（微生物与生化药学专业论文）福寿螺纤维素酶的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 福寿螺( p o m a c e ac a n a l i c u l a t a ) 的食道、胃、肝、肠等组织中均含有纤维素酶。 福寿螺胃液经5 0 饱和度硫酸铵沉淀、s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶过滤层析、 o c t y l 一s e p h a r o s ec l 一4 b 疏水层析，得到一种s d s p a g e 电泳均一的纤维素酶，分 子量为4 2 0 k d 。它水解微晶纤维素、羧甲基纤维素钠( c m c n a ) 、木聚糖三种 底物的比活力分别为3 5 ，3 4 2 , n 1 7 7 u m g ，分别表示纤维二糖水解酶、内切- 1 3 1 ，4 葡聚糖酶和内切一1 3 1 ，4 一木聚糖酶三种活性。它水解c m c - n a 的最适温度为4 5 ， 最适p h 范围为p h 5 0 5 5 ；水解微晶纤维素和木聚糖最适温度为5 0 。c ，最宜口h 值 范围为5 5 6 0 。 福寿螺内脏加入缓冲液，匀浆、离心后，上清液选择加入5 体积的壳聚糖 溶液( 1 ) 絮凝，离心得到澄清的粗酶液。用壳聚糖溶液絮凝后c m c - n a 酶的得 率为9 5 5 。粗酶液中c m c n a 酶、微晶纤维素酶、b 葡萄糖苷酶和木聚糖酶的 酶活性，分别为6 5 、0 3 l 、3 1 、2 9 8 u m l 。粗酶液用s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶过滤柱 层析，以c m c - n a 和纤维二糖为底物追踪纤维素酶活力，结果两种底物均显示单 一的酶活力峰。所以福寿螺各组织中的纤维素酶活性应该来自同一个纤维素酶 系。该酶液水解稻草粉和花生壳粉的活性在4 0 。c 最高，水解玉米秸秆粉的活性在 4 5 最高；而且水解稻草粉和玉米秸秆粉的能力要高于水解花生壳粉。 关键词：福寿螺；纤维素酶；木聚糖酶；柱层析；分离纯化 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t i ns e v e r a lt i s s u e so fp o m a c e ac a n a l i c u l a t a ，s u c ha se s o p h a g u s ，s t o m a c h ，l i v e r a n di n t e s t i n e s ，c e l l u l a s es y s t e m sw e r ef o u n d t h es t o m a c hj u i c eo fa m p u l l a r i a c r o s s e a nw a sc o l l e c t e di no r d e rt op u f f f yc e l l u l a s e ac e l l u l a s e ，t h em o l e c u l a rm a s so f w h i c hw a s4 2 0 k d a ，w a sp u r i f i e df r o mt h ej u i c eb y5 0 a m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，s e p h a d e xg - 10 0g e lf i l t r a t i o n c o l u m na n do c t y l - s e p h a r o s ec l 一4 b c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h i se n z y m ei sa b l et oh y d r o l y z em i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ， c a r b o x y l m e t h y lc e l l u l o s es o d i u ms a l t ( c m c - n a ) a n dx y l a nw i t ht h es p e c i f i ca c t i v i t i e s o f3 5 ，3 4 2 ，a n d17 7 u m g ，r e s p e c t i v e l y i ts h o w st h a tt h i se n z y m eh a sa c t i v i t i e so f c e i l o b i o h y d r 0 1 a s e ，e n d o - p 一1 ，4 一g l u c a n a s ea n de n d o - p - 1 ，4 一x y l a n a s e w h e nh y d r o l y z i n g c m c n a ，m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s ea n dx y l a n ，i tr e a c h e st h e i rm a x i m u ma t4 5 ，5 0 a n d 