（应用化学专业论文）基于巯基识别的DNA、蛋白质生物传感器的研制.pdf

硕士学位论文 摘要 摘要 本课题引入功能性的巯基识别物质结合荧光、电化学检测手段， 研制了高灵敏、高特异性的检测含巯基的多肽、蛋白质以及d n a 的 生物传感器。具体的说，本论文的主要研究工作包括： ( 1 ) 建立一种光谱型生物传感器，采用巯基特异性试剂n - ( 9 吖啶) 马来酰亚胺( n a m ) 来检测表面固定的多肽以及d n a 。作为模型体系， 首先在烷基硫醇( m u a ) 自组装膜修饰的金电极表面固定还原型谷胱 甘肽g s h ，采用n a m 标记g s h 中的游离巯基生成具有荧光的衍生 物，恒电位条件下脱附电极表面吸附物，检测脱附物在o 1 m o l l 1 k o h 溶液中的荧光强度。g s h 的检测限为4 0 p m o l l 。该方法可扩展到检 测电极表面固定的六肽f t ( 含3 个半胱氨酸残基) ，脱附物的荧光强度 约为g s h 时的3 倍，同f t 与g s h 中半胱氨酸残基的数量比相吻合。 我们还采用该方法对表面固定的d n a 进行了序列特异性分析，结果 令人满意。该方法将电化学脱附与荧光检测相结合，具有灵敏度高、 重现性好、样品用量少、快速准确等优点。 ( 2 ) 建立一种电化学生物传感器，采用双功能交联试剂n - ( 2 乙基 一二茂铁) 马来酰亚胺( f c m i ) 检测表面固定的微量p 5 3 蛋白质。在金电 极表面组装巯基化的单链s s d n a 探针己硫醇( h t ) 混合自组装膜， 随后单链s s d n a 探针与序列匹配的靶点d n a 杂交。所形成的一致 性双链d n a 捕获溶液中的野生型p 5 3 蛋白质。利用f c m i 对p 5 3 分 子表面的半胱氨酸残基衍生。p 5 3 与一致性双链d n a 之间的特异性 相互作用可通过检n - - 茂铁的电化学信号来指示。结果表明，碱基数 目错配会大大影响双链d n a 对野生型p 5 3 蛋白质的捕获。该方法可 检测的p 5 3 最低浓度为1 3 3n m o l l 一。 上述生物传感器与采用溶液方法检测含巯基的多肽或蛋白质相 比，具有灵敏度高、重现性好、样品用量少、快速准确等优点，为表 面固定的生物分子的检测提供了有效的途径。 关键词含巯基的生物分子，n - ( 9 吖啶) 马来酰亚胺，荧光，n - ( 2 一乙 基二茂铁) 马来酰亚胺，循环伏安 硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n dv o l t a m m e t r yh a v eb e e nu t i l i z e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fu l t r a t r a c el e v e l so fb i o m o l e c u l e ss u c ha sp e p t i d e s p r o t e i n sa n dd n ap r e i m m o b i l i z e do n t ot h ee l e c t r o d es u r f a c e t h e i n t r o d u c t i o no ft h ef u n c t i o n a lt h i 0 1 s p e c i f i cr e a g e n t si nt h e s em e t h o d s i n c r e a s e st h es e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y , a n dt h ea b i l i t yt or e c o g n i z et h e s p e c i e sa n a l y z e d t h em a i nc o n t e n t so ft h et h e s i sa r ea sf o l l o w s ： 1 t od e v e l o pam e t h o df o rt h ed e t e c t i o no fs u r f a c e c o n f i n e dp e p t i d e s c o n t a i n i n gc y s t e i n er e s i d u e so ro l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ( o d n s ) w h o s e3 e n d sm o d i f i e dw i t ht h i o lg r o u p s ，at h i o l - s p e c i f i cf l u o r e s c e n tc r o s s - l i n k e r , n 一( 9 一a c r i d i n y l ) m a l e i m i d e ( n a m ) w a su s e d t h ep e p t i d e ss t u d i e dh e r e i n i n c l u d eb o t ht h eo x i d i z e