（环境科学专业论文）以水果加工废弃物为底物纯培养发酵生物制氢研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t t h r o u g hp a r t i a lt r a i n i n ga n dc o n t i n u o u sf l o wt r a i n i n g , p u r es t r a i nr 3i su s e di nt h i ss t u d y t op r o d u c eh y d r o g e n t h es u b t r a t e sa r et h ew a t e sp r o d u c e db yf r u i tp r o c e s s i n gi n d u s t r i e s t h e p u r p o s eo ft h i ss t u d yi sn o to n l yt h ep r o d u c t i o no fh r d r o g e nb u ta l s ot h ew a s t ed e g r a t i o n i n p a r t i a lc u l t i v a t i o ne x p e r i m e n t ，t h ea p p l ea n do r a n g ei n d u s t r i a lw a s t er e s i d u ea r eu s e d a s s u b s t r a t e s i nt h ec o n t i n u o u sf l o wt r a i n i n ge x p e r i m e n t s ，t h es u b s t r a t ei sg r a p ed 痂l l 【w a s t e w a t e r t h eo n e sd i s c u s s e di nt h i ss t u d ya r et h eb e s tp r o c e s sc o n t r o lp a r a m e t e r so fr 3i nd i f f e r e n t ，s u b s t r a t e sa n dd i f f e r e n tc u l t i v a t i o nt y p e s i np a r t i a lc u l t i v a t i o ne x p e r i m e n t ，u s i n ga p p l ew a s t er e s i d u e ，w h e ni t sd o s a g e ，i n i t i a lp h v a l u ea n dr e a c t i o ns y s t e ma r er e s p e c t i v e l y4 0 0 9 l ，6 0a n d3 0 3 5 ，t h er e a c t i o ns y s t e m a c h i e v e st h eb e s ts t a t e i nt h e s ec o n d i t i o n s ，h y d r o g e np r o d u c t i o ny i e l da n dh y d r o g e nc o n t e n t a r er e s p e c t i v e l y4 2 3 51 m l la n d4 8 9 ：c e l lc o n c e n t r a t i o na c h i e v e s0 2 2 4 9 l ；a v e r a g er a t eo f h y d r o g e np r o d u c t i o ni s2 0 21m m o l h 2 g c d w 。h ：t h ec o n t e n t so fe t h a n o la n da c e t i ca c i da r e r e s p e c t i v e l y1 8 9 6 5 1 m g la n d1 0 3 2 8 8 m g l ；f e r m e n t e de v e n t u a l l yp hv a l u ei s3 3 3 u s i n g o r a n g ew a s t er e s i d u e ，w h e ni t sd o s a g e ，i n i t i a lp hv a l u ea n dr e a c t i o ns y s t e mt e m p e r a t u r ea r e r e s p e c t i v e l ylo o g l ，6 5a n d2 5 3 5 ，t h er e a c t i o ns y s t e ma c h i e v e st h eb e s ts t a t e i nt h e s e c o n d i t i o n s ，h y d r o g e np r o d u c t i o ny i e l da n dh y d r o g e nc o n t e n ta r er e s p e c t