（环境科学专业论文）氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究.pdf

关键词：氧化铜纳米颗粒，细胞毒性，氧化胁迫，d n a 损伤，排泄，a 5 4 9 细胞 t o x i c i t ym e c h a n i s mo fc u on a n o p a r t i c l ei nh u m a n l u n gc e l l s a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fn a n o t e c h n o l o g y , e n g i n e e r e dn a n o p a r t i c l e s ( e n p s ) w e r eu s e dg r a d u a l l yi ne n e r g y , b i o l o g i c a la n dm e d i c i n ef i e l d s h o w e v e r , t h eu s a g e ， t r a n s p o r t ，d i s p o s a lo fe n p si n e v i t a b l yr e s u l ti n t h e i rr e l e a s ei n t oa m b i e n ta i ra n d p e n e t r a t ed e e pi n t ot h el u n g s ，a n de v o k ea d v e r s ee f f e c t s t o l u n g ，a n dt h e np o s e u n e x p e c t e dh e a l t hi m p a c t s t oh u m a n s a st h eb a s i cu n i to ft h el i f ea c t i v i t i e s ，c e l l sh a v e c h a r a c t e r i s t i c st ou s ec e l l sa st e s to r g a n i s m ，s u c ha ss h o r tt e s tc y c l e ，e a s y - c o n t r o l l e d c u l t u r ec o n d i t i o n s ，h i g hs e n s i t i v i t y , a n di tc a nr e v e a lt o x i c i t ym e c h a n i s mf r o mt h e m o l e c u l a rl e v e l ，s oi ti sw i d e l yu s e di ne x p l o r i n gt o x i c i t ym e c h a n i s mo fe n p s i nt h i s s t u d y , t h eh u m a nl u n ge p i t h e l i a l ( a 5 4 9 ) c e l l sw e r ec h o s e na st e s tc e l l s t h ea i mw a s t oi n v e s t i g a t et h ec e l l u l a ru p t a k ea n d e x p o r tc o p p e ro x i d e ( c u o ) e n p s t oc e l l sa n dt h e e x a c tt o x i cm e c h a n i s m t h er e s u l t sw e r ep r e s e n ta sf o l l o w s ： t o x i c i t yo fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fc u o e n p st oa 5 4 9c e l l sw a si n v e s t i g a t e d i nt h i ss t u d y c u oe n p s ( 2 0t o10 0m g l ) h a ds i g n i f i c a n tt o x i c i t yt oa 5 4 9c e l l s w h e r e a sc u ob u l kp a r t i c l e s ( b p s ) s h o w e dm u c hl o w e rt o x i c i t y ( 2 4hi c s o ，58a n d15 f o rc u ob p sa n de n p s ，r e s p e c t i v e l y ) t h e r e f o r e ，a 5 4 9c e l l se x p o s e dt o15m g m c u o e n p sf o r2 4hw a sc h o s e nf o rt h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t so ft o x i c i t ym e c h a n i s m t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p i ca n a l y s i sd e m o