da n dr e d u c e df o r m so fg l u t a t h i o n e ，a n da h e x a p e p t i d e ( f t ) p e p t i d e s a r ef i r s ta t t a c h e do n t ot h ea c t i v a t e d 11 一m e r c a p t o u n d e c a n o i c a c i d ( m u a ) t e r m i n a t e d a l k a n e t h i o l s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( ，s a m s ) a n dt h e nd e r i v a t i z e dw i mn 气m t h e c y s t e i n er e s i d u e sw a sd e t e r m i n e dv i ac o m b i n a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a l d e s o r p t i o nw i t hf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n g s hc o n c e n t r a t i o na sl o wa s4 0 p m o l l c a nb em e a s u r e d t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi nt h ec a s eo ff t i s a b o u t3t i m e sa sh i g ha st h a tf o rg s h ，w h i c hi sc o n s i s t e n tw i t ht h em o l a r r a t i oo fc y s t e i n er e s i d u e si nt h e s et w om o l e c u l e s t h e a n a l y t i c a l p e r f o r m a n c eo fg e n ea n a l y s i sw a sa l s oe v a l u a t e dt h r o u g ht h ea n a l y s e so f ac o m p l e m e n t a r yt a r g e ta n dt a r g e t sw i t hv a r y i n gn u m b e r so fm i s m a t c h i n g b a s e s t h em e t h o dd e s c r i b e dh e r ei ss i m p l e ，s e n s i t i v e ，r e p r o d u c i b l e ，a n d d o e sn o tr e q u i r es o p h i s t i c a t e da n a l y t i c a li n s t r u m e n t a t i o na n ds e p a r a t i o n p r o c e d u r e s 2 d e v e l o p m e n to fs e n s i t i v ea n ds e l e c t i v em e t h o d st od e t e c tp r o t e i n a tt r a c el e v e l si so f g r e a tb i o l o g i c a li m p o r t a n c e c o n s e n s u s d o u b l e s t r a n d e do l i g o n u c l e o t i d e ( d s d n a ) w a sf i r s tf o r m e do n t og o l d e l e c t r o d e sv i a h y b r i d i z a t i o n o ft h i o l a t e d s i n g l e s t r a n d e d d n a ( s s d n a ) h e x a n e t h i o l ( h t ) m i x e ds e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e rw i t ht h e c o m p l e m e n t a r yd n a t oc a p t u r ew i l d - t y p ep 5 3i ns o l u t i o n t h ec y s t e i n e r e s i d u e so nt h ee x t e r i o ro ft h ep 5 3m o l e c u l e sw e r ed e r i v a t i z e dw i t ha t h i o l s p e c i f i cr e a g e n t ，- ( 2 一e t