5 0 ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h ef a v o rp hr a n g e sa r ep h5 0 5 5 ，p h5 5 - 6 0a n dp h 5 5 6 o b u f f e rs o l u t i o nw a sa d d e dt ot h ee n t r a i l so ft h ea m p u l l a r i ac r o s s e a n ，a n dt h e n g r o u n da n dc e n t r i f u g e d t h ec h i t o s a ns o l u t i o n ( 1 ) w a sa d d e dt ot h es u p e r n a t a n tf l u i d w i t ht h ep e r c e n t a g eo f5 t h em i x t u r ew a sc e n t r i f u g e da n dt h ec r u d ee n z y m ef l u i dw a s a c q u i r e d t h ey i e l do ft h ec m c a s ew a s9 5 5 a f t e rt h ec h i t o s a nf l o c c u l a t i o n w h e n h y d r o l y z i n gc m c - n a ，m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ，c e l l o b i o s ea n dx y l a n ，t h es p e c i f i c a c t i v i t i e so ft h ec r u d ee n z y m ef l u i dw e r e6 5 ，0 3l ，3 1a n d2 9 8 u m l ，r e s p e c t i v e l y t h ec r u d ee n z y m es o l u t i o nw a sp u r i f i e db ys e p h a d e xg - 1 0 0g e lf i l t r a t i o nc o l u m n ， w h e nc m c n aa n dc e l l o b i o s ew e r eu s e dt ot r a c et h ea c t i v i t i e so ft h ec e l l u l a s es y s t e m t h er e s u l tw a st h a te a c ho ft h e mh a do n ea c t i v i t yp e a k i ts h o w e dt h a tt h ea c t i v i t i e so f h y d r o l y z i n gc e l l u l o s ei nt h et i s s u e so fa m p u l l a r i ac r o s s e a nd e s c r i b e da b o v ew e r e f r o mt h es a m ec e l l u l a s es y s t e m w h e nt h i sc r u d ee n z y m es o l u t i o nh y d r o l y z e dt h e p o w d e ro fs t r a w , p e a n u tp u l la n dc o r n s t a l k ，i tr e a c h e dt h e i rm a x i m u m a t4 0 c ，4 0 c a n d4 5 c ，r e s p e c t i v e l y t h ea b i l i t i e so fd e g r a d i n gs t r a wa n dc o r n s t a l kw e r eh i g h e r t h a nd e g r a d i n gp e a n u tp u l l k e y w o r d ：p o m a c e ac a n a l i c u l a t a ，c e l l u l a s e ，x y l a n a s e ，c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 浙江大学硕十学位论文 第一章文献综述 1 1 前言 地球上每年由光合作用可以产生数亿吨的植物资源，其中最主要的成分就 是纤维素和半纤维素。作为世界上最丰富的可再生资源，纤维素的有效利用一 直为人们所关注。纤维素半纤维素的酶学降解生产简单糖是公认的最理想的的 转化方法。因此，纤维素酶和半纤维素酶的研究一直是生物学领域的重要课题 之一。长期以来对纤维素酶的研究主要集中于微生物纤维素酶。一些微生物的 纤维素酶在纺织，造纸，饲料以及食品等领域已有应用，且市场需求量逐年增 长。但是由于已发现的纤维素酶在自身性质上还远远不能满足再生能源和其它 工业领域的需要，纤维素酶还不能进入更大规模的生产应用领域。所以寻找高 活力、能大量生产的纤维素酶已成为国内外研究的热点。 