n s t r a t e dc u on pe n t r yi n t o a 5 4 9c e l l sa n do r g a n e l l e s ，i n c l u d i n gl y s o s o m e s ，m i t o c h o n d f i aa n dt h en u c l e u s s i m u l t a n e o u s l y ，c u oe n p sw e r eo b s e r v e di np r i m a r yl y s o s o m ei nt h ec y t o p l a s mo f t h ec e l l s ，s u g g e s t i n gt h a tp a r t i c l e se n t r yi n t ot h ec e l l si st h r o u g he n d o c y t o s i sr a t h e r t h a nd i f f u s i o n c o m p a r i n gt h eu p t a k ec o n t e n to fc u oe n p sb e t w e e nt h ec e l l sw i t h a n dw i t h o u tn a n 3p r e t r e a t m e n t ，e n d o c y t o s i sw a sc o n f i r m e dt o b et h ep r i m a r y p a t h w a yo fc u oe n p su p t a k e c u oe n p s ( 1 5m g l ) i n d u c e dm i t o c h o n d r i a l d e p o l a r i z m i o n ，p o s s i b l ym e d i a t e db yr o sg e n e r a t i o n i n t r a c e l l u l a rc u o e n p sf i r s t g e n e r a t er o s ，w h i c hs u b s e q u e n t l y i n d u c e st h ee x p r e s s i o no fp 38a n dp 5 3a n d u l t i m a t e l yc a u s e sd n ad a m a g e af r a c t i o no ft h ec u o e n p sw a se x p o r t e dt ot h e i i i e x t r a c e l l u l a re n v i r o n m e n ta n dd e t o x i f i c a t i o np r o c e s s e so c c u r r e di nc e l l s a d d i t i o n a l l y , c e n t r i f u g a lu l t r a f i l t r a t i o nt u b e sw e r es u c c e s s f u l l ye m p l o y e dt od e t e r m i n et h ed is s o l v e d c u 2 + f r o mc u oe n p si nt h ec e l lm e d i u m d i s s 0 1 v e dc u 2 + i o n sc o n t r i b u t e d1 e s sm a n h a l fo ft h et o t a lt o x i c i t yc a u s e db yc u oe n p s t h u s ，m o s to fc y t o t o x i c i t yw a sc a u s e d b yt h ec u o e n p st h e m s e l v e s k e yw o r d s ：c u on a n o p a r t i c l e s ，c y t o t o x i c i t y , o x i d a t i v es t r e s s ，d n ad a m a g e ， e x c l u s i o n ，a 5 4 9c e l l s 1 v 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 0 前言 近年来，随着纳米技术广泛应用于人类的工业、医药、生物、日常生活等领 域，毫不夸张的说2 1 世纪已经逐渐转变为“纳米”世纪。据不完全统计，已经 有2 0 多个国家开始生产和销售不同种类的纳米产品，包括防晒霜、纺织品、化 妆品、运动配件等( l e ee ta 1 ，2 0 0 8 ；n a t i o n a ln a n o t e c h n o l o g yi n i t i a t i v e ；t h er o y a l s o c i e t yr e p o r t ，u k ，2 0 0 4 ；t h o m a se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。