（皮革化学与工程专业论文）蓝湿皮的酶软化研究.pdf

蓝湿皮的酶软化磷究 皮革化学与工程专业 研究生余凤湄指导教师李息强 对蘸湿皮避行酶软化处瓒，燕皮革制造中的项新技术，该方法w 以提高 皮革豢欺凌，改善藏熬疫革瓣矮鬟，捷毫经济效髓。零论文戳垂褥 l ； 髓黪糖 复会酶为软化剂，对熊应用条件进行了研究，确波了簸适宜的工蕊条件，并与 麓萃鬻瑙豹酶麓裁魄较，放多方谣考察了该囊含簿戆软讫散采。蒸予皮革豢软 度与抗弯强度和压缩性能之间的关系，建巍了一种量化袭征柔软发的方法。 | 奠软化液中的强脯氨酸浓度来裘征软化效果，研究了p h 馕、反威温震、反 应黠闼、薅弼爨、蓝滋受铬食量以及表聪活缝裁辩软纯效采敬影嫡。疆及蛾 假对粒磷的影响，并与制革常用的簧白酶制箭a s l 3 9 8 潞、胰酶、1 6 6 酶戳及 5 3 7 簿送章亍了较位效莱蕊琵较。臻究缍纂表臻，激较纯液孛熬羟麓爨羧濠发寒 蔽征软化效聚，是一种比较有效的分析方法。本实验室裔行醚翻的鬟合酶对铸 鞣胶腰有较强的水解俸丽，带其较俄蕴涵皮辩，综合考虑反应条件对较健效鬃、 救西的影昀以及容易达到的生产祭 串，通窘魏应焉条件是：潋发5 5 ，斌毽 5 5 ，酶用量3 0 0 u g 蕊漱皮。此外，软亿散采随蕊湿皮铬含量( c r ”) 静增大 嚣 减，l 、，囊蓝滋皮戆蘩鑫蘩蠢、予2 ，7 对，霹滋获缮较好黪敦纯羧渠。卡二靛基 苯磺酸钠一类的阴离予登表面活性帮套大大降低复合酶鹘软纯效莱，嚣 t x l o o p - 1 0 一类静释离子型表萄溪程裁有髓予提离软德效聚。届耱酶避移软 化效果的眈鞍，复合辩豹较纯效莱矮妊，蒸余穰次灸5 3 7 酶、胰酶、a s i 3 9 8 酶、1 6 6 酶。 磅突了复台簿软织辩夔灌度纾壤结稔、铬含整、牧缝漫袋以及最震褥刘数 成革的外观、手感、丽积和物理性能的影响，并与制革常用的蛋臼酶进行了比 较。研究结果表明，复合酶以及a s l 3 9 8 酶、胰酶、1 6 6 酶、5 3 7 酶软化对铬含 量和收缩温度几乎没有影响，复合酶和5 3 7 酶软化后的蘸湿皮的纤维编织较未 经软化的蓝湿皮要松散，其余三种酶软化对蓝湿皮的纤维结构没有明照的影响。 由复合酶和5 3 7 酶软化后的蓝湿皮制得的成革，粒面比较细致均匀，手感也较 柔软，伸长率显著提高，雨经a s i 3 9 8 酶、胰酶、1 6 6 酶软化的菔滋皮制得的 成革的粒丽较粗，手憋与未经软化的试样比较无明显差剐，伸长率下降。无论 用何种酶软化蓝澎皮，都会降低簸后所得成革的抗张强度和撕裂强度。 皮革柔软度与它的抗弯强度和压缩性能之间有密切的联系，本论文基于遮 一原理，建立了一种测量柔软度的方法，并税据这一方法的溯莺结栗比较了复 合酶和几种箭革常用骚白酶对蓝湿度的软化效果。实验绪采表掰，该方法所用 仪器简单、操作容易、鳍采可靠，而豆不会对被禊样品造成破坏，是一种比较 好的测量柔软度的新方法，用复合酶、a s l 3 9 8 酶、胰酶、1 6 6 酶、5 3 7 酶软化 蓝湿旋，复合酶的软化簸采晴羲优于其它几种酶，5 3 7 酶也有较好的较纯效栗。 关键谰：复合酶软亿蘸瀑痰柔软度 w e tb l u eb a t e dw i t h e n z y m e s a b s t r a c t b a t i n gw e tb l u ew i t he n z y m ei s an e wt e c h n o l o g yi n l e a t h e rm a n u f a c t u r e p r o c e s st h a tc a l lm a k e l e a t h e rs o f l e ra n d i m p r o v e t h eq u a l i t yo fl e a t h e r a c o m p o u n d e n z y m ep r e p a r e db y o u r l a b o r a t o r yw a s u s e dt ob a t ew e t b l u e ，a n di t sc h a r a c t e r i s t i c s w e r es t u d i e d ，a n dt h eo p t i m a lp r o c e s sc o n d i t i o n sw e r ee s t a b l i s h e d b a t i n ge f f e c to f t h ec o m p o u n de n z y m ew a ss t u d i e df r o mm a n y a s p e c t s ，a n dc o m p a r e dw i t hs e v e r a l e n z y m e s o f t e nu s e di nl e a t h e r m a k i n g a n e wm e t h o db a s e do nt h er e l a t i o no f l e a t h e r s o f t n e s sw i t hi t s f l e x i n gs t r e n g t h a n dc o m p r e s s i n gp r o p e n i e sf o rt