（材料加工工程专业论文）电纺壳聚糖聚乙烯醇纳米纤维的制备与表征.pdf

浙江理工人学硕士学位论文 摘要 电纺是一种方法简单、成本低廉的技术，能够有效制备聚合物纳米纤维支架。电纺制 备的纳米纤维支架能够很大程度地模仿天然细胞外基质的结构和功能，而且纳米纤维具有 很高的比表面积和孔隙率，非常有利于细胞粘附、繁殖和分化，在组织工程领域具有潜在 的应用。 本文研究了壳聚糖( c s ) 聚乙烯醇( p v a ) 的电纺。采用扫描电镜( s e m ) 考察了纺丝液浓 度、组分配比、挤出速度、电压和极距对电纺纤维形貌的影响；采用原子力显微镜( a f m ) 考察了电纺纤维的表面形态；采用扫描电镜能谱( e d x ) 分析了电纺纤维膜中纤维和液滴 的成分；采用红外光谱( f t - i r ) 、差示扫描量热( d s c ) 、x 射线衍射( x r d ) 等方法分析 了电纺纤维中c s 与p v a 分子间的相互作用。 结果表明，通过c s 与p v a 共混可以有效提高溶液的可纺性，制备了直径在 7 3 1 4 7 n m ，且分布较为均匀的电纺纤维。当纺丝液浓度为5 ( w v ) 时，得到的电纺纤维 与液滴共存，且纤维形态较差；当纺丝液浓度为8 ( w v ) 时，得到的电纺纤维形态较佳。 当c s 质量比小于7 0 时，溶液的可纺性较好，纤维直径随着壳聚糖含量的增大而减小。 在1 0 ( v v ) 和3 0 ( v v ) 的醋酸( h a c ) 浓度下，电纺只能得到与液滴共存的纤维；在5 0 ( v v ) 和7 0 ( v v ) 的浓度下，电纺得到了形态良好而均一的纳米纤维。随着挤出速度的增大， 电纺纤维直径有逐渐增大趋势，挤出速度为0 5 0 8 m l h 时得到的纤维形貌最佳。随着纺 丝电压的增大，电纺纤维直径有增大趋势，在4 0 k v 下得到的纤维形态最佳。随着极距的 增大，电纺纤维直径先减小后增大，分散性逐渐变差，极距在1 1 1 6 c m 时得到的纤维形 貌最佳。电纺纤维的直径大小随着喷丝口内径的增大而先增大后减小；随着喷丝口内径的 增大，电纺纤维的直径分布逐渐变窄。通过戊二醛蒸汽或无水乙醇的处理，都可以使电纺 c s p v a 纤维交联或固化，提高了纤维的耐湿性，使电纺膜在水中保持原来的纳米结构及 高孔隙率，在组织工程领域具有很好的应用前景。a f m 照片观察到c s p v a 纤维为表面 光滑的圆柱形。e d x 分析显示，电纺膜中的纤维和液滴都存在n 元素，说明纤维和液滴 中都有c s 的存在，也就是意味着在电纺过程中并没有产生c s 和p v a 之间的分离。f t - i r 、 d s c 和x r d 分析表明电纺纤维的c s 和p v a 两组分之间有强烈的氢键作用；c s 组分的 加入使得电纺纤维的结晶微结构不好。 关键词：电纺，壳聚糖，聚乙烯醇，纳米纤维，形貌 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t e l e c t r o s p i n i n n gi s as i m p l ea n dl o w - c o s tt e c h n o l g yt op r e p a r en a n o f i b r o u ss c a f f o l d s e f f e c t i v e l y n a n o f i b r o u ss c a f f o l d sf a b r i c a t e db ye l e c t r o s p i n n i n gc o u l dm i m i ct h es t r u c t u r ea n d f u c t i o no ft h en a t u r u a le x t r c e l l u l a rm a t r i x ( e c m ) t oag r e a te x t e n t ，a n dh a v es h o w e da m a z i n g c h a r a c t e r i s t i c ss u c ha sv e r yl a r g es u r f a c ea r e a - t o - v o l u m er a t i oa n dh i g hp o r o s i t yw i t hv e r ys m a l l p o r es i z e ，p r o m o t i n gc e l la t t a c h m e n t ，p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n t h e r e f o r e ，e l e c t r o s p u n n a n o f i b e r sh a v eb e c o m ep r o m i s i n gm a t e r i a l si nt i s s u ee n g i n e e r i n g i nt h i sw o r k ，c h i t o s a n p o l y ( v i n ya l c o h o ) ( c s p v a ) w e r es t u d