暴露在环境中的纳米颗粒 ( e n g i n e e r e dn a n o p a r t i c l e s ，e n p s ) ，由于其具有独特的物理化学性质，能够与生 物系统发生相互作用，会对环境和生态系统造成潜在的危害( m a y n a r d 等，2 0 0 6 ； n e l 等，2 0 0 6 ；w i e s n e r 等，2 0 0 6 ) 。目前，已有学者在( ( s c i e n c e ) ) 、( ( n a t u r e ) ) 等 杂志先后报导了e n p s 的潜在毒性，呼吁在充分开发利用e n p s 潜能的同时，加 强对e n p s 环境行为和生态效应的研究( s e r v i c e 等，2 0 0 3 ；m a y n a r d 等，2 0 0 6 ) 。 因此在纳米技术的飞速发展的同时，更应当评价e n p s 长期暴露于环境中对于人 类和环境的负面影响，促进纳米技术的可持续发展。 已有研究证明e n p s 能够在动物整体水平( w a r h e i te ta 1 ，2 0 0 9 ) 、细胞水平 ( a s h a r a n ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 、蛋白及基因水平( z h ue ta 1 ，2 0 0 7 ；b h a b r ae ta 1 ，2 0 0 9 ) 对生 物体造成毒性损伤。同时，暴露在空气中的e n p s 通过呼吸作用进入肺部，可以 引起肺部疾病( p e n t t i n e ne ta 1 ，2 0 0 1 ；w e i c h e n t h a le ta 1 ，2 0 0 7 ) ，暴露于肺细胞的 e n p s 诱导发生炎症反应，进一步导致细胞死亡( y a n ge ta 1 ，2 0 0 9 ) 。对于人体而 言，肺部损伤将会严重影响人体健康，因此研究e n p s 对人体肺细胞的毒性效应 及致毒机制具有重要的科学意义。 金属和金属氧化物e n p s 广泛应用于个人护理产品( s e r p o n ee ta 1 ，2 0 0 7 ) ， 催化齐t j ( d u t t ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 及水质净化产品( k o b e e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。人类肺上皮细胞 a 5 4 9 作为一种模式细胞被广泛应用于肺部毒性研究中( s i m o n - d e c k e r se ta 1 ， 2 0 0 8 ；b r a y d i c h s t o l l ee ta 1 ，2 0 1 0 ) 。金属和金属氧化物e n p s 对于哺乳动物细胞的 毒性效应已有报导，研究表明e n p s 可以产生氧化胁迫导致细胞毒性，但是e n p s 的细胞摄取和排泄机制，e n p s 在细胞内的定位及确切毒性机制尚不明确。因此， 本文通过研究氧化铜c u oe n p s 对a 5 4 9 细胞的毒性效应及摄取排泄过程，深入 探讨e n p s 对人体肺细胞的致毒机制。 l 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 1 绪论 1 1 研究背景与意义 由于e n p s 自身极其微小的粒径、相对较大的比表面积、表面含有大量活性 位点等特殊的理化性质，使其广泛应用于生物、医药、电子、催化等领域。纳米 产品在过去1 0 年呈现飞速增长，其范围及种类不断扩大，估计在未来的1 0 年里 将增加到5 8 0 0 0 吨( m a y n a r d a n dm i c h e l s o n ，2 0 0 6 ；k l a i n ee ta 1 ，2 0 0 8 ) 。在纳米材 料大规模化生产、使用和处理过程中，e n p s 不可避免的进入到大气、水体、土 壤中( b r a t 等，2 0 0 9 ) 。至今已有大量研究表明，e n p s 对细菌、藻类、动物和植 物等均能产生毒性效应( m e d i n ae ta 1 ，2 0 0 7 ；s a i s o ne ta l + ，2 0 1 0 ；d u m a se ta 1 ， 2 0 1 0 ：i s p a se ta 1 ，2 0 0 9 ；l i u e ta 1 ，2 0 1 0 ) 。因此，作为一种潜在新型有毒物质， e n p s 环境效应的研究己成为国际上纳米技术领域的研究热点。 近年来，金属和金属氧化物e n p s 对生物毒性研究在公众和学术界引起关注。 研究表明，e n p s 主要在动物的肺，肝，脾，肾组织产生毒性效应( c h e ne ta 1 ，2 0 0 6 ； w a n g e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。e n p s 释放进入空气中会对肺部健康产生负面影响。细胞作为 生命活动的基本单位，具有试验周期短、培养条件易于控制、灵敏性高等特点， 可以从分子层面揭示致毒机制，所以广泛应用于探究e n p s 的毒性机制 ( m a u r e r - j o n e se t a l ，2 0 1 0 ；f a h m ye la 1 ，2 0 0 9 ) 。目前已有很多针对金属和金属氧 化物纳米颗粒对人体肺上皮细胞的毒性研究报道，但是在e n p s 在人体细胞内的 转运和致毒机制等研究方面还缺少大量的基础资料。