h y l f e r r o c e n e ) m a l e i m i d e ( f c m i ) i i w e l l d e f i n e dv o l t a m m e t r i cp e a k st h a tr e p o r to nt h e i n t e r a c t i o no ip 5 3 w i t hc o n s e n s u sd s d n aw e r eo b t a i n e d t h el e v e lo fp 5 3b i n d i n gw a s f o m l dt ob ed e p e n d e n to nt h es u r f a c ed e n s i t yo ft h ec o n s e n s u sd s d n a ， t h el e v e lo fp 5 3b i n d i n gw a sf o u n dt ob ed e p e n d e n to nt h es e q u e n c eo r - t h ed o u b l e s t r a n d e d ( d s d n a ) t h ep r e s e n tm e t h o dc a nm e a s u r ep ，j c o n c e n t r a t i o na sl o wa s1 3 3n m 0 1 l k e yw o r d sb i o m o l e c u l e s ，n - ( 9 a c r i d i t y l ) m a l e i m i d e ，f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y , n - ( 2 - e t h y l f e r r o c e n e ) m a l e i m i d e ，v o l t a m m e t r y 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名： 西 盈一一 日期：三盟年月当 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名 聊签名等一心尹 硕士学位论文第一章绪论 1 1 生物传感器 第一章绪论 在生物圈里，存在着数以万计的物种，他们之间通过各种奇妙的作用发生着 千丝万缕的联系。许多微生物具有独特的生物化学识别能力使他们得到营养物 质，远离危险，对这些物质进行快速自动分析，是科学家们梦寐以求的目标。在 过去的2 0 多年里，生物学与物理学，化学融为一体，产生了新一代的装置生 物传感器( b i o s e n s o r ) ，一个典型的多学科交叉产物，导致了分析生物学技术的一场 革命。目前，生物传感器的概念得到公认。作为传感器的一个分支，它从化学传 感器中独立出来，在生物医学【】、环境监测【4 】、等领域显示出广阔的应用前景， 引起了世界各国的极大关注。 1 1 1 生物传感器的定义与原理 国际理论化学与应用化学联合会定义生物传感器为5 】：“一个生物传感器应 是一个独立的，完整的装置，通过利用与换能器保持直接空间接触的生物识别元 件工作，它能够提供特殊的定量和半定量分析信息。 其过程可以描述为：待测 物通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别，发生化学反应后，所产生的信息被 相应的换能器转换成与被测物物理性质相关的各种信号【6 1 。其工作原理如图1 1 所示。 生物识别膜 飞酶 ； 荔抗原做体： 麓篡；： 壤d n a i ： 鼍 蛋白质 ： 痪。；爨兰黧。饼夕 换能器 图1 1生物传感器工作原理示意图 0 晶0珍嗍 粕0 力一 硕士学位论文第一章绪论 1 1 2 生物传感器的发展历程 1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n s i 7 】首次把嫁接酶法和离子敏感氧电极技术结合，创制 了测定葡萄糖含量的酶电极，开创了生物传感器的先河。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 瞄l 用聚丙烯酰胺凝胶固定葡萄糖氧化酶成膜和氧电极组装在一起，制成了固定化酶 电极这是生物传感器的首次问世。在这之前的电化学传感器只能检测阴、阳 离子，当与生物识别物质结合以后，许多其他物质得以检测。随后许多其它的生 物组分和换能器相继应用到生物传感器中。1 9 7 5 年，j a n a t a 【9 】研制出了电化学免 疫生物传感器，同年d i v i e s 1 0 】发表了第一篇关于电流型微生物传感器的论文。电 位型微生物传感器出现于1 9 7 7 年【1 1 1 ；组织传感器出现于1 9 7 8 年【1 2 】，线粒体电极 则是1 9 8 0 年【1 3 】完成的。8 0 年代，利用生物反应中的光效应、热效应、场效应和 质量变化而开发的生物传感器蓬勃发展，开始了生物电子学传感器的新时代。 