i v e l y5 4 0 9 4 m l i la n d 5 0 5 ；c e l lc o n c e n t r a t i o na c h i e v e0 2 7 g l ；a r e r a g er a t eo fh y d r o g e np r o d u c t i o ni s 1 9 8 8 m m o lh 2 gc d w h ；t h ec o n t e n t so fe t h a n o la n da c e t i ca c i da l er e s p e c t i v e l y19 0 1 8 m g la n d 12 0 0 2 7 m g l ；f e r m e n t e de v e n t u a l l yp hv a l u ei s3 13 t h e s ec o n c l u s i o n ss h o wt h a t ：u s i n g o r a n g ew a s t er e s i d u ea ss u b s t r a t e ，t h eh y d r o g e np r o d u c t i o ne f f e c t i v e n e s si sb e t t e r t h e c a r b o h y d r a t e si no r a n g e sa lem u c he a s i e rt ou s eb yr 3f o rp r o d u c i n gh y d r o g e n b u tt h e s u b s t a n c e si no r a n g e si n h i t i n gt h ec e l l so fr 3g r o w t hi sm o r et h a nt h a ti na p p l e s o n c et h e o r a n g ec o n s u m p t i o ni sh i g h e r , t h ec e l lc o n c e n t r a t i o na n dh y d r o g e np r o d u c t i o ny i e l dd r o p p e d d e e p l y u s i n gg r a p ed r i n kw a s t e w a t e ra ss u b s t r a t e ，i nc s t r ，r 3i s u s e dt op r o d u eh y d r o g e n w h e nt h er e a c t o ri si nas t a b l eo p e r m i o ns t a g e , b i o g a sp r o d u c t i o ny i e l da n dh y d r o g e nc o n t e n t c a na c h i e v e4 6 6 l da n d5 8 9 6 ；c o dr e m o v a lr a t ei sa b o u t2 6 ；f e r m e n t a t i o nt y p ei s e t h a n o lt y p ef e r m e n t a t i o ne 用u e n tp hv a l u ei s3 5 i nt h ee o n t i n u n o u sf l o we x p e r i m e n t s ，i n f l u e n tp hv a l u ei sa d j u s t e d w h e ni n f l u e n tp h v a l u ei s5 5 ，t h ec a p a c i t yo fr 3p r o d u c i n gh y d r o g e ni sb e s t a tt h i st i m e , b i o g a sp r o d u c t i o n y i e l da n dh y d r o g e nc o n t e n ta l er e s p e c t i v e l y6 8 5 8 8 6 l da n d3 9 4 4 - - 6 5 13 ：c o dr e m o v a l r a t ei ss t i l l2 6 ：e f f l u e n tp hv a l u ei s4 3 8w h i c hi ss u i t a b l en i c h eo fr 3 i nt o t a lv o l a t i l ea c i d , t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o la n da c e t i ca c i da l er e s p e c t i v e l y7 0 6 m g la n d4 4 6 m g l r 3a l w a y s a b s t r a c t k e e pt h ec h a r a c t c d s t i c so f e t h a n o lt y p ef e r m e n t a t i o n k e y w o r d sb i o h y d r o g e np r o d u c t i o n ；h y d r o g e n - p r o d u c i n gb a c t e r i u m ；f r u i tp r o c e s s i n gw a s t e ； p a r t i a lc u l t i v a t i o n ；c s t r l 绪论 1 绪论 1 1 概论 进入2 1 世纪，人类面临的两大全球性问题是环境污染与能源危机。