因此，本文以c u oe n p s 为 研究对象探究其对人体肺上皮细胞( a 5 4 9 细胞) 摄取、转运、释放及致毒机制， 为e n p s 的对人体健康风险评价和无害化处理提供科学理论依据。 1 2e n p s 概述 1 2 1e n p s 的概念 纳米是一米的十亿分之一( 1 0 9 m ) ，是一种几何长度的量度单位，大约等于 4 5 个原子排列起来的长度。构成纳米材料的基本单位尺度很小，且具有很大的 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 表面积，使得纳米材料具有不同于宏观尺度材料的许多特殊效应和物理化学特性 ( n e le ta 1 ，2 0 0 6 ；x i ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。根据美国试验与材料协会( t h ea m e r i c a n s o c i e t yf o rt e s t i n ga n dm a t e r i a l s ) 和英国标准学会( t h eb r i t i s hs t a n d a r d si n s t i t u t i o n ) 的定义，纳米材料是指至少在一维空间粒径在1 1 0 0u r n 的材料；e n p s 是指至少 在二维空间粒径在1 1 0 0n l n 的材料( k l a i n ee ta 1 2 0 0 8 ) 。虽然e n p s 团聚体的粒 径可能会超过1 0 0a m ，但是实际生物毒性研究中也应当考虑其对生物的毒性效 应( b o r me ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 2 2e n p s 的分类 人工合成e n p s 根据其化学组成的不同可分为5 类：碳e n p s 、金属氧化物、 零价( z e r o - v a l e n t ) 金属、量子点( q u a n t u md o t ，q d s ) e n p s 和有机聚合物等其它 e n p s ( j u - n a ma n dl e a d ，2 0 0 8 ) ( 1 ) 碳e n p s 碳e n p s 主要包括富勒烯( c 6 0 和c 7 0 ，及其衍生物) 和碳纳米管。一般来说， 富勒烯是由6 0 个碳原子构成的分子的总称，通常是由非平面的五元环、六元环 等组成的封闭式空心球形或者椭球形结构的共轭烯，所以富勒烯通常表示为c 6 0 ( k r o t oe ta 1 ，1 9 8 5o 此外，还有分子量较大的富勒烯，例如c 7 0 ，c 7 6 ，c 7 8 等， 目前针对于c 6 0 的研究是最为广泛的。 碳纳米管主要包括单壁碳纳米管( s w c n t ) 和多壁碳纳米管( m w c n t ) 。 在结构方面，s w c n t 是由直径约一纳米和长度约几微米单层石墨片构成的，而 m w c n t 则是由两层或两层以上具有不同直径和长度的同轴石墨层构成的( g a o ， 2 0 0 4 ) 。碳纳米管具有弹性高、密度低、绝热性好、强度高、隐身性优越、红外 吸收性好、疏水性强等优点。 ( 2 ) 金属氧化物类e n p s 金属氧化物类e n p s 主要包括氧化铁、氧化锌、氧化钛、氧化铜、氧化铈等 e n p s 。氧化锌e n p s 具有一般氧化锌大颗粒无法比拟的性能及用途，具有屏蔽紫 外线、吸收红外线及杀菌防霉作用。此外，纳米氧化锌还具有增稠作用，有助于 增加涂料分散的稳定性。二氧化钛e n p s 分为三种晶体类型，分别为锐钛矿型、 金红石型和板钛矿型。二氧化钛e n p s 的光学效应随粒径大小而呈现明显的变化， 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 尤其是纳米金红石二氧化钛随角度变化具有变色效应。而锐钛相则具有较高的光 催化性。二氧化铈e n p s 能够同时以c e ( i i i ) 和c e ( i v ) 的形式存在，这两种氧化 形态决定了e n p s 的粒径大小，研究表明c e ( i i i ) 含量越多，粒径越小。 ( 3 ) 金属e n p s 金属e n p s 可以应用于感应、催化、载体运输等生物医药领域。由于纳米金， 具有独特的稳定性、惰性、磁性和光化学性质，并且制作简单，表面修饰基团可 操作性强，所以应用十分广泛。银e n p s 具有显著的抑菌性能，广泛应用在纺织 品和化妆品中起到医疗作用。由于零价态铁e n p s 具有巨大的比表面积，高表面 活性，独特的催化活性，被广泛的用于地下水污染物( 有机物，杀虫剂，重金属 等) 的原位修复( p h e n r a te ta 1 2 0 0 9 ) 。 ( 4 ) 量子点( q d s ) 量子点( q u a n t u md o t ) 是由少量的原子所构成的准零维( q u a s i - z e r o - d i m e n s i o n a l ) 的纳米颗粒，。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在10 0n l l 以下，外观恰似一 微小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应 ( q u a n t u mc o n f i n e m e n te f f e c t ) 特别显著( l i ue ta 1 2 0 0 6 ) 。 