i e db ye l e c t r o s p i n n i n g t h e e f f e c t so fs o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n ，m a s sr a t i oo fc s p v a ，s o v e n ts o l u t i o n ，f l o wr a t eo fs p i n n a b l e s o l u t i o n ，a p p l i e dv o l t a g e ，d i s t a n c eo ft i pt oc o l l e c t i o n ( t c d ) ，a n di n t e r n a ld i a m e t e ro f n e e d l eo n t h em o r p h o l o g yo fn a n o f i b e r sw e r ei n v e s t i g a t e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) t h e s u r f a c eg e o m e t r i cp r o p e r t i e sw a ss t u d i e db ya t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) t h ec o m p o n e n t s o ff i b e r sa n db e a d si ne l e c t r o s p u nm e m b r a n e sw e r es t u d i e db ye n e r g yd i s p e r s i v ex - r a y s p e c t r o s c o p y ( e d x ) t h em o l e c u l a ri n t e r a c t i o nb e t w e e nc sa n dp v a w a ss t u d i e db yf o u r i e r t r a n s f o r mi n f r a r e d ( f t - i r ) ，d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) ，a n dx r a yd i f f r a c t i o n ( x r d ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es p i n n a l i t yo fc sw a si m p r o v e db yt h eb l e n dm e t h o dw i t l lp v a ， a n dh o m o g e n e o u sf i b e r sw i t hd i a m e t e ro f7 3 - 14 7 u mw e r ep r e p a r e d f i b e r sa n db e a d sw e r e o b t a i n e db ye l e c t r o s p i n n i n go ft h eb l e n ds o l u t i o n 晰t l l5 ( w v ) c o n c e n t r a t i o n ，a n dt h ef i b e r m o r p h o l o g y i sb a d ；w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e dt o 8 ( w v ) ，t h em o r p h o l o g yo f e l e c t r o s p u nf i b e r sb e c a m eg o o d t h es o l u t i o nw a ss p i n a b l ew h e nt h et h em a s sr a t i oo fc sw a s l e s st h a n7 0 a n dt h ef i b e rd i a m t e rd e c r e a s e da si n c r e a s i n gt h em a s sr a t i oo fc s ；f i b e r s 谢t h b e a d sd e f e c t sw e r eo b t a i n e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fh a cw a sl o ( v v ) a n d3 0 ( v v ) ； h o m o g e n o u sn a n o f i b e r sw i t h o a tb e a d sw e r eo b t a i n e dw h e nu s i n g5 0 ( v v ) o r7 0 ( v v ) h a c a s s o l v e n t t h ef i b e rd i a m e t e ri n c r e a s e da si n c e a s