微生物纤维素酶的研究开始于1 9 1 2 年，其发展大致经历了三个时期：五十 年代以前主要是研究防止微生物对纤维素的破坏作用；六七十年代针对人口数 量的剧增，研究转向利用纤维素资源生产单细胞蛋白；七十年代以后，随着能 源危机的出现和环境污染的加剧，研究的重点又逐渐转到了新能源的开发与保 护环境上来。近年来，在产纤维素酶微生物的选育、纤维素酶系的组成、酶解 机理、纤维素酶的合成的调节和控制以及纤维素酶的应用等方面都取得了较大 的进展。 动物纤维素酶自上世纪9 0 年代中期开始引起注意，并已形成一个新的纤维 素酶研究领域。1 9 9 8 年澳大利亚和日本两个研究机构报道了白蚁纤维素内切酶 基因，证明动物有自身的纤维素内切酶【”，此后动物来源的纤维素酶越来越多 地受到了人们的关注。由于动物纤维素酶所表现出的特殊性质，它的研究已成 为纤维素酶研究领域的热点之一。 1 2 福寿螺的介绍 福寿螺( p o m a c e ac a n a l i c u l a t a ，异名a m p u l l a r i ag i g a s ，a m p u u a r i u m c r o s s e a n a ) ，又名大瓶螺、苹果螺。它属于软体动物门( m o l l u s c a ) ，腹足纲 浙江大学硕士学位论文 ( g a s t r o p o d a ) ，前鳃亚纲( p r o s o b r a n c h i a ) ，中腹足目( c a e n o g a s t r o p o d a ，旧称 m e s o g a s t r o p o d a ) ，瓶螺科沁n p l l l l a r i i d a e ) 【2 1 0 它原产于南美亚马逊河流域，是当 地人们食用的螺类。 1 2 1 形态特征 福寿螺整个身体由头部、足部、内脏囊、外套膜和贝壳5 个部分构成。头部 圆筒形，有前、后触手各一对，眼点位于后触手基部，口位于吻的腹面。头部腹 面为肉块状的足，足面宽而厚实，能在池壁和植物茎叶上爬行。贝壳短而圆、大 且薄，壳右旋，有4 5 个螺层，体螺层膨大，螺旋部极小，壳面光滑，多呈黄色 至深褐色。脐孔大且深，厣为褐色角质薄片，具同心圆生长纹，厣核偏向螺轴一 侧。外套膜薄而透明，包裹整个内脏囊，外套腔的背上方有一个薄膜状的肺囊， 能直接呼吸空气中的氧，具有辅助呼吸的功能。肺囊充气后能使螺体浮在水面上， 遇到干扰就会排出气体迅速下沉。雄螺生殖孔开口于交接器顶端，雌螺生殖孔开 口于外套腔【3 1 。 图1 1 福寿螺解剖图 “。 f i g 1 1t h ea n a t o m i c a lp i c t u r eo f p o m a c e ac a n a l i c u l a t a 它还有另一种独特的生物构造：呼吸管。这种器官，是在脖子左边一个遮 盖孔的褶层所构成的，没在使用时几乎是看不见的。当螺需要换肺里的气时，褶 层的肌肉会缩起，褶层就会变成一个柔软的管状构造( 呼吸管) ，使螺能在水面下 方也能呼吸空气。留在水下方给福寿螺一个极大的优势，因为在水面它们很容易 受到食螺鸟类的攻击。 浙江大学硕士学位论文 成螺贝壳厚，壳高5 7 厘米，成螺雌雄异体，爬行体长3 5 - 6 厘米：卵圆球形， 直径2 2 5 毫米，初产时深红色、粘稠，孵化前变淡。幼螺初孵体长2 2 5 毫米， 软体部分呈深红色，初孵幼螺可在水中爬行，以后贝壳向右旋增加。螺口径在2 2 厘米以下为幼螺或高龄幼螺。幼螺贝壳薄，贝壳的缝合线处下陷呈浅沟，壳脐深 而宽。 1 2 2 生活习性 福寿螺喜生活在水质清新、饵料充足的淡水中，多集群栖息于池边浅水区， 或吸附在水生植物茎叶上，或浮于水面，能离开水体短暂生活。最适宜生长水温 为2 5 3 2 ，超过3 5 生长速度明显下降，生存最高临界水温为4 5 。c ，最低临界 水温为5 。c 。福寿螺食性广，是以植物性饵料为主的杂食性螺类，主食浮萍、蔬 菜、瓜果等，尤其喜欢吃带甜味的食物。人工饲养条件下，喜食玉米、麸皮等精 饲料，幼螺以细萍、腐殖质、精饲料为主。饥饿状态下，成螺也会残食幼螺和螺 卵n 1 - 2 3 应用价值和农业危害 福寿螺具有体大肉厚、味道鲜美、高蛋白、低脂肪等特点，它含有丰富的蛋 白质、胡萝h 素、多种维生素和矿物质，是餐桌上的佳肴，由于含脂量低，是高 血压、冠心病患者的优质滋补品。可用于制备营养口服液、复合氨基酸、营养调 味品、螺肉罐头、高蛋白饲料添加剂及富钙饲料添加剂等，具有较大的经济意义。 另外，它还是一些珍贵水产动物的饲料。 这种草食性水生生物适应性极强，生长繁殖快，自从上世纪引进国内以来， 由于未能充分考虑外界物种入侵的问题，已在我国南方农田快速繁殖，大量啃食 农作物，对水稻种植等造成很大危害，成为继水葫芦后的又一生态灾害。 福寿螺以植物为食，生长迅速，体内含有大量消化酶，特别是纤维素酶，是开 发新的纤维素酶的理想来源之一，其研究已有相关报道1 4 5 】。 1 3 纤维素酶的介绍 浙江大学硕士学位论文 1 3 1 纤维素酶系的组成及分类 纤维素酶是一种多组分的酶系，采用各种层析、电泳等技术可将纤维素酶分 成不同的组分。此酶指的是能降解纤维素1 3 1 ，4 - 葡萄糖苷键的一类酶的总称， 因此纤维素酶又有纤维素酶复合物之称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系， 主要来自于真菌和细菌。纤维素酶的组成与分类有两种主要的分类形式。