1 2 3e n p s 的特性 ( 1 ) 表面效应 纳米材料的表面效应是指e n p s 表面的原子数与总原子数之比随粒径的变小 而急剧增大，从而引起其性质发生的变化。当e n p s 的粒径小于t 0n m ，可以迅 速增加e n p s 表面的原子比例。当e n p s 粒径降到ln r o 后，其表面的原子数比例 将达到9 0 ，e n p s 的表面几乎全部布满原子。由于e n p s 的表面原子数迅速增 多，使得e n p s 表面的原子配位数缺乏，进而使e n p s 具有较高的化学活性。熔 点降低，比热增大是e n p s 表面效应的主要表现( 杨玉芬等，2 0 0 2 ) 。 ( 2 ) 尺寸效应 由于e n p s 粒径( 尺寸) 逐渐变小从而引起宏观的物理性质的变化称为尺寸 效应。随着e n p s 粒径逐渐的减小，与e n p s 的体积成比例的能量也随之相应的 降低，当体积能相当于热能或比热能更小时，就会发生由强磁状态转变为超顺磁 状态的现象。当e n p s 的粒径与光波、德布罗意波的波长相当或更小时，会改变 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 光的共振频移，介电常数以及超导性能。e n p s 的尺寸效应可以显著改变材料的 超导电性、介电性能、光、热、磁、力及声学性能( 杨玉芬等，2 0 0 2 ) 。 ( 3 ) 体积效应 由于e n p s 体积极小，所以其包含了很少的原子数。因此，e n p s 的扩散、 吸附、催化、烧结等物理、化学性质将显著不同于大颗粒的特性，因而就不能用 通常的块状物质的性质对e n p s 加以说明，这种特殊的现象通常称之为体积效应 ( 杨玉芬等，2 0 0 2 ) 。 ( 4 ) 量子效应 量子尺寸效应是指当e n p s 的粒径降低到某一阈值时，费米能级附近的电子 能级则由准连续能级变化为分立能级，吸收光谱阈值向短波方向移动的现象( 杨 玉芬等，2 0 0 2 ) 。 1 2 4e n p s 的应用 随着纳米科技的发展，利用e n p s 特异的光、电、磁、热、声、力、化学和 生物学性能，纳米材料已被广泛应用于电子、化工、冶金、军事、医学和生物工 程等领域( 杨玉芬等，2 0 0 2 ) 。 ( 1 ) 催化剂材料 e n p s 作为催化剂有着许多传统材料所不具有的优点：粒径极小，比表面积 巨大，催化效率较高，化学反应活性高。例如，铁粉e n p s 可以起到成核作用， 在c 6 h 6 气相热分解而制各出碳纤维。f r c o n i 等e n p s 可以取代贵金属材料 从而作为汽车尾气净化过程中的催化剂。此外，镍、铜锌e n p s 混合制成的加氢 反应催化剂，其选择性高于现在使用的雷尼镍( r a n e yn i ) 的5 - - 一1 0 倍。迄今，工 业上利用二氧化钛一三氧化二铁e n p s 作为催化剂，在废水处理过程中取得了极 好的处理效果。 ( 2 ) 陶瓷材料 随着纳米技术的飞速发展，纳米陶瓷应运而生，其可以克服传统陶瓷材料 质的缺点( 如地较脆，韧性、强度较差等) ，e n p s 陶瓷使得现代的陶瓷具有金属 似地的柔韧性和可加工性。 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 ( 3 ) 传感器材料 随着e n p s 粒径的减小，其比表面积逐渐增大，表面原子数也随之增多， 表面的原子配位不饱和性将导致大量的悬键产生等，使得它化学反应活性高、表 面积巨大、对周围环境敏感度极高( 光、温度等) 、与气体相互作用强、检测范围 扩大。以上所示的特性使得e n p s 满足了传感器功能上所要求的高灵敏度、高响 应速度以及检测范围大等指标。因而可以利用e n p s 制成敏感度高的多功能的超 小型、低能耗型传感器。 ( 4 ) 医学领域的应用 研究表明，生物体内的r n a 蛋白质复合体，其线度在1 5 2 0 n m 之问，并且 生物体内的多种病毒都属于e n p s 。如果将对人体无害的e n p s 注人到血液中， 随血液流到人体的各个部位，既可用来探测病端，又可用于疾病的治疗。科研人 员已经成功利用氧化硅e n p s 进行了细胞分离，用金e n p s 子进行定位病变治疗， 以减少副作用等。另外，使用e n p s 作为载体的病毒诱导物己经取得了突破性进 展，现在已用于临床动物实验，估计不久的将来即可服务于人类。此外，一些具 有生物活性的e n p s 还可用于人造骨、人造牙齿等。 ( 5 ) 环境保护的应用 环境污染问题日益突出，传统技术存在处理效率低成本高等问题，e n p s 由 于具备独特的物理化学性质，可以有效的解决许多环境问题。例如利用t i 0 2e n p s 的光催化特性，可以有效的降解磷农药。纳孔材料和纳米膜材料可以用来消除环 境中水污染和大气污染。例如，e n p s 还可以作为汽车尾气净化催化剂。研究结 果表明，e n p s 具有极强的氧化还原性能，可以彻底解决汽车尾气中的c o 和n o x 的污染问题。 1 3e n p s 的暴露途径及毒性评价方法 1 3 1e n p s 的产生及排放途径 在纳米材料广泛应用的同时，其对生物系统产生的潜在环境效应不容忽视。 