i n gt h ef l o wr a t e ，a n dt h eb e s tf i b e rm o r p h o l o g y w a so b t a i n e da tt h ef l o wr a t eo f0 5 0 8 m l h ；t h ef i b e rd i a m t e rw a sl a r g e ra st h ea p p l i e dv o l t a g e b e c a m eh i g h e r , a n dt h eb e s tf i b e rm o r p h o l o g yw a so b t a i n e da tt h ev o l t a g eo f4 0 k v t h ea v e r a g e f i b e rd i a m e t e rf i r s t l yi n c r e a s e da n dt h e nd e c r e a s e da si n c r e a s i n gt h ei n t e r n a ld i a m e t e ro ft h e n e e d l e ；a n di tw a so b s e r v e dt h a ta ni n c r e a s ei nt h en e e d l ed i a m e t e rc a u s e dad e c r e a s ei nt h e p o l y d i s p e r s i t yo f t h en a n o f i b e rd i a m t e r s t h ef i b e rd i a m e t e rf i r s t l yi n c r e a s e da n dt h e nd e c r e a s e d i l 浙江理_ t 大学硕士学位论文 a si n c r e a s i n gt c d ，a n dt h ef i b e rd i s t r i b u t i o nw a st e n dt ou n h o m o g e n e o u s ，t h eo p t i m a lf i b e r m o r p h o l o g yw a so b t a i n e dw h e nt h et c dw a s11 16 c m c r o s s l i n k e do rs t a b i l i z e dc s p v a f i b e r sw e r eo b t a i n e db yt r e a t i n gt h eo r i g i n a l e l e c t r o s p u nf i b e r s u n d e rt h ee t h a n o la n d g l u t a r a l d e h y d ev a p o r , r e s p e c t i v e l y t h ep r o p e r t yo fw a t e r - r e s i s t a n c ew a si m p r o v e db yt r e a t m e n t o fc r o s s l i n k i n g ，a n dc o u l dk e e pt h eu n i q u en a n o f i b r o u ss t r u c t u r ea n dh i g hp o r o s i t yi na l l a q u e o u se n v i r o m e n t ，a n dc o u l db ea p p l i e da sp o t e n t i a lb i o m e d i c a lm a t e r i a l s a f mi m a g e s s h o w e dt h a tc s p v ae l e c t r o s p u nf i b e r sh a dac y l i n d r i c a ls h a p ea n ds m o o t hs h a p e e d xs h o w e d t h a tt h eb e a d sa n df i b e r sh a dn i t r o g e ne l e m e n t ，n a m e l yn os e p e r a t i o nb e t w e e nc sa n dp v a w h e ne l e c t r o s p i n n i n g f t - i d s c ，a n dx r dd e m o n s t r a t e dt h a tt h e r es t r o n gi n t e r m o l e c u l a r h y d r o g e nb o n d sb e t w e e nt h em o l e c u l e so fc sa n dp v a t h ec r y s t a l l i n em i c r o s t r u c t u r eo ft h e e l e c t r o s p u nf i b e r sw a s n o