1 9 8 0 年c a r a s 和j a l l a t a 【1 4 】首先研制成功可测定青霉素的酶场效应晶体管生物传感 器，这一成果为离子酶场效应晶体管开创了新的研究领域，又为生物传感器的微 型化，全固态化，集成化和多功能化开辟了一条新的途径，实现了生物传感器与 微电子技术的结合，为生物传感器应用于医学领域的在线测定奠定了基础。1 9 8 0 年a i z a w a 将a f p 抗体固定于醋纤膜上，并将此膜紧贴在电流型氧电极的透氧 膜表面，组装成测定a f p 的免疫电极【1 3 】，以抗体为识别元件的免疫传感器开始 使用。19 8 3 年l o w e 和c o f d f i n c h 1 5 】第一次将光学换能器引入到酶传感器领域。 此后，d n a 、r n a 甚至人工识别元件都先后应用于生物传感器中。近些年来， 己经研制出一系列在环境监测、临床检验和生化分析等方面具有实用价值的生物 传感器。 酶生物传感器的发展大致可以分为3 个阶段：以氧为中继体的电催化第一代 生物传感器，基于人造媒介体的电催化的第二代生物传感器和直接电催化的第三 代生物传感器： 2 硕士学位论文第一章绪论 n ( ) eleect秀rod彰e挺= e a 。 多 c 水： 、乡 e l e c t r o d e 乡 ( s u b s t r a t e e 。j 乡 图1 2 三代生物传感器的电子转移机理 ( a ) 第一代( b ) 第二代( c ) 第三代 第一代生物传感器：用酶的天然电子传递体氧来作为酶的氧化还原活性 中心的电子受体，通过检测反应物的消耗( 0 2 的减少) 或产物的增加( h 2 0 2 或 r ) 来 反映被测物的浓度变化的传感器被称为第一代生物传感器。当检测反应过程中的 氧含量减少时，由于直接的电子传递过程较慢，传感器对底物敏感性不够理想， 而且传感器易受环境中氧浓度的影响；当对反应产物h 2 0 2 进行测定时，在金属 电极和碳电极上h 2 0 2 直接氧化的过电位较高，试样中共存的其他电化学活性物 质( 抗坏血酸、尿酸等) 也能同时被氧化而产生干扰电流，给测定带来干扰。 可以通过采用各种选择性渗透膜，利用膜的极性、荷电性或孔径尺寸来去除 干扰物质【1 8 】；或是采用化学修饰电极降低过电位，但其灵敏度始终受到体系中 溶解氧浓度的限制。 第二代生物传感器：自上世纪七十年代起，人们开始研究以小分子电子媒介 体代替氧来沟通酶的电活性中心与电极之间的电子通道，通过检测媒介体在电极 上被氧化的电流变化来测量底物浓度的变化，以此为基础构建了第二代电化学生 物传感器。至八十年代中期，介体型酶电极的发展在改善酶电极性能方面取得长 足的进步，1 9 8 4 年a n t h o n yc a s s 博士【1 9 】率先发表了这方面的研究工作，自此，二 茂铁被广泛的作为电子传递媒介体在电极表面和酶催化反应层间起传递电荷的 3 硕士学位论文第一章绪论 作用。媒介体存在的方式有两种：一种是溶解在试样的溶液中，另一种是固定在 生物敏感膜内。由于前者必须向试样中不断加入媒介体，这类传感器不利于商品 化、实用化。而后者在测量时无需加入其他试剂而被称为无试剂生物传感器1 2 ， 为活体检测提供了方便，因此已成为传感器研制的一种趋势。 使用电子媒介体作为酶促反应的受体，不仅摆脱了电极对氧的倚赖性，而且 由于电子电位受媒介体的氧化电位决定，使用低氧化电位的电子媒介体，可以避 免其他电活性物质的干扰。 第三代生物传感器：利用酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号转换的 生物传感器被称为第三代生物传感器。 1 9 7 8 年苏联科学家发现在分子氧存在下漆酶和过氧化物酶可以实现直接电 子转移。此后，其它蛋白质及酶的直接电化学从不同角度得到广泛的研究。c o o p e r 等【2 l j 人通过碳化二亚胺，把细胞色素c 共价键合到- 乙酰半胱胺酸修饰金电极 上，使细胞色素c 与修饰电极间的直接电子传递得以发生，由此做成的生物传感 器对超氧化合物有很好的响应。含血红素酶的直接电化学屡有报道，许多基于过 氧化物酶直接电化学检测过氧化氢和有机过氧化物的第三代生物传感器被制备 出来【2 2 ，2 3 1 。最常见的第三代传感器是使用聚吡咯【2 引，四氰基喹啉并二甲烷和乙 炔聚合物【2 5 ，2 6 】等，通过恒电位或循环伏安制备。 前两代电化学生物传感器均属于间接电催化，其最大缺点是必须借助电子媒 介体，使传感器结构复杂并在其使用上具有较大局限性，而基于氧化还原蛋白质 在电极上直接电子转移的第三代电化学生物传感器却很好的克服了这些缺点。基 于这种原理制备的传感器与氧或其他电子受体无关，无需引入外加媒介体，因此 固定化相对简单，无外加毒性物质，是最理想的生物传感器。 1 1 3 生物传类型及特点 生物传感器种类繁多，从不同的角度可以有不同的分类。常见的可以从以下 几个角度来进行分类： 生物传感器和化学传感器一样，都是基于电化学或光学传感的原理，原则上 可分为电化学式和光学式两大类。其中电化学式包括电位式、电流式和电导式， 光学式包括吸光式、反光式和发光式。 根据传感器输出信号的产生方式可分为：生物亲和型1 2 7 】、代谢型和催化型【2 8 ， 2 9 。生物亲和型生物传感器利用抗原与抗体间专一性识别或键合性质来对抗原、 半抗原或抗体进行检测，它检测的是热力学平衡的结果。