白c b f 1 3 一m y h l l ，急性粒细胞白血病m 1 中t ( 6 ；9 ) ( p 2 3 ；q 3 4 ) 易位产生融合蛋白 d e k c a n ，急性淋巴细胞白血病中t ( 1 ；1 9 ) ( q 2 3 ；p 1 3 ) 易位产生融合蛋白 e 2 a p b x l ，而在慢性粒细胞白血病中t ( 9 ；2 2 ) ( q 3 4 ；q 1 1 ) 易位产生融合蛋白 b c r a b l 等等。 白血病的发生过程中，由于染色体易位及基因突变，造成白细胞过度增殖， 阻断了细胞的分化，使细胞停留在较早的分化阶段，并且细胞的凋亡也受到抑 制。对于白血病的发生，有“二次打击”学说。如在急性早幼粒细胞白血病a p l 中，患者伴有特异性染色体t ( 1 5 ：1 7 ) ( q 2 2 ：q 2 1 ) 阳性或p m l - - r a r a 融合 基因阳性，以及f l t 3 基因的突变等( g i l l i l a n d ，2 0 0 3 b ) 。在急性粒细胞白血病中 m 2 b 中，患者常常伴有t ( 8 ；2 1 ) ( q 2 2 ；q 2 2 ) 或a m l l e t o 融合基因，以及c k i t 基因的突变等( w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 曲。 1 3 2 t ( 8 ：2 1 ) 型白血病研究进展 在急性粒细胞白血病中m 2 b 中，常常伴有t ( 8 ；2 1 ) ( q 2 2 ；q 2 2 ) 或a m l l 一e t o 融合基因，其阳性率能达到9 0 ( n i s s o ne ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 a m l l 也叫做c b fq 或者p e b p 2qb ，r u n x l ，位于染色体2 1 q 2 2 区，全 长超过2 6 0 k b ，含1 2 个外显子，编码4 8 0 个氨基酸的核磷酸蛋白。e t o 也叫 做m t g 8 ，位于染色体8 q 2 2 区，全长1 3 6 k b ，包含1 3 个外显子，其编码的产物 也为核磷酸蛋白。染色体易位产生的a m l l 一e t o 融合蛋白在m 2 型白血病中占 大概2 0 到4 0 ，( p e t e r s o na n dz h a n g ，2 0 0 4 b ) ，a m l1 是r u n x 家族的一个重要 成员，所有的r u n x 家族都包括一个r u n t 的d n a 结合结构域，研究发现，r u n t 在个体的性别决定中发挥重要的作用( d u f f ye ta 1 ，1 9 9 1 ；k a n i ae ta 1 ，1 9 9 0 ) ，而 a m l l 除了包括r u n t 结构域，也同时包括一个转导结构域n m t s 和一个抑制性 的结构域( k a n n oe ta 1 ，1 9 9 8 ；l i ue ta 1 ，2 0 0 6 ) ，a m l l 在早期造血中发挥着重要的 作用，在生理情况下造血各系中均有表达。在a m l l e t o 融合蛋白中，n 端 a m l l 的r u n t 的结构域的存在能够使a m l l e t o 融合蛋白结合到a m l l 的目 第1 章绪论 的基因的启动子上。研究发现，在a m l l 基因被敲除的小鼠模型中，发生了严 重的中枢神经系统出血损害，由此导致胚胎致死，死亡发生的时间为11 5 到1 2 5 天，并且这种小鼠还常常伴有严重的胚胎造血缺陷( l i c h t ，2 0 0 1 ；l u t t e r b a c ha n d h i e b e r t ，2 0 0 0 ) 。进一步的研究发现，a m l l 也是一种特别的抑癌基因，a m l l 基因的表达出现异常或基因突变均有可能导致肿瘤的发生( o s a t o ，2 0 0 4 ；s i l v ae t = =。 a 1 ，2 0 0 3 ) 。 e t o 蛋白属于e t o 家族，e t o 在核基质内的定位是主要和m s i n 3 a 与组蛋 白去乙酰化酶( h d a c ) 一致，e t o 家族包括e t o ，e t 0 2 和m t g r l ( c a l a b ia n dc i l l i ， 1 9 9 8 ；k i t a b a y a s h ie ta 1 ，1 9 9 8 ；w a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) ，研究中发现，e t o 主要在心脏、 脑部表达，在骨髓c d 3 4 + 造血干细胞中也早期发现有表达，调控造血细胞的分 化与生存( t o n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) ，但是在晚期成熟血细胞中却未发现表达，说明e t o 在血细胞的早期分化过程中起一定作用，但在分化成熟的细胞中e t o 的作用不 大。