能源是发展工 业、农业、国防、科技以及提高人民生活水平的重要物质基础，对能源物质的开发和利 用程度对人类社会的可持续发展有着深远的影响。许多国家为了争夺能源不惜动用武 力，而那些不可再生能源( 石油、煤等) 终究是有限的，总有一天会耗竭。并且，不可 再生能源( 燃烧煤、石油等物质) 的燃烧会给环境带来灾难性的破坏，造成同益严重的 臭氧层空洞、温室效应、酸雨三大全球性环境问题。因此，我们必须尽快寻求一种清 洁、可再生的能源替代传统的不可再生能源。 在科技不断发展、人民社会生活水平日益提高的今天，人们对能源的需求量与日俱 增，据统计世界上最近2 5 年内能源的消耗量相当于过去1 0 0 年的消耗f 1 】，如今衡量人 们生活水平和文明程度的一个重要标志之一就是能源的消耗量。但是从现代能源结构来 看，在商品能源中，有9 5 是包括煤炭、天然气和石油在内的化石能源【2 1 。 地球上，储量极为有限的一级能源化石能源都是不可再生能源。在人类大量的开采 和利用下，这些珍贵的化石能源逐渐走向枯竭。据估算，以目前的储量和开采程度，石 油仅能维持5 0 一8 0 年，煤炭也只能维持2 0 0 3 0 0 年左右p j 。科技的日益进步，使得人们 对能源的需求量大幅度攀升，而化石能源越来越少，远远无法满足人们对能源的需求， 我们面临着空前严重的能源危机。另外，开采和利用化石能源不仅会产生大量的废水废 渣，还会产生c 0 2 ，以及s 0 2 、n 0 2 等污染性物质，预计到2 0 2 0 年c 0 2 的排放量将从 现在的6 1 亿吨增加到9 8 亿吨【j 。酸雨和温室效应等环境问题的出现将直接导致生态 环境恶化，并严重影响人类生存和经济社会可持续发展，因此人类开发清洁可再生能源 迫在眉睫。开发清洁、高效的二次能源已逐渐成为人们研究的热点课题，许多国家都在 加紧对氢能、太阳能、生物质能、地热能和海洋能等替代性能源的开发和利用。 1 2 生物制氢的主要类型 从产氨菌的种类上对生物制氢进行划分，可以分为三种类型绿藻和蓝细菌产 氢、光合细菌产氢和厌氧细菌发酵产氢。 1 9 3 7 年n a k 锄u r a 【6 】最早报道了光合细菌在黑暗中产氢气的现象，1 9 4 9 年g e s t 和 k a m e n 卜剐最早报道了深红红螺茵( r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m ) 在光照条件下释放氢气的现 象。研究的不断深入表明：很多藻类和光合细菌都具有生产氢气的特性，目前研究较多 的主要包括颤藻属( o s c i l l a t o r i a ) 、球形红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n o a ss p h e r o i d e s ) 、深 红红螺菌、球形红微菌( r h o d o m i c r o b i u ms p h e r o i d e s ) 、深红红假单胞菌 ( r h o d o p s e u d o m o n o a sr u b r u m ) 、液泡外流红螺菌( e c t o t h i o r h o d o s p i r av a c u o t a t a ) 等 5 - 9 1 。 东北林业大学硕j ：学位论文 蓝藻类以水作为氢供体，在光照条件下将水直接分解释放氢气和氧气，就原理来说其发 展前景很广阔，但是，不足的是此反应必须克服较大的自由能，导致该方法目前的产氢 速率还比较低。而光合细菌则是以有机酸和碳水化合物为底物，与藻类相比它需要的自 由能少，但仍需要较大驱动氢化酶的能量，因此其产氢速率也不比藻类高。分析光合法 生物制氢技术的主要研究成果，该技术未来的研究方向主要有：光合产氢机理研究、高 效产氢基因工程菌研究和实用系统的开发研究、参与产氢过程的酶的结构和功能研究、 产氢抑制因素研究等。在众多发展方向之中，研究价值较大的是光反应器和高效产氢工 程菌的构建等实用系统。长期以来，各国科学工作者峰持不懈地致力于开展大量研究光 合法生物产氢技术的工作，但光合法生物制氢的效果仍然并不很理想。光合细菌氢气生 产能力及其转化光能的效率都偏低、产氢代谢过程的稳定性也很差、需要的光能源十分 充足，这些所有问题得不到有效的解决，极大程度地限制了光合法生物制氢技术的发 展。因此要将光合法生物制氢技术推向大规模工业化水平，有待解决的问题仍很多。 另一类在代谢过程中产氢的微生物是产氢发酵细菌。它们可以在发酵作用下，通过 自身生理代谢的特性，在逐步分解有机底物的过程中产生氢气。 