tw e l ld e v e l o p e dw i t he x s i t e n c eo fc sc o n t e n ti nt h eb l e n d k e y w o r d s ：e l e c t r o s p i n n i n g ，c h i t o s a n ，p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) ，n a n o f i b e r , m o r p h o l o g y 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期：年月 日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 一 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 。 学位论文作者签名： 日期：年月 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名： 日期：年月日 浙江理工大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 组织工程和组织工程用生物材料 1 1 1 组织工程学的概念和原理 组织工程学是利用工程学和生命科学的原理和方法研究生物有机体的组织器官和其 他功能替代物的新兴交叉学科。它集生物工程、生命科学、材料科学与工程、临床医学于 一体，帮助病人恢复受损组织的功能，提高生物质量i l j 。 从细胞工程学的角度看，早在上世纪5 0 年代，市场上可应用的营养素和酶可将组织 分解为有功能的细胞成分，从而开始了体外细胞培养的研究。细胞工程的诞生使大规模细 胞培养成为可能，进入8 0 年代以后，随着组织培养技术的普及，以及对体外细胞相互作 用研究的深入，为重建有功能的组织打下基础。 从材料学的角度看，生物医用材料的研究已从生物惰性材料发展为生物活性材料和生 物可吸收性材料。目前，所研究的大多数生物可降解材料如聚乳酸( p l a ) 、聚乙醇酸( p o a ) 和聚羟基丁酸酯( p h b ) 等，其降解产物为天然小分子，并参与人体新陈代谢，这类材料的 研究和应用为组织工程学的建立与发展奠定了良好的物质基础。组织工程学的建立就是在 这种历史背景下产生和提出的【2 1 。 应用组织工程学原理研制人造生物器官，其基本方法是将体外培养的高浓度组织细胞 扩增后吸附在一种生物相容性良好，并可被人体逐步降解的支架材料上。该支架材料可为 细胞提供生存的三位空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进而进行新陈代谢，使细胞 按预制形态的三维支架生长；然后将这种复合体植入机体所需部位。种植的细胞在生物支 架降解吸收工程中，继续增生繁殖，形成新的具有特殊功能和形态的相应组织和器官，从 而可达到修复组织外形和功能重建的目的，原理示意图见图1 1 。 组织工程的研究主要集中在以下几个方面：( 1 ) 组织细胞依附的支架材料的研究；( 2 ) 支架材料与细胞之间相互作用机理的研究；( 3 ) 组织工程体外组织细胞培养最佳条件和环 境的研究；( 4 ) 组织工程临床试验评价。其中组中工程支架的构建使组织工程化人工器官 研究成功的前提条件。 浙r i 理r 人学硕上学位论文 惑 器” 泰 i l i 绷纵l m m 此“1 f i g - 1 1 p r i n c i p l e * o f t i s s u ee “g i n 盹r i n g 1 i 2 组织工程用生物材料 组织工程常将种子细胞种植在具有生物活性的可降解生物材料构筑的i 维支架上，期 望三维支架能够提供细胞所需要的力学和化学信号，指导细胞的黏连、增殖与分化，并最 终形成三维组织。凼此，生物材料在组织工程上有着非常重要的应用。随着组织工程的发 展，对生物材料提出了新挑战。首先生物材料应符合乍物安全性的要求，对人体无毒、无 致敏性、无刺激性、无遗传毒性和无致癌性。其次，生物材料应具有良好的生物相容性， 即对人体组织、血液和免疫等系统无不良反应。此外，更希望植入的生物材料不被免疫系 统排斥，并能产牛所期望的宿卡反应。从材料表面所拄生的蛋白质吸附、免疫反应、细胞 因子和生长冈子的释放、目标细胞的反应着手诱发期挚的愈合途径，使组织重建，是第 二代生物材料所要达到的目标”j 。 1 2 1 生物材料简介 组织t 程用生物材料按其来源可分为天然生物大分f 材料和人工合成高分子材料。 无然类生物材料一般生物相容性良好，不易产生排异反应，已j “泛应用于组织工程材 料。 1 1 胶原( c o l l a g e n ) ：胶原被广泛地应用于组织工程，它是细胞外基质( e c m ) 的主要成 分。胶原是人体中含量撮丰富的一种结构蛋白，约占机体总蛋白的2 5 。目前已技现的 胶原蛋白类型不少于1 9 种1 4 1 ，常用作组织工程材料的主要足i 、i i 、i i i 型胶原，其中又 以i 型胶原应用最为广泛。胶原分子呈棒状，长约2 8 0 n m ，分子量约为3 0 1 0 5 ，出三条 多肽链组成。胶原吸水膨胀，但不溶于水。