e s t i n gl e a t h e r s o f t n e s sw a se s t a b l i s h e d w h e nt h eb a t i n ge f f e c tw a se s t i m a t e db yd e t e r m i n i n gt h ec o n c e n t r a t i o no f h y d r o - p r o l i n ei nt h eb a t e - l i q u o r , e f f e c t so fm a n yf a c t o r si n c l u d i n gp h ，r e a c t i o n t e m p e r a t u r ea n dt i m e ，d o s a g eo f c o m p o u n de n z y m e ，c h r o m ec o n t e n to f w e tb l u ea n d s u r f a c t a n t so nb a t i n ge f f e c tw e r es t u d i e d 。强eb a t i n ge f f e c to fc o m p o u n de n z y m e a n da s l 3 9 8p r o t e a s e ，p a n c r e a t i n ，1 6 6p r o t e a s ea n d5 3 7 p r o t e a s e w e r ec o m p a r e d i n a d d i t i o n ，t h ee f f e c to fp ho ng r a i nw a sa l s os t u d i e d t h er e s u l t ss h o wi ti s 雠 e f f e c t i v em e t h o dt h a tb a t i n ge f f e c ti se s t i m a t e db y d e t e r m i n i n gt h ec o n c e n t r a t i o no f h y d r o * p r o l i n ei nt h eb a t e - l i q u o r i nr e s p o c to ft h ee f f e c to fr e a c t i o nc o n d i t i o n so n b a t i n g e f f e c ta n dg r a i na n dt h ep r o c e s sc o n d i t i o n sa c h i e v e de a s i l y , w h e nt h e c o m p o u n de n z y m e i su s e dt ob a t ew e tb l u e ，t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e ，p h , d o s a g eo f e n z y m er e s p e c t i v e l y 躺5 5 c 5 5a n d3 0 0 u g t h eb a t i n ge f f e c td e l e s w i t ht h e c h r o m ec o n t e n to fw e tb l u ei n c r e a s e s ，a n dt h eb e t t e rb a t i n ge f f e c t 蝴b eo b t a i n e d w h e n t h ec h r o m ec o n t e n t ( c d ) o f w e t b l u e i s l e s s t h a n 2 7 a n i o n i cs u r f a c t a n t s s u c ha ss o d i u ml a u r y lb e n z e n es u l f o n a t e 翔醯et h eb a t i n ge f f e c td e c r e a s e d , b u t n o n i o n i cs u r f a c t a n t ss u c h 船t x - 1 0 o p 一1 0b e n e f i tt o i m p r o v eb a t i n g e f f e c t c o m p a r e d t h eb a t i n ge f f e c to f c o m p o u n de n z y m e w i t ht h a to fo t h e r e n z y m e s ，i tw a s f o u n dt h a tt h ec o m p o u n d e n z y m eh a v eb e s tb a t i n ge f f e c t ，a n dt h ed e c r e a s es e q u e n c e o ft h eb a t i n ge f f e c to fo t h e re n z y m e si s5 3 7 p r o t e a s