2 0 0 9 年首次出现e n p s 致人死亡的报导，长期暴露在e n p s 的工作环境中的工人 会引起肺部损伤而导致死亡( s o n ge ta 1 ，2 0 0 9 ) 发现。人工e n p s 的生态毒性效 6 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 应研究逐渐成为了当今社会上的研究热点。e n p s 在生产、消费和废弃过程中将 有意无意的释放进入环境，经迁移和运输进入到生态系统中( 图1 ) ( n m u s e e ， 2 0 1 1 1 。 图1e n p s 的产生及其在生态系统中的循环过程 f i g u r e1 e n p sg e n e r a t i o na n dc y c l i cp r o c e s si ne c o l o g i c a ls y s t e m s 1 3 2e n p s 的暴露途径 ( 1 ) 呼吸系统 研究表明，s w n t 可释放到空气中的浓度可达到0 1 5 3 1 a g m 3 ，工人的每只手 套上估计沉积有o 1 2 - - 一6 m gs w n t 。但是世界各国都未制定出针对e n p s 的职业 健康标准，从事e n p s 生产、加工的工人是在没有防护的情况下工作，会接触到 大量的e n p s ( m a y n a r de ta 1 ，2 0 0 4 ) 。国际放射线防护委员会( i c r p ) 的研究表明， e n p s 可以通过呼吸作用在人类呼吸道及肺泡中沉积。粒径为l n m 的颗粒，9 0 左右可以在鼻咽部沉积，其余1 0 沉积在气管支气管区；粒径在5 l o n m 的颗 粒，分布在上述3 个区域均为2 0 , - 3 0 ；粒径为2 0 n m 的颗粒，约有5 0 左右 颗粒沉积在肺泡内。e n p s 通过呼吸系统到达肺泡后，附着在肺泡表面的难溶颗 粒，有的以主动运输方式通过细胞膜进入细胞，以至引起细胞病变；有的可到达 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 淋巴腺或随淋巴液循环到达血液，因此可能具有较高的潜在毒性。 ( 2 ) 皮肤接触 众所周知，皮肤是人类阻挡外源污染物质的重要屏障系统，外源物质丰要是 通过表皮脂质屏障被皮肤吸收。z v y a g i n 等( 2 0 0 8 ) 研究表明，化妆品中的z n o e n p s 和t i 0 2e n p s 可以在皮肤毛囊角质层沉积，并能穿透表皮进入到真皮层。 i 司时也有研究发现经过化学修饰的t i 0 2e n p s 可以诱导产生羟基自由基并且能 够使d n a 发生氧化损伤，而且t i 0 2e n p s 具有光催化特性，经阳光照射后可以 催化损伤人体细胞中的d n a ( r o s e m a re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。综上所述，经皮肤接触的 e n p s 也会对人体健康产生潜在威胁。 ( 3 ) 其它途径 由图1 可以看出，e n p s 会在生产、消费和处理的各个环节中释放进入环境， e n p s 除了在空气中和直接接触之外，其迁移能力在土壤，水体中的更强、影响 范围也更广，也更容易受到外界环境因素( 如p h 和人类活动) 的影响。在水环境 l 1 ，e n p s 通过吸附解析、悬浮沉降等一系列复杂的物理化学过程，进而会对水 生生态系统产生潜在的影响( n o w a c k 和b u c h e l i ，2 0 0 7 ) 。 1 3 3e n p s 的毒性评价方法 与其它污染物的毒性研究方法相似，e n p s 的毒性研究既有间接的反映生物 体的损伤程度的指标，又可以通过直接的毒性效应观察。 ( 1 ) e n p s 体内实验 实验方法主要包括：用支气管吸入法或支气管注入法将e n p s 导入动物体内。 【l 驶入法与注入法相比，更加接近生物真实的暴露情况( o s i e r 和o b e r d 6 r s t e r ， 1 9 9 7 ) 。因此应尽量采用支气管吸入法模拟生物体实际的暴露情况，研究e n p s 对生物体的毒性效应。在此基础上，使用外推法评价e n p s 对生物体的毒性效应。 ( 2 ) e n p s 体外实验 e n p s 体外实验主要是e n p s 对细胞造成毒性作用。目前，研究细胞毒性效 心f f 勺研究方法主要根据细胞存活率、细胞膜完整性通透性改变，氧化胁迫等指标 _ 斗：j 堡乱：捡钡4 。 细胞存活率是细胞毒性研究最常用的测试指标，测试方法如m 丌、x t t 、 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 w s t - 1 、c c k 8 法等。测定原理是细胞线粒体内存在的琥珀酸脱氢酶，可将四唑 盐类物质还原生成有颜色的甲躜( f o r m a z a n ) ，然后运用比色法通过酶标仪在相 应波长处读取吸光度值，根据与对照吸光度值的比值来表征e n p s 对细胞毒性的 大小。其中，m t t 法是目前e n p s 细胞毒性检测中最常用的方法，步骤烦琐， 且容易引起假阳性结果。w o r l e k n i r s c h 等( 2 0 0 6 ) 研究发现，m t t 方法显示 s w c n t s 具有显著的细胞毒性，但是利用w s t - 1 、l d h 法等测定细胞活性却则 得出相反的结果。