通过酶消化提取的胶原往往表现出温和的免疫 2 浙江理工大学硕士学位论文 原性【5 一，而且胶原分子中包含有促进细胞粘附和生长的精氨酸。甘氨酸一天冬氨酸( r g d ) 多肽片段，表现出的细胞相容性【7 1 。因此胶原是较早通过美国药品和管理委员会( f d a ) 批准的生物材料之一。 2 ) 明胶( g e l a t i n ) ：明胶是胶原的部分变性衍生物，它是由胶原的三重螺旋结构解体 为单分子而形成，是天然多肽聚合物。明胶中含量最多的氨基酸是脯氨酸、羟脯氨酸和甘 氨酸，很少量的蛋氨酸，分子量为1 5 1 0 4 4 5 1 0 4 。明胶有两种组成：明胶a 和明胶b 。 明胶a 是在热变性前用酸处理的明胶，而明胶b 则是用碱处理，使其谷氨酰胺与天冬酰 胺的酰胺残基转变为谷氨酸和天冬氨酸，因此明胶b 的氨基含量比明胶a 至少高2 5 。 3 ) 透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ) ：透明质酸是e c m 中糖氨多糖( g a g s ) 的重要组成物， 尤其在结缔组织中含量丰富。透明质酸具有高度水化的性能，在对组织内部的水分平衡、 关节的润滑以及稳定软骨基质等方面发挥了重要的作用【刀，其分子量为5 0 1 0 4 8 o 1 0 6 。高纯度的透明质酸免疫原性低，生物相容性好，而且透明质酸在体内可被血清中的 透明质酸酶所降解，其降解产物对创面愈合具有促进作用。但是，由于透明质酸的力学强 度不够，无法单独应用与构建组织工程支架，多数情况下需要与其它种类的生物材料复合 使用。 4 ) 血纤蛋白( f i b r i n ) ：血纤蛋白通常用作外科密封胶和粘合剂，是实现创伤愈合的主 要生物基质。血纤蛋白能够促进成纤细胞的渗透和增殖，从而加速创伤的修复过程。血纤 蛋白凝胶可以用患者的自体血液制备，因此它是自体组织工程支架。血纤蛋白是体内天然 组成成分，具有很好的细胞相容性。血纤蛋白构建的组织工程支架能够促进细胞的粘附、 生长和迁移，进而引导组织再生，而且血纤蛋白能促进移植支架的血管化。血纤蛋白的降 解速率可由蛋白酶控制剂( 如抑蛋白酶肽) 调控【8 】。但血纤蛋白凝胶力学性能较差，影响 了其应用。 5 ) 海藻酸盐( a l g i n a t e ) - 海藻酸盐是由褐藻提取的多糖，是p d - 甘露糖醛酸( m 单 元) 和仅l 古洛糖醛酸( g 单元) 无规连接的共聚物，常用作止血材料和创伤辅料。向 海藻酸的酸性溶液中添加二价阳离子如c a 2 + 、m 9 2 + 、a a 2 + 、s r 2 + ，它们能与海藻酸的古洛 糖醛酸上的羧基发生静电作用，形成白色的凝胶。由于海藻酸生物材料不能降解，使其应 用受到一定限制。利用过碘酸钠可以使海藻酸盐轻度氧化，而氧化海藻酸盐可通过水解途 径降解。氧化5 的海藻酸盐仍能由c a 2 + 交联形成凝胶，该交联凝胶在磷酸缓冲液中9 天 基本降解完全。降解型海藻酸水凝胶与一般海藻酸水凝胶相比能明显的促进软骨组织在动 物体内的形成【9 1 。 3 浙江理工大学硕士学位论文 6 ) 壳聚糖( c h i t o s a n ) ：壳聚糖【d ( 1 4 ) 一2 一氨基2 脱氧一d 一葡萄糖】是一种带有多氨基的 多糖类物质，是甲壳素脱乙酰化的产物，其平均分子量一般在3 0 万1 0 0 万d a ，脱乙酰 度通常大于7 0 ，结构是见图1 2 1 1 0 1 。甲壳素则是一种存在于节足动物的外壳以及真菌类 细胞壁中的天然多糖类物质，来源非常广泛。壳聚糖虽然不是人体中e c m 的构成物，但 其结构和一些性质与e c m 的主要成分氨基葡聚糖非常相似。壳聚糖具有良好的生物相容 性和可降解性，无刺激性、无免疫原性、无热源反应，并具有能促进创面愈合的功能，而 且易于加工成多孔支架、管材、棒材以及微球等型材【1 1 d 引。由于壳聚糖分子链上富含氨基 与羟基，非常便于对壳聚糖进行改性，以及改变其溶解性和加工性能1 1 2 ，1 9 1 。早期，壳聚 糖主要应用于医用缝合线、防粘连材料以及创面敷料等方面。近年来，壳聚糖作为一种新 型的组织工程材料越来越得到人们的重视。 鞠i t 0 5 a n 图1 2 甲壳素和壳聚糖的化学结构式1 1 0 1 f i g 1 2c h e m i c a ls t r u c t u r eo fc h i t na n dc h i t o s a n 人工合成高分子材料最大的优点在于可以根据具体组织或器官的特点进行专门设计， 其表面性能以及生物降解率都可进行调节，而且合成组织工程材料的力学性能和加工性能 都较天然生物材料优良，产品的质量也易标准化，有利于大规模生产。但是，人工合成高 分子材料最大的缺点是材料表面缺乏细胞可以识别的位点，不具备生物活性，而且材料的 降解产物可能存在一定的毒性【2 0 l 。 1 ) 聚乙交酯( p g a ) ：聚乙交酯又称聚乙醇酸，是简单的线形脂肪族聚酯，它由乙交 酯开环聚合而成。p g a 玻璃化温度t g 为3 5 4 0 。c ，具有结晶度高( 4 5 5 5 ) 、熔点高 ( 2 2 0 - 2 2 5 。c ) 等特点，是最早应用于医用缝合线的合成材料。高度结晶的p g a 不溶于 大多数有机溶剂，只溶于高氟代的有机溶剂( 如六氟异丙醇) 中。