能够发酵产氢的微生物种类很多，如克氏梭菌( c l o s t r i d i u mk u y v e r i ) 、丁酸性梭状芽 胞杆菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) 、巴氏梭茵( c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ) 、丙酮丁醇梭菌 ( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) 、拜氏梭状芽胞杆菌( c l o s t r i d i u mb e i j e r i n c k i i ) 、中间柠檬酸杆 菌( c i t r o b a c t e ri n t e r m e d i u s ) 、热纤维梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 、大肠杆菌 ( f s c h e r i c h i a 田、拟杆菌属( b a c t e r o i d e s ) 、醋酸球菌属c e t i v i b r i o ) 、产气肠杆菌 ( e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) 、产气韦荣氏球菌( v e i l l o n e l l ag a z o g e n e s ) 、奥氏甲烷杆菌 ( 讹历a n o b a c t e r i u mr e t t g e r i ) 、拟盐杆菌属( h a l o b a c t e r o i d e s ) 、瘤胃球菌属 ( r u m i n o c o c c u s ) 、褐球固氮菌( a z o l o b a c t e rc h r o o c o c c u m ) 、嗜热产氢菌属 ( t h e r m o h y d r o g e n i u m ) 等。在菌株分离中，比较多的时梭菌属和肠杆菌属的细菌，其产氢 能力也普遍较高【9 】。为了获得更高的氢气生产能力科研人员仍致力于分离出更多的产氢 发酵细菌。 较光合法生物制氢，发酵法生物制氢技术的优越性表现在： ( 1 ) 产氢稳定性更好。由于发酵法生物制氢技术在有机底物的分解过程中制取氢 气，不需要光源，因此该技术不依赖光照，可不分昼夜地持续产氢，从而保证产氢的持 续稳定性。 ( 2 ) 产氢能力更高。迄今为止，综合分析比较发酵菌和光合菌生产氢的能力，发酵 产氢细菌的产氢能力高于光合细菌。 ( 3 ) 生长速率更快。研究表明：发酵细菌的生长速率普遍快于光合细菌。它可以快 速提供大量产氢发酵微生物，更有利于实现工业化大规模产氢。 ( 4 ) 制氢成本更低。发酵产氢细菌的底物是植物光合作用的产物，等于问接利用了 太阳能。它的底物还可以时工农业生产的废弃物或廉价农作物，能够在获得氢的同时实 现资源化处理废物，从而大大降低发酵法制氢的生产成本。 l 绪论 发酵法生物制氢技术的优越性已越来越为人们所认识，最近几年，发酵法生物制氢 技术正渐渐上升为生物制氢研究领域的新热点。 1 3 发酵法生物制氢机理 1 3 1 丙酸型发酵途径 参与丙酸型发酵1 睢1 3 1 的主要微生物是丙酸杆) - 禹( p r o p i o n i b a c t e r i u m ) ，生化反应式 如下： c 6 日1 2 d 6 + h 2 0 + 3 a d p 寸c h 3 c o o 一+ c h 3 c h 2 c o o 一+ h c o ；+ 3 日+ + h 2 + 3 a t p ( 1 - 1 ) 乙酸和丙酸，还有少量丁酸是丙酸型发酵的主要末端发酵产物，但丙酸型发酵的气 体产量微小甚至无气体产生。丙酮酸发酵形成丙酸，与此同时还包含部分t c a 循环机 制，其产生不经乙酰辅酶a 旁路，并且由于丙酸杆菌属没有氢化酶，因而没有h 2 产生 【i o 1 3 1 0 1 3 2 丁酸型发酵产氢途径 丁酸、乙酸、h 2 、c 0 2 和少量的丙酸为该类型发酵主要末端发酵产物。参与丁酸型 发酵【1 4 , 1 5 1 的主要微生物是梭状芽孢杆菌属( c l o s t r i d i u m ) 。从氧化还原反应平衡角度分 析，终产物只有乙酸并不理想，因为过高的乙酸将导致产生大量n a d h + h + ，进而导致 p h 值过低产生负反馈作用。由此看来，产乙酸过程与丁酸循环机制耦联( 即呈现丁酸 型发酵) 的代谢过程是非常有必要的。这一过程中，尽管葡萄糖的产丁酸途径不能氧化 产乙酸过程中过剩的n a d h + h + ，但是产丁酸过程减少了酸性末端产物的产生量，所以 对加快葡萄糖的代谢进程有积极作用。反应式如下： 5 c 6 h 1 2 0 6 + 1 2 h 2 0 + 2 n a d + 1 6 a d 矿，i 4 c h 3 c h 2 c o o + 2 c h ，c o o 七l o h c o ； + 2 n a d h + 8 一+ l o h 2 + 1 6 舡p g o ，- 2 5 2 3 k j m o l 葡萄糖( 1 2 ) 1 3 3 乙醇型发酵产氢途径 任南琪等【1 7 】发现了乙醇型发酵，乙醇、乙酸、h 2 、c 0 2 以及少量丁酸为其主要末 端发酵产物。