通过进一步的研究表明，s w c n t s 可与m t t 及其中间产物结 合，而不能与其它的反应试剂相结合，从而干扰了测定方法使s w c n t s 显示出毒 性。相比而言，w s t - 1 和c c k 8 法操作简单且无误差，产生的f o r m a z a n 容易溶 解，反应时间也短，实验结果也更稳定。因此在进行e n p s 的毒性试验时，至少 使用2 种或者更多独立的测试方法才能保证实验数据的可靠性。 细胞膜通透性检测主要通过乳酸脱氢酶( l d h ) 法和碘化丙啶( p i ) 染色法。 乳酸脱氢酶是存在于正常细胞的胞质中的一种蛋白质，细胞膜受损或通透性发生 变化时会被释放到细胞外，此时可以通过测定细胞培养液中乳酸脱氢酶的活性判 断细胞膜受损的程度。此方法操作简便快捷，但是灵敏性不高，也是常用的研究 e n p s 细胞毒性的方法之一。碘化丙啶是一种可以与细胞d n a 结合的染料，但 是在细胞膜完整的时候，p i 这种染料无法通过细胞膜与d n a 结合，在细胞膜受 损之后，p i 与d n a 结合后发出红色荧光，利用流式细胞仪测定荧光强度来评价 细胞膜的受损程度( g e o r g ee ta 1 ，2 0 1 0 ) 。 另外，还可以考虑通过测定细胞器稳定性等间接检测e n p s 对细胞毒性作用 的大小。溶酶体的稳定性可以通过中性红染色法来测定。中性红染料通过非离子 扩散进入到细胞质中，然后在溶酶体中蓄积。但是在死亡细胞或溶酶体受损的细 胞中，中性红会被释放到细胞外，通过测定细胞中的中性红染料的荧光强度来表 征细胞溶酶体的稳定性( n e m e se ta 1 ，1 9 7 9 ) 。但是中性红是一种非特异性染料， 容易与细胞内的其它物质结合从而产生假阳性结果。 随着对e n p s 细胞毒性效应机制的深入研究，e n p s 细胞毒性的研究方法涉 及氧化应激反应、基因毒性等方面。其中，测定谷胱甘肽浓度，t b a 法测量脂 质过氧化产物丙二醛含量及活性氧自由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 含量 的检测常用于评价e n p s 引起的氧化应激反应。目前最常用的测定r o s 总量的 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 方法是利用d c f d a ( 2 - d i c h l o r o d i h y d r o f l u o r e s c ( e ) i nd i a c e t a t e ) 荧光探针 ( j a k u b o w s k i 和b a r t o s z ，2 0 0 0 ) 。检测e n p s 对d n a 潜在毒性的实验方法有主 要有彗星实验，微核试验( a s h a r a n ie ta 1 。2 0 0 9 ) ，聚合物链式反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，p c r ) ( e o m 和c h o i ，2 0 1 0 ) 等方法，利用上述先进、精确的方 法更能够从分子层面揭示e n p s 对细胞的致毒机制。 随着仪器测试技术的不断更新发展，利用测试仪器直观观察e n p s 的摄取、 迁移和细胞损伤对研究e n p s 的毒性效应具有重大的意义。应用透射电子显微镜 ( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，t e m ) 、扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ，t e m ) 、原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 、能量过 滤式透射电子显微镜( e n e r g yf i l t e r i n gt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ，e f t e m ) 和共聚焦显微镜( c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e ，c l s m ) 同步辐射等检测 手段对e n p s 进入细胞全过程进行直接观测，推动e n p s 的跨膜和毒性机制研究。 1 4e n p s 的生物毒- | 生研究进展 1 4 1e n p s 的生物毒性 目前e n p s 对生物的毒理学研究尚处于起步阶段，并且在人类受纳米材料的 影响还比较有限时，一定要及时对纳米材料的生物毒性给予关注。目前为止，科 学家们对富勒烯( c 6 0 ) 、碳纳米管( c n t s ) 、金属及金属氧化物、量子点( q u a n t u md o t ， q d s ) 和有机聚合物等e n p s 的生物效应进行了初步的研究。