以p g a 为原料的无纺 网状支架主要应用于组织工程软骨、骨以及肌腱的构建。 4 浙江理工大学硕士学位论文 2 ) 聚丙交酯( p l a ) ：聚丙交酯又叫聚乳酸，是近来应用更为广泛的一种组织工程材 料，由于其单体分子手性的不同，可分为l 型、d 型以及l d 型聚乳酸，其中由于自然界 中多为l 聚乳酸，所以l 型聚乳酸( p l l a ) 应用更为广泛。聚乳酸可以由丙交酯催化开环 聚合而成，也可以由乳酸直接缩聚合成。聚乳酸可以是玻璃态聚合物，其t g 约在6 0 。c ； 也可以是半结晶高结晶聚合物，结晶熔点在1 3 0 - 1 8 0 之间。静态结晶产物一般不透明， 而应力诱导结晶材料则透明。 3 ) 聚乙丙交酯( p l g a ) ：通过不同比例乙交酯和丙交酯的共聚，可获得一系列具有 不同降解速率( 从几个星期到几年) 的聚交酯共聚物( p l g a ) 。8 5 1 5p l g a 常用作手术缝 合线，其它组成的p l g a 则多用于控制释放载体。大孔p l g a ( 7 5 2 5 ) 海绵作为组织工 程支架使用。 4 ) 聚己内酯( p c l ) ：p c l 是由己内酯开环聚合得到的热塑性结晶聚酯，玻璃化 温度和熔点都很低，分别为6 0 和6 0 ，在室温下呈橡胶肽，适用于构建软骨组织工程 支架。p c l 的另一显著特点是降解速率缓慢，通常其完全降解时间以及强度保持时间都 大于2 4 个月，非常适于作为长期植入装置或再生速率缓慢的组织或器官的支架材料。 5 ) 聚乙烯醇( p v a ) ：p v a 是一种水溶性高分子化合物，由醋酸乙烯酯溶液聚合后， 再经碱催化醇解得到。p v a 具有良好的水溶性和组织相容性，力学性能强，柔韧性好， 无毒性，目前已广泛应用于医学领域。其分子链中的侧链羟基可以结合粘附蛋白而对细胞 具有较强的粘附作用，有利于细胞在p v a 材料上增长和增殖【2 。人体内虽缺乏p v a 降解 酶，但p v a 材料改进制备后具有生物降解性【2 2 , 2 3 】。 1 1 2 2 壳聚糖和聚乙烯醇在组织工程中的应用 各种生物材料因各自的特点被不同程度地应用在组织工程领域中。这里主要介绍壳聚 糖和聚乙烯醇两种生物材料在组织工程中的应用。 1 1 2 2 1 壳聚糖在组织工程中的应用 壳聚糖在皮肤组织工程中的应用：h o w l i n g 等在研究甲壳质及壳聚糖对人真皮维细 胞和角质细胞增殖作用的基础上发现，不同分子量、不同脱乙酰度的壳聚糖及其衍生物对 细胞具有不同的增殖作用，同样壳聚糖这种促进细胞增生的能力需要血清的存在，表明壳 聚糖不仅同人皮肤细胞具有较好的相容性，而且可以与血清中生长因子相互作用，提高血 5 浙江理工大学硕士学位论文 清对细胞生长的促进作用。o k a m o t o 等2 5 1 、u e n o 等0 2 6 1 和c h o 等2 7 1 在实验中都发现壳聚糖 能够促进动物皮肤创伤处上皮化，形成肉芽组织，从而促进伤口愈合；b r a y e 掣2 8 1 以壳聚 糖胶原材料为支架培养人成纤维细胞和角质细胞形成人工皮肤，并将其移植到猪的皮肤 损伤处，手术后1 4 天，发现创伤处人工皮肤在形态上类似周围正常皮肤，结果提示了利 用壳聚糖材料及体外培养的人皮肤细胞构成人工皮肤( 真皮替代物) 在临床上应用的可能 性。 壳聚糖在骨组织工程中的应用：i t 0 等【2 9 l 通过壳聚糖结合羟基磷灰石、氧化锌和氧化 钙等成分制备了一种可快速硬化、固定时间短、释放热量少、p h 中性、具有较强抗压强 度的骨填充材料，并对材料的缩水性、抗拉强度、硬度、离子释放及形态进行了分析，结 果表明此种材料适合用于骨移植并且具有诱导骨生成的作用。胞的分化，加速骨的形成。 l a h i j i 等【3 0 】在观察成骨细胞在壳聚糖材料上的活性时发现，壳聚糖不仅具有提高成骨细胞 成活率及活性的作用，而且能够促进成骨细胞的表型表达，进一步证明了以壳聚糖作为支 架材料可以支持人成骨细胞生长和功能表达，具有较好的生物相容性。 壳聚糖在关节软骨组织工程中的应用：壳聚糖作为软骨修复的生物材料，在关节内及 体外与软骨细胞应具有良好的相容性。l u 等【3 1 1 将壳聚糖注射到大鼠关节内，发现壳聚糖 不仅没有引起炎症反应，而且能够减缓骨后软骨变薄，提高膝关节软骨细胞的密度，提示 壳聚糖在膝关节内不仅具有良好的相容性，而且具有促进软骨修复的能力。体外实验同样 证明了壳聚糖与软骨细胞具有较好的相容性，l a h i j i 等1 3 0 1 通过在壳聚糖膜上培养软骨细 胞，发现软骨细胞在壳聚糖膜上生长良好，并且分泌胶原i i ，验证了壳聚糖能够提高软骨 细胞的成活率并促进其行使正常生理功能的假说。 另外，壳聚糖在神经组织工程【3 2 l 、肝脏组织工程【3 3 1 、肌腱修复【3 4 】、人工血管形成【3 5 】 等方面的研究也有一定的进展。 1 1 2 2 2 聚乙烯醇在组织工程中的应用 p v a 多以水凝胶的形式在组织工程中研究应用。p v a 水凝胶可采用戊二醛、电子束 等引发化学交联的方法制备，也可以通过多次冷冻干燥的方法得n t 3 6 1 。