e ，p a n c r e a t i n ，a s l 3 9 8p r o t e a s e a n d16 6 p r o t e a s e e f f e c t so fb a t i n gw e tb l u ew i t he n z y m e so nt h ef i b r o u s s t r u c t u r e ，c h r o m e c o n t e n t ，s h r i n k a g et e m p e r a t u r e ) o fw e tb l u ea n da p p e a r a n c e ，h a n d ，d i m e n s i o n a n d p h y s i c a lp r o p e r i e so f f i n i s h e dl e a t h e rw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tb a t i n g w e tb l u ew i t he n z y m e sm e n t i o n e da b o v eh a v el i t t l ee f f e c to nf i n a lc h r o m ec o n t e n t a n dt s + t h ef i b r o u ss t r u c t u r eo fw e tb l u eb a t e dw i t hc o m p o u n da n d5 3 7p r o t e a s ei s l o o s e r , a n db a t i n gw e tb l u ew i t ho t h e re n z y m e sh a v en oo b v i o u se f f e c to nt h ef i b r o u s s t r u c t u r eo fw e tb l u e + f i n i s h e dl e a t h e r sm a d ef r o mt h ew e tb l u eb a t e dw i t h c o m p o u n da n d5 3 7p r o t e a s eh a v em o r eu n i f o r mg r a i na n db e t t e rh a n d 。f i n i s h e d l e a t h e r sm a d ef r o mw e tb l u eb a t e dw i t ha s l 3 9 8p r o t e a s e ，p a n c r e a t i na n d1 6 6 p r o t e a s eh a v e m o r ec o a r s eg r a i na n di t sf e e lh a v er i oo b v i o u sd i f f e r e n c ew i t ht h a to f c o n t r 0 1 t h et e n s i l es t r e n g t ha n dt e a r i n gs 廿e n g t ho ff i n i s h e dl e a t h e r sd e c l e 蹦e dw h e n w e tb l u ei sb a t e dw i t ha n yk i n do fe t , , z y m e , b u tt h ee l o n g a t i o ni n c r e a s e d o b v i o u s l y w h e nw e tb l u ei sb 8 t e dw i t hc o m p o u n de n z y m ea n d5 3 7 p r o t e a s e t h e r ei sc l o s er e l a t i o nb e t w e e ns o f t n e s so fl e a t h e rw i t hi t sf l e x i n gs t r e n g t ha n d c o m p r e s s i n g 武埔鞫鼬，t h e r e f o r ean e w m e t h o db a s e do nt h er e l a t i o nf o rt e s t i n g l e a t h e rs o f t n e s sw a se s t a b l i s h e d ，a n dt h eb a t i n ge f f e c to fd i f f e r e n te n z y m e sw e r e c o m p a r e db yt e s t i n gs o f t n e s so f f i n i s h e dl e a t h e r sw i t ht h i sn e wm e t h o d t h er e s u l t s s h o wt h a tt h i sm e t h o dh a v es e v e r a lv i r t u e ss u c ha ss i m p l ea p p a r a t u s ，o p e r a t i n g e a s i l y , r e l i a b l er e s u l t ，a n dl e a t h e r s t e s t e dw o u l dn o tb e d a m a g e d ，s o i ti sab e t t e rn e w m e t h o df o rt e s t i n gl e a t h e rs o f t n e s s 。