而催化型生物传感器则 利用酶的专一性和催化性，在接近中性和室温条件下对酶作用的底物进行检测， 它检测的是整个反应动力学过程的总效应。 4 硕士学位论文 第一章绪论 根据生物传感器的信号转换器类型可分为：电化学生物传感器l l 引、光化学 生物传感器【3 0 1 、压电生物传感器【3 1 1 、热传导生物传感器【3 2 】。 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质可分为类：酶传感器p 引、 微生物传感器【3 4 1 、组织传感器【3 5 】、d n a 传感器【3 6 】、免疫传感器【3 7 】、细胞传感 器以及分子印迹生物传感器 生物传感器一般具有以下的特点： ( 1 ) 根据生物反应的特异性和多样性，理论上可以制成测定所有生物物质的 传感器，因而测定范围相当广泛。 ( 2 ) 通常其敏感材料是固定生物元件，可以多次重复使用。 ( 3 ) 不需要进行样品的预处理，它利用本身具备的良好选择性把样品中被测 组分的分离和检测统一为一体。测定时一般不需另加其他试剂，使测定过程简便 迅速，容易实现自动分析。 ( 4 ) 体积小、响应快、样品用量少，可以实现携带及连续在线检测。 ( 5 ) 可进行在线活体分析。 ( 6 ) 准确度较高，一般相对误差可达到1 以内。 ( 7 ) 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪，因而便于推广普及。 1 1 4 生物传感器的应用情况及发展趋势 随着生物传感器在环境、食品、医药和军事等方面应用范围的扩大，人们对 生物传感器提出了更高的要求。为了获得高灵敏度、高稳定性、低成本的生物传 感器，人们己着力于下面的研究与开发。 ( 1 ) 开发新材料 功能材料是发展传感器技术的重要基础。由于材料科学的进步，人们可以控 制材料的成分，从而设计制造出各种用于传感器的功能材料。 ( 2 ) 采用新工艺 借助于基因重组技术、溶胶凝胶技术、酶的定向取向技术、光学成像技术、 微电子技术与微制作技术、计算机信息处理技术、纳米技术等技术的引入，得以 制造出综合性能稳定、可靠性高、体积小、重量轻的敏感元件。 ( 3 ) 研究多功能集成传感器 对于复杂体系中多种组分的同时测定，人们正尝试发展多功能集成传感器， 在尽可能小的面积上排列尽可能多的传感器。 ( 4 ) 研究仿生传感器 仿生传感器就是模仿人感觉器官的传感器。从目前的发展现状来看，各种类 型的仿生传感器都是热门的研究领域。 硕士学位论文第一章绪论 ( 5 ) 研究智能式传感器 这种带微型计算机的传感器兼有检测、判断信息处理等功能。 ( 6 ) 生物传感器的市场化 1 2 自组装膜技术( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 分子自组装是一种普遍存在于生命体系中的现象，大量复杂的、具有生物学 功能的超分子系统( 蛋白质、核酸、生物膜、脂质体等) 正是通过分子自组装形成 的。此外，分子自组装也是分子合成工程中的重要手段之一，是构成某些特殊功 能材料( 液晶、多层膜、单层膜、功能性表面等) 的有力工具。这些材料具有新奇 的功能和特性，在分子器件、分子调控等方面具有潜在的应用价值，因而自组装 体系的研究与应用受到了广泛的重视1 3 引。 1 2 1s a m s 发展简史 s a m s 研究的起源可以追溯到1 9 4 6 年，z i s m a n 3 9 | 等在清洁的金属表面吸附 一种表面活性剂，从而在金属表面制备了单分子膜。但那时人们还没有认识到自 组装膜的潜在优势，因而没有引起太多的关注。 真正自组装的研究兴起是在二十世纪八十年代。1 9 8 0 年s a g i v 4 0 j 等报道了十 八烷基三氯硅烷在硅片上形成的s a m s ，19 8 3 年n u z z o l 4 l 】等成功地制备了烷基硫 化物在金表面的s a m s ，这一工作成为s a m s 发展史上的里程碑。从此几种制备 s a m s 的体系逐渐成熟和发展起来。这些体系包括脂肪酸在氧化铝表面形成的 s a m s ，主要研究小组有a l l a r a 【4 2 讣组等。有机硅烷衍生物在羟基化表面形成的 s a m s ，如s a g i v 4 0 1 等在1 9 8 0 年报道的c 1 8 h 3 7 s i c l 3 在玻片表面上的成膜。 8 0 年代引人注目的成就就是开展了疏基化合物在金表面的自组装研究工 作。1 9 8 7 年，a l l a r a 4 3 等用循环伏安法研究了直链硫醇分子在金表面的s a m s 。 9 0 年代人们对疏基化合物在金属和半导体表面形成的s a m s 进行了广泛和深入 的研究。研究的自组装试剂除最常用的硫醇外，还有硫醚、双硫化合物、苯硫酚 等。自组装的基底材料除了单晶和多晶的金外，还有银、铜、铂、汞、铁和纳米 粒子如纳米金、纳米氧化铁等，但大部分的工作都是在金表面进行的。r a z u m a s 4 4 ， a b b o a 4 5 , 4 6 j 等也对金电极表面的自组装进行了广泛而系统的研究。 脂肪酸及其衍生物在基底上的组装在9 0 年代也是一个比较重要的研究领 域。人们对脂肪酸及其衍生物在a 1 ，a g ，c u 等金属氧化物表面的s a m s 的形成机 理和结构进行了系统的研究。