第一种 分类方法是根据各酶功能的不同主要分为三类：( 1 ) 内切一1 3 1 ，4 一葡聚糖酶 ( e n d o b 一1 ，4 - g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ) ，来自于真菌简称为e g ，来自于细菌简 称为l e n ) ，此酶又称c x 酶( c xe n z y m e ) 、c m c 酶( 羧甲基纤维素酶) ( c a r b o x y m e t h y l c e l l u l a s e ) 。它将天然纤维素水解为无定型纤维素。( 2 ) 纤维二糖水解酶 ( c e 1 0 b i o h y d r o l a s e ，c b h ，e c 3 2 1 9 1 ) ，来自于真菌简称c b h ；来自于细菌 简称c e x ) ，此酶又称外切一b 一1 ，4 一葡聚糖酶( e x o b 一1 ，4 - g l u c a n a s e ， e c 3 2 1 4 ) 、c l 酶( c ie n z y m e ) 、微晶纤维素酶( a v i c e l a s e ) 。它将无定型 纤维素水解为纤维二糖。( 3 ) b 一葡萄糖苷酶( e c 3 2 1 2 1 ，1 3 1 ，4 - g u c o s i d a s e ) ，又称为纤维二糖酶( c e l l o b i a s e ) ，缩写为b g 或c b 。这类 酶将纤维二糖和短链纤维寡糖水解成葡萄糖分子。对纤维二糖和纤维三糖的水解 很快，随葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。该酶的专一性差，实际上可作用于 所有的葡萄糖1 3 一二聚物【6 1 。 第二类通常认为主要包括c 1 酶、c x 酶和1 3 一葡萄糖苷酶。c l 酶主要作用天然 纤维素，将其转变成水合非结晶纤维素；c x 酶又可分为c x l 酶和c x 2 酶，c x l 酶是 内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于一1 3 1 ，4 - 葡萄糖苷键， 生成纤维糊精和纤维二糖，c x 2 酶为外断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分 子的非还原性末端作用于一b 一1 ，4 一葡萄糖苷键，逐步切断一b 一1 ，4 - 糖苷键生成葡 萄糖。纤维二糖酶又称b 一葡萄糖苷酶，其作用于纤维二糖，生成葡萄糖。这些 酶协同作用可将纤维素彻底降解为还原糖葡萄糖 7 8 1 。 1 3 2 纤维素酶的结构 t i l b e u r g hh 等【9 i 用木瓜蛋白酶有限酶切里氏木霉( t r i c h o d e r m af e c s o d 的c b h1 分子得到具有独立活性的两个结构域：个是具有催化功能的催化域 ( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) ，另一个是具有结合纤维素功能的纤维素结合( 吸附) 域 浙江大学硕士学位论文 ( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 。用类似的方法在多种细菌的纤维素酶中发 现类似的结构。对粪碱纤维单胞菌( c o l l u l o m o n a s ，= i m i ) 的一个外切酶c e x 和一 个内切酶l e na m 深入研究表明，c b d 在纤维素酶中位于氨基端或羧基端，它通过 一段高度糖基化的连接桥( 1 i n k e r ) 与催化区相连。 1 3 2 1 催化结构域 纤维素酶分子的催化结构域( c d ) ，主要体现酶的催化活性及对特定水溶性 底物的特异性。用x 光衍射的方法，j u ym 等【1 0 l 对热纤梭菌的c e ld f i 9 催化域进行 了结晶和解析。结果表明，内切酶的活性位点位于一个开放的“裂缝”( c l e f t ) 中， 它可与纤维素链的任何部位结合并切断纤维素链：外切酶的活性位点位于一个长 “环”( l o o p ) 所形成的“内部通道”( t u n n e l ) 里面，它只能从纤维素链的非还 原性末端切下纤维二糖。m e i n k ea 等【1 1 】利用蛋白质工程的方法将粪碱纤维单胞菌 的外切酶c b ha 分子的l o o p 删除后，发现该酶的内切酶活性提高。应用定点突变 和酶专一性抑制剂的大量研究结果，证明g l u 位于细菌的内切酶、外切酶、葡萄 糖苷酶的活性位点；在异头碳原子位通过构型的保留或构型的转化完成催化反应， 其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂，从而证明了细菌纤维 素酶降解纤维素的水解双置换机制【1 2 1 。 1 3 2 2 结合结构域 纤维素结合结构域( c b d ) 在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过 连接桥与催化结构域相连。纤维素结合结构域不具备水解纤维素的功能，但有助 于纤维素酶与底物的结合，它的三维结构极其复杂，对酶的催化活力起决定作用。 