w h e nw e tb l u e i sb a t e dr e s p e c t i v e l yw i t h c o m p o u n de n z y m e ，a s l 3 9 8 p r o t e a s e ，p a n c r e a t i n ，1 6 6p r o t e a s e a n d5 3 7 p r o t e a s e ，t h e b a t i n ge f f e c to f c o m p o u n d e n z y m e i sb e s t k e yw o r d s ：c o m p o u n d e n z y m eb a t i n g w e tb l u es o f t n e s s 四川大学硕士学位论文 1 前言 1 1 课题提出的背景 随着科技的进步，生产的发展和人们生活水平的提高，传统的制革工艺已 经越来越不能满足人们对服装革等高档软革的要求，对传统工艺进行改进和创 新，以生产出更能满足人们要求的革制品已势在必行。 生皮在浸灰时，生皮的脂类、表皮、毛根，纤维间质、色素、脂腺、汗腺 等遭受水解，这些脂类分解产物和蛋白质的降解产物在皮内组成了皮垢，软化 的主要目的就是除去皮垢，彻底消除肿胀，并且1 止胶原纤维分裂以利于鞣剂的 渗透和其它化学品作用，以赋予成革优馥的手感、柔软度、韧性和其它性能。 利用蛋白酶可以作用角蛋白等蛋白质的分解产物，从而使皮垢更容易除去，经 过浸灰后残余的脂类，也可以通过软化液中的脂肪酶催化而水解除去一部分。 传统制革工艺中的软化都是在准备工段用胰酶和a s l 3 9 8 中性蛋白酶对生皮在 弱碱性条件下进行，是对浸灰过程的补充，它进一步除去胶原纤维间质和分散 纤维。软化后再通过浸酸等工序，然后进行鞣制，经过铬鞣后得到蓝湿皮。 由于生产服装革等高档软革对胶原纤维的松散程度要求较高，而按照常规工艺 得到的蓝湿皮往往由于以下几个主要原因而不能满足要求： 一方面，一些原因使得鞣制之前的软化进行得不彻底，如：浸水不透，软 化不足等现象，或者是由于一些工艺上的缺陷，这就使得所得到的蓝湿皮中仍 有或多或少的皮垢以及未水解的腊类。此外，铬鞣废液富含油脂、蛋白质、盐 和未被吸收的铬，蓝湿皮放置在这种液体中直到进入挤水工序，挤水使得废液 里的这些成分附着在蓝湿皮的粒面上，这些残余皮垢、脂类以及污物的存在， 使得由蓝湿皮加工得到的革不够柔软，粒面感观和颜色不够均匀一致，有不着 色现象，染色后有色花和色差存在于革表面，而对铬鞣后得到的蓝湿皮作进一 步地酶软化，则可以除去其表面的污物以及皮内残余的皮垢。 另一方面，近年来原料皮供应偏紧，许多制革厂都是购买不同生产厂家的 蓝漫皮进行生产，或者统一前工序生产蓝湿皮，然后根据产品的不同要求进行 鞣后处理。前处理工艺的不同带来坯革的差异，使得同批产品存在着纤维分散 程度、鞣制程度不一等问题，影响成品质量。而且，一般厂家生产和出售的初 鞣革通常存在着浸水不足、脱脂不彻底、软化不足等现象，经一般常规工艺处 理后，成品革身骨差、多僵边和死皱印，目前还无有效工艺能去除初鞣革所产 四川人学坝士学位论文 生的僵边及死皱。此外，蓝湿皮堆置过久，易使纤维板结、粒面缺陷增加，目 前也还没有能根本解决这些问题的方法【2 1 。对蓝湿皮进行酶处理，作为软化的 补充手段，对弥补前处理工序的不一致，减轻粒面缺陷，提高产品质量可以起 到明显的效果。 此外，在准备工段中对生皮进行酶软化，若控制不当，则有可能软化过度， 使所得到的成革粒面松散不紧密，影响成品质量，而蓝湿皮的胶原基本上己得 到固定，耐酶作用能力增强，对它实施软化条件较之生皮要缓和得多，不易造 成软化过度而导致皮胶原蛋白质的大量损失，相反，还可使成革的柔软性、粒 面感官等性能得到改进。 基于以上几个方面的原因，本论文寄希望于通过对蓝湿皮的酶软化研究， 找到一种能提高成革柔软度、有效改善成品革质量的酶制剂，并建立起关于皮 革柔软度分析的物理方法。 1 2 蓝湿皮酶软化的研究现状 蓝湿皮酶软化技术的研究是一个新的领域，国内外的研究者和酶制剂生产 企业对这方面的研究很少，目前，所能找到的关于用酶制剂对蓝湿皮进行软化 处理的论文报道只有十余篇，我国关于这方面的研究更少。 关于蓝湿皮酶软化的研究，大体上开始于二十世纪七十年代。德国的 s t a t h e r 。“1 研究了霉菌蛋白酶对蓝湿皮的软化效应，认为该种处理可以提高成 革的坚牢度和得革率。与此同时，罗姆公司的p f l e i d e r e r o ”试验了包括胃蛋 白酶、木瓜蛋白酶和酸性酶e r o p i kd v p 在内的多种酶对蓝湿皮的软化作用，以 及与之相配套的戊二醛、荆树皮栲胶复鞣技术。