a l l a r a 【4 3 】等研究了脂肪酸在氧化铝表面上形成 s a m s 的结构，对羧基与基底的键合方式、分子的取向、膜与空气的界面结构进 6 硕士学位论文第一章绪论 行了探讨，在此基础上，t a 0 1 4 7 】等进一步研究了一系列不同链长的脂肪酸在银、 铜、铝表面的s a m s 结构。研究表明，不同的基底材料上，s a m s 的结构( 梭基 与基底的键合方式、分子链的取向及存在缺陷程度等) 存在很大的区别，此外， 分子链中碳原子的个数不同( 奇数或偶数) ，末端基团的取向也不同。这些结果从 反射红外和接触角测定的实验中得到了证实。其他从事这一领域研究的还有 p e m b e r t o n 4 8 】等。 在硅表面通过碳硅键化学键合而形成烷烃s a m s 是自组装膜研究的新领 域。c h i d s e y l 4 9 】等研究了利用r c o o o o c r 与硅氢表面的多步自由基反应而制得 了较为紧密的s a m s 。由于烷烃在自然界中的数量很大，所以研究烷烃在基底表 面的s a m s 具有重要意义。 1 2 2s a m s 的制备和动力学过程研究 s a m s 的制备方法是将基底浸入含有各种官能团的成膜分子的溶液中，使成 膜分子通过化学键作用与基底相互作用，自发吸附在异相( 固液或气液) 界面上 而成有序膜【5 0 。如图1 3 所示：可以将s a m s 从组成和结构上分为3 部分【4 9 】：结合 基底为分子的头基( h e a dg r o u p ) ，它与基底表面的反应点以共价键或离子键结合， 该结合过程为放热反应，活性分子将尽可能占据基底表面的反应点；自组装膜分 子链间靠范德华力作用( 如果链中带有极性基团还有静电作用等) 使活性分子在 固体表面有序紧密排列，分子链中间可通过分子设计引入特殊的基团，从而赋予 s a m s 特殊的物理化学性质；自组装膜最上端为分子末端基团( t e r m i n a lg r o u p ) ， 选择末端基团可以获得具有特定物理化学性能的表面或借助其反应活性构筑多 层膜。 s a m s 组装的动力学研究表明【5 1 】：成膜分子与基底表面进行自组装成膜可分 为两个步骤。第一步是快速的化学吸附过程，在很短的时间内就可以完成 8 0 9 0 的膜的自组装，该时间段内，膜组装完成时间与组装液的浓度有关，即 浓度越大，组装越快。一般来讲，在几分钟内组装即可完成。第二步为表面膜的 重组过程，即从无序态到有序态，分子形成致密膜的过程，表面形成规则排列的 二维膜，但这个过程所花的时间较长，一般为几小时或几十小时。从其影响因素 来看，第一步受组装试剂活性基团与基底材料表面的反应速度控制，第二步与组 装的混乱度，链上的不同基团及其在基底材料表面的移动性能有关。 7 硕士学位论文第一章绪论 t e r m i n a lg r o u p h e a dg r o u p a i k y lo rd e r i v a t i z e d a i 蚓g r o u p 图1 3自组装单层膜结构及作用力示意图 1 2 3s 劬v i s 的类型及优势 由于在s a m s 中可以连接不同的官能团，所以用s a m s 技术可制得各式各样 的有序排列的单层膜。不同s a m s 的体系成膜机理不尽相同，概括起来主要可分 为五大类 4 9 ，5 0 】： ( 1 ) 有机硫化物在金属和半导体上形成的s a m s 这种s a m s 是通过有机硫化物的硫原子与基底表面金属原子形成配位键而形 成的。人们对于硫和硒的化合物在金属表面特别是金表面上的组装进行了广泛而 深入的研究，其中烷基硫醇类s a m s 是最早用于自组装的一类体系，也是研究得 比较详细和深入的体系。巯基与金之间有强烈的化学作用，其成键结合度高，反 应条件易控制，膜高度有序。其作用机理如下【5 2 】： r s h + 2a u o _ r s a u + a u o + 1 2h 2 1 2r s s r4 - 2a u o _ r s a u4 - a u o 公式( 1 1 ) 公式( 1 2 ) 一般认为烷基硫醇类s a m s 的形成有两步【5 2 】：1 从低密度气态到低密度固相 的凝聚，主要涉及硫醇分子在基底表面的吸附和平铺；2 固相完全覆盖基底表 面并达到饱和，平铺的分子重新沿表面法线方向排列并向高密度相转移，最终形 成单层膜。具体如图1 - 4 所示：( a ) 在低覆盖度下硫醇分子以高流动晶格气相存在； ( b ) 在表面覆盖度达到饱和之前，“波纹相”岛、多相成核及其生长与晶格气相 达到平衡，硫醇分子平铺在基底表面：( c ) 表面“波纹”相覆盖度达到饱和；( d ) 在“波纹”相畴界，通过高密度岛的成核，表面进行固固相转移；( e ) “波纹” 相逐渐消失，高密度岛逐渐生长，直至表面达到饱和。 匿 硕士学位论文第一章绪论 帆 鸭 hj 啊_ v 蝇 广_ 1 劬产竺警盘生竺咝竺篮譬攀 图1 _ 4 金表面烷基硫醇s a m s 的形成示意图 除了硫醇可用作组装试剂外，研究的含硫的试剂还有：联硫化合物【4 l j 、双 烷基硫化物【5 3 1 、硫酬5 4 1 等。用作基底的材料除金外，还有p t 【5 5 1 等。 ( 2 ) 长链脂肪酸类在金属氧化物表面所形成的s a m s 长链烷基脂肪酸自组装膜的原理是基于酸碱反应，通过酸根与基底表面的金 属形成离子键而组成的。现已研究的体系有脂肪酸在a 9 2 0 ，c u o ，a 1 2 0 3 等表面形 成的s a m s 4 2 ，4 8 , 5 l 】。， 以脂肪酸在a l 表面的吸附为例，其自组装机理如图1 5 所示【4 引： a g o a 1 2 0 3 图1 - 5 脂肪酸类s a m s 在金属氧化物上的结构示意图 在空气中，灿表面极易形成一层a 1 2 0 3 超薄膜，其中的一部分a l 原子与羟基 或水分子结合而带一个正电荷。当脂肪酸在a l 表面发生吸附时，羧酸电离产生带 9 硕士学位论文 第一章绪论 负电荷的羧基并同带正电荷的a l 原子键合，形成牢固的离子键合；而羧酸电离产 生的矿可以与a 1 2 0 3 表面的o 结合形成o h 或同o h 结合生成h 2 0 。 ( 3 ) 有机硅烷及其衍生物组装的s a m s 这种膜需要羟基化的基底表面，通过s i o 共价键与底物键合，由于是通过分 子间相互聚合所形成，所以特别稳定。作为自组装的硅烷类化合物多为氯取代或 烷氧基取代的长链有机硅烷，如：s i 0 2 、a 1 2 0 3 ，石英，玻璃，云母等【5 6 ，5 7 1 o 以十八烷基三氯硅烷( o t s ) 为例，其自组装单分子层的形成经过三个步骤， 首先o t s 水解，水解的三羟基十八烷基硅烷通过氢键与基底的硅羟基或相邻分子 的硅羟基发生强烈吸引，最后，水解的o t s 分子中的羟基与表面硅羟基间以及和 相 i j o t s 分子脱水形成共价键。如图1 6 所示。 a 卜l a 图1 - 6 羟基化硅基底表面烷基氯硅烷s a m s 的形成示意图 ( 4 ) 配位键s a m s 这一领域的研究还刚刚开始，l i n d f o r d ) 及c h i d s e y 5 8 】等首次在硅表面通过自组 装烷烃形成单分子膜，其主要机理是通过c s i 键键合到硅表面。 ( 5 ) 磷酸盐沉淀的s a m s 磷酸盐单层膜就是基于磷酸盐与四价过渡金属离子形成不溶盐的性质而形 成的s a m s 。m a l l o u k t 5 9 1 等首先发现z r 4 + 与亚烷基二磷酸自动吸附形成自组装膜。 其后，人们对于其它的磷酸盐化合物自组装膜也进行了研究。 s a m s 具有以下几点潜在优势【6 0 】： ( 1 ) 制备简单，耗能少，成本低，只需将底材浸入含活性分子的溶液或蒸汽 中，活性分子则会自发形成。 ( 2 ) 分子排列有序，结构紧密。 ( 3 ) 高密度堆积和低缺陷含量，无论基底形状如何，其表面均可形成均匀一 致的覆盖层。 1 0 硕士学位论文第一章绪论 ( 4 ) 热力学稳定。 ( 5 ) 可人为设计分子结构和表面结构来获得预期的界面物理和化学性质，有 利于选择膜的空间结构和取向类型，赋予膜特定的功能。 ( 6 ) 有机合成和制膜有很大的灵活性和方便性。 1 3 荧光光谱技术用于构建生物传感器的研究进展 蛋白质是人体中重要的生物大分子，它不仅对于维持生命是十分重要和必不 可少的，同时，它对于生命遗传密码的翻译、信息的转录、d n a 的复制等均有 密切关系。蛋白质与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质的逆转、遗 传、生命的起源和生物进化等有密切的联系，它是生命现象的物质基础。正是由 于蛋白质本身的重要性，所以对它的研究一直受到人们的重视。其定量测量是化 学、生物化学、医学等研究领域的重要课题。 在蛋白质分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 以及苯 丙氨酸( p h e ) 。个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 也能发射荧光。 t r p 、t y r 以及p h e 由于其侧链生色团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其 中t r p 的荧光强度最大，t y r 次之，p h e 最小。因为蛋白质的荧光通常在2 8 0 r i m 或 更长的波长被激发，p i l e 在绝大多数实验条件下不被激发，所以很少能观察到p h e 的发射。这样蛋白质的内源荧光主要来i ! l t r p 和t y r 残基。t r p 残基对微环境的变 化很敏感，并且大多数蛋白质都含有几个不同的t r p 残基，因而常作为内源荧光 探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。除测定蛋白质分子的自身荧光，即“内源 荧光”外，还可以利用荧光探针，即“外源荧光”。 由于光学生物传感器具有非破坏性的操作模式，较高的信号产生与读取速 度，使得光学生物传感器成为迄今为止应用最为普遍的生物传感器。荧光分析法 因其具有灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生 理环境的优点而在蛋白质分析中应用广泛。在检测生物活性物质，如酶，蛋白质， 多肽，d n a ，抗原抗体等方面广泛的被使用。 