人们推测，c b d 可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由c b d 上其 余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链从纤维素表面脱离开来，以利于催化区的水解 作用。但有一些纤维素酶并没有c b d ，如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小 体( c e l l u o s o m e ) 吸附纤维素的。c b d 执行着调节酶对可溶和非可溶性底物专一性 活力的作用，对酶的催化活力是非常必需的。c b d 是一面亲水，另一面疏水的楔 形结构，能插入和分开纤维素的结晶区，在其吸附于纤维素分子链表面后，酶分 子连接到纤维素上，可能提高了底物表面有效酶的浓度，或者可能促进了纤维素 浙江大学硕士学位沦文 表面单个葡聚糖链的增溶溶解，具有疏解纤维素链的作用。不同的c b d 以不同的 拓扑学结构与结晶纤维素结合，都具有相似的刚性支柱结构，以便进行识别和结 合所需的侧链能正确定位。 纤维素酶结合结构域可以分为1 0 个家族，大部分纤维素结合结构域属于第1 、 i l 、i i i 家族，而其余的7 个家族仅有少数几个甚至一个成员 1 4 1o 第1 家族成员均仅 由3 0 4 0 个氨基酸构成，包括了所有由真菌纤维素酶的底物结合结构域，存在于 酶的n 一端或c 一端。比较典型的是李氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 的外切一b 一1 ，4 一葡聚 糖酶c b hi ，它由以两对二硫键稳定的一组三链1 3 一片层结构组成。结构域的一面 包含三个酪氨酸残基以及一些能形成氢键的氨基酸残基。酪氨酸残基的间距正好 等于葡聚糖链上三个葡萄糖残基的距离，点突变实验证实了这三个酪氨酸残基对 酶与纤维素底物的结合有十分重要的作用。第1 i 家族的纤维素结合结构域由 9 0 1 8 0 个氨基酸残基组成，同样也存在于酶n 端或c 端。较典型的是来自 c e l l u l o m o n a s 砌肭外切d 一1 ，4 - 葡聚糖酶内切一p 一1 ，4 - 木聚糖酶( c e x ) ，这种酶同时 具有葡聚糖外切和木聚糖内切两种活性。这类纤维素结合结构域由两层b 片层形 成一个三明治结构，并具有一个较为平整的外表面，这个外表面上有两至三个芳 香族氨基酸残基，这几个芳香族氨基酸残基介导了酶与底物分子的结合。第1 i i 家族的纤维素结合结构域包含有1 3 2 1 7 2 个氨基酸残基，该家族的许多成员都存 在于纤维素酶体( c e l l u l o s o m e ) 6 0 ，立l l c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 的c i p b 蛋白。该蛋 白的主体结构是由9 个1 3 片层结构组成的三明治夹层，其中有一个c a 2 + 的结合位 点。三明治夹层的两个表面中的一个上带有多个线状排列的芳香氨基酸残基和极 性氨基酸残基，这些氨基酸残基可能参与了对纤维素的结合i ”】。 1 3 2 3 连接桥 连接桥( l i n k e r ) 是一段相当长、高度糖基化的连接肽，此区大多富含脯氨 酸和羟脯氨酸，它的作用可能是保持c d 年n c b d 之间的距离；有助于同酶分子间形 成较为稳定的聚集体1 怕】。虽然真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大，但它们 的催化区在一级结构上氨基酸数量和三维结构上的大小却基本一致。但它们的 l i n k e r 和c b d 却存在明显的差异。真菌和细菌来源的纤维素酶的c b d 的三维结构 也得到了解析，真菌c b d 由3 3 3 6 个氨基酸组成，且具有高度的同源，而细菌由 浙江大学硕士学位论文 1 0 0 一1 1 0 个氨基酸组成，同源性较低。真菌的外切酶的c b d 的结构形状呈“楔型”， 一面亲水，另一面疏水；结构中芳香族氨基酸只有3 个t y r ，它们位于平坦的亲水 面，执行吸附纤维素的功能；细菌外切酶的c b d 很大，且包含很多芳香族氨基酸， 它们中的t r p 5 4 年f l t r p 7 2 暴露于蛋白分子表面，执行吸附功能。细菌纤维素酶 l i n k e r 富含p r o 和t h r ，完全由p r o t h r 这样的重复顺序组成，而真菌的纤维素酶 l i n k e r 富含g 1 y ，s e r 和t h r 。不同维素酶1 i n k e r 的糖基化程度和糖链也不同， 糖化不是纤维素酶活力所必需的。在高级结构的分子形状上，细菌纤维素酶c d 与c b d 夹角为1 3 5 。：真菌纤维素酶c d 与c b d 夹角为1 8 0 。i m 伸1 。有限酶切时， 真菌纤维素酶只具有一个酶切位点，在靠近c d 与连接桥边结区，酶切时可将c b d 与连接桥一并切去；而细菌的外切酶具有两个酶切位点，有限酶切时，可将c b d 和连接桥分别切去【1 6 1 。 1 3 3 纤维素酶的作用机理 1 3 3 1 纤维素的结构 纤维素是由d 一葡萄糖基通过b 一1 ，4 一键连接而成的长链葡聚糖分子，这些分 子彼此顺着长链走向由氢键结合而聚集成丝状纤维。大量丝状纤维交错排列构 成植物细胞壁的骨架，而纤维之间则充填果胶、半纤维素和木质素。