日本的白山琢持“3 等则较为系 统地测试了枯草杆菌蛋白酶在近中性条件下对铬鞣皮纤维的水解作用，测定了 其水解率、热水溶解率、热变性温度，研究了铬含量对酶软化效果的影响关系。 八十年代初，印度中央皮革研究所的p a n n e e r s e l v a m 等人。3 在其实验室开发了 一种霉菌酸性软化酶a f ，用该酶和商品酶u n i p o no r u 进行蓝湿皮的软化，测 定软化后皮革物理性能和纤维结构的变化，并对两种酶的软化效果进行比较， 其结论是蓝湿皮软化具有独特的功效，可以获得均匀一致的皮革，其物理机械 性能可以得到改善。九十年代以来，这方面的研究明显增加。罗马尼亚的m i h a l d e s e l n i c u 和v i c t o r i ab r a t u l e s o 用胃蛋白酶对削匀蓝湿皮进行了处理，研究 嚣川太学颤主学位论文 结果表明胃蛋白酶比碱性蛋自酶作用缓和，可提高成革柔软度和得革率肼。美 圈的j o h nw m i t c h e l l 和d a v i dg o u e l l e t t e 对酸性脂肪酶和酸性戮白酶缡合 处理蓝滋皮款传周进行了磅究，磅究结果裳明，这季孛缀合处理对改裁粒瑟溥激 度和染色后的颜色均匀性有定的效果“”。 在鬻内，巾嚣嚣l e 轻工疆学院瀚魏整钵3 等久魄较了酸性蛋童酶5 3 7 与罗 姆公司的f e r e o nm 3 0 1 ，德国希伦赛勒赫( s c h i _ l l + s i l a c h e r ) 公司的v n k o l a 等酶在不同条件下酶软佬伟糟。该研究认为，经过软纯的蓝滋皮的收缩温度有 不嗣程度的提麓，并对此现象进行了分柝。山东轻工业学院的李彦蠢“”和嬲川 大学的张铭让等人亦发表了其进行菔湿皮酶软化的研究结果，他们使用了n o v o n o r d i s k 酸蛙虽垂酶a b g 窥l 鬟薅酶a d l 。该磺究分辑了铬溶液浓度对酶活力熬影 响，对软化前胎的成革进行了化学分析，认为蓝湿皮软化可以增加得革率4 5 ，坯萃油膳含量、菠铬含整均有鹗显下降。霞川大学豹萃恚华也磷究了这两 种酶的成用工艺“”。此外，河北肃宁第二制革厂的余龙根等人研究了中性酶软 化蓝湿皮的效莱，研究结果表明，利用中性酶软化蓝灞皮对掇高身膏柔软、去 赊僵边最毒一定熬效架，但会捷粒糕变 ! 譬糖糙“。 以上研究驻示，蓝湿皮酶软化可以改善成革的粒面均匀性、提高得革率、 改逶染德效果并提蹇艘革豹耪装指标。餐跫缺乏鼹袋孳柔软废戆量健表薤绥渠 和对蓝漫皮胶原组织在软化过程中水解变化的壹接分析，以及基于这种分析的 软化效莱评价。 1 3 目前柔软度的主要评价方法及研究现状 疫攀豹柔软是撰只雾要小豹力基裁w 造成皮革一定变形熬矮地特点“”。柔 软度是评价皮革质量的重要物理指标之一，尤熟是在评价软鞍面革、服装革、 家其革、较毽袋革等轻莘僚辘对。译徐瘦摹柔软度豹传统方法是逶遥感官来鉴 定，即通过“眼看手摸”来确定皮革是否柔软，带有极大的拳观性、偶然性和 不平行瞧，目前评价皮革柔软度的方法磁圭要怒这种奎蕊的评价方法，评价结 架困人聪异，不能客鼹反映发革柔软与番的真实结果。鉴于鬃软度农评输月疑装 革等高档软革质量是否优良时的熏要性，建立一种更加客观、准确和较为科学 黥溅试手段或方法藏嚣褥戈必重要。 目前，在国内外均有工作者对皮革柔软度的量化描述进行了研究，国外关 四川火学硕士学位论文 于这方面的研究由于其结果的准确性或者仪器设备的局限性“”很少在实际 生产中被使用，国内也有少量关于这方面研究的报道“。谭宏源等通过对猪 革压缩性能的研究，指出可以用描述猪革负载一压缩率曲线方程式 r ：b ，l ，一b 。l ：+ b t l + b 。中的b ，值来量化表征柔软度。章川波等应用j n s t r o n 一1 1 2 2 万能材料强力机测试皮革的抗弯刚度，再经过数学处理推导出表征皮革柔软度 的计算公式”。这些测量方法复杂，仪器也不易获得，因而并未得到推广应用。 为获得准确、科学而又简单易行的方法和装置对皮革柔软度进行客观评价，还 需要进一步的深入研究这一研究工作也是本文的主要研究内容。 1 4 本研究的目的 对蓝1 湿皮作进一步的酶处理，可以显著提高皮革质量，创造巨大的直接经 济利益。皮革工业是我鬣国民经济的重要产、监部门，1 9 9 9 年我国生产皮革3 5 亿平方米，皮衣0 8 亿件、皮鞋2 4 亿双，出口创汇1 0 0 亿美元，列轻工行业之 首。其产量约占全球总产量的2 3 ，但由于质量原因，其销售额仅占全球贸易 颓的1 4 ，其经济效益远低于全球平均水平。质量问题一直是困扰和制约我国 皮革行业旋展的首要问题之一，据国家技术监督部门1 9 9 9 年对国内1 0 1 家胶粘 皮鞋生产企业的1 0 2 种产品进行抽查的结果显示：生产领域的抽样合格率为 7 1 4 ，流通领域为5 6 ：8 ，批发市场产品合格率则仅为4 4 4 。由此可见，如 何提高我国皮革制品的质量，将成为我国皮革行业应该重视的首要问题之一“。 成品革的质量与性能问题，是在皮革制作过程中逐渐形成，并在成品革中 最终显现出来的，如手感差，部位差明显等等，这与鞣制前处理工序的不一致 大有关系。用酶制剂对蓝湿皮作进一步的酶处理，对弥补前处理工序的不一致， 减轻粒面缺陷，提高成品革的品质有明显的效果，可以在不增加产量和投入的 情况下，极大地提高其经济效益。 