通过对p v a 化学 改性，可使p v a 分子链侧基带上可化学交联基团，如采用氨基丁醛二乙基乙缩醛改性的 p v a 通过紫外光引发形成p v a 水凝胶包裹人真皮纤维细胞【2 l 】，体外培养2 周后，细胞仍 能保持活性并分泌细胞外基质蛋白如羟基脯氨酸，用r g d s ( a r g g l y a s p s e r ) 改性p v a 水 凝胶后，成纤细胞在凝胶表面贴附、铺展。k o b a y a s h i 等【3 7 】用r g d s 改性p v a 水凝胶以 6 浙江理工大学硕士学位论文 加强角膜上皮细胞对此材料的粘附性。c h o 等【3 8 】制备了p v a 与藻酸盐复合构建的水凝胶 材料，研究发现软骨细胞在复合水凝胶中较单纯藻酸盐具有更好的细胞粘附性，生长也更 为迅速。吴佳奇等【3 9 l 采用乳化发泡冷冻固化去除表面活性剂法获得多孔p v a 、和多孔 p v a 壳聚糖( p v a c s ) 水凝胶，研究发现p v a c s 还具备成肌诱导活性，有望在需长期植 入的组织工程中作为组织填充物进一步发挥作用。 另外，p v a 多孔纤维支架材料的研究也已经开展。白利明等【4 0 】用p v a 纤维编织构建 了韧带支架材料，并在体外分离培养人前交叉韧带细胞，结果表明，该p v a 支架材料具 有较高的力学性能和优良的生物相容性，有望成为一种组织工程前交叉韧带支架材料。 1 2 纳米纤维组织工程支架和电纺技术 科学家们发现，当物质的颗粒小到纳米量级时，物质的各种性质( 如机械强度、磁、 光、声、热等) 都将发生变化，并具有辐射、吸收、吸附等许多新性能，由此有望制备具 有特殊功能的材料【4 。 纳米技术在组织工程领域的应用主要是纳米支架材料的制备及支架的构建。由于纳米 材料的结构单元或尺寸为纳米数量级，自由表面( 界面) 显著增多，各纳米单元之间存 在相互作用，这些特点使纳米材料具有一些独特的效应，包括尺寸效应和表面( 界面) 效应。 同样，纳米支架也会起到毫米和微米支架所无法取代的作用，即出现纳米效应。虽然人们 已经能在厘米、毫米、微米尺度对支架进行设计、制备、表征和调控，但在纳米级别的研 究还远远不够，对纳米支架的研究可望改变今天人们停留在微米尺度认识支架材料的立体 结构、孔隙的大小及分布、表面空间拓扑结构等对细胞的形态、粘附、生长及功能的影响 的局面，实现在分子水平对植入材料进行设计的目标。因此，纳米组织工程支架是当前乃 至未来若干年的一个重要研究课题【4 2 1 。 1 2 1 纳米纤维支架的优势 理想的组织工程支架需要满足以下要求：( 1 ) 材料应在结构和功能上与天然细胞外基 质相似，具有良好的生物相容性，即无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥；( 2 ) 合适 的可生物降解吸收性，即与细胞、组织生长速率相适应的降解吸收速率；( 3 ) 合适的孔尺寸、 高的孔隙率( 9 0 ) 和相连的孔形态，以利于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞 外基质( e c m ) 的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内生长；( 4 ) 特定的三维外形以获得所需的组织或器官形状；( 5 ) 高的表面积和合适的表面理化性质以 利于细胞粘附、增殖和分化，以及负载生长因子等生物信号分子；( 6 ) 与植入部位组织的 力学性能相匹配的结构强度，以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为 7 浙江理t 大学硕十学位论文 植入细胞提供合适的微应力环境1 4 3 1 。可见，列在首位的结构和功能仿生是组织工程支架 最重要的性能要求，而结构仿生则是功能仿生的前提和基础。 图1 3 所示的组织工程的3 个不同层次清楚地表明，组织工程应该在宏观( 超细胞 1 0 0 1 a m 和细胞 1 0 p m ) 、微观( 亚细胞0 1 1 0 1 m a ) 和纳观( o h 曲一一一一叛米 o 1 蛔k 一一纳米( i o 1 轴) 图1 3 不同层次的组织工程i 4 2 1 f i g 1 3t i s s u ee n g i n e e r i n ga td i f f e r e n tl e v e l s 三维纳米纤维支架在结构上与天然e c m 更接近，比表面积巨大，能提供大量的细 胞接触点，可使单位体积内的细胞数量增加，为细胞的粘附、增殖、生理功能提供更好的 微环境，并改善蛋白质吸附，也更有利于药物和生物因子的释放引，因而被认为比传统 的微米级支架更有利于细胞的粘附和生长 4 9 1 。纳米纤维支架材料也存在尺寸效应和表面 ( 界面) 效应，这两个特性使纳米支架材料更能有效地诱导细胞生长和组织再生，因而在 性能上与具有相同组成的微米级支架材料存在非常显著的差异，即存在生物纳米效应。三 维纳米纤维支架的优点不仅仅表现为纳米生物效应的存在，而且也为人们在分子水平研究 8 浙江理工大学硕士学位论文 材料与肌体组织的相互作用提供了平台，由此实现了在分子水平对植入材料的设计与制 造。纳米纤维支架的上述优点促使人们努力寻找合适的方法制备纳米纤维，并构建具有适 当结构( 包括孔隙率、孔径大小及其分布等) 的支架。 