丝状纤维 内部的葡聚糖分子之间可以形成氢键，在一定空间范围内，氢键达到一定数量 级，形成一个极为紧密有序的结构区域，称为结晶区，也称不可及区：而其余 相对松散的区域，可及度较高，称为非结晶区或无定形区。结晶区与非结晶区 之间并无明显的界限，二者之问是无级过渡的。 1 3 3 2 纤维素降解机制 纤维素酶的作用机制至今仍不很清楚，普遍认为是3 种组分协同作用的结果， 但各组分如何作用，尤其是c 1 酶和c x 酶的作用方式，许多研究者提出了不同看法。 1 c 1 一c x 理论 1 9 5 0 年，r e e s e p 0 1 等对纤维素酶的作用方式提出了一个著名的c 卜c x 假说，其 基本水解模式是：c t 酶首先作用于结晶纤维素使其变成无定形纤维素，无定形纤 维素再被c x 酶进一步水解成可溶性产物。 浙江大学硕士学位论文 结晶纤维素 c x 酶 无定形纤维素 b - 葡萄苷酶 葡萄糖一 图1 2c 卜c x 理论。 f i g 1 2c i c xt h e o r y c 1 酶 纤维二糖 2 协同机制 r e e s e 认为c 1 作用是破坏结晶区结构为纤维素酶其它组分结合创造条件， 而后其他学者所分离得到的类似r e e s ec 1 因子均被证实为c b h l 2 1 粥】。w o o d 2 4 】 等分离鉴定了c 1 酶，认为c l 酶是一种水解酶，它不易作用于羧甲基纤维素，而 能作用于结晶纤维素，磷酸膨胀纤维素等，主要产物是纤维二糖，从而证明c 1 酶是一种1 5 1 - 4 葡聚糖纤维二糖水解酶。天然纤维素水解成葡萄糖的过程中， 必须依靠3 种组分的协同作用才能完成，然而针对内切酶与外切酶作用次序存 在争议【2 5 28 1 。 不溶性纤维素+ 不溶性和可溶性纤维寡糖 l c 日h 反馈抑制卜纤维二糖 ll c b _ 葡萄糖 图1 3 纤维素水解反应的协同机制。 f i g 1 3s y n e r g i s t i cm e c h a n i s mo fc e l l u l o s eh y d r o l y z a t i o n 协同机制为大多数学者所接受。纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖至少需要 三种不同酶的协同作用：内切一1 3 - 1 ，4 一葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和p 一葡萄糖苷 浙江大学硕士学位论文 酶。纤维素的水解反应需要上述三种组分协同作用才能有效地进行。通常，先 由葡聚糖内切酶水解纤维素可及度较高的非结晶区，产生大量还原性末端和非 还原性末端；再由葡聚糖外切酶从这些葡聚糖的非还原性末端起始逐步水解切 割葡聚糖长链；葡聚糖外切酶的水解产物通常为纤维二糖，而较高浓度的纤维 二糖会对葡聚糖外切酶产生产物抑制作用，因此需要6 一葡萄糖苷酶将纤维二 糖水解为葡萄糖以解除这种抑制作用 2 9 o 另一种观点以e n a r i 3 0 1 等人为代表，认为首先是由外切型葡聚糖酶( c b hi 和 c b h i i ) 水解不溶性纤维素，生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖，然后由内切型葡 聚糖酶( e gi 矛f f e g l l ) 作用于纤维糊精，生成纤维二糖；再由c b 组分将纤维二糖 分解成2 个葡萄糖。 1 3 3 3 酶解反应机理 纤维素中6 - l ，4 一糖苷键的酶解反应机理有转换( i n v e r s i o n ) 年l ：l 滞1 貂( r e t a i n i n g ) 两种 机制。在转换机制中糖苷键水解酶的两个参与催化反应的羧基距离为 0 9 一1 0 n m ，其反应过程包括两个步骤：广义酸催化解离离去基团；广义碱催化 帮助水分子对糖环碳2 位的亲核攻击( 见图1 4 a ) d i 。广义酸催化和广义碱催 化同时进行，因此整个反应过程可看作是一次一步到位的反应。滞留机制反应 则分为两步进行：糖基化反应，生成糖酶共价中间物，同时离去基团离开活性 部位；去糖基化反应，糖一酶共价中间物水解。采用滞留机制的酶活性部位，两 个参与催化反应的羧基相距约o 5 5 n m ( 见图l a b ) 1 3 1 i 。 从催化部位的结构上看，采用转换机制和采用滞留机制的两类糖苷水解酶 最大的区别就在于参与催化反应的两个羧基之间的距离。后者的两个羧基之间 只能容下一条糖链，而前者的两个羧基之间除可容下一条糖链外，还恰好留有 一个水分子的空间，从而使糖基化和去糖基化反应能同时进行【3 ”。 纤维素底物分子往往十分巨大，远大于酶分子，并且在反应体系中纤维素 和半纤维素底物也并非均匀分布。因此纤维素和半纤维索的酶解是一种非均 相反应，要有效水解巨大的底物，纤维素酶除具备催化结构域外，通常还包含 底物结合结构域，并且两结构域之间以连接序列相连。这种结构模式也是糖昔 水解酶类最常见的结构模式。 浙江大学硕士学位沦文 、邀( = 、。一 。王o h 。_ _ 。 、乡 图1 4d l ，4 一糖苷键酶解催化机理。 ( a ) 转换( i n v e r s i o n ) 机制：( b ) 滞留( r e t a i n i n g ) 机制 f i g 1 4e n z y m ec a t a l y t i cm e c h a n i s mo f l ) - 1 4 - g l y c o s i d i cb o n d ( a ) i n v e r s i o nm e c h a n i s m ( b ) r e t a i n i n gm e c h a n i s m 1 4 动物纤维素酶 1 4 1 动物纤维素酶发现 对微生物和植物中纤维素酶的研究起步较早，而动物纤维素酶的研究知道上 世纪九十年代末才有所进展。有些种类的真菌和细菌体内具有复杂的纤维素酶 系，可以有效地水解纤维素，如梭状芽孢杆菌( c 1 0 s t r i d i u mt h e r m o c e j j u m ) 中的 多纤维素酶体。在植物中，纤维素酶在植物的不同发育阶段发起到水解细胞壁的 作用，如果实成熟和叶柄脱落的生理现象。对于动物来说，起先，普遍的观点认 为动物本身不含有纤维素酶，那些食木性的节肢动物及草食性动物之所以可以以 一蕊。 一 百， 一。驽兰甚，立 菇。 王r o 浙江大学硕士学位论文 植物为食物来源，是因为其体内含有大量可以水解纤维素的共生菌，它们对纤维 素的消化主要是依靠其消化道内共生的微生物、原生动物完成的。这一理论最初 由c l e v e l a n d 于1 9 2 4 年提出。他在研究白蚁( r e t i e u l i t c f m p sf l a v i p e s ) 时发现， 除去后肠中原生动物的白蚁不能存活。在此后很长一段时间里，大家就是用这一 理论来解释高等动物为何能消化纤维素。此后也有很多研究证明了除了动物消化 系统中的原生动物外，其共生的细菌或真菌也能产生纤维素酶【圳。 随着对纤维素酶研究的深入，这一理论受到了挑战。1 9 6 3 年，m a r s h a l l 等在 蜗牛( h e l i xp o f a t i 盘) 无菌的肝胰腺中检测到了纤维素酶和几丁质酶活性，而且 还发现其消化液中纤维素酶和几丁质酶的活性与消化液中菌体的含量无关。此 外，还有研究结果表明，高等动物体内很可能存在内源性的纤维素酶，如将白蚁 ( l e u c o t e f m e s s p e r a t u s ) 暴露于较高温度中其肠道微生物的数量将大大减少，但 肠道中纤维素酶活力却未见明显下降。s c r i v e n e r 等研究食木蟑螂( p a n e s t h i a c r i b r a t a ) 时发现纤维素酶活性只在前肠和中肠中存在，而在有大量原生动物存 在的后肠中却未检测到纤维素酶的活力。将这种蟑螂用含有四环素( 能抑制细菌 和原生动物生长) 的滤纸喂养，1 2 周后仍未检测到其肠道内纤维素酶活性的下降， 并且在此期间，其产生的c o 。和消耗的0 ：之比介于0 9 8 和i 0 3 之间，表明他们并没 有动用体内储备的营养物质。由此一系列实验证明，食木蟑螂很可能具有内源性 的纤维素降解能力刚。 1 9 9 8 年，s m a n t 等【2 4 】用分子生物学的方法，从两种不同种属的植物寄生的线 虫中得到了4 个内切一b 1 ，4 葡聚糖酶( e g ) 的e d n a ；同年，w a t a n a b e 等利用白蚁 ( s p e r t a u s ) 的内切一6 1 ，4 葡聚糖酶的抗血清对其e d n a 文库进行免疫筛选，并采用 e d n a 末端快速扩增法( r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ，r a c e ) 得到白蚁内切 一b 1 ，4 一葡聚糖酶e d n a 。从而进一步证明了动物体内确实存在内源性的纤维素酶。 1 4 2 动物纤维素酶研究进展 1 9 9 8 年以来，从多种动物体内分离得到了内源性纤维素酶，但它们大都属于 内切一d 一1 ，4 一葡聚糖酶。例如，两种植物寄生的线虫( f f e t e r o d e r ag l y c i n e s 弄d 6 1 0 b o d e r ar o s t o e h i e n s i s ) 中各分离得到两种e g ，即h g e n g l 、h g e n g 2 和 g r e n g l 、g r - e n g 2 ，并得到了其相应的c d n a 。这4 种e g 均属于糖苷水解酶第5 家族 浙江大学硕士学位论文 ( g h f 5 ) ，并且其中一个含有细菌式样的纤维素结合结构域( c b d ) 3 4 ，通过基因组 p c r 的方法得到了全基因，h g - e n g l 和6 r - e n g l 含有8 个内含子，h g - e n 9 2 和6 r - e n 9 2 含有7 个内含子【3 5 】。1 9 9 9 年，利用己知的纤维素酶从螫虾的肝胰腺c d n a 库中得到 一个纤维素酶的e d n a ，属于g h f 9 中的成员，并且通过基因组p c r 的方法得到了证 实，这是从甲壳类中得到的第一个内源性纤维素酶的基因f 捌。从白蚁家族中有代 表性的成员f e r m i t i d a e 和r h i n o t e r m i t i d a e 中克隆得到了内源性e g 的e d n a ，这些 e g 均由4 4 8 个氨基酸残基组成，并且均属于g h f 9 ，都只含有单一的催化结构域。 通过原位杂交实验证明，t e r m i t i d a e 中的e g 来自中肠，而r h i n o t e r m i t i d a e 中的 e g 来自唾液腺i 1 。