本实验室长期从事皮革酶脱毛的理论和应用研究，以及制革前处理加酶助 剂的开发与工业应用研究“”。本论文研究的目的就是要开发出一种新型酶制 剂，用于蓝湿皮的软化处理，弥补前处理工序的不一致以及在蓝湿皮堆放的过 程中所造成的产品缺陷，提高成品革的质量，为人们提供质量更高的产品，并 为皮革工业赳造更大的经济效益。冠对。寻求以量i 匕拨述故方式来窖观评价皮 革柔软度的方法。 四川大学硕士学位论文 1 5 本研究的主要内容 本论文的目的在于通过多种酶对蓝湿皮的软化对比试验，找到一种能显著 提高成革的柔软度、有效改善成品皮革质量的酶制剂，并对该酶制剂进行仔细 的研究，确定它的应用条件，从不同的角度来考察它的软化效果，主要以下几 方面的内容： 1 以软化液中的羟脯氨酸浓度为表征软化效果手段，研究反应温度、p h 值、 反应时间等因素对本实验室研制的复合酶软化效果的影响，确定能达到最好软 化效果的应用条件，并与常用蛋白酶进行比较。 2 用不同酶制剂进行蓝湿皮软化的对比试验，全方位考察蓝湿皮酶软化对 纤维结构、成革外观、物理机械性能、面积、收缩温度等方面的影响。 3 建立一种能客观、科学地测定皮革柔软度的方法或手段，对成革的柔软 度进行量化表征，从而评价各种酶软化蓝湿皮的效果。 四川大学硕士学位论文 2 复合酶软化蓝湿皮的应用条件研究 并不是所有的酶制剂都能对蓝湿皮起软化作用，生皮的胶原纤维经过铬鞣 后已得到基本固定，耐酶作用能力强，且蓝湿皮中尚未与胶原蛋白结合的游离 铬离子对很多酶制剂有抑制作用，制革上常用的蛋白酶制剂难以对铬鞣胶原起 作用，因此，本研究中所用酶应满足的条件之一，便是在c r 等重金属离子及 复杂皮革化学品存在的环境下有较高的胶原蛋白水解活力；需要满足的第二个 条件是酶活力要达到一定的要求，如果酶的活力不高，软化的效果不明显，酶 的用量就会很大；酶的价格以及是否方便易得，这两点是最后工业化的前提， 如果酶的价格太高，产品的成本相应也会很高，也就得不到市场的接受；此外 用该种酶时，反应的条件要相对容易控制。 针对铬鞣胶原不同于生皮胶原的特点，我们开发出了一种复合酶制剂，该 酶制剂主要为蛋白水解酶，活力范围在中性和微酸性区域。研究了它对蓝湿皮 软化的应用条件以及一些添加剂对软化效果的影响，并与常用蛋白酶制剂进行 了比较，还对软化液中的产物形态进行了扫描探针显微镜观察。 羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，因此软化液中羟脯氨酸含量的多少可 以反映出酶制剂对铬鞣胶原水解作用的强弱，在本节的实验中，便以软化液中 羟脯氨酸的浓度来表征酶制剂对蓝湿皮的软化效果。 2 1 实验药品及仪器设备 2 1 1 主要实验试剂和材料 猪蓝湿皮 复合酶制剂 a s l 3 9 8 蛋白酶( u 5 万) 胰酶( 1 ：2 5 ) 6 6 蛋白酶( u 4 万) 5 3 7 蛋白酶( u 3 5 万) t x l o 烷基酚型非离子表面活性剂 o p 一1 0 烷基醚型非离子表面活性剂 十二烷基苯磺酸钠阴离子型表面活性剂 对二甲氨基苯甲醛 成都科嘉皮革有限公司 本实验室研制 工业品 工业品 工业品 工业品 工业品 工业品 工业品 分析纯 四川大学硕士学位论文 氯胺一t 磷酸氢二钠 一水柠檬酸钠 酪素 f o l i n 试剂 盐酸 其余未列出的试剂均为分析纯 2 1 2 主要实验仪器及设备 p h s 一3 c 精密酸度计 7 2 2 光栅分光光度计 h z s - h 水浴振荡器 。 t - 5 0 0 型电子天平 b s l1 0 s 型电子天平 d g b 2 0 0 0 2 型台式干燥箱 l g l 0 2 4 a 高速离心机 + 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 自制 分析纯 上海精密科学仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 常熟双杰测试仪器厂 北京塞多利斯天平有限公司。 重庆试验设备厂 北京医用离心机厂 2 2 实验方法 2 2 1 酶的组合 蓝湿皮软化复合酶为本研究室制备，由酸性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、 淀粉酶等复配而成，蛋白水解活力7 万u g ，其中的各种成分都是容易获得 的工业化产品，成本与制革常用酶制剂相当。 2 2 2 蓝湿皮试样的准备 在实验前于猪蓝湿皮的皮心部位取一块性质比较均匀一致的皮块，洗净后 剪成4 m m 3 大小的均匀颗粒作为蓝湿皮试样，以塑料膜密封于烧杯中，使其含 水量不随时间的变化而变化，待用。 2 2 3 复合酶蛋白水解活力与温度的关系 定义蛋白水解活力为在一定条件下，l 克酶制剂每分钟水解酪蛋白产生的 四川大学硕士学位论文 酪氨酸微克数，以单位克。1 ( u g 。1 ) 表示。 该复合酶活力的测定是以酪蛋白为底物，按照f o l i n 试剂法测定 3 2 1 在p h 值 为6 5 时，不同温度下该复合酶的蛋白水解活力，并作温度一蛋白水解活力曲 线图。 