1 2 2 电纺技术在构建纳米纤维支架中的应用 构建纳米纤维支架的方法有相分离技术( p h a s es e p a r a t i o n ) 5 0 1 ，自组装技术 ( s e l f - a s s e m b l y ) 5 1 1 ，和电纺技术( e l e c t r o s p i n n i n g ，也叫静电纺丝) 1 4 8 1 等。相分离法是通过 溶解、凝胶、萃取、凝固和干燥等几个步骤，得到纳米尺寸的多孔泡沫体，固体聚合物转 移到泡沫孔内，得到聚合物纳米纤维，它的缺点是转移过程消时太长。自主装法是通过单 体或小分子的非化学键相互作用力，组装成特定形貌聚合物的一种方法，它和相分离法一 样，也需要较长的时间来形成连续的聚合物纳米纤维。与上述方法相比，电纺法制备聚合 物纳米纤维具有设备简单、成本低廉、操作容易以及高效等优点，因此它被认为是制备大 量聚合物连续纳米纤维最有效的方法，在构建纳米纤维支架领域应用广泛【4 2 ，5 2 ，5 3 1 。电纺 聚合物制备的纤维支架主要有以下几个特点1 5 3 】：( 1 ) 能够制备直径与天然e c m s 相近的连 续纳米纤维，使得支架能够很大程度地仿生人体内e c m s 结构；( 2 ) 制备的支架具有较高 的孔隙率和较好的孔道连通，加上纳米纤维具有极大的比表面积，这些都为细胞的生存提 供了良好的微环境，有利于细胞的粘附、分化、增殖和分泌e c m s ；( 3 ) 通过选择适当的 材料和加工因素，可以获得降解率可控的纳米纤维支架，通过对材料表面的理化修饰可以 提高支架的生物相容性，也可以控制支架的厚度、结构和力学性能；( 4 ) 电纺所得的定向 排列纤维结构的支架能够引导细胞定向迁移和生长，并最终控制再生组织的结构；( 5 ) 同 轴电纺技术可以将生物活性分子加入到纳米纤维的芯层，从而有效地将天然材料和人工合 成材料融合起来，为生物活性分子的释放提供了理想的平台。 1 2 2 1 电纺技术简介 在静电力作用下，聚合物溶液或熔体被喷射拉伸成纤维的过程称为电纺。早在2 0 世 纪3 0 年代，f o m ：1 l l a l s 【5 4 l 已经在专利中报道了该方法，成功得到醋酸纤维素纤维。2 0 世纪 6 0 年代，t a y l o r 对电纺进行基础研究，包括临界电压的公式、喷丝口处t a y l o r 锥的形成 等【5 5 j 。2 0 世纪8 0 年代，m a n l e y 和l a r r o d o 通过电纺聚乙烯和聚丙烯熔体成功制备了连续 纤维【5 6 1 。2 0 世纪9 0 年代，随着纳米技术的兴起以及纳米纤维优越的性能和应用潜力，电 纺技术引起了人们极大的兴趣。r e n e k e r 和d o s h i 等对电纺工艺和原理进行了多方面的深 入研究，发表了大量论文1 5 2 ，5 7 , 5 引，为电纺的发展作出了贡献。1 9 9 9 年，d o s h i 创建e s p i n t e c h o l o g i e s 有限公司( 目前世界上唯一的电纺公司) ，研发并出售各种应用于不同领域的 9 浙江理工人学硕士学位论文 电纺纤维产品。近几年，取向电纺纤维的制备、陶瓷电纺纤维的制备以及采用同轴电纺技 术制蔷芯核型纳米纤维和空心纳米纤维被称为电纺技术的二大突破h 。 电纺技术与传统纺丝技术虽丈的不同在于电纺是通过静电力作为牵引力束制备超细 纤维。在电纺t 艺中，聚合物溶液或熔体被加l 几千至几，l 丁伏的商葡净电，从而在毛细管 和接地的接收装置间产生一个强大的电场力。电场力旋加于液体的表面而产生电流。相同 乜荷相斥导致了电场力与液体的表面张力方向相反。如果电场力的大小等于高分子溶液或 熔体的表面张力时，带电液滴就悬挂在毛细管的末端并处在平衡状态。随着电场力的增大， 在毛细管末端呈半球状的液滴在电场力的作用下将被拉伸成圆锥状，即泰勒锥。当外加静 电压增大h 超过某一临界值时，聚合物溶液所受电场力将克服其本身的表面张力和粘滞力 而形成喷射细流i 。喷射细流在几十毫秒内被牵伸千万倍，沿不稳定的螺旋轨迹弯曲运 动( 如“鞭动”) ，随着溶剂挥发，射流同化形成微米至纳米级超细纤维，以无序状排列在 收集装置上，形成类似无纺布状的纤维毡。电纺的基本装置见罔i4 旧】。 甲h i g h d e 图1 4 电纺的基本装置 f i g 1 4 s c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f b a s i cs “p f o re l 睇t 阳8 p i 衄i “g 屯纺纤维形貌在很人程度卜决定电纺纤维支架的结构和功能，通过选择、凋整各种因 素，可以得到形貌u n 空的电纺纤维。影响电纺纤维微观形貌的因素很多，包括：( 1 ) 纺艘 液特性的影响，如聚合物类型、分了链的构相、溶液粘度( 浓度) 、粘弹性、导电率以及 溶剂的极性和表面张力等。f 2 1 操作条件的影响：如施加电场强度、喷丝口到收集装黉的 距离、纺丝液流动速率等【吐蚓。此外，周围环境的温度和湿度也会影响电纺纤维的形态。 电纺制备过程中常会得到带有液珠的纤维，这是种伴有缺陷的纤维。r e n e k e r 等系统 ：一 耀一 浙江理工大学硕士学位论文 研究了p e o 溶液性质对