从线虫( m e l o i d o g y n e i n c o g n i t a ) 中分离到了一个e g ( 被命名为 m i e n g l ) ，它包括一个催化结构域和由富含羟基的氨基酸残基相连的一个结合结 构域组成，它的催化结构域属于g h f 5 ，c b d 属于第1 i 家族( 包括细菌水解酶的 c b d s ) p 8 ，它的分子量为5 3 4k d ，最适温度( t m ) 和最适p h ( p h m ) 分别为5 0 。c 和 5 0 【3 9 】。2 0 0 0 年，从一种低等白蚁( c o p t o t e r m e s ，：o r m o s a n u s ) 中分离到一个分子量 为4 8k d ，等电点( p i ) 、t m 和p h m 分别为4 2 、5 0 和6 o 的e g 。它属于g h f 7 成员( 主 要包括真菌纤维素酶，它被分成两个亚群：e g 和c b h ) ，而从其他白蚁中得到的纤 维素酶均属于不含真菌成员的g h f 9 4 0 i 。从贻贝( m y t i l u s e d u l i 0 中纯化得到一个 分子量为1 7 7 l k d 的e g ，p i 、t m 和p h m 分别为7 6 、3 0 5 0 和5 5 。它属于g h f 4 5 的第2 个亚家族【4 1 】。克隆到了贻贝此e g 的基因，且这个阱不含c b d ”1 。最近，从 鲍鱼( h a l i o t i sd i s c u sh a n n a i ) 的肝胰腺中纯化得到一种e g ，其分子量为6 6k d ， t m 和p h m 分别为3 8 。c 和6 3 ，它属于g h f 9 成员 4 3 1 。在甲虫( p s a c o t h e ah i l a r i 曲幼 虫的消化道中分离到了一个分子量约4 7k d ，包括单一催化结构域的e g ，归入g h f 5 的第2 亚家族，这是节肢动物门中发现的第一个属于g h f 5 的纤维素酶【4 4 l 。王冀等 从福寿螺( 以印“l a r ac r o s s c a n ) 的胃液中纯化到了一种分子量约4 1 5k d 具有葡 聚糖内切酶、葡聚糖外切酶以及木聚糖酶等多种酶活力的多功能纤维索酶( 命名 为e g x ) ，并从福寿螺卵巢中克隆由9 个外显子和8 个内含子组成的该基因组片段， 这是迄今为止在动物中发现的第一个具有潜在应用价值的多功能纤维素酶【4 。5 l 。 线虫、白蚁、福寿螺等基因的克隆，进一步证实了内源性动物纤维素酶的存 在。另外，虽然白1 9 9 8 年以来，很多动物纤维素酶的基因被克隆，但是可能是由 于动物纤维素酶存在着复杂的翻译后修饰，并且这些修饰，如糖基化修饰除对酶 1 2 浙江大学硕士学位论文 的稳定性有作用外，对纤维素酶的水解活性也有很重要的影响【4 5 1 。这使动物纤维 素酶难于在微生物或昆虫细胞中表达。到目前为止，最近报道的甲虫a p r i o n a g e 2 扭s f 霭b 物纤维素酶在昆虫细胞中的表达是比较成功的例子1 4 6 “7 1 。 1 5 纤维素酶的应用 纤维素酶从被发现起就受到世界各国生物界的关注。当今世界，能源和资 源闷趋危机，人们都十分期望能借助纤维素酶将地球上最丰富f 占全球总生物量 8 0 1 、最廉价的可再生资源纤维素转化为能直接利用的能源和资源。现在纤维 素酶的应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟 草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔。专家预测，针 对扮演绿色化学品的纤维素酶的研究开发利用是新世纪的可再生性资源的关 键。对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意 义。 1 5 1 纤维素酶在纺织工业中的应用 1 5 1 1 减量处理 纤维素纤维织物用纤维素酶处理都伴随着纤维的减量或失重，并引起许多 性能变化。减量加工大多数采用液体染色机和水洗机。棉织物经过纤维素酶整 理后。手感和外观可以有很大的改善。因为织物表面的绒毛被去除，处理后的 织物更光洁、颜色更鲜艳。织物的硬挺度和刚性降低，光滑度和悬垂性提高， 使织物获得更好的手感。若织物被减量过大，纤维的强度会受到损伤。棉织物 的失重率一般控制在3 5 范围为好。 1 5 1 2 生物抛光处理 天然纤维素的结构复杂，结晶度高，在一定酶浓度和时间条件下很难把纤 维素完全水解成葡萄糖单体，仅对织物表面或伸出织物表面的茸毛状短小纤维 作用。生物抛光也就是去除从纤维表面伸出的细微纤维，经纤维素酶处理后稍 经机械加工就可以得到表面平滑而茸毛少的织物。抛光的主要功效是使服装和 面料长久保持光鲜、手感更柔软。 浙江大学硕士学位论文 1 5 1 3 水洗和石磨处理 纤维素酶还广泛应用于牛仔裤产品的洗涤加工，代替石洗加工工艺。最早 应用在靛蓝牛仔服装的洗涤整理上，以获得与石磨相同的染料脱色，洗白等褪 色防旧效果。纤维素酶用于牛仔服装水洗石磨加工，加工后的服装雪花点多、 立体感强、色光好：与传统的石磨工艺相比，酶洗工艺条件温和，耗能降低，减 少了服装和设备的磨损，水洗效率高；与传统的化学助剂整理工艺相比，酶洗 工艺大大减少了污水排放，有利于环境保