2 2 4 反应条件对蓝湿皮复合酶软化效果的影响 2 2 4 1p h 值对软化效果的影响 在两组2 2 个2 5 0 m i 锥形瓶中分别装入2 5 9 试样，然后在每一组锥形瓶中 依次加入l o m lp h 分别为3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、 7 5 、8 0 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液，将两组锥形瓶放入水浴振荡器中于 室温下振荡半小时，以使试样内外的p h 值达到致，然后在测试组中加酶液 0 2 m i 管( 酶液的浓度为0 0 5 9 m l 。) ，每一对照样加0 2 m l 蒸馏水，每一锥 形瓶都用橡皮塞塞好( 下同) ，摇匀后放入振荡器于5 5 反应6 小时，振荡器 振荡频率为1 2 5 次分钟( 以下均同) 。待反应完毕后，取出试样并立即过滤， 取滤液测定羟脯氨酸浓度。 2 2 4 2 反应温度的影响 在两组1 2 个2 5 0 m 1 锥形瓶中分别装入2 5 9 试样和l o m lp h 为6 5 的磷酸 氢二钠一柠檬酸缓冲液，放入振荡器中于室温下振荡半小时，然后在测试样中加 酶液0 2 m l ( 浓度同上) ，对照样加0 2 m l 蒸馏水，每组按4 0 、4 5 、5 0 、 5 5 、6 0 、6 5 编号，每两个试样( 测试样和对比样) 分别在各温度下反应 6 小时。待反应完毕后，取出试样并立即过滤，取滤液测定羟脯氨酸浓度。 2 2 4 3 反应时间的影响 在两组1 2 个锥形瓶中分别装入2 5 9 试样和l o m lp h 为6 5 的磷酸氢二钠一 柠檬酸缓冲液，放入振荡器中于室温下振荡半小时，然后在测试样中加酶液 0 2 m i ( 浓度同上) ，对照样加0 2 m l 蒸馏水，放入振荡器中于5 5 ( 2 下反应，每 隔两小时拿出一个测试样和一个对比样，并立即过滤，取滤液测定羟脯氨酸浓 度。 四川大学硕士学位论文 2 2 4 4 酶用量的影响 所用复合酶在p h 为6 5 ，温度为5 5 c 时，话力为8 8 万u g 。 在7 个锥形瓶中分别装入2 5 9 试样和l o m lp h 为6 5 的磷酸氢二钠一柠檬 酸缓冲液，放入振荡器中于室温下振荡半小时，然后在每个锥形瓶中加不同量的 酶液，体积差用蒸馏水调整，在水浴振荡器中于5 5 1 c 下反应6 小时待反应完毕 后，取出试样并立即过滤，取滤液测定羟脯氨酸浓度。 2 2 5p h 值对粒面粗细的影响 在猪蓝湿皮的同一部位取七块5 x 5 厘米的皮块，取样位置保证七块皮之间 看不出粒面粗细的差别，然后将这七块皮分别称重后放在七个5 0 0 m l 的锥形瓶 中，分别加入液比为2 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液。p h 值分别为4 5 ，5 0 ， 5 5 ，6 0 ，6 5 。7 0 ，7 ，5 ，放入振荡器中于室温下振荡半小时，以使试样内外 的p h 值达到一致，然后在每一锥形瓶中加酶液0 2 m l ( 浓度同上) ，用橡皮塞 塞好，摇匀后放入振荡器于5 5 反应6 小时。反应完毕后，取出皮块观察粒面 的变化。然后再将各皮块放在p h 值为4 5 的缓冲液( 液比为2 ) 中于常温下振 荡4 小时，取出皮块观察粒面粗细的变化情况。观察完后将皮块放回锥形瓶中， 加3 的铬粉，放回水浴振荡器在4 0 c 下复鞣一小时，用小苏打提碱至p h 值为 4 o 一4 2 ，取出锥形瓶静置过夜，第二日取出皮块观察粒面粗细的变化情况。 2 2 6 软化液中产物形态的扫描探针显微镜观察 在两个2 5 0 m i 锥形瓶中装入2 5 克蓝湿皮试样，加1 0 m l p h 值为5 5 的磷酸 氢二钠一柠檬酸缓冲液，加酶液0 2 m l ( 浓度同上) ，对照样加0 2 m l 蒸馏水， 放入振荡器中于5 5 下反应4 小时后，取出用离心机在i 0 0 0 0 转分的转速下 离心6 0 分钟，取清液稀释l o 倍，充分摇匀后，用微量注射器汲取5 微升，滴 在云母片上。空气干燥，以待观察。 2 2 7 蓝湿皮中铬含量对软化效果的影晌 在猪蓝湿皮的相同部位取四块大小相同的皮，将其中三块称重并放在3 个 5 0 0 m 1 的锥形瓶中，加入液比为2 的水，然后分别加入皮重3 、6 、9 的铬耢， 放在水浴振荡器中振荡复鞣1 小时，用小苏打提碱至p h 值为4 ，o 一4 2 ，取出锥 9 四川大学硕上学位论文 形瓶静置过夜，次日将皮块取出。在四块皮上各剪下一小块蓝湿皮，剪碎后洗 掉游离的铬离子，然后烘干至恒重，采用酸性高锰酸钾法测定蓝湿皮的铬含量 ”3 3 ，以三价铬离子重量占蓝湿皮重量的百分比( c r “) 来表示。剩余皮块分别剪 成4 m m 大小的颗粒作为软化实验试样。在四个锥形瓶中分别装入2 5 9 铬含量 不同的剪成颗粒状的蓝湿皮试样，然后加入1 0 m lp h 为5 5 的磷酸氢二钠一柠檬 酸缓冲液，放入振荡器中于室温下振荡半小时，然后在测试样中加酶液0 2 m l ， 在振荡器中于5 5 下反应6 小时。同时做对比实验，即不加酶液。待反应完毕 后，取出试样并立即过滤，取滤液测定羟脯氨酸浓度。 2 2 8 三种表面活性剂对软化效果的影响 蓝湿皮在软化前，要用表面活性剂进行回软，之后虽经水洗，但难免会残 留少量的表面活性剂，因此，很有必要考察不同表面活性剂对软化效果的影响。 