通过总结近几年的研 究成果，其主要表现出以下特点： ( 1 ) 对于藻类( a r u o j ae ta 1 ，2 0 0 9 ；w a n ge ta 1 ，2 0 1l c ) 、细菌( j i a n ge ta 1 ，2 0 0 9 ； g u n a w a ne ta 1 ，2 0 11 ) 、鱼类( z h a oe ta 1 ，2 0 11 ) 和植物( m ae ta 1 ，2 0 1 0 ；s e r a ge ta 1 ， 2 011 ) ，尤其是对于动物细胞( x i ae ta 1 ，2 0 0 6 ；a s h a r a n ie ta 1 ，2 0 0 9 ；j i a n ge ta 1 ， 2 0 1 0 ；j u g a ne ta 1 ，2 0 1 1 ) 的毒性研究均已开展并进行了深入研究，但是缺少对于大 型水生植物和海洋生物的研究。 ( 2 ) 上述毒性研究集中于急性毒性实验，半致死浓度多处于“m g l ”级别 萨下更低，表明e n p s 对生物体具有潜在的生物毒性作用。 ( 3 ) 不同种类和粒径的e n p s 毒性差异较大，即便是同种e n p s 也会因其粒 1 0 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 径、表面官能团等的不同而具有较大差异。决定e n p s 能否进入生物体并产生毒 性效应的关键因素是粒径小。当e n p s 粒径小到一定程度时，就可能直接通过细 胞膜从而进入细胞。反之，要穿过细胞膜就要通过其它方式( 如内吞作用) ，或 者会对膜的完整性造成损伤。 ( 4 ) 不同的生物物种或细胞对于e n p s 会表呈现出不同毒性效应，这可能和 生物复杂的响应机制相关。 ( 5 ) 客观存在的环境因素通过改变e n p s 的化学行为而影响e n p s 的毒性效 应。归纳起来，主要包括：通过改变e n p s 的悬浮性来改变其毒性；e n p s 与环境 中的其它污染物会发生相互作用，影响其与生物体的接触。此外金属和金属氧化 物e n p s 的溶解性容易受到环境因素的影响( 如水环境中的p h ，水温) 。因此， e n p s 毒性评价必须要考虑环境因素对其物理化学行为的影响。 由于e n p s 的生物环境效应、毒性、安全性的研究刚刚起步，不仅可靠的实 验资料和数据有限，而且实验和毒性评价方法也面临极大的挑战。目前判断e n p s 与传统毒物的毒性强弱作用还为时尚早，需要进行更加深入和系统的研究。但是， 随着纳米技术的不断更新发展，纳米产品的不断普及和应用，e n p s 极有可能成 为影响生态系统稳定性的新型环境污染物。 1 4 2e n p s 对细胞的毒性机制 目前，e n p s 对生物细胞的致毒机制尚不清楚，有限的研究主要集中于e n p s 溶解产生离子对细胞造成的毒害作用、氧化损伤( 氧化胁迫) 和基因毒性等方面 ( s t u d e re ta 1 ，2 0 1 0 ；x i ae ta 1 ，2 0 1 0 ；a h a m e de ta 1 ，2 0 1 0 ：王震宇等，2 0 1 0 ) 。 ( 1 ) 氧化损伤 e n p s 的表面活性很强，e n p s 进入到细胞后可以诱导细胞产生r o s ，或者 通过干扰电子传输链而产生r o s 。r o s 主要包括1 0 2 、0 2 - 、h 2 0 2 和o h 等种类， 其会在细胞内大量的累积，在细胞不能及时去除这些r o s 时就会发生氧化胁迫， 造成细胞毒性。r o s 造成细胞损伤的过程可以大致分为以下三个氧化胁迫阶段： 低水平：转录引子n r f 2 调节抗氧化防御系统，抵抗最初的氧化胁迫；高水 平：r o s 的过量生成能够刺激细胞中敏感性的酶，进而发生细胞的促炎反应； 最高水平：细胞膜脂质过氧化、线粒体损伤，细胞d n a 损伤，引起细胞凋亡( x i a 氧化铜纳米颗粒对人体肺细胞的致毒机制研究 e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。研究表明，氧化损伤是e n p s 毒性的主要可能机制之一。x i a 等( 2 0 0 6 ) 的研究显示，聚苯乙烯e n p s 可以诱导单核巨噬细胞产生r o s ，造成细胞氧化损 伤。y a n g 等( 2 0 0 8 ) 的研究也表明，z n oe n p s 可以诱导小鼠胚胎成纤维细胞内 谷胱甘肽转移酶的减少和脂质过氧化产物丙二醛的产生以及大量r o s 的生成， 表明氧化胁迫是引起e n p s 细胞毒性的主要原因。a s h a r a n i 等( 2 0 0 9 ) 也得出相 似的结论，a ge n p s 可以破坏人肺成纤维细胞的线粒体电子传递链，引起大量 r o s 产生，干扰a t p 的合成，进而造成d n a 损伤。但是这一机制并不能解释 所有的毒性现象。例如t i 0 2e n p s 对小胶质细胞暴露7 2 h 后并没有产生毒性作用， t i 0 2e n p s 产生r o s 并没有造成细胞损伤( l o n ge ta 1 ，2 0 0 7 ) 。因此，不同种类的 e n p s 对生物造成的毒性机制不同，氧化损伤是否为e n p s 致毒的原初反应还有 待深入研究。 ( 2 ) 基因毒性 e n p s 对细胞d n a 造成的损伤也是现阶段研究的热点之一，e n p s 进入细胞 后可能直接攻击细胞d n a ，使得细胞d n a 链断裂，诱导产生更多的r o s ，引 起氧化胁迫，使细胞生理代谢紊乱，最终导致细胞死亡( s i n g h 等，2 0 0 9 ；l i n d b e r g 等，2 0 0 9 ) 。e o m 和c h o i ( 2 0 1 0 ) 研究表明，a ge n p s 对淋巴细胞的毒性效应 不是由氧化胁迫直接造成的，而是e n p s 首先攻