并且在报道中发现，与e t o 相互作用的蛋白包括核抑制复合物 n - c o r ( l a u s e ne ta 1 ，2 0 0 4 ) ，s m r t 、m s i n 3 、h d a c 、a t r o p h i n - - 1 、s o n ( a h n e ta 1 ，2 0 0 8 a ；a h ne ta 1 ，2 0 0 8 b ) 、p l z f 、生长因子非依赖因子1 ( g f i 1 ) 等( c a ie ta 1 ， 2 0 0 4 ；d a v i se ta 1 ，2 0 0 3 ；f r a c c h i o l l ae ta 1 ，1 9 9 8 ；h u ga n dl a z a r , 2 0 0 4 ；m e l n i c ke t a 1 ，2 0 0 0 ；m o r o h o s h ie ta 1 ，2 0 0 0 ；n e f fe ta 1 ，19 9 8 ；v a n g a l ae ta 1 ，2 0 0 1 ；w a n ge ta 1 ， 1 9 9 8 a ；w a n ge ta 1 ，1 9 9 8 b ；w o o de ta 1 ，2 0 0 0 ) 。e t o 蛋白还能以寡聚化的形式调控 共抑制因子( k w o ke ta 1 ，2 0 0 9 ；s a u n t h a r a r a j a he ta 1 ，2 0 0 0 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ； z e i s i ge ta 1 ，2 0 0 8 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) ，h d a c 组蛋白去乙酰化酶能通过去乙酰化 组蛋白，增加染色质的重要构成的组蛋白上的正电荷，并且去乙酰化的组蛋白 与d n a 的结合能力增强，从而控制染色质的结构，阻断了一系列转录因子与 d n a 结合而抑制靶转录，在基因表达过程中起负调控作用( m i l l se ta 1 ，2 0 0 1 ： t a b ee ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 a m l l e t o 融合蛋白序列中包含了几乎全部的e t o 蛋白。融合蛋白 a m l l 一e t o 的存在，影响了细胞一系列的调控发生变化，报道中发现 a m l l 一e t o 可以负调控一些a m l l 的目的基因，比如说m d r 1 ，g m 。c s f 受体， 白介素i l 一3 ，c l o s ，t c r b ，p 1 4 增强子等，研究中发现，t f 8 ；2 1 ) 形成的a m l l e t o 融合蛋白也可以通过其e t o 部分的多个结构域与组蛋白去乙酰化酶以及核抑 制复合物募集而抑制基因转录并阻滞造血细胞分化的，从而在m 2 型 a m l l 0 一e t o 融合蛋白白血病发生过程中起重要作用( h i l d e b r a n de ta 1 ，2 0 0 1 ) ， a m l l 一e t o 显性负调控a m l l 可能最终引起转录平衡的失常，影响了正常造血 第1 章绪论 细胞的增殖、分化及凋亡，并最终引起白血病的发生。与此同时，研究中也发 现a m l l 一e t o 的存在也可以正调控一系列基因，如b c l 2 ，p 3 0 0 等( g a m o ue ta 1 1 9 9 8 ；k l a m p f e re ta 1 ，1 9 9 6 ；p e t e r s o na n dz h a n g ，2 0 0 4 b ) 。因此t ( 8 ；2 1 ) 白血病的发 生于融合蛋白a m l l e t o 的存在密切相关，干扰了造血干细胞基因的正常调 控。并且在人类白血病中a m l l 是最常发生异常的基因之- - ( o o l u b e ta 1 ，1 9 9 5 ； n u c i f o r aa n dr o w l e y , 19 9 5 ；t e n e ne ta 1 ，19 9 7 ) 。 