如图1 1 ，这一发酵类型经如下发酵途径产生乙醇，对总产氢量及发酵稳 定性进行综合评定可发现：乙醇型发酵是不失为一种较佳的厌氧发酵产氢途径。 乙醇型发酵的最适末端发酵产物稳定性较好，工程控制条件也较易获得，并且，其 还可承受较高的有机负荷，处理有机物能力强。所以，在工程应用中应优先选择乙醇型 发酵产氢途径。纯菌种分离鉴定和代谢分析为这种理论找到了物质基石出【一h 列。 东北林业大学硕上学位论文 翌竺2 h 嚣琴芝 l：。2n五。+2銎nahdch + h ，o ( 国i i + ” 0 2 9 0 2 2 c h ) 一c c o o h l2 c h 3 一c h o 7 孓一2 c 一c h 2 0 h 丙酮酸 乙醛 2 n a d + 2 n a d h 乙醇 + h + 图1 - 1 细菌乙醇型发酵产氢途径 1 3 4 混合酸发酵产氢途径 混合酸发酵产氢途径是指反应系统内没有一种或两种末端产物占明显优势地位的一 种状态。相较于形成确定发酵类型的系统，其气体产量要少。实际上是对一种介于上述 三种发酵类型之间但任意一种都无明显优势的体系进行的定义。 1 4 生物制氢技术的发展现状 随着人们同益关注和重视氢能源并逐渐深入地认识对生物制氢技术认识，国际上大 量的科研工作者致力于这项研究。目前生物制氢技术主要的研究成果以及发展方向可概 括为以下几方面 1 4 1 高效产氢菌种的分离和筛选 现阶段的国内外对生物制氢技术的研究还停留在实验室研究阶段。限制生物制氢技 术发展的主要因素之一是产氢菌生产氢气的能力不高。，国内外科研人员为攻克这一问 题，纷纷开展了许多到分离和筛选产氢细菌的工作，寻找高效产氢菌种。 1 4 2 生态因子对产氢能力的影响 生态因子可极大地作用于产氢发酵菌的生长和代谢，还可影响细菌的产氢能力。目 前研究生态因子主要集中在下面几个方面：p h 值、氧化还原电位、温度还有金属离 子。 1 4 2 1 p h 值和氧化还原电位( o r p ) p h 值对发酵细菌产氢代谢活性有着很重要的影响，同时对发酵产物的组成也产生 影响。因此有很多相关研究探讨发酵细菌最适产氢p h 值。h e y n d r i c k x 等19 8 7 年研究了 细胞内的p h 值对发酵产物的作用，其结果表明：高p h 值条件下的发酵产物主要是酸 类物质；而低p h 值条件下的发酵产物通常是丙酮和丁醇等物质f 2 3 2 6 】。任南琪等于1 9 9 8 年提出：p h 值和氧化还原电位会对产氢发酵微生物的发酵组成产生重要影响，并建立 了产氢一产酸发酵细菌的三种发酵类型p h o r p 二维实现生态位副2 3 2 6 1 。 此外，王勇 2 7 】认为：氧化还原电位( o x i d a t i o n r e d u c t i o np o t e n t i a l ，o r p ) 是与p h 值 一样的决定发酵类型的重要限制因素，其也会极大地影响发酵液相末端产物的组成。乙 醇型发酵过程的o r p 范围为一3 5 0m v 一- 4 2 0m v ，丁酸型发酵过程的o r p 范围为1 8 0m v 盘| | | l 绪论 2 6 0 m v 。 1 4 2 2 温度 温度对微生物的生理代谢和生长也产生重要影响，对不同的微生物而言，其最适生 长和产氢温度均不相同。j u n g 等( 2 0 0 2 ) 对c i t r o b a c t e rs p y 1 9 的研究表明：该菌种细胞 生长和产氢的最适宜温度在3 0 - - 4 0 c 2 8 - - 2 9 1 。k u m a r 等证明：温度为3 6 ( 2 ，e n t c r o b a c t c r c l o a c a e l i t - b t0 8 达到最大产氢速率，对低温或高温范围的研究也有报道，但其效果不 是十分理想 3 0 1 。 1 4 2 3 金属离子 金属离子能够通过影响氢酶的结构以及功能，从而影响产氢发酵细菌的产氢性能。 王勇于2 0 0 2 年的研究表明：f e 参与产氢一产酸代谢过程中相关酶系的作用，并对细菌的 生物氧化及脱氢过程产生直接影响，还能诱导发酵过程转变为平衡程度较高的乙醇型发 酵类型。g r a y 等于19 6 5 年指出：肠杆菌和梭菌在缺铁的环境下不能产氢气，但一旦金 属离子的浓度超出一定范围，还会引起细菌中毒。 1 4 3 细胞固定化和非固定化技术的研究 为达到持续高效的生物制氢目的同时实现生物制氢技术产业化应用价值，提高反应 “ 系统内细胞产氢速率及其持有量是一种有效措施。为了提高产氢细菌的产氢能力以及生 物量，研究人员利用包埋剂或者微生物载体，对产氢细菌的细胞固定化技术进行了大量 研究。 t a n i s h o t 3 1 3 2 1 等于19 9 4 年利用产气肠杆菌( e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) e 8 2 0 0 5 菌株进 行了连续流非固定化产氢试验，实现可持续产氢率1 5 m o l h 2 m o l ( 糖) 。 y o k o i 3 3 - 3 4 1 等人于1 9 9 7 年采用产气肠杆菌h o 3 9 菌株进行了连续流产氢实验。