在四个锥形瓶中分别装入2 5 9 试样和1 0 m l p h 为5 5 的磷酸氢= 钠一柠檬 酸缓冲液，除一个锥形瓶作空白样外，在另外三个锥形瓶中分别加入1 滴的十 二烷基苯磺酸钠、o p l o 非离子型表面活性剂和t x 1 0 非离子型表面活性剂， 将各锥形瓶放入水浴振荡器中于室温下振荡l 小时后，加0 2 m l 酶液，在振荡 器中于5 5 下反应6 小时，待反应完毕后，取出试样并立即过滤，取滤液测定 羟脯氨酸浓度。 2 2 9 复合酶$ 1 j n 与制革常用蛋白酶对蓝湿皮的软化效果比较 在5 个锥形瓶中分别装入2 5 9 试样，并加入1 0 m l 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲 液，缓冲液的p h 值因将要加入的酶制剂而异，然后分别加入适量的复合酶制剂、 5 3 7 蛋白酶、胰酶、a s l 3 9 8 蛋白酶和1 6 6 蛋白酶溶液，然后在水浴振荡器中 于各自的反应温度下反应6 小时。同时各作一空白对比样。待反应完毕后，取 出试样并立即过滤，取滤液测定羟脯氨酸浓度。各种酶制剂的反应条件见表1 。 1 0 凹j i i 大学硕士学位论文 表2 1 不同酶制剂的反应条件以及在该条件下的活力 2 2 1 0 待测软化液滤液的处理 取l m l 待分析滤液注入安瓿瓶中，并注入l m l1 2 n 盐酸，以火焰封1 3 ，在 1 4 0 。c 下水解1 0 小时，然后取出t m l 水解液按附录2 的方法测定水解液中的羟 脯氨酸的吸光度，并根据羟脯氨酸浓度一吸光度标准曲线求出其浓度。 2 2 1 1 羟脯氨酸的测定 羟脯氨酸含量的测定我们选择b e r g e m a n 和l o x l e y 改进的氯氨一t 氧化、对 二甲氨基苯甲醛显色法来实现。”，见附录一。 配制一定浓度梯度的羟脯氨酸溶液，按上述方法显色，作羟脯氨酸浓度一吸 光度标准曲线。 2 3 结果和讨论 2 。3 1 复合酶蛋白水解活力与温度的关系 所用复合酶制剂由多种不同类型的酶组成，其对蓝湿皮中的胶原蛋白以及 其它在准备工段中未能去掉的杂蛋白起水解作用，在用于蓝湿皮软化时，了解 它的蛋白水解活力与温度的关系是很有必要的，这样才能知道它适宜的使用温 度范围。 图2 1 是该复合酶在p h 值为6 5 时，其蛋白水解活力与温度的关系。由图 中可看出，当p h 值为6 5 时，该复合酶在3 7 。c - - 6 0 c 的温度范围内，它的蛋 白水解活力随温度的升高面增大。因此，在该温度范围内，温度的升高有利于 反应的进行。 四川丈学硕士学位论文 圈2 1 温度对复合酶活力的影晌 2 3 2 反应条件对蓝湿皮复合酶软化效果的影响 图2 - 2 、2 - 3 、2 - 4 、2 - 5 分别是p h 值、温度、作用时间以及酶用量对酶软 化效果的影响。 345678 0 h 图2 - 2p h 值对软化效果的影响 图2 - 2 是软化温度为5 5 c 、反应时间为6 小时时，软化液中羟脯氨酸的浓 度随p h 变化的曲线圈。由此图可知，p h 在3 0 - 8 0 范围内变化时，软化液中 羟脯氨酸浓度的总变化趋势是随p h 的升高而升高，当p h 在3 5 以下时，所用 酶对铬鞣猪皮胶原的作用很小，而在p h 为3 5 - 5 5 之间，软化液中羟脯氨酸浓 2 l_116山)l_0。越醺斑城蓬瓤 四川大学硕士学位论文 度的变化很小，在此范围内p h 值的变化对软化效果的影响很小，当p h 达到6 0 时。软化液中的羟脯氨酸浓度开始急速增加，雨在蠲达到7 ，5 后。这种变化趋 势又趋于平缓。由此可看出，该酶在p h 值3 5 6 5 的范围内很稳定，在这一范 围内p h 的改变不会引起较大的软化效果的改变，而实际生产中蓝湿皮酶软化的 环境是很复杂的，因此在这一p h 值范围内，实施蓝湿皮的酶软化有利于工艺过 程的控制。 4 04 55 05 56 06 5 温度 c 圄2 - 3 反应温度对软化效果的影响 图2 3 是p h 值为6 5 ，软化时间为6 小时时，软化液中羟脯氨酸的浓度随 反应温度变化的曲线图。由图可见，软化液中羟脯氨酸的浓度随反应温度的升 高而升高，在4 0 5 c 一5 5 。c 之间，上升的幅度很小，温度对酶软化效果的影响不 显著，而在5 5 。c - 6 5 。c 之间，上升的幅度很大，温度对酶软化效果的影响很大， 由此可见，在4 0 。c 一6 5 之间，该复合酶对蓝湿皮的软化效果随温度的升高而 增大，要达到较好的软化效果，反应温度的下限为5 5 。 ， 一 、j；i1。1j11j1。，j。1，t 婚f；巧悔竹5 o 二口)；-0x趟蛏斑掘鳝辍 四川太学硕士学位论文 时间，h 黧2 _ 4 最应时润对软化效果的影嫡 国2 - 4 是软纯温度为5 s ，软化球篷为6 5 簿t 较纯液中羟精氨酸的浓 度随反应时间变化的曲线圈。由图4 可以看出，在1 2 个小时的反成时间内，软 化液中的羟脯氨酸浓度与反应时闻呈线性关系，软化液液中羟脯氨酸的浓度随 反应时阃的延长两线性增长。由此可见，该酶的热稳定性很好，在该反应温度 下，能长时间保持活力而没有明显的褒减，函此在瘦嗣该复合酶软化蓝温皮时 疆鞋透过延长圣