但是，最近的研究表明a m l l e t o 融合基因在部分正常人和一些非白血病 细胞中也有发现，并且t ( 8 ；2 1 ) 急性髓系粒细胞白血病( a m l ) 经过治疗获得缓解 的一些患者骨髓细胞中有持续低表达，并且在a m l l e t o 可诱导表达的转基因 小鼠模型建立中，并不导致白血病发生( b u c h h o l ze ta 1 ，2 0 0 0 ；c a r r o l le ta 1 ，1 9 9 6 ； d eg u z m a ne ta 1 ，2 0 0 2 ；h i g u c h ie ta 1 ，2 0 0 2 ；n i s h i d ae ta 1 ，2 0 0 6 ；y e r g e a ue ta 1 ， 1 9 9 7 ；y u a ne ta 1 ，2 0 0 1a ，b ) ，由此可以猜测该型白血病需要获得额外的突变才可 以转化为较明显的白血病。众所周知，人体一系列肿瘤的发生都是各种突变不 断累积的( a b b o t te ta 1 ，2 0 0 6 ；a b r a m c z y ke ta 1 ，2 0 0 9 ；h a n a h a l la n dw e i n b e r g ， 2 0 0 0 ) ，急性粒细胞a m l l e t om 2 型白血病的发生很有可能也是一个多基因突 变导致的过程，需要突变基因与a m l l e t o 的共同作用下发生。 研究中发现急性粒细胞白血病a m l 中重要的信号转导途径中的酪氨酸激 酶具有较高的突变率，如c k i t ，f l t 3 ，c f m s ，p d g f rq ，p d g f r0 等，均为 第1 i i 类受体酪氨酸激酶( r e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e ， r t k ) ，受体酪氨酸激酶的 胞外区是结合配体结构域，配体是可溶性或膜结合的多肽或蛋白类激素，包括 胰岛素和多种生长因子等；如c k i t 的配体为干细胞因子s c f ( s t e mc e l lf a c t o r ， s c f ) 。胞内段是酪氨酸蛋白激酶的催化部位，并具有自磷酸化位点( j a y ee ta 1 ， 19 9 2 ；s c h l e s s i n g e ra n du l l r i c h ，19 9 2 ) ，配体与受体酪氨酸激酶结合后，能促进受 体形成二聚体，随后其内在酪氨酸激酶活性被激活，两个受体的细胞内结构域 的尾部相互接触，激活它们的蛋白激酶的功能，结果使尾部的酪氨酸残基磷酸 化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物( s i g n a l i n g c o m p l e x ) 。迅速磷酸化特异的酪氨酸残基，由此激活胞内的一系列信号分子， 如g t p 酶激活蛋白( g a p ) 、p 1 3 k 、g r b 2 和s r c 样非受体酪氨酸激酶，蛋白酪 氨酸磷酸酶s h p l 等。 c k i t 基因编码9 7 6 个氨基酸残基，为膜蛋白。在造血细胞、生殖细胞、 黑色素细胞、肥大细胞及肠腔隙细胞等的发育过程中均发挥着起重要作用。研 究发现，c k i t 在正常造血过程中起核心作用。小鼠c k i t 的突变造成酪氨酸 激酶活性的持续性激活，造血干细胞发生恶性增殖( b e l l o ce ta 1 ，2 0 0 9 ；c r o s i e re t 第1 章绪论 a 1 ，1 9 9 3 ；h i w a t a r ie ta 1 ，2 0 0 3 ；i k e d ae ta 1 ，1 9 9 1 ；l a s ae ta 1 ，2 0 0 6 ；m a r k o v ae ta 1 ， 2 0 0 9 ；m u r o ie ta 1 ，1 9 9 3 ；s z a n k a s ie ta 1 ，2 0 0 9 ；v a l v e r d ee ta 1 ，1 9 9 6 ) 。c k i t 的突变 可见于伴t ( 8 ；2 1 ) 的m 2 患者( w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 a ) ，显示了c k i t 突变与m 2 b 密切 相关。不能正常的发生细胞分化( r e i l l y , 2 0 0 2 ) ，f l t 3 突变与a m l l 一e t o 共同作 用下同样导致动物模型中急性粒细胞m 2 型白血病的发生( g i l l i l a n d ，2 0 0 3 a ) 。研 究中发现，c k i t 突变，持续性激活现象在胃肠道基质细胞瘤( g a s t r o i n t e s t i n a l s t r o m a lt u m o r s ，g i s t ) 、肥大细胞增多症也有发现。例如在g i s t 中，c 。k i t 就 以一种功能获得性性突变存在，而且在g i s t 的发病过程中起着重要的作用。 在大约6 0 一8 0 a m l 患者的原始粒细胞可表达c k i t ，并检测到c k i t 激活或者突变，并在白血病的发病及治疗中引起了广泛的关注( c r o s i e re ta