在 非固定化条件下，实现产氢速率1 2 0 m l h 2 l h 。菌体以琼脂凝胶为固定基质，其最大产 氢速率可提高到2 4 0 m l h 2 l - h 。采用多孔玻璃为附载体，可实现产氢率8 5 0 m l h 2 l h ， 较非固定化细胞产氢率提高7 倍。 r a c h m 锄【3 6 1 等于1 9 9 8 年研究e a e r o g e n e s h u 1 0 l 发现：该细菌茵体自絮凝作用很 强，如将这种细胞接种至反应器，其细胞浓度较用载体固定化的细胞浓度显著提高。 上述研究结果表明：使用细胞固定化技术，反应系统的运行稳定性和产氢速率有很 大提高。但固定化技术巨大的工作量、复杂性、以及高昂的成本决定了应用该技术只能 局限于小型的实验室研究，而无法实现大规模工业化生产。并且基质作为固定化载体， 会占据反应器内极大部分的有效空间，从而，因生物持有量不足极大地限制了反应器比 产氢率的进一步提高。实际上，以具有自絮凝作用的厌氧活性污泥或细菌为产氢菌种， 既可避免生物制氢反应器中微生物流失、保证系统内持有较高的生物量，还可以不必对 细菌细胞进行复杂的固定化处理，从而达到高效产氢目的。 1 4 4 利用不同基质进行生物制氢的探索 资料表明：现阶段，研究生物制氢技术大多采用成分单一的基质。1 9 9 5 年，y o k o i 东北林业大学硕士学位论文 等对产气肠杆菌h o - 3 9 菌株对不同基质的利用情况进行了研究。研究的基质包括果 糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、纤维素、糊精和淀粉等。研究结 果表明：较适合的产氢基质是麦芽糖和葡萄糖，不适合的为纤维素和淀粉。1 9 9 3 年， t a g u c h i 3 m 卅等比较研究了在多种基质上巴氏梭菌a m 2 1 b 的产氢能力。研究的基质包括 纤维二糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、木糖、淀粉等等。研究结果表 明：以蔗糖为基质，a m 2 1 b 产氢效率最高，以淀粉为基质其产氢效率最低。 考虑生物制氢的成本，以单一基质为底物进行产氢的成本较高。而以工农业生产废 弃物等廉价复杂基质为底物进行产氢，不但能实现废弃物的资源化处理，同时还能降低 产氢成本。近几年利用固体废物和有机废水为主的复杂物进行生物制氢的研究得到了一 定程度的丌展。( 如表1 1 ) 。 表1 1 利用废水和废物制取氢气的实例 l 绪论 1 5 水果加工业果肉废渣处理的研究现状 我国是世界上屈指可数的水果生产大国，水果总产量越居世界首位。并且伴随着水 果业的迅猛发展，水果产量大幅度攀升，水果加工业应运而生。然而伴随着水果加工量 逐年增长，每年产生的大量水果废渣长期得不到有效利用，导致资源浪费严重，同时也 带来严峻的环境负担，因此开发利用水果废渣资源是当前水果加工业正面临的一项战略 任务。 在国家的重视和科研人员的不懈努力之下，水果废渣作为饲料或饲料添加成分的应 用相当广泛，但由于技术等因素的制约，在高附加值产品生产中果渣的应用仍十分有 限。现在就苹果橙子果渣的综合应用情况加以概述。 1 5 1 苹果果渣概述 1 5 1 1 苹果果渣营养成分分析 苹果渣是在苹果加工生产过程中剩下的下脚料，包含苹果皮、部分果肉和果芯。在 世界上，苹果年产量超过1 1 1 3 万吨的我国是最大的苹果生产国之一。现阶段，有近 1 1 0 的苹果进行加工处理，且加工数量呈逐年上升趋势，除渣率为2 0 - , 3 0 ，总产量 相当可观。苹果渣营养成分丰富并且微量元素含量高。 表1 2 苹果果渣成分分析 果渣成分新鲜果渣干果渣 水分 6 6 4 7 8 2l l 1 2 5 碳水化合物 9 5 2 1 9 8 无 无氨提取物无 5 4 7 7 - 5 9 2 9 果胶 1 5 2 51 5 - 1 8 粗纤维 4 3 1 0 5l5 3 3 2 0 5 5 蚩白质 1 0 3 1 8 24 4 5 - 5 6 7 脂肪 o 8 2 1 4 33 7 5 4 6 5 灰分 0 5 6 2 2 72 1 l 3 5 0 钾( 以k 2 0 计) o 2 旬6 无 磷( 以p 2 0 5 计) o 4 一曲7 无 从表卜2 中可看出，苹果渣中含量较高的时碳水化合物和粗纤维而含量较低的是蛋 白质。新鲜苹果渣中水分含量很高，若无适当贮存方法，则必须立即使用。否则，其将 会很快被微生物破坏。 1 5 1 2 苹果渣的利用 ( 1 ) 发酵生产柠檬酸： 在食品、医药、精细化工等行业中广泛应用柠檬酸被是一种重要的化工原料，近年 来，由于经济增长迅速，去需求量也越来越多。目前，国外生产柠檬酸主要的主要原料 是糖蜜。在我国采用的方法主要是玉米和薯干的深层发酵，近年来，又实现了深层发酵 精淀粉制取柠檬酸的工业化生产。而以苹果渣为主要原料发酵生产柠檬酸具有很多优越 性：首先苹果渣中丰富的纤维素、半纤维素和还原糖资源可以被充分利用，其次也大大 降低了柠檬酸的生产成本。 东北林业大学硕士学位论文 通过激光诱变方法，选育出了黑曲霉更优突变株其很适合苹果渣发酵生产柠檬酸。 