1 3 1 蛋白质检测荧光光谱法的研究进展 荧光光谱法灵敏度高，复杂组分辨识度好，作为一种常规的检测手段在生物 传感方面发挥着其优势，是定量测定蛋白质的常用方法。常用的几种方法是内源 荧光法、荧光探针法、荧光偏振、时间分辨荧光法及激光诱导时间分辨免疫分析 法。 硕士学位论文第一章绪论 ( 1 ) 内源荧光法 内源荧光法是基于蛋白质中存在着酪氨酸和色氨酸，能够吸收2 7 0 3 0 0 n m 的 紫外光而发出紫外荧光发展起来的【6 l 6 2 1 。当测定体系中加入小分子配体( s m ) 时， s m 与蛋白质发生相互作用，会导致蛋白质荧光的猝灭，利用s m 对蛋白质内源 荧光的猝灭这一现象可以确定蛋白质与s m 的作用类型及其结合部位等。此法比 紫外分光光度法灵敏，且核酸的干扰较小，来自其他小分子化合物的干扰也比较 小。 ( 2 ) 外源荧光法 对于蛋白质的研究仅利用其内源荧光是不够的，需要通过外源荧光性质的研 究才能获得更多关于蛋白质分子的各种信息，这就使得荧光探针对蛋白质分析有 着重要的意义，这已成为蛋白质微量检测及溶液的构相分析中的手段之一。作为 一个好的荧光探针应满足以下条件【6 3 ，删：探针分子与蛋白质分子的某一微区必 须有特异性的结合，并且结合比较牢固；探针的荧光必须对环境条件敏感；蛋白 质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。在外源荧光法中，又可分为荧 光增强法和荧光猝灭法。 ( 3 ) 荧光偏振法 利用荧光体在转动扩散速度上的差异而导致偏振荧光的差别，建立了荧光偏 振测定法。利用荧光偏振我们可以研究：( 1 ) 酶与荧光底物的结合程度；( 2 ) 蛋白 质聚合与解离；( 3 ) 蛋白质从螺旋到无规则卷曲的研究。另外还可得到一些通常 由圆二色谱和紫外可见分光光度计得不到的有关蛋白质柔性微区的信息【6 引。 ( 4 ) 时间分辨荧光光谱法 时间分辨荧光光谱是依据待测组分荧光衰减特性的差异而进行选择性测定， 可以消除瑞利和拉曼散射的干扰，又可以根据荧光寿命的差异对荧光光谱重叠组 分进行测定，为复杂体系的荧光测量提供了选择性基础。时间分辨一荧光免疫分 析以具有较长荧光寿命的荧光基团作为免疫标记，利用时间分辨荧光测量技术进 行测定。一方面可以在荧光分子定量中获得高灵敏度，另一方面可以通过时间分 辨技术使选择性得到改善，这样就可以定性和定量分析微量蛋白质。 ( 5 ) 激光诱导时间分辨免疫分析法 在稀土配合物时间分辨荧光光谱和免疫分析的基础上发展起来的激光诱导 时间分辨免疫分析法在灵敏度、专一性、稳定性等方面均可与放射免疫分析相媲 美，是超微量蛋白质免疫分析的有力手段，已用于人尿中免疫球蛋白g 的测定m 1 。 1 3 2 蛋白质分子荧光探针的发展趋势 近年来在特定蛋白质的光学标记方面，尤其是分子小、量子效率高、荧光探 1 2 硕士学位论文 第一章绪论 针分子设计与应用方面的研究取得了较大进展。可以预计今后相关研究将会侧重 于以下几个方面： ( 1 ) 合成新型分子荧光探针，提高灵敏度，增强光稳定性，降低合成成本， 开发出更多针对生物活体内不同种类蛋白质分析检测的特异性荧光探针。 ( 2 ) 深入研究荧光探针与蛋白质的作用方式，对蛋白质进行定量分析和特异 识别来探讨生命机理，加深对生命过程机理的理解。 ( 3 ) 利用激光共聚焦等荧光成像技术实现对一些生物过程运用多种方法、多 种参数进行多层面实时观测、动态研究，开发新的、灵敏的、能进行活体追踪和 检测的分析测试方法。 ( 4 ) 蛋白质表达的变化或异常会造成疾病的发生，通过蛋白质标记物研究疾 病机理，对疾病进行预警，防患于未然，实现对疾病的早期发现、早期治疗和早 期诊断，同时开发针对各种疾病机理的高效药物。 总之，在生物学、医学等学科的有力推动与渗透下，随着新型、性能优异的 荧光探针的不断开发与应用，人类将能够实现对生命特质的结构与功能的探讨， 进而解释生命的奥秘，极大地推动并促进生命科学、分析化学与医学的发展。 1 4 电化学生物传感器研究进展 生命现象的许多过程皆伴随着电子传递反应，应用电化学方法研究生物体系 的电子传递及其相关过程，是揭示生命本质的较好途径，而生命科学的飞速发展 也需要借助更多的研究手段来实现。 电化学传感器与其它检测技术相比，具有选择性好、灵敏度高、成本低、耗 能小、体积小、仪器简单、快速、易于集中、可以微型化、无放射污染、测试费 用低廉等优点、同时又不破坏测试体系，不受生物样品中浑浊、溶血等情况干扰， 符合现代分析技术发展的要求，得到了迅速发展。下面介绍两种最常用的电化学 生物传感器。 1 4 1d n a 电化学传感器 脱氧核糖核酸( d n a ) 是生物的基本遗传物质，人类的d n a 大约有6 0 亿核苷 酸碱基对，含有大约1 0 万个独立基因，包含着巨大信息量，蕴涵着整个生命的 秘密。生命体绝大多数遗传信息储存在d n a 片段中的4 种碱基序列中，人们形 象的将d n a 碱基序列称为遗传编码，而d n a 序列分析是揭开遗传密码的关键， 也是基因研究的核心。 d n a 的电化学研究工作始于1 9 6 1 年【6 7 1 ，早期的工作主要在于d n a 的基本 硕十学位论文第一章绪论 电化学行为研究。近十几年来，多种电化学方法开始用于d n a 的研究，其研究 范围己扩大到d n