通过选择复合纤维素酶来酶解苹果渣，提高还原糖的含量，然后再进行液态深层发酵生产 柠檬酸，酶解后还原糖含量可提高到3 6 3 ，最后柠檬酸的产量可达到2 5 6g l 【g ( 干苹果 渣) ，总糖的利用率可达到8 0 。同时，还进行了固态发酵的放大实验研究，经陕西省产 品质量监督检验所检验萃取结晶后的产品符合国家食品添加剂柠檬酸标准 g b l9 8 7 219 8 6 t 4 1 4 3 j 。 ( 2 ) 制各膳食纤维 大量研究表明：膳食纤维是一种不可或缺的功能性食品基料。其对人体有多重重要 的生理功能：首先，摄入膳食纤维能增加胃内饱腹感，从而减少食物摄入量，防止肥胖； 其次，其可以维持正常的血脂、血糖和蛋白质水平，达到预防糖尿病、结肠癌和冠心病 等疾病的作用；再次，膳食纤维还可以刺激肠壁，增强肠胃蠕动。现阶段的食品工业中， 被誉为富含膳食纤维的功能性保健新食品的开发己成为潮流。苹果渣的无氮浸出物含量 高达6 0 ，其中果胶含量在2 0 左右。我们完成了以苹果渣制备膳食纤维的工艺研究，通 过水洗、脱色、酸解、醇沉或盐析等制备出了水溶性膳食纤维和水不溶性膳食纤维，生 产的产品细白，其中不溶性膳食纤维具有很强的溶胀性和持水力，并且达到较高的提取率 【“ 4 6 】 o ( 3 ) 发酵生产饲料蛋白 以节果渣为碳源，再加入适量氮源和微量无机盐类，通过诱变选育出混合菌种，并采 用两种新的固固态发酵和液固态发酵工艺大量生产微生物菌体，经干燥等处理，即可得到 饲料蛋白产品f 4 7 瑚】。产品粗蛋白含量高达2 3 9 ，且富含各种维生素、氨基酸、有益微 量元素和蛋白酶类，符合国家饲料卫生标准，作为蛋白饲料部分地代替鱼粉和豆粕广泛地 应用到养殖领域。 1 5 2 橙子果渣概述 1 5 - 2 1 橙子果渣营养成分分析 橙子果渣营养成分含量很高，富含蛋白质、有机酸、维生素以及钾、磷等微量元 素。橙子果渣成分如表1 3 。 表1 3 橙子果渣成分分析 橙子果渣成分新鲜果渣 水分 8 0 12 8 6 7 5 9 碳水化合物 9 3 5 2 2 31g 无氨提墩物 无 维他命c5 0 0 1 - 5 3 2 9 粗纤维 2 4 6 0 9 蛋白质0 9 4 - - 1 0 3 9 脂肪 0 12 - - - 0 3 6 9 灰分 0 4 轧1 2 7 9 钾( 以k 2 0 计)1 8 l m g 磷( 以p 2 0 5 计) 1 4 m g 1 绪论 1 5 2 2 橙子渣的利用 ( 1 ) 提取橙皮油 橙皮多种用途，提取橙皮油是其中最主要的一种用途，同时它也是是芋烯最重要的 天然来源之一。提取橙皮油有蒸馏、冷榨和浸提法等，普遍使用的是水蒸汽蒸馏法。无 论采用哪一种方法，提取完的果渣均有其它用途( 例如作为饲料、副食品，或是用来提 取果胶、橙皮苷) 1 5 1 - 5 3 1 。 ( 2 ) 提取橙皮苷 橙皮苷主要有：具有降低血管脆性、维持血管正常渗透压、缩短出血时间等作用， 能够预防和治疗由高血压和动脉硬化所导致的血管疾病；在欧洲，它还被用在口服药物 中治疗慢性血管疾病；此外，甲基橙皮苷还可制成药用化妆品、营养化妆品及治疗黑 斑、雀斑等皮肤病的药物【体5 7 1 。 ( 3 ) 制取柠檬酸 制取柠檬酸的工艺如下：碳酸钙一沉淀；硫酸一酸解、橙子残渣一压榨一汁 一浓缩一糖蜜；橙子残渣一压榨一固形物一干燥一陈皮；糖蜜+ 陈皮一混合一灭苗 一接种一发酵一沉淀一过滤一滤渣一酸解一浓缩一晶体一洗涤一甩干一干燥一产品。 采用上述工艺每l o o k g 的橙子废料可产出2 1 5 9 的柠檬酸。柠檬酸带有水果酸气 味，呈白色粉末或半透明结晶状。柠檬酸是广泛应用于饮料制造业、食品及油脂加工业 的食品添加剂。 ” 水果果渣中含糖量较高，如果能将糖转化为可以利用的资源，不仅可以实现废弃物 的再利用，同时可减少环境污染，因此利用水果果渣为底物生物制氢具有十分重要的意 义。 ：鼍： 1 5 3 果汁饮料废水概述 1 5 3 1 果汁饮料废水产生情况及其危害 我国目前人均饮料消费量还比较低，仅为世界平均水平的1 5 ，蕴含着巨大的发展 潜力。近年，中国饮料的年产量以高于2 0 的年均增长速率递增，饮料市场己然成为中 国食品行业中发展最快的市场之一。自2 0 0 0 年以来，2 0 0 4 年全国饮料总产量提高 2 2 7 ，实现2 9 1 2 3 万吨，再一次达到了新高峰；2 0 0 5 年，饮料行业产销两旺，产成 品、销售收入、利润和税金同比增长幅度较大，全国共生产软饮料3 0 8 6 万吨，其中果 汁饮料占软饮料的1 7 1 7 ，达5 3 0 万吨，较2 0 0 4 年同期增长2 2 4 t 5 引。生产果汁饮料 使用的产品与新鲜水的比例约为l ：6 ，2 0 1 0 年我国果汁饮料废水产量高达4 2 7 5 万m 3 。 果汁饮料废水有机物含量高，如在不予处理或处理不达标的情况下将其排入地表水体， 将会给地表水体带来严重的污染，因此寻求一种合理且高效的方法治理水果饮料废水显 得尤为重要。 1 5 3 2 饮料废水常用处理工艺及其弊端 目前，我国处理果汁饮料废水主要是在传统的生物法基础上进行改进后处理该废 东北林业人学硕士学位论文 水，如改良的二级生化污水处理工艺、高效气浮一活性污泥法、a o 混凝沉淀工艺等 p w 。经改良后，生化法基本上可以达到排放标准，但是因为进水有机负荷波动大，这种 方法很难保证处理的稳定性，并且采用这种方法剩余污泥量大，处理费用也较高，这些 都无疑带给企业巨大的经济负担。怎样才能既保证达标排放，又寻求到一种既经济又合 理的治理方式，既能充分利用资源，变废为宝，又能最大限度地减轻果汁饮料企业经济 负担，这些成为果汁饮料企业目前关注的重要问题。 1 6 本课题的研究意义及主要研究内容 1 6 1 本课题研究的目的和意义 当前人类面临的两大世界性难题是能源枯竭和环境恶化，氢能源的出现可极大的帮 助缓解这些问题。在未来的生物制氢发展中存在着巨大潜力的是直接采用微生物从富含 碳水化合物的工农业废弃物或有机废水中生产氢气，这是因为除了剩余农产品，从淀 粉、蔗糖或者果品加工厂的生产过程中所产生的废水和废弃物都可用作制氢原材料，在 实现生物制氢的同时，还可使上述废水或固体废弃物得到不同程度的净化处理【船删。生 物制氢具有十分广阔的发展前景，但是在当前研究阶段上还存在诸多技术问题，这些问 题成为生物制氢产业化的瓶颈，因此，如何在利用废弃物作为生物制氢原料的同时获得 更高产量的氢气是研究者们历尽所能要解决的问题【6 1 。 菌种e t h a n o l o g e n b a c t e r i u ms p n o vr 3 是从生物制氢反应活性污泥中分离得到的。 在此基础上，本文采用果品加工厂废弃物( 苹果废渣、橙子废渣、葡萄饮料废水) 作为 底物，探讨其在分批培养和连续流培养工艺中作为菌种r 3 生物制氢原材料的可行性， 并对其在发酵产氢过程中的工艺控制参数进行了研究。以期获得最大的氢气产量。本研 究对于利用水果加工废弃物作为底物进行生物制氢的可行性及相关技术问题的解决具有 重要意义。 1 6 2 本课题研究的内容 ( 1 ) 在分批培养实验中，以苹果加工业废渣作为底物进行生物制氢的可行性分析，及 产氢发酵过程中相关工艺控制参数的调控。 ( 2 ) 在分批培养实验中，以橙子加工业废渣作为底物进行生物制氢的可行性分析，及 产氢发酵过程中相关工艺控制参数的调控；并对菌种r 3 以苹果废渣和以橙子废渣为底物 进行产氢发酵的产氢效能进行比较。 ( 3 ) 在连续流培养实验中，以葡萄饮料废水作为底物进行生物制氢的可行性分析，及 产氢发酵过程中相关工艺控制参数的调控。 2 实验装置、材料和方法 2 实验装置、材料和方法 2 1 实验装置及工艺流程 2 1 1 分批培养实验装置 2 1 1 1 细菌厌氧培养 在以苹果废渣和橙子废渣为底物进行产氢发酵细菌的产氢效能实验和人工调控试验 中，采用的是产氢细菌的分批培养实验。分批培养实验装置如图2 1 所示。采用1 0 0m l 的封口瓶为反应器。为了使反应系统为无菌、厌氧环境，采用l m 一1 培养基1 2 州，在1 2 1 o c 条件下，高压灭菌2 0m i n ；在细菌接种和培养之前，先用9 9 9 9 9 的高纯氮吹脱2 0 m i n ，以驱除培养瓶内液相和气相的氧，使用的厌氧指示剂为忍天青( 0 0 2 ) ，当培养 液中忍天青的颜色由红青色变为无色时，表明系统已处于厌氧状态。在3 5o c 、转速为 1 2 0r m i n 的条件下将细菌置于恒温气浴振荡箱中进行振荡培养【3 4 1 。 l m 一1 培养基：葡萄糖2 0 9 l - 1 ；牛肉膏2 9 l - ；蛋白胨4 9 l 1 ；酵母膏1 9 l 。 1 ；k 2 h p 0 41 5 9 l - 1 ；n a c l4 9 l - ；f e s 0 4 7 h 2 0o 1 9 l - 1 ；m g c l 2o 1 9 l - 1 ； l 一半 胱氨酸0 5 9 u 1 ；微量元素液( m n s 0 4 7 h 2 00 0 1 m l ；z n s 0 4 7 h 2 00 0 5 m l ；h 3 8 0 3 0 0 1 m l ；n ( c h 2 c o o h ) 34 5 m l ；c a c 2 2 h 2 00 o l m l ；n a 2 m 0 0 40 0 1 m l ；c o c l 2 6 h 2 0 0 2 m l ；a i k ( s 0 4 ) 20 0 1 m l ) 1 0m l ；维生素液( 钴铵素0 0 1 m l ；抗坏血酸0 0 2 5 m l ；核 黄素0 0 2 5 m l ；柠檬酸0 0 2 m l ：吡多醛0 0 5 m l ；叶酸0 0 1 m l ；对氨基苯甲酸 0 0 1 m l ；肌醇0 0 2 5 m l ) 1 0 m l ；0 0 2 忍天青l 2 m l ；p h 值6 - 6 4 。 6 1 进水与取样2 消化气体取样3 气体计餐 4 n a h c 0 3 瓶5 气体释放6 空气浴7 反应瓶 图2 1 分批培养生物制氢装置示意图 2 1 1 2 连续流纯培养试验装置 在本研究中采用的连续流纯培养实验装置及其工艺流程如图2 2 所示。主体设备为 连续流搅拌槽式反应器( c s t r ) ，在其内部设有气一液固三相分离器，并且该反应器反应 区与沉淀区为一体化结构。该反应器还设有搅拌器，其与反应器结合部位进行了油封和 东北林业大学硕士学位